For in-vitro diagnostic use. Product Code: FS015._ RAT LIVER IFA SUBSTRATE SLIDES 8 METHODOLOGY. 8.1 Materials provided FS015.1, FS015.

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1 8 METHODOLOGY RAT LIVER IFA SUBSTRATE SLIDES For in-vitro diagnostic use Product Code: FS015._ Product manufactured by: The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. Telephone: +44 (0) Fax: +44 (0) FDA (USA) Information Analyte ID Codes AMA: 0439 ANA: 0441 Complexity Cat: High 1 INTENDED USE This product is intended for use in the screening and titration of circulating autoantibodies in human serum as an aid in the diagnosis and treatment of various autoimmune diseases. The two major autoantibodies detected are antinuclear antibodies (ANA) and antimitochondrial antibodies (AMA). 2 SUMMARY AND EXPLANATION Indirect immunofluorescence is the reference method for screening and titrating circulating autoantibodies in human serum. Animal tissue sections, e.g. from rat, are generally preferred over other commonly-used substrates including human tissue sections and cell preparations; this is primarily due to the lack of interference from HLA and/or other blood group antibodies. Particular autoantibodies are associated with a number of different diseases. ANA almost always occur with systemic lupus erythematosus (SLE) but are also commonly found in patients with connective tissue and rheumatoid diseases. AMA are frequently present in primary biliary cirrhosis but may also be detected in patients with other liver diseases. A more detailed description of which autoantibodies are associated with which diseases is given in section 9 (ref. 1-7). 3 PRINCIPLE An indirect immunofluorescence technique is utilised where patient samples and appropriate controls are incubated with the substrate slides. The unreacted antibodies are washed off and an appropriate fluorescent labelled conjugate is applied. Unbound conjugate is washed off, and slides are viewed with a fluorescence microscope. Positive samples produce apple-green fluorescence which corresponds to areas of the section where autoantibody has bound. 4 REAGENTS Rat liver sections on 5- or 10-well slides individually wrapped in a foil pouch containing a desiccant. 5 CAUTION Proper handling and disposal methods should be established for all potentially infective samples tested with this product; only personnel adequately trained in such methods should be permitted to perform the procedures. 6 STORAGE AND STABILITY Unopened slides should be stored at 2-8 C and can be used until the given expiry date. DO NOT FREEZE. Once slides are removed from a foil bag, they should be used immediately. 7 SPECIMEN COLLECTION Blood samples should be collected by venepuncture, allowed to clot naturally and the serum separated as soon as possible to prevent haemolysis. The serum may be stored at 2-8 C for up to 7 days prior to assay (ref. 8), or for prolonged storage, aliquoted and stored at -20 C or below. DO NOT freeze and thaw sera more than once. Avoid using lipaemic, haemolysed or microbially contaminated sera as decreased titres or unclear staining patterns may occur. 8.1 Materials provided FS015.1, FS x Rat Liver Slide - (5-well) or 25 x Rat Liver Slide - (10-well) respectively x instruction leaflet. 8.2 Additional materials required PBS for sample diluent and washes Container for PBS buffer Micropipettes and disposable tips to apply patient samples Humid chamber for incubation steps (e.g. Magnetic Staining Chamber, Code BD010) Fluorescence microscope with 495nm exciter filter and 515nm barrier filter Plastic squeeze bottle for initial wash in PBS Additional components may be obtained from The Binding Site: PBS (CON 3.3), negative control (CON 92), homogenous ANA positive control (FA105), mitochondrial positive control (FA128), anti-human IgG (H+L) AFF FITC (FA003), 1% Evans Blue (CON 93) and Mounting medium (CON 195). 