Diplomarbeit. Vorgelegt zur Erlangung des Grades eines Diplombiochemikers an der Fakultät für Chemie der Ruhr-Universität Bochum.

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1 Diplomarbeit Vorgelegt zur Erlangung des Grades eines Diplombiochemikers an der Fakultät für Chemie der Ruhr-Universität Bochum Molekularzytogenetische Analyse einer ungeklärten intrachromosomalen Duplikation im Bereich 3q24-3q26.31 von Javad Karimzad Hagh angefertigt in der Abteilung für Humangenetik der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum Tag der Abgabe der Arbeit: Referent: Korreferent: Prof. Dr. J. T. Epplen Prof. Dr. R. Heumann

2 Danksagung Ich danke Herrn Prof. Dr. Jörg T. Epplen für die Bereitstellung des interessanten Themas dieser Arbeit, die uneingeschränkte Unterstützung und umfassende Beratung. Ich danke Herrn Prof. Dr. R. Heumann für seine ausgezeichnete Unterstützung während meines gesamten Studiums. Ich danke Herrn Dr. Fritz Gerresheim für die ausgezeichnete Beratung im Verlauf dieser Arbeit in praktischen als auch in theoretischen Fragen und für ständige Diskussionsbereitschaft und kritische Anmerkungen. Er hat mir einen tiefen Einblick in die Molekularzytogenetik ermöglicht. Ich danke Frau Dr. Gabriele Dekomien für ihre uneingeschränkte Unterstützung und ein stets offenes Ohr bei theoretischen und praktischen Fragen und kritischen Anmerkungen. Sie war für alle kleinen und großen Probleme stets ein geeigneter Ansprechpartner. Ebenso möchte ich mich hier bei Frau Irmengard Kolin-Gerresheim für ihre Interesse an meine Arbeit, wertvollen Ratschläge und kritischen Anmerkungen im Laufe dieser Arbeit bedanken. Sie ist eine ausgezeichnete Zytogenetikerin und ich bin sehr froh, dass ich ihre Unterstützung bekommen konnte. Ich danke Herrn Dr. Moritz Meins, Herrn René Gödde, Frau Tanja Schrameyer und Herrn Peter Jagiello für ihre anregenden Disskutionsbeiträge. Ich danke meinen Kolleginnen Frau Viktoria Albrecht, Frau Sigrid Becker und Frau Irene Mittelstaedt- Michalczewski. Ich möchte mich bei Frau Gudrun Rodepeter und Frau Magarethe Schumacher für ihre wertvolle Bearbeitung an den Dauerkulturen während dieser Diplomarbeit bedanken. Ich danke allen Mitarbeiter/innen der Abteilung für Humangenetik für die wunderbare Arbeitsatmosphäre. Ganz besonders danke ich meiner Frau für die moralische Unterstützung während meines bisherigen Werdegangs. 2

3 Inhalt Seite Abkürzungen 5 1. Einleitung Numerische Aberration Strukturelle Aberrationen Ein Bruch in einem Chromosom Zwei Brüche in einem einzigen Chromosom Inversion Interstitielle Deletion Ringchromosom Brüche in mehreren Chromosomen Reziproke Translokationen Zentrische Fusion (= Robertson Translokation) Insertionstranslokation Chromosomenduplikation Gen-Dosiseffekte und pathogenetische Aspekte Brachmann-de-Lange-Syndrom Duplikation (3q)-Syndrom Problemstellung Material und Methoden Material Bakterien Blutprobe vom Patienten Chemikalien Lösungen Kulturmedien DNA-Größenmarker Radioisotope Enzyme Kits Membranen Röntgenfilme Methoden BAC-Klonierungsvektor Plasmid-DNA-Isolierung ( Mini Präparation ) Phenol/Chloroform-Extraktion Zerkleinern von DNA mit Ultraschall ( Sonification ) Markierung der DNA-Sonde Präparation und Darstellung der Chromosomen Präparation Anfärbung der Chromosomen QFQ-Technik GTG-Technik RBA-Technik FISH Denaturieren von Präparaten Denaturieren von Sonden Hybridisierung

4 Waschen Präparation von Cot-1-DNA aus genomischer DNA Southern-Blot Ergebnisse Zytogenetische Analyse des Karyotyps Molekularzytogenetische Analyse durch chromosome painting Molekularzytogenetische Analyse mit bandspezifischen Sonden Molekulargenetische Analyse bei der Optimierung der BAC-Isolierung Erster Ansatz zur molekulargenetische Analyse: Southern-Blot Hybridisierung Diskussion Literatur..72 4

5 Abkürzungen A Adenin Abb. Abbildung Ad autosomal dominant A. dest. destilliertes Wasser AMP/ADP/ATP Adenosinmonophosphat/ Adenosindiphospat/ Adenosintriphosphat Ar autosomal rezessiv As Aminosäure BAC künstliches Bakterienchromosom CLD Cornelia de Lange BLDS Brachman Cornelia de Lange Syndrom bp Basenpaare C Cytosin CGH Comparative genomic hybridisation cm Centimorgan DA Dalton DNA Desoxyribonukleinsäure Dup.3 Duplikation an Chromosom 3 E.coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamin-N, N,N,N -tetraessigsäure-dinatriumsalz FISH Fluoreszenz In Situ-Hybridisierung g Guanin GTG G-Banden durch Trypsin, Giemsa h Stunde(n) kb Kilobasenpaare l Liter M Molar Mb Megabasen µg Mikrogramm min Minute µl Mikroliter ng Nanogramm p kurzer Arm eines Chromosoms 5

6 PCR q QFQ RBA rpm RT RT-PCR sec SDS SSW SST-Röhrchen STS T Tab. TBE TE Tris U V UV w/v WCP Polymerase-Kettenreaktion langer Arm eines Chromosoms Q-Banden Quinacrin-gefärbt Reverse-Banden durch Brom-Desoxyuridin, Acridinorange Umdrehungen pro Minute Raumtemperatur {normalerweise reverse transcription} RealTime PCR Sekunde(n) Natrium-Dodecyl-Sulfat Schwangerschaftswoche Röhrchen mit Silicon und ein Gel sequence tagged site Thymin Tabelle Tris/Borsäure/EDTA-Puffer Tris/EDTA-Lösung Trishydroxymethylaminomethan Einheit (en) Volt Ultraviolettes Licht weight per volume whole chromosome painting 6

7 1. Einleitung Angeborene Fehlbildungen oder angeborene Anomalien umfassen neben morphologisch definierten Krankheitsbildern auch Verhaltensstörungen, funktionelle Defekte und Stoffwechselkrankheiten, die zum Zeitpunkt der Geburt bereits vorhanden sind. Sie sind eine der häufigsten Ursachen für Kindersterblichkeit. In 40-60% aller angeborenen Fehlbildungen ist die Ursache unbekannt. Für ~15% sind genetische Faktoren (Chromosomenanomalien und Mutationen) verantwortlich; ~10% angeborener Fehlbildungen haben äußere Ursachen; für ~20-25% der Fehlbildungen werden Kombinationen von äußeren und genetischen Faktoren als ursächlich vermutet (Sadler, 1997). Eine Reihe von Fehlbildungen kann auch durch äußere Faktoren der Umwelt wie Medikamente, Viren, Bakterien, Rauchen, Alkohol, Unterernährung, Chemikalien und Strahlung, die man als teratogene Faktoren bezeichnet, hervorgerufen werden. Mikrozephalie, Neuralrohrdefekte, Extremitätenfehlbildungen, Herzfehler, Lippen- und Gaumenspalten, Anenzephalie, Hydrozephalus, mentale Retardierung Wachstumsrückstand, Dysmorphien des Gesichts, Fehlbildungen des Urogenital- und Skelettsystems und Verhaltensstörungen stellen die häufigsten Merkmale angeborener Fehlbildungen dar. Chromosomale Aberrationen gehören zu den wichtigsten Ursachen kongenitaler Fehlbildungen. Mutationen in der genomischen DNA können darin bestehen, dass ganze Chromosomen oder Chromosomenabschnitte verloren gehen oder dazu kommen. Eine Umstrukturierung kann aber auch ohne Gewinn oder Verlust von genomischem Material vorkommen, wobei man von einer Translokation oder Inversion spricht. Eine Mutation, die so umfangreich ist, dass man sie unter dem Lichtmikroskop direkt erkennen kann, ist eine Chromosomenmutation. Die kleinste Deletion oder Insertion, die noch sichtbar zu machen ist, hat eine Größe von mindestens zwei bis vier Megabasen (Mb) DNA. Chromosomenanomalien können entweder in sämtlichen oder nur in einem Teil der Zellen des Körpers auftreten. Im letzteren Fall spricht man von einem chromosomalen Mosaik. Derartige Mosaike bestehen aus zwei oder mehr zytogenetisch verschiedenen Zelllinien. Mosaike können sowohl in somatischen Zellen wie auch in der Keimbahn entstehen. Je 7