8.3 Test procedure Quality control Positive and negative controls should be used every time samples are tested Mounting medium: Remove the mounting medium from the fridge to allow it to reach room temperature (18-28 C) before it is needed Dilute PBS concentrate. Dilute PBS concentrate with distilled water (1 part PBS concentrate +19 parts distilled water) and mix. The PBS is used for diluting patient samples and as a wash buffer Dilute patient samples. Screening: Dilute patient samples 1/20 by adding 10μL of serum to 190μL of PBS buffer. Titration: Make serial dilutions of positive screened samples with PBS buffer (e.g. 1/20, 1/40, 1/80 and 1/160 etc.). For example: Take 100μL of the 1/20 dilution, mix with 100μL PBS to give a 1/40 dilution (repeat for further dilutions) Substrate slides. Allow substrate slide(s) to reach room temperature (18-28 C) prior to removal from pouch(es). Label slides appropriately, place in the humid chamber and add positive and negative controls to appropriate wells. Add μL of diluted patient samples to the remaining wells Slide incubation. Incubate slides for 30 minutes in a humid chamber at room temperature (18-28 C) PBS wash. Remove slides from humid chamber and rinse briefly with PBS squeeze bottle. Do not squirt directly on to the wells. Place slides in a rack and immerse in PBS and agitate or stir for 5-10 minutes Addition of fluorescent conjugate. Shake off excess PBS and blot around wells. Return slides to humid chamber and immediately cover each well with a drop of appropriately diluted fluorescent conjugate. DO NOT LEAVE WELLS UNCOVERED FOR LONGER THAN 15 SECONDS. Drying out of the substrate seriously affects the results Slide incubation. Incubate slides for 30 minutes in humid chamber at room temperature (18-28 C), in the dark PBS wash. Wash again as described in step OPTIONAL COUNTERSTAIN. Add 2-3 drops of 1% Evans Blue per 100mL of PBS prior to slide immersion Mounting with coverslip. Remove one slide at a time from PBS wash. Quickly dry around the wells and add a drop of mounting medium to each well. Carefully lower the slide onto the coverslip, avoiding air bubbles but, if present, do not attempt to remove. Wipe excess medium from around edge of coverslip. Insert code: CIN020, Version: 1 st April 2007, Page 1 of 6

2 View slides under fluorescence microscope. Slides may be stored for up to 3 days at 2-8 C, in the dark, without significant loss of fluorescence. 9 RESULTS 11 Normals: EXPECTED VALUES AND SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS 9.1 Quality control A serum sample containing ANAs should give a bright apple-green staining pattern in cell nuclei. The negative control should show dull green staining in all sections, with no discernible fluorescence. If the controls do not appear as described, the test is invalid and should be repeated. 9.2 Interpretation of results Negative results. These are seen as dull green staining with no discernible fluorescence. Suspected weak reactions should be repeated at a higher dilution (e.g. 1/40). If the repeated result appears the same as the original, the test is regarded as negative. Positive results. These are seen as significant fluorescence in specific tissue areas giving one of the following patterns: Antinuclear antibodies (ANA) ANA stain the nuclei of liver cells. Almost all SLE patients have ANA in the serum, but ANA can also be found in various connective tissue diseases including rheumatoid arthritis. ANA can also occur with chronic active hepatitis and primary biliary cirrhosis and in response to certain drug treatments. Additional information can be obtained by interpreting the ANA nuclear patterns obtained (see below). It is recommended that all positive ANA samples are titred to endpoint to ensure that possible mixed reactions are detected that may otherwise have been missed. Further analysis of such samples for autoantibodies to double stranded DNA and extractable nuclear antigens is also advised. Pattern Common antigens Disease association involved Homogeneous ds DNA, histones SLE Rheumatoid arthritis (RA) Mixed connective tissue disease Drug induced lupus Peripheral Native/ds DNA SLE (Rim) Speckled Extractable nuclear antigens, Ribonucleoprotein, Scl-70, SSB Scleroderma Sjogren s syndrome Mixed connective tissue disease SLE Nucleolar 4-6S RNA Scleroderma Sjogren s syndrome SLE, RA and progressive systemic sclerosis Antimitochondrial antibodies (AMA) AMA stain the hepatic cell cytoplasm in the liver. They are strongly associated with primary biliary cirrhosis, but can also occur with other liver diseases. NB: Each laboratory should establish at which point a positive result is considered clinically significant. 10 LIMITATIONS OF PROCEDURE 10.1 The light source, filters and optics of different makes of fluorescence microscopes will influence the sensitivity of the assay. The performance of the microscope is significantly influenced by correct maintenance especially centring of the mercury vapour lamp and changing of the lamp after the recommended period of time Staining patterns often change as a sample is titred out to end point. This is usually due to the presence of more than one autoantibody, especially for ANAs Autoantibodies can be activated or induced by a wide range of drugs including oral contraceptives and antibiotics. Abnormals: Antibody Occurrence percentage Reference ANA 0-2% 2 AMA 0-8% 7 Antibody Clinical diagnosis Occurrence percentage Reference ANA SLE 99% 4 Mixed connective tissue disease 90% 3 Other autoimmune 15-50% 3, 5 diseases (RA, scleroderma, Sjogren s syndrome, dermatomyositis AMA Primary biliary cirrhosis >95% 3 12 COMPARISON STUDY A comparison study was performed on 116 clinical samples using The Binding Site s Rat Liver Kit and a commercially available reference method. All 116 samples tested gave identical results by the two methods. For the patterns described in section 9.2, relative sensitivity, specificity, and agreement were all 100%. 13 REFERENCES 1. Tan E. M. (1989). Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, Doniach D. et al (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic (lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical implications. Clin. Exp. Imm. 1, Wallington T. B. & Gooi H. C. (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed Gooi, H C & Chappel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. pp Cavallaro J. J. et al (1976). Immunofluorescent detection of autoimmune diseases, Immunology Series No. 7. CDC, Atlanta, GA. 5. Seah P. P. et al (1971). Antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis herpetiformus and adult coeliac disease. Lancet 1, Seah P. P. et al (1973). Antireticulin antibody: Incidence and diagnostic significance. Gut 14, Goudie R. B. et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary cirrhosis. J. Clin. Path. 19, Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3 rd Edition) Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield SUMMARY OF PROCEDURE 14.1 Equilibrate mounting medium to room temperature Dilute PBS with distilled water Dilute patient sera 1/20 with PBS Equilibrate substrate slides to room temperature (18-28 C) Apply 50μL positive and negative controls and diluted patient sera to appropriate wells Incubate in a humid chamber for 30 minutes Wash for 5-10 minutes in PBS Blot around each well and immediately cover each well with a drop of conjugate Incubate as in step Wash as in step Mount View slide under fluorescence microscope Due to the short distance between wells on the 10 well slides it is possible for cross contamination of samples and controls to occur. Care must be taken, especially at the washing stages, to ensure that this does not happen Suitability for use with other manufacturers' IFA reagents has not been assessed but use with such reagents should not necessarily be excluded This test alone should not be considered diagnostic. All other factors including the clinical history of the patients and other serological or biopsy results must also be taken into account. Insert code: CIN020, Version: 1 st April 2007, Page 2 of 6

3 RATTEN-LEBER OBJEKTTRÄGER FÜR DIE IFT Zur in-vitro Diagnostik Bestell-Nr.: FS015._ In England hergestellt von: The Binding Site Ltd, P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A D Schwetzingen, Deutschland Telefon: +49 (0) Fax: +49 (0) office@bindingsite.de 8 TESTDURCHFÜHRUNG 8.1 Gelieferte Materialien FS015.1, FS x Rat Liver Slide (5-well) oder 25 x Rat Liver Slide (10-well) (Objektträger mit Ratte-Leber-Gefrierschnitten, 10 x 5 Auftragsstellen - FS015.1, 25 x 10 Auftragsstellen - FS015.2) x Arbeitsanleitung 8.2 Benötigte nicht im Kit enthaltene Materialien PBS-Pufffer zum Verdünnen der Patientenseren und zum Waschen Gefäß für PBS-Puffer Mikropipetten und Einmal-Spitzen zum Pipettieren von Patientenseren Feuchte Kammer für die Inkubationen (z.b. Magnetische Färbekammer, Bestell-Nr.: BD010). 1 VERWENDUNGSZWECK Diese Objektträger dienen zum Nachweis und zur Titration von zirkulierenden Autoantikörpern im Serum, zur Unterstützung der Diagnose und Therapie von verschiedenen Autoimmun-Erkrankungen. Die auf diesem Gewebe am häufigsten nachgewiesenen Autoantikörper sind antinukleäre (ANA) und antimitochondriale Antikörper (AMA). 