8 früher in der Entwicklung ein Mosaik entsteht, umso mehr Zellen sind betroffen. Mosaike im engeren Sinne entstehen aus einer einzigen befruchteten Eizelle Chimären dagegen bilden sich, wenn zwei Zygoten zu einem einzigen Embryo verschmelzen. Die Identifizierung von Chromosomenstörungen gehört zur Routine-Diagnostik in der Zytogenetik. Im Rahmen dieser Diagnostik wurde bei einem 4-Monaten Jungen mit angeborenen Fehlbildungen, bei dem bei einer zytogenetischen Untersuchung eine intrachromosomale Duplikation im langen Arm eines der beiden Chromosomen 3 festgestellt. Derartige Duplikationen sind sehr selten und haben offensichtlich recht komplexe Entstehungsmechanismen, die bislang nicht exakt erforscht sind. Chromosomenanomalien werden dabei in zwei Kategorien eingeteilt, numerische (Abb. 1) und strukturelle (Abb. 2). Das Ziel dieser Diplomarbeit ist eine möglichst genaue Charakterisierung der gesamten Duplikation mit zytogenetischen und molekulargenetischen Methoden. Die Methoden sollen Rückschlüsse über Art und Länge der duplizierten Region zulassen. Die molekulargenetische Charakterisierung soll Möglichkeiten eröffnen, die exakten Bruchstellen festzustellen, deren Umgebungen genau zu untersuchen und über die Entstehung der Brüche zu spekulieren. 8

9 Numerische Chromosomenanomalien Polyploidie Zusätzliche Kopien des gesamten Chromosomensatzes, z.b. Triploidie (3n), Tetraploidie (4n) Aneuploidie einzelne Chromosomen dupliziert oder deletiert z.b. Trisomie 21, Monosomie X Mixoploidie 2 oder mehr Zelllinien, die sich in der Anzahl der Chromosomen unterscheiden Mosaike unterschiedliche Zelllinien, die von einer Zygote abstammen Chimäre unterschiedliche Zelllinien, die von verschiedenen Zygoten abstammen polyploides Mosaik z.b. diploid/triploid aneuploides Mosaik z.b. normal/trisomie 21 Abb. 1: Numerische Chromosomenanomalien. 9

10 Strukturelle Chromosomenanomalien unter Beteiligung von Chromosomenbrüchen 1 Bruch in einem Chromosom 2 Brüche in einem Chromosom 2 Brüche in verschiedenen Chromosomen 3 Brüche, davon mindestens 2 in einem Chromosom Deletion eines Endstücks 1 azentrisches Bruchstück geht verloren reziproke Translokation Balancierter Austausch azentrischer Bruchstücke Inversion Balancierter Karyotyp Deletion eines Zwischenstücks der Bereich zwischen den Bruchstellen geht verloren, die Endstücke fusionieren miteinander zentrische Translokation(Fusion) die zentrischen Bruchstücke zweier akrozentrischer Chromosomen verschmelzen miteinander Ringchromosom Die Bruchstellen fusionieren miteinander und der Bereich zwischen den Bruchstellen schließt sich zu einem Ring Insertionstranslokation Bereich zwischen 2 Bruchstellen eines Chromosoms wird herausgeschnitten und an einer 3. Stelle - entweder auf demselben oder einem anderen Chromosom - eingebaut Abb. 2: Strukturelle Chromosomenanomalien 10

11 1.1. Numerische Aberration Bei numerischen Chromosomanomalien ist die Chromosomenzahl verändert, ohne dass Chromosomenbrüche auftreten (Abb. 1). Die meisten Zellen enthalten beim Menschen 46 sowie die Gameten 23 Chromosomen. Somazellen sind diploid (2n), normale Gameten haploid (1n). Man unterscheidet bei numerischen Abberationen Polyploidien, Aneuploidien und Mixoploidien. Die meisten numerischen Chromosomenaberrationen beim Embryo sind nicht mit dem Leben vereinbar. Die für die Chromosomendiagnostik wichtigsten Aneuploidien sind die potentiell lebensfähigen, autosomalen Trisomien 13, 18 und 21 sowie die geschlechtschromosomalen Aneuploidien 47, XXY, 47, XYY, 47, XXX und 45, X. Diese Aneuploidien treten bei Lebendgeborenen auf, wenngleich auch sie häufig bereits im Laufe der Schwangerschaft zum intrauterinen Fruchttod führen. Triploidien oder Tetraploidien treten auf, wenn die fetalen Zellen anstelle von 2 Chromosomensätzen 3 oder 4 Chromosomensätze, also 69 oder 92 Chromosomen aufweisen. Triploidien werden meist durch Dispermie verursacht und führen in der Regel vor der 15. SSW zum Spontanabort. Tetraploidie entsteht in der Regel durch Ausfall der ersten mitotischen Teilung; auch diese Schwangerschaften führen meist im ersten Trimenon zum Spontanabort Strukturelle Aberrationen Strukturelle Chromosomenanomalien entstehen möglicherweise nach Chromosomenbrüchen und betreffen dann meist einzelne oder mehrere Chromosomen (Abb. 2). Brüche können durch Viren, durch Strahlung, Medikamente oder spontan entstehen. Strukturaberrationen führen zu verschiedenen von Konsequenzen: Entweder kommt es zu einer balancierten Strukturanomalie, dabei geht kein genetisches Material verloren und es wird auch kein Material vermehrt; oder es entsteht eine unbalancierten Strukturanomalie durch eine partielle Monosomie (mit Verlust von Material) oder Trisomie (mit Zugewinn). Eine zytogenetisch erkennbare partielle Monosomie oder Trisomie hat in den allermeisten Fällen eine körperlichen oder geistige Behinderung zur Folge. Eine balancierte Strukturaberration wirkt sich hingegen in der Regel phänotypisch nicht aus, kann aber in der darauf folgenden Generation zu unbalancierten Chromosomensätzen führen. 11

12 Je nachdem, wie oft und wo Chromosomen brechen, können unterschiedliche Arten von Strukturanomalien entstehen.(therman, Sulsman, 1992) Ein Bruch in einem Chromosom Bricht ein Chromosom nur an einer Stelle, werden normalerweise die beiden Enden, die Bruchstellen schnell wieder durch Reparaturenzyme vereint. Unterbleibt aber die Wiederverheilung, geht das Endfragment (ohne Centromer) verloren (terminale Deletion). Unter bestimmten Umständen ist eine Stabilisierung durch die Neubildung eines Telomers möglich. Das verbleibende zentrische Fragment hat jetzt kein funktionelles Telomer und ist instabil. Die Mehrzahl die zytogenetisch terminal erscheinenden Deletionen stellen sich jedoch bei genauer Untersuchung als interstitiell heraus (s.1.2.2) Zwei Brüche in einem einzigen Chromosom Bricht ein Chromosom in zwei Stellen, beobachtet man in der Regel eine der folgenden Erscheinungen, Inversionen, interstitielle Deletionen oder Ringchromosomen Inversion Eine Inversion entsteht, wenn der Chromosomenabschnitt zwischen den Bruchstellen umgedreht wird, bevor die beiden Stellen wieder miteinander verbunden werden. Enthält der invertierte Abschnitt das Centromer, spricht man von einer perizentrischen Inversion. Ist die Inversion auf einen Chromosomenarm beschränkt, spricht man von einer parazentrischen Inversion. In beiden Fällen handelt sich um eine balancierte Umlagerung ohne Verlust von Chromosomenmaterial Interstitielle Deletion Interstitielle Deletionen kommen zustande, wenn die beiden endständigen Chromosomenfragmente ohne das Zwischenstück miteinander verknüpft werden. Das Fragment ohne Centromer (azentrisches Fragment) geht im Verlauf der nachfolgenden Zellteilungen verloren. 12

13 Ringchromosom Ein Ringchromosom entsteht, wenn die beiden Bruchenden des Fragments zwischen den Bruchstellen miteinander verbunden werden und das Fragment sich so zu einem Ring schließt. Nur Ringchromosomen mit einem Centromer können die Zellteilung überdauern Brüche in mehreren Chromosomen Brechen zwei oder mehr Chromosomen, so können sich hybride Chromosomen bilden, die sich aus Stücken verschiedener Chromosomen zusammensetzen. Je nach Lage der Bruchstelle kann man unterteilen: reziproke Translokationen, zentrische Fusionen und Insertionstranslokationen Reziproke Translokationen Bei einer reziproken Translokation wird zwischen zwei nicht homologen Chromosomen wechselseitig je ein azentrisches Fragment ausgetauscht werden. Insgesamt resultiert daraus wieder ein Gewinn noch ein Verlust von Chromatin, die Umlagerung ist also balanciert. Träger einer balancierten reziproken Translokation können unbalancierte Keimzellen bilden, aus denen Zygoten mit partieller Trisomie und Monosomie für bestimmte Chromosomenbereiche hervorgehen. Die Träger der reziproken Translokation selbst zeigen in den meisten Fällen keine Auffälligkeiten Zentrische Fusion (= Robertson Translokation) Fusionieren zwei große Fragmente von akrozentrischen Chromosomen, dann wird ein dizentrisches Chromosom gebildet. Bei der Bildung dieses Fusionschromosoms (z.b. Chromosomen 14 und 21) gehen normalerweise die azentrischen Fragmente bei der nächsten Zellteilung verloren. Obwohl Robertson-Translokationen zum Verlust von Material führen, betrachtet man sie normalerweise als balanciert. Die Träger solcher Translokationen sind phänotypisch unauffällig, können aber unbalancierte Keimzellen bilden Insertionstranslokation Für diesen Translokationstyp sind drei Brüche und zwei Chromosomen erforderlich. Aus dem einen Chromosom wird ein zwischen zwei Bruchstellen gelegener Abschnitt 13

14 herausgeschnitten und dann in einem zweiten Chromosom an einer Bruchstelle eingebaut. Balancierte Träger sind auch hier in den meisten Fällen unauffällig. Die Nachkommen von Trägern dieser Anomalie sind dem Risiko einer partiellen Monosomie oder Trisomie ausgesetzt Chromosomenduplikation Eine Chromosomenduplikation ist die Verdopplung einer Chromosomenregion. Sie kann direkt (direkte Duplikation) oder invertiert (invertierte Duplikation) vorkommen. Eine Duplikation wird manchmal als eine "teilweise Trisomie" (partielle Trisomie) angesehen. Wenn also eine Duplikation vorliegt, verfügt die Patient in diesem Chromosomenbereich über drei Kopien anstatt von zweien. Ohne besondere Regulation bedeutet dies, dass 150% der Genprodukte von Duplikationsregion vorhanden sind, was zu einem erhöhten Risiko für angeborene Anomalien führt. Die meisten der Chromosomenduplikationen sind nicht letal - können aber zu reduzierter Lebensfähigkeit führen. Die Auswirkungen der Duplikation sind von der Länge und der betroffenen Regionen abhängig. Es bestehen Korrelationen zwischen den Genotypen und Phänotypen bei gleichen Duplikationen in unterschiedlichen Individuen. Reine Chromosomenduplikationen sind nur ganz selten in der Literatur beschrieben. Die meisten Duplikationen kommen in Kombination mit anderen Chromosomenabnormalien vor (Faas et al., 2002). Gründe für die Entstehung von Chromosomenduplikationen werden im Abschnitt 4 diskutiert Gen-Dosiseffekte und pathogenetische Aspekte Die Überexpression eines normalen Genprodukts kann pathogene Folgen haben. Aneuploide Chromosomenzahlen haben schwere, im Allgemeinen letale Auswirkungen. Selbst wenn jedes einzelne Chromosom vollkommen in Ordnung ist, so ist die richtige Anzahl dennoch von grundlegender Bedeutung. Das Down-Syndrom ist die Folge einer um 50% erhöhten Dosis des Chromosoms 21. Zur Verhinderung negativer Folgen von überzähligen Chromosomen müsste es bei Eukaryoten Kontrollsysteme geben, die die Überexpression von bestimmten Genen unterdrücken können. Derartige Kontrollsysteme werden als Dosiskompensationsmechanismen bezeichnet. Bei Frauen z.b. ist dadurch jeweils nur ein X-Chromosom aktiv (Hennig, 2002). 14

15 Monosomien haben katastrophalere Auswirkungen als Trisomien. Die Menge des Genexpressionsprodukts, die für eine normale Funktionsweise erforderlich ist, kann bei verschiedenen Zellen variieren. So sind verschiedene Phänotypen zu beobachten, die von der gebildeten Menge an funktionsfähigem Genprodukt abhängig sind. Loci, bei denen eine Verminderung der Aktivität um 50% (ein normales Gen mit einer funktionslosen oder fehlenden Kopie) oder Erhöhung der Aktivität um 50% (zwei normale Gene mit einer normalen Kopie) phänotypische Auswirkungen hat, sind Gendosis-sensitiv. Bei Erbkrankheiten ist jedoch die Zahl der Genkopien selten erhöht. Die meisten Gene sind nicht dosisempfindlich. So variiert zum Beispiel die Anzahl der Gene für das grünempfindliche Lichtpigmentprotein in der Xq28-Region bei verschiedenen Menschen. Hier handelt es sich um nicht pathogene Polymorphismen. Die Charcot-Marie-Tooth Erkrankung Typ1 A (CMT1A; MIM118220) ist ein gutes Beispiel für einen Erbdefekt, der auf einer erhöhten Gendosis beruht. Eine Überexpression des PMP22-Gens (Duplikation bzw. Deletion dieses Gens bei ~70% von Patienten) durch erhöhte Kopiezahl oder aufgrund aktivierender Mutationen führt zur CMT1A (Kim et al., 2003). Bei Trisomien oder partiellen Duplikationen, in denen mehrere Gene dreifach vorhanden sind, ist die Auswirkung noch größer. Hierbei ist die Entscheidung, welche Gene für die charakteristischen Krankheitsbilder verantwortlich sind, erschwert. Die Genprodukte können direkt oder indirekt bei der Bildung verschiedener Anomalien beteiligt sein und untereinander in verschiedenen genetischen Ebenen modulieren. (Strachan, Read, 1996) Brachmann-de-Lange-Syndrom Das Brachmann-de-Lange-Syndrom [BDLS; OMIM ; 3q26.3] ist eine heterogene angeborene Krankheit mit unbekannten biochemischen und genetischen Grundlagen. Das einzige, bis jetzt vorgeschlagnes Gen, was mit dem BDLS in Verbindung gebracht wurde, ist CDL1 in 3q26.32 (Wilson et al., 1985). Allerdings wurden durch Kopplungsanalysen bei 10 verschiedenen Familien dieser Genort für die BDLS Erkrankung ausgeschlossen (Kranz et al., 2001). Daher wurden auch andere Loci, z.b. in 4p mit dem BDL-Syndrom in Verbindung gebracht (Mau et al., 2000). Das klinische Bild der Erkrankung ist sehr variabel und durch charakteristische Aussehen gekennzeichnet: Mikrozephalie; konvex geschwungene Augenbrauen, die im Bereich der Nasenwurzel zusammenwachsen (Synophrys); lange, kräftige Wimpern; Epikanthus; kurze Nase mit flachem, breitem Nasenbein sowie typischerweise dreiecksförmig gebogener 15

16 Nasenboden mit geschrumpfter Nasenscheidewand; langes, oft leicht vorstehendes Philtrum; schmale, konvex gebogene Mundwinkel; oft tief angesetzte, nach hinten verdrehte, fehlgebildete Ohrmuschel; Minderwuchs; Extremitätenanomalien in leichter Ausprägung wie kleine Hände und Füße; Hypertrichose (lokalisiert oder generalisiert); Genitalanomalien; angeborene Herzfehler; verzögerte Sprachentwicklung; unterschiedlich ausgeprägte geistige Behinderung. BDLS tritt überwiegend sporadisch auf, zeigt aber seltene Beispiele direkter Transmission als Hinweis auf autosomal dominante Vererbung (Wilson et al., 1985; Krantz et al., 2001). Weitere Zeichen von BDLS wurden bei Patienten erkannt, die eine partielle Duplikation an 3q aufweisen. (Falek et al., 1966; Francke et al., 1979; Wilson et al., 1985; Fasset et al., 2002) 1.6. Duplikation (3q)-Syndrom Das klinische Bild vom Dup. (3q) wurde zuerst als Brachmann-de-Lange-Syndrom mit Chromosomaberrationen diagnostiziert (Falek et al., 1966). Eine klinische Beschreibung wurde durch Wilson et al. (1985) vorgelegt. Sie kann ein breites Spektrum von Fehlbildungen aufweisen. Das Syndrom zeigt sich jedoch eher in einer charakteristischen Form und ist am meisten mit Fehlbildungen des Gesichts, fehlgebildeten kleinen Ohren, Mikrozephalie, mentalen Retardieren, Malformationen an den Händen und Füßen, Genitalanomalien wie Hypospadie (angeborene Fehlbildung der Harnröhre), Wachstumsrückstand und angeborenen Herzfehlern verbunden. Zytogenetische Untersuchungen zeigen 3 Kopien im Bereich 3q (partielle Duplikation in 3q) mit unterschiedlichen Längen, die meistens in der Region von 3q21-3qter vorkommen. Viele Veröffentlichungen weisen darauf hin, dass der kritische Bereich in der Region von 3q26.3-3q27 liegen soll. In einer aktuellen Veröffentlichung wird aufgeführt, dass die kritische Region im Bereich 3q26.3 (Fass et al., 2002) liegen soll. Das dup(3q)-syndrom ist eine ähnliche Form des Brachmann-de Lange-Syndroms (Jackson et al., 1993).Wilson et al. (1978) vermuteten unterschiedliche klinische Voraussetzungen für beide Syndrome. Die meisten BDLS-Patienten weisen keine Chromosomabnormalien auf (Merikangas et al., 1977, Wilson et al., 1978, Breslau et al., 1998, Opitz et al., 1985, 1994). Bei einer 16

17 Untersuchung der Chromosomen von fünf BDLS-Patienten in der Prometaphase fanden Breslau et al. (1981) weder numerische noch strukturelle Chromosomenaberrationen. Bei einer großen Untersuchung von 45 dänischen BDLS-Patienten konnten Beck und Mikkelsen (1981) nur zwei feststellen (eine balancierte Translokation t(13q;14q) und eine mit Karyotypen 45, X). Möglicherweise existiert ein biologischer Zusammenhang zwischen BDLS- und Duplikation (3q)-Syndromen. Verantwortliche Gene müssten eigentlich in der kritischen Region 3q26.3 lokalisiert sein, sodass es bei einer Deletion oder Duplikation in diesem Bereich zu überlappenden Eigenschaften zwischen den beiden Syndromen kommt. Beim BDLS befinden sich jedoch auch auf anderen Chromosomen Kandidatengene. Ulrika at al. (2000) berichten von einem 3-jährigen Mädchen mit partieller Trisomie 4p und partieller Monosomie an 8p mit mehreren überlappenden Eigenschaften zum BDLS. Die Autoren haben ihren Fall mit verschiedenen dup 4p und BDLS-Patienten verglichen und vermuten, dass der zweite verantwortliche Locus für BDLS-Phänotypen distal auf 4p lokalisiert ist Problemstellung Die Ziel meiner Diplomarbeit ist: 1. Untersuchung von mit BACs für die fragliche Chromosomenregion; 2. Herstellung eigener fluoreszenzmarkierter DNA-Sonden; 3. Charakterisierung der Duplikation und Diskussion möglicher Entstehungsgründe bzw. Entstehungsmechanismen; 4. Feinkartierung der Bruchstellen; 5. Vergleichen des klinischen Bilds unseres Patienten mit anderen Patienten, die eine gleiche Duplikation in 3q aufweisen 17

18 2. Material und Methoden 2.1. Material Bakterien Escherichia coli Top DH10B mit BACs (als Vektoren: pbace 3,6) Tab. 1 BACs die für die FISH- und Southernblot-Analyse eingesetzt wurden Klon Lab.-Bezeichnung Locus Die Position (UCSC) Chr3 Rp BAC-1 3q ,966, ,044,799 RP11-205A6 BAC-2 3q ,231, ,282,190 RP11-333H9 BAC-3 3q ,517, ,681,713 RP11-220J13 BAC-3a 3q ,598, ,764,456 RP11-575C1 BAC-3b 3q ,407, ,607,363 RP11-166D18 BAC-3c 3q23 140,741, ,895,291 RP11-485G4 BAC-3d 3q23 143,125, ,276,482 RP11-372E1 BAC-3e 3q23 143,816, ,999,142 RP11-160A13 BAC-3f 3q23-q24 144,049, ,207,975 RP11-16p13 BAC-3g 3q24 144,451, ,605,278 RP11-8J23 BAC-3h 3q24 144,710, ,870,417 RP11-76N7 BAC-3i 3q24 144,762, ,927,829 RP11-164C13 BAC-3j 3q24 144,823, ,984,481 RP11-392C7 BAC-3k 3q24 144,843, ,024,362 RP11-44A19 BAC-3l 3q24 144,861, ,028,982 RP11-451I2 BAC-3m 3q24 144,898, ,089,406 RP11-260J24 1-BAC-4 3q24 144,934, ,087,179 RP11-16M17 2-BAC-4 3q24 145,010, ,200,361 Rp11-692L6 BAC-4 3q24 145,781, ,926,336 RP11-145F16 BAC-5 3q ,307, ,477,735 RP11-91L9 BAC-6 3q ,471, ,621,804 RP11-657F23 BAC-7 3q ,806, ,918,218 RP11-627P8 BAC-7q 3q ,140, ,148,146 RP11-141C22 BAC-7b 3q ,285, ,463,304 RP11-722A10 BAC-7c 3q ,876, ,886,437 RP11-151A21 BAC-7d 3q ,072, ,219,988 RP11-536F13 BAC-7e 3q ,958, ,102,650 RP11-172G5 BAC-7f 3q ,487, ,608,234 RP11-148D23 BAC-7g 3q ,767, ,939,655 RP11-89J17 1-BAC-8 3q ,693, ,861,049 RP11-292L5 BAC-8 3q ,451, ,644,055 RP11-416O18 BAC-9 3q ,094, ,272,602 RP11-35G16 BAC-10 3q ,574, ,727,779 18

19 Blutprobe vom Patienten Blutproben des Patienten standen sowohl als Heparin-Blut (für zytogenetische Analysen) als auch als EDTA-Blut (Zellkultur und DNA-Präparation) für die Untersuchungen zur Verfügung Chemikalien Aceton (Merck), Acrylamid (Flukal), Agar (GIBCO BRL), Agarose (GIBCO BRL), Ammonium-Peroxodisulfat (Baker), Ammonium-peroxy-disulfat = APS (Baker), Borsäure (Baker/MBI Fermentas), Bovin-Serumalbumin = BSA (Fluka), Bromphenolblau (Barker), Chloramphenicol (Sigma), Chloroform (Merck), Desoxyribonukleotid-Tri-phosphat / dntp (2 -Desoxy-Adenosintri-phosphat / datp 2 -Desoxy-Guanosin-triphosphat / dgtp, 2 -Desoxy-Tymidin-triphosphat / dttp; MBI Fermentas), Ethanol (zur Analyse: 99,8%; Merck, Riedel), Ethidiumbromid (Sigma), Ethylendiamin-N,N,N,N Tetraessigsäure- Dinatriumsalz = EDTA (Merck), Ficol 400 (Pharmacia), Formaldehyd (Baker), Formamid (Baker), Glycerin (Riedel), Hefeextrakt (Gibco), Isoamylalkohol (Riedel), Isopropoanol (Riedel), MarrowMAX TM -Medium (Invitrogen), Miniralöl (Sigma), Natriumacetat = NaAc (Riedel), Natriumchlorid = NaOH (Riedel), NP-40 (Abbortt), Phenol (Riedel), RPMI-Medium (Gibco), Salzsäure = HCl SDS =Natriumdodecylsulfat; (Barker), Trishydroxymethylaminomethan = Tris (Biomol), Trypton (Gibco), Salmon Sperma-DNA (Invitrogen) Lösungen Die Lösungen wurden bei Bedarf autoklaviert. Es wurde immer bidestilliertes Wasser verwendet. Agarosegel-Ladepuffer: Hybridisierungspuffer (FISH-Puffer): 0,25 (w/v)% Bromphenolblau 0,25 (w/v)% Xylencyanol FF 15 (w/v)% Ficol 400 dest. H2O 10% Dextransulfat 40% 2x SSC 50% ultrapures deionisiertes 19

20 Chloroform/Isoamylalkohol: 1% Tween 20 Formamid Mischung von Chloroform mit Isoamylalkohol im Verhältnis 24:1(w/v) Church-Hybridisierungspuffer: 0,5 M Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 ph 7,2 7% (w/v) SDS 1 mm EDTA Denaturierungslösung I (für Southern-Blot): Denaturierungslösung II (für FISH): Denhardt s (100): Ethidiumbromid-Lösung: 1,5 M NaCl 0,5 M NaOH dest. H 2 O 70% (w/v) Formamid 10% (w/v) 20x SSC-Puffer ph 5,3 dest.wasser 2% (w/v) Polyvinylpyrrolidon 2% (w/v) BSA 2% (w/v) Ficoll 400 0,5% (w/v) Ethidiumbromid Neutralisierungslösung (ph 8.0): 1,5 M NaCl 2 0,5 M Tris/HCl P1-Lösung: 15 mm Tris ph 8 10 mm EDTA P2-Lösung: P3-Lösung: SSC-Puffer (20x) ph 7,2: SSPE-Puffer (1x) ph 7,4: 2 M NaOH 1 % SDS 3 M KOAC ph5,5, autklaviert, 3 M NaCl 0,3 mm NaCitrat 0,18 M NaCl 0,1 M Naphosphat 1 mm EDTA STE-Puffer (TEN) ph 8,0: 10 mm Tris/HCl (ph 8,0) 10 mm EDTA 0,1 M NaCl TAE-Gelelektrophorese-Laufpuffer(1x): 40 mm Tris 40 mm Acetat 1 mm EDTA 20

21 TBE-Gelelektrophorese-Laufpuffer(1x): 89 mm Tris 89 mm Borsäure 2 mm EDTA TE-Puffer (1x) PH 8,0: 10 mm Tris/HCl (PH 8,0) 1 mm EDTA (PH 7,4) Wachlösung I (für Southern- Blot nach Hybridisierung): Waschlösung II (für Southern-Blot nach Hybridisierung): Waschlösung III (für Souhtern-Blot nach Hybridisierung): Waschlösung (für FISH): 7x SSC 0,1% SDS 1x SSC 0,5% SDS 0,1x SSC 1% SDS 50% (w/v) Formamid 10% (w/v) 2x SSC ph 7 dest. Wasser Kulturmedien Low Salt LB-Chloramphenicol Medium: 1%(w/v) Trypton 0,5%(w/v) Hefeextrakt 0,5%(w/v) NaCl µg/ml Chlroamphenicol DNA-Größenmarker Lambda-DNA/HindIII-Marker (MBI Fermentas) Fragmentlängen (bp): 23310, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 puc 19-DNA/MspI (HpaII)-Marker (MBI Fermentas) Fragmentlängen (bp): 501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34, 26 1kb DNA-Marker (Gene Ruler) Fragmentlänge10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, Radioisotope [α- 32 P]dATP (370 MBq/ml, 10mCi/ml; 5000 Ci/mmol, ca. 185 TBq/mmol) 21

22 Enzyme Klenow-Polymerase (Amersham) Restriktionsendonuklease BamHI (MBI) Nuklease S1 (Amersham) Kits Armspezifische DNA-Sonden für Chromosom 3p und 3q (Q-Biogene) WCP (whole chromosome painting ) für Chromosom 3 (grün; Abbott) Markierungskit mit Fluroreszenzfarbstoffen (grün, rot, blau; Q-Biogene) DNA-Aufreinigungssäule (Genetix) random-primed labelling (Amersham) Membranen Hybond TM -N Nylonmembran (Amersham) Röntgenfilme Hyperfilm TM. MP (Amersham) 2.2. Methoden BAC-Klonierungsvektor Erste Feinkartierungen der Duplikationsregion lassen sich am besten mittels BACs durchführen, die Insertionen (Tab. 1) der vermutlich duplizierten Regionen haben. BACs enthalten nur wenig Replikone pro Zelle - wie etwa den Fertilitäts- oder F-Faktor von E.coli. (Abb. 3), die die Kopienzahl des F-Faktors pro E.coli-Zelle auf ein bis zwei Kopien einstellen. Die Replikation des F-Faktor in E.coli ist strikt kontrolliert und auf eine Kopiezahl von 1-2 beschränkt, was eine Rekombination der Insertionsfragmente verhindert. 22

23 Abb. 3: BAC-Klonierungsvektor (pbace3.6) ohne Insertion. Die Länge der bakteriellen genomischen DNA bertägt bp. Sie enthält einige wichtige Gene wie: oris und repe für die unidirektionale Replikation, para und parb für die Beschränkung der Kopiezahl auf 1-2 CM (R) für Chloramphenicol-Resistenz-Marker. In diesen Vektor können die die menschliche DNA-Fragmente von über 300 kb einkloniert werden (Shizuya et al., 1992; Abbildung von In Vektoren, die auf diesem F-Faktor-System basieren, können Fremd-DNA Fragmente von über 300 kb einkloniert werden (Shizuya et al., 1992). Das gesamte menschliche Genom umfasst bei enger Überlappung mehr als Einzelklone (CITB-BAC Bibliothek). Die inserierte DNA der BAC-Vektoren umfasst ~5-200 kb. (Durchschnitt: 140 kb). Die Klonierungsvektoren sind normalerweise recht stabil und werden bei der Zellverteilung wie das Bakteriengenom repliziert Plasmid-DNA-Isolierung ( Mini Präparation ) Die Plasmid-Isolierung wurde nach einem Protokoll von QIAgen modifiziert. E.coli Zellen (DH10B mit entsprechenden BACs; Tab. 1) werden in 5 ml LB-Medium, mit µg Chloramphenicol, bei 37ºC und 200 rpm für 8h vorkultiviert und in 20% Glycerol bei - 80 C gelagert. 100 µl dieser Vorkultur wird in LB-Chloramphenicol-Medium (über Nacht bei 37ºC und 200 rpm vermehrt. Die Bakterienzellen werden durch Zentrifugation für 10 min bei 3000 rpm und 4ºC sedimentiert. Der Überstand wird entfernt, das Sediment 23

24 vollständig getrocknet und in jeweils 300 µl Puffer P1-Lösung resuspendiert. Die lysierten Bakterienzellen werden in neue Eppendorfgefäße übertragen, mit 300 µl frischer P2- Lösung 5 min vermischt, anschließend mit 300 µl eisgekühlter P3-Lösung versetzt und für 15 min auf Eis inkubiert. Zur Entfernung der Präzipitatreste schließen sich mind. zwei Zentrifugationsschritte an (30 min, rpm und 15 min bei rpm bei 4ºC). Überstand wird jeweils in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Die DNA wird durch Zugabe von 800 µl raumtemperiertem Isopropanol präzipitiert und bei 30 min bei rpm und 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die DNA mit 500 µl auf Raumtemperatur äquilibrierten 70%igem Ethanol gewaschen. Anschließende Zentrifugation für 10 min bei rpm und 4ºC. Die DNA wird ca min an der Luft getrocknet und mit 150 µl TE- Puffer aufgelöst und zu einem Endvolumen von 450 µl vereinigt. Abbildung 15a, b und c (Abspalte 3.4) zeigen die einzelnen Kontrollschritte der Vektorisolierung Phenol/Chloroform-Extraktion Zur Proteinentfernung wird die in TE- Puffer gelöste DNAs jeweils in ein neues SST- Röhrchen überführt und mit 1 ml Phenol und Chloroformisoamylalkohol versetzt. Anschließend werden sie für 10 min bei 2500 rpm zentrifugiert. Mit einer Zugabe von jeweils 2 ml reinem Chloroform werden die Reste von Phenol entfernt und dann für 5 min gut gemischt. Anschließend werden sie für 10 min bei 2500 rpm zentrifugiert Zerkleinern von DNA mit Ultraschall ( Sonification ) Der Überstand mit den isolierten BACs wird nach der Phenol/Chloroform-Extraktion für die Sondenherstellung mit Ultraschall bearbeitet. Die optimale DNA-Fragmentlänge beträgt für den FISH-Einsatz zwischen bp (Abb. 15a, b). Für die Zerkleinerung der DNA-Fragmente in die gewünschte Länge kann man DNase oder Ultraschall einsetzen. Der Einsatz von Ultraschall ist einfacher und lässt sich besser dosieren. Die optimale Beschallung für 10 µg BAC gelöst in 500 µl TE-Puffer beträgt 3x1 min mit jeweils 2 min Abkühlung auf dem Eis (Sonifier der Firma Branson, output-control 30, Duty Cycle 30 und Pulsed unkontinuierlich). Entsprechend müssen Zeit und Intensität der Beschallung bei der Zerkleinerung von Lachsspermien- bzw. der Gesamt-DNA erhöht werden. Die optimale Beschallung für ca. 300 µg DNA gelöst in 500 µl TE-Puffer beträgt 8x 2,5 min mit jeweils 2 min Eisinkubationspausen (output-control 40, Duty Cycle 40 und Pulsed 24

25 unkontinuierlich). Die zerkleinerten DNA-Fragmente bei 1,5% Agarosegel werden kontrolliert Markierung der DNA-Sonde Mit Hilfe molekulargenetischer Methoden lässt sich prinzipiell jede DNA-Sequenz klonieren, isolieren und als Sonde verwenden. DNA-Sonden lassen sich aus klonierter DNA, PCR-Produkten oder synthetischen Oligonukleotiden herstellen. Nukleinsäuren lassen sich entweder radioaktiv oder nichtradioaktiv markieren. Sowohl radioaktiv markierte als auch einige nichtradioaktive Markermoleküle (zum Beispiel Biotin, Digoxigenin, Fluoreszenzfarbstoffe) können indirekt in Form von modifizierten Nukleotiden enzymatisch in DNA eingebaut werden [z.b. Nick-Translation, random-primed labelling]. Es lassen sich sowohl die doppelsträngige als auch einzelsträngige DNA chemisch direkt markieren. Dabei werden die Nukleotide am Strang modifiziert (A.R. Leitch, T. Schwarzacher, In Situ-Hybridisierung 1994). In der vorliegenden Arbeit wurden die bearbeiteten DNA-Fragmente für die Herstellung der DNA-Sonden (1µg) chemisch direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoff anhand eines labelling kits (ULS : universal linkage system von Q-Biogene) markiert. Es ist preiswert und enthält nur wenige Arbeitsschritte Präparation und Darstellung der Chromosomen Präparation Für die Chromosomenanalyse werden lebende Lymphozyten aus peripheren Blut benötigt, die im sich in Kultur vermehren. Daher ist der vergleichsweise rasche Transport der Blutprobe ins Labor wichtig. In vivo enthalten nur Zellen des Knochenmarks und des Chorions ausreichende Anteile mitotisch aktiver Zellen. Lymphozyten des peripheren Bluts werden durch Phytohämagglutinin zur Zellteilung angeregt. 0,15-0,35 ml Blut werden zu 5 ml Medium gegeben (Minimalmedium RPMI mit Zusätzen von Serum, Glutamin und Antibiotika). Die Zellteilung wird durch Zugabe von µl eines Colchicin- Derivats (Colcemid) nach ca. 30 Minuten beendet. Colcemid unterbricht die Mitose im Stadium der Metaphase, so dass es zu einer relativen Anreichung von Zellen in der Metaphase kommt. 25

26 Die Präparation der Chromosomen beginnt mit einer Zentrifugation von 10 min und der anschließenden Aufnahme des Zellsediments in leicht hypotoner Lösung (0,65% KCl). Nach Inkubation für ~20 min bei 37 C wird erneut zentrifugiert (10 min). Anschließend wird das Zellsediment in Fixativ aufgenommen. Die Fixierlösung besteht aus einem Gemisch von Metanol und Essigsäure im Verhältnis 3:1. Das Fixativ wird nach anschießender Zentrifugation 2-3 mal gewechselt. Danach können die fixierten Zellen in eine Pipette aufgenommen und auf einen Objektträger aufgetropft werden. Für gute Präparationen ist die Raumfeuchtigkeit kritisch. Beim Auftropfen platzen die Zellen und die Chromosomen haften in mehr oder weniger gespreiteter Form auf dem Objektträger. Dann werden einige Objektträger für das Färben (QFQ, GTG, RBA) ausgewählt (Rooney et al., 1992) Anfärbung der Chromosomen QFQ-Technik Nach dem Auftropfen bleiben die Objektträger über Nacht bei Zimmertemperatur liegen. Danach wird der Objektträger für 25 min mit dem Fluoreszenzfarbstoff Quinacrine gefärbt und ~3 min gewässert. Auf den getrockneten Objektträger gibt man 2-3 Tropfen Pufferlösung und deckt diesen mit einem Deckglas ab. Dieses wird mit Nagellack abgedichtet und unter dem Fluoreszenzmikroskop analysiert (Abb. 6a) GTG-Technik Nach dem Auftropfen wird der Objektträger bei 60 C im Thermostaten gealtert (ca. 16 h). Nach einer Vorbehandlung in Trypsinlösung (2-4 min) und anschließendem Waschen in Pufferlösung wird der Objektträge für ~2 min in Giemsa-Lösung gefärbt. Nach kurzem Waschen in dest. Wasser wird er getrocknet und mit einem Deckglas in Einschlussmittel als Dauerpräparat eingedeckt (Abb. 6b) RBA-Technik Lymphozyten aus einer Dauerkultur (Zellzahl 0,4x10 6 /ml) werden in 5 ml Medium 72 h kultiviert. 7 h vor Zugabe von Colcemid werden 0,05 ml einer BrdU/FdU Lösung (BrdU: 100 mg in 100 ml Medium, FdU: 5 mg in 100 ml Medium) zugesetzt. Eine Stunde vor Abbruch der Kultur wird Colcemid zugegeben. Die Aufarbeitung und Präparation erfolgt wie oben beschrieben. Die Präparate werden in einer 5%igen Acridinorangelösung (Acridinorange: 5 mg in 100 ml Phosphat-Puffer ph 6,8) 5 min gefärbt. 26

27 BrdU wird statt Thymidin während der Synthesephase des Zellzyklus in die DNA eingebaut. Bei Zugabe in der letzten Phase der Kultivierung und in vielen Zellen (der asynchron wachsenden Kultur) in der letzten Phase eines Zellzyklus bekommt man ein bei früh und spät replizierenden Abschnitten unterschiedliches Bandenmuster, das mit R- Bändern fast identisch ist. Abschnitte früh replizierender DNA fluoreszieren grün (entsprechen hellen Giemsa-Banden), spät replizierende Segmente fluoreszieren rot (dunkle Giemsa-Banden; Abb. 19b) FISH Während die Chromosomenanalyse einen Gesamtüberblick über alle im Lichtmikroskop erkennbaren Chromosomenaberrationen gibt, können mit Hilfe der Fluoreszenz-In-Situ- Hybridisierung (FISH) auch submikroskopische Veränderungen nachgewiesen werden. Ein Vorteil der FISH-Methode ist, dass die Analyse auch an Interphasekernen durchgeführt werden kann. FISH erlaubt, spezifische Nukleinsäuresequenzen (RNA und DNA) in Geweben, Zellen, Zellkernen und Chromosomen sichtbar zu machen. Damit lassen sich komplementäre Sequenzen direkt im biologischen Präparat, in situ lokalisieren (Pardue, Gall, 1969; John et al., 1969; Übersichtsarbeiten: Leitch et al., 1994; Swiger und Tucker, 1996). FISH-Untersuchungen ermöglichen die Identifizierung von sonst nur schwer analysierbaren Chromosomenanomalien. Dabei müssen jeweils spezifische Sonden eingesetzt werden. Die Sonden werden aus großen genomischen Klonen wie Cosmiden, BACs (bacterial arteficial chromosomes) oder YACs (yeast arteficial chromosomes) hergestellt, die mit Fluorochromen markiert werden Denaturieren von Präparaten Die Präparate (Objektträger) werden zuerst mit einer Alkoholreihe (70%, 85%, 100%) für jeweils 10 min behandelt und dann bei RT getrocknet. Danach werden sie für 8 min in einem Färbeküvette in Denaturierungslösung bei 73 C inkubiert. Anschließend werden sie in einer eisgekühlten Alkoholreihe (70%, 85%, 100%) jeweils 2 min gewaschen bei RT getrocknet Denaturieren von Sonden Der in TE gelösten markierten DNA ( ng) wird zunächst Lachs-DNA (10 µg), sowie Cot-1- (5 µg) oder Gesamt-DNA (10 µg) zugegeben. Anschließend wird die DNA 27

28 mit Alkohol und Salz präzipitiert. Das Präparat wird für 20 min bei rpm und -4 C zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Das Sediment wird für ca. 5 min bei RT getrocknet und in 10 µl FISH-Puffer (s ) gelöst. Das DNA-Gemisch wird für 8 min bei 80 C im Wasserbad denaturiert und für 20 min bei 37 C prähybridisiert (CISS- Hybridisierung). Die so vorbehandelte denaturierte Sonde wird auf den Objektträger gebracht, auf dem sich die denaturierten Chromosomen befinden (Abb. 5). Mittels Deckglas wird die Hybridisierungsstelle vorsichtig abgedeckt. Es dürfen keinerlei Luftbläschen zwischen Objektträger und Deckglas verbleiben. das Deckglases wird durch Rubber Cement (Fa. Marabu).abgedichtet Hybridisierung Das Präparat wird für h bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubiert. Dabei diffundiert die markierte DNA-Sonde zur DNA der Chromosomen und hybridisiert mit komplementären DNA-Sequenzen (Abb. 5) Waschen Das Deckglas wird vorsichtig entfernt. Der Objektträger wird in Waschlösungen (3x 10 min in FISH-Waschlösung, 1x 10 min in 2x SSC-Lösung, 1x 5 min in NP-40-Lösung) bei 46 C ± 1 C gewaschen und bei RT getrocknet. Anschließend wird auf den Objektträger mit den fixierten Chromosomen vorsichtig 10 µl DAPI-Farblösung getropft und mit einem Deckglas bedeckt. Die Ränder des Deckglases werden durch Nagellack abgedichtet. Das Präparat wird getrocknet und unter dem Fluoreszensmikroskop weiter analysiert. Alle Schritte, bei denen mit Fluoreszenzfarbstoffen oder markierte Sonden umgegangen wird, werden im abgedunkelten Raum bei Gelblicht durchgeführt. Abb. 4 veranschaulicht alle Arbeitsschritte. 28

29 Herstellung des zytologischen Präparats Markierung der Sonde getrennte Denaturierung von Sonde und Hybridisierung Waschen Mikroskopische Darstellung Abb. 4: Überblick über den Ablauf einer In-Situ-Hybridisierung 29

30 Deckglas DNA im Metaphase- oder Interphasechromosom Objektträger DNA-Sonde (direkt markiert) I. Denaturierung gesuchte Zielsequenz II. Hybridisierung Abb. 5: FISH-Methodik. Die markierte und denaturierte Sonde wird direkt auf den Objektträger gegeben, auf dem sich die Chromosomen-DNA in denaturierter Form, also einzelsträngig, befindet. Dort findet die Hybridisierung statt. 30

31 Präparation von Cot-1-DNA aus genomischer DNA Als Cot-1-DNA wird die Fraktion doppelsträngiger DNA-Stücke bezeichnet, die man erhält, wenn man fragmentierte gesamtgenomische DNA denaturiert und bei definierter Salzkonzentration und Temperatur solange renaturieren lässt, bis das Produkt aus DNA- Ausgangskonzentration in Mol/l (C o ) und Zeit in sec (t) den Wert 1 hat. (C o x t = 1). Cot-1- DNA besteht demnach fast ausschließlich aus hochrepetitiven Sequenzen der Ausgang- DNA. Cot-1-Fraktion oder genomische Gesamt-DNA werden als Blockade-DNA verwendet. Sie hybridisiert mit den Sequenzen in Sonden und Chromosomen, die hochrepetitiv sind und in allen menschlichen Genomen vorkommen. Dadurch stehen diese unspezifischen Sequenzen für die Hybridisierung mit der eigentlichen Sonde nicht mehr zur Verfügung. Bei der CISS-Hybridisierung (chromosomale In-Situ-Suppressionshybridisierung) erfüllt die Blockade-DNA den oben genannten Zweck. Neben Blockade-DNA verhindert DNA aus Lachssperma unspezifische Hintergrundsignale (Leitch, Schwarzacher, 1996). Für die Herstellung von ca 400 µg Cot-1 (~ 2% von Ausgangmenge DNA) wird 75 mg genomische DNA in 10 ml TE-Puffer (ph 8,2) gelöst eingesetzt. Diese DNA wird 8mal 2,5 min, gefolgt von jeweils 2 min Abkühlung auf dem Eis, beschallt (Sonifier der Firma Branson, output-control 60, Duty Cycle 60 und Pulsed diskontinuierlich). Die DNA- Fragmentlängen werden auf einem 1,5%tiges Agarosegel überprüft und ggf. weiter beschallt. Die zerkleinerten DNA-Fragmente werden 6 min bei 96 C denaturiert und für 4 min bei 65 C äquilibriert. Durch Zugabe von 640 µl 5 M NaCl wird eine Endkonzentration von 0,3 M eingestellt und in 0,3 M NaCl für 45 sec bei 65 C reassoziiert. Die Reassoziation wird durch Zugabe von 10,6 ml eiskaltem 2x Nuclease-S1-Puffer gestoppt. Anschließend wird die nicht reassoziierten einzelsträngige DNA durch Zugabe von U Nuclease S1 und Inkubation für 30 min bei 37 C eleminiert (Nuclease S1 schneidet einzelsträngige DNA, die nicht reassoziiert ist. Danach wird eine Phenolextraktion (s ) durchgeführt und die DANN in TE-Puffer auf Endkonzentration von 10 mg/ml resuspendiert. 31

32 Southern-Blot Beim Southern Blot-Verfahren (Southern, 1975) wird Ziel-DNA zunächst mit einem Restriktionsenzym in definierter Fragmente geschnitten. Die Sonde erkennt gewünschte DNA-Sequenzen in einer Mischung von geschnittenen DNA-Fragmenten, die in einer Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt wurden. Die DNA wird im Gel zu Einzelsträngen denaturiert und dann auf eine Nylonmembran übertragen, wo man sie durch die Wärme und durch UV-Lichtbestrahlung kovalent an die Filter binden und mit radioaktiv markierten einzelsträngigen DNA-Sonden hybridisieren kann. Auf einem Autoradiogramm erkennt man die Bande(n) von DNA-Fragmenten, die komplementär zur radioaktiven Proben sind (Strickberger, 1985). Für die Durchführung des Versuchs werden zunächst 10 µg genomische DNA (jeweils von Patient und Kontrollperson) und 5 µg BAC mit dem Restriktionsenzym (z. B. BamHI, 80U) über Nacht bei 37 C inkubiert. Anschließend wird die Restriktion auf einem 0,8%igen Agarosegel kontrolliert. Danach wird die restringierte genomische DNA (10 µg) von Patient und Kontrollperson auf einem 0,8%igem Agarosegel aufgetragen. Zusätzlich wird ein 1kb-DNA-Marker und eine Reihe von BAC-Verdünnungen (400 ng, 40 ng, 4 ng, 0,4 ng, 0,04 ng) als Positivkontrollen aufgetragen. Die Gelelektrophorese wird zuerst bei 70 V für 3 Stunden und dann bei 90 V für weitere h (je nach erwarteter Bandenlänge) durchgeführt. Danach wird das Gel für 30 min in EtBr angefärbt und photographiert. Anschließend wird das Gel in einer alkalischen Lösung für 30 min bei RT denaturiert und nach kurzem Abspülen mit dest. Wasser für weitere 30 min mit einer Neutralisierungslösung behandelt. Für den Blot-Aufbau wird Filterpapier, die Nylonmembran und Filmstreifen entsprechend zugeschnitten. Zunächst wird ein in 10x SSC-Lösung gespültes 1x Filterpapier auf eine glatte Ablage in 10x SSC-Lösung aufgelegt. Anschließend wird das Gel auf das Papier gelegt und darauf ein Fenster mit dünn geschnittenen Filmsteifen gebildet. Danach wird die geschnittene Nylonmembran auf das Gel aufgelegt und mit einer Glaspipette Luftblasen entfernt. Danach werden noch zwei weitere in 10x SSC-Lösung gespülte Filterpapiere auf die Nylonmembran gelegt und abgerollt. Zum Abschluss kommen anschließend noch 3 getrocknete Filterpapierlagen und saugfähige Papierhandtücher. Ein Gewicht von etwa 1,5 kg beschleunigt den vertikalen DNA-Transfer in die Membran. Das gesamte System bleibt für 18 h bei RT stehen. Zur Kontrolle, ob der Transfer erfolgreich war, wird das Gel in EtBr für 30 min gefärbt. Anschließend wird DNA auf der Membran fixiert (2 h bei 80 C; 2 min mit UV; 32

33 700µJ/CM 2 ). Die Sonden werden aus BACs mittels eines random-primed labelling Kits hergestellt und somit radioaktiv mit 32 P markiert. Die Membran wird zwei Stunde mit Church-Puffer bei 60 C vorhybridisiert Die radioaktiv markierten Sonden werden 10 min bei 95 C denaturiert und in die Hybridisierungsröhre zur Membran in die Church-Lösung gegeben und über Nacht bei 60 C hybridisiert. Nach der Hybridisierung wird die Membran jeweils 15 min in verschiedene Wachlösungen behandelt.(1x Waschlösung-I bei RT, 1x Waschlösung-II bei 37 C und 1x Wachlösung-III bei 60 C). Nach den Waschgängen wird die Membran 10 min in 6x SSC-Lösung gespült und dann zwischen 2 Filterpapieren getrocknet. Anschliessend wird die Membran 20 h exponiert und im Phosphoimager analysiert. Zusätzlich wird die Membran für ~3 Wochen auf einen Röntgenfilm bei -80 C exponiert und ausgewertet. 3. Ergebnisse 3.1. Zytogenetische Analyse des Karyotyps In den Abbildungen 6a und b ist der unbalancierte Karyotyp des Patienten dargestellt Man kann keinerlei numerische Aberration feststellen. In beiden Darstellungstechniken (QFQ und GTG) sieht man aber eine auffallende Veränderung bei einem der beiden Chromosomen 3. Das mutierte Chromosom ist eindeutig länger als das homologe Chromosom 3. Kein anderes Chromosomenpaar weist eine korrespondierende oder eine andere strukturelle Aberrationen auf. Man kann also von einer Duplikation ausgehen (Karyotyp 46 XY, 3q+). Das Bandenmuster der beiden Chromosomen 3 ist im gesamten kurzen Arm sowie in den langen Armen gleich - fast bis einschließlich Bande 3q19. Dann folgt ein unklares Muster im mutierten Chromosom bis kurz vor dem distalen Bereich. Ab Bande 3q28 stimmen die Muster der homologen Chromosomen wieder überein. Ob die duplizierte Region aus Chromosom 3 selbst oder aus einem der anderen Chromosomen stammt und ob es eine direkte oder invertierte Duplikation ist, ließ sich mit klassisch zytogenetischer Methodik zunächst nicht eindeutig klären. 33