2 EINFÜHRUNG Die indirekte Immunfluoreszenz ist die Referenzmethode für das Screening und die Titration von zirkulierenden Autoantikörpern im humanem Serum. Tierische Gewebeschnitte, wie z. B. von der Ratte, werden allgemein gegenüber anderen Gewebeschnitten einschließlich menschlichem Gewebe oder Zellkulturen bevorzugt, da bei ihnen keine Störungen durch HLA und/oder anderen Blutgruppen-Antikörpern auftreten. Einzelne Autoantikörper sind mit einer Anzahl von verschiedenen Erkrankungen assoziiert. ANAs werden in der Regel bei systemischem Lupus erythematodes (SLE), aber auch bei Patienten mit Bindegewebs- und rheumatischen Erkrankungen gefunden. AMAs werden häufig bei Patienten mit primärer biliärer Zirrhose gefunden, sie können aber auch bei anderen Lebererkrankungen auftreten. Eine detaillierte Auflistung, welche Autoantikörper mit welcher Krankheit assoziiert werden, ist in Abschnitt 9 aufgelistet (Ref. 1-7). 3 TESTPRINZIP Der Test beruht auf der indirekten Immunfluoreszenz-Technik. Die Patientenseren und entsprechenden Kontrollen werden auf den Gefrierschnitten inkubiert. In einem Waschschritt werden die nicht reagierenden Antikörper entfernt und dann das Fluoreszein-Konjugat zugegeben. Überschüssiges Konjugat wird durch Waschen entfernt. Die Untersuchung der Objektträger erfolgt unter dem Fluoreszenzmikroskop. Positive Proben zeigen in den Bereichen der Gefrierschnitte, in denen die Autoantikörper an entsprechende Strukturen gebunden haben, eine apfelgrüne Fluoreszenz. 4 REAGENZIEN Objektträger mit Ratten-Leber-Gefrierschnitte mit je 5 oder 10 Auftragsstellen. Die Objektträger sind einzeln in Folienbeutel, die ein Trockenmittel enthalten, verpackt. 5 WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN Die zu untersuchenden Patientenseren sollten als potentiell infektiös angesehen werden entsprechende Umgangs- und Entsorgungsmethoden beachten. Der Test sollte nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. 6 LAGERUNG UND STABILITÄT Ungeöffnete Objektträger bei 2-8 C lagern, sie sind so bis zum angegebenen Verfallsdatum verwendbar. NICHT EINFRIEREN! Ist der Folienbeutel eines Objektträgers einmal geöffnet, muss er sofort verwendet werden. 7 PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG Blutproben über Venenpunktur sammeln und bei Raumtemperatur gerinnen lassen. Das Serum so schnell wie möglich vom Gerinnsel abtrennen um eine Hämolyse zu vermeiden. Die Seren können bei 2-8 C bis zu 7 Tage vor dem Test gelagert werden (Ref. 8). Für eine längere Lagerung empfiehlt es sich, die Seren aliquotiert bei mindestens -20 C einzufrieren. Serum nur einmal einfrieren und auftauen. Keine stark lipämische, hämolytische oder mikrobiell verunreinigte Seren verwenden, da dadurch erniedrigte Titer oder unklare Muster auftreten können. Insert code: CIN020, Version: 1 st April 2007, Page 3 of Fluoreszenzmikroskop mit einem 495nm Anregungsfilter und 515nm Barrierefilter Spritzflasche für 1. Waschschritt Zusätzlich benötigte Komponenten können bei The Binding Site bestellt werden: PBS-Puffer (Bestell-Nr.: CON3.3), Negativkontrolle (Bestell-Nr.: CON92), ANA-homogen Positivkontrolle (Bestell-Nr.: FA105), Mitochondriale Positivkontrolle (Bestell-Nr.: FA128), anti-hu- IgG-(H+L)-FITC-Konjugat (Bestell-Nr.: FA003), 1%ige Evans-Blue- Lösung (Bestell-Nr.: CON93) und Eindeckmedium (CON195). 8.3 Testdurchführung Qualitätskontrolle Die Negativ- und Positivkontrollen sollten bei jedem Testansatz mitgeführt werden Eindeckmedium: Das Eindeckmedium aus dem Kühlschrank nehmen und vor Gebrauch auf Raumtemperatur (18-28 C) erwärmen lassen PBS Konzentrat verdünnen. PBS Konzentrat mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1/20 (1 Teil PBS Konzentrat + 19 Teile destilliertes Wasser) verdünnen und mischen. Der gebrauchsfertige PBS-Puffer wird zum Verdünnen der Patientenseren und als Waschpuffer verwendet Patientenseren verdünnen Screening: Patientenseren im Verhältnis 1/20 verdünnen. (z.b. 10μL Serum + 190μL PBS-Puffer). Titration: Von im Screening positiven Proben eine serielle Verdünnungsreihe erstellen (z. B. 1/20; 1/40; 1/80; 1/160; 1/320; 1/640 usw.). z. B. 100μL eines 1/20 verdünnten Patientenserums mit 100μL PBS- Puffer versetzen - ergibt eine 1/40 Verdünnung usw Objektträger vorbereiten. Die Objektträger auf Raumtemperatur (18-28 C) erwärmen lassen. Folienbeutel erst direkt vor dem Gebrauch öffnen! Die Objektträger aus dem Folienbeutel nehmen, entsprechend beschriften und in eine feuchte Kammer geben. Positiv- und Negativkontrollen und je µL der verdünnten Patientenseren auf die jeweiligen Auftragsstellen pipettieren Inkubation der Objektträger. Die Objektträger 30 min. bei Raumtemperatur (18-28 C) in der feuchten Kammer inkubieren Waschen mit PBS-Puffer. Die Objektträger aus der feuchten Kammer nehmen und rasch mit PBS-Puffer (Spritzflasche) waschen, dabei nicht direkt in die Auftragsstellen spritzen. Die Objektträger in eine Halterung geben und in ein PBS-Pufferbad eintauchen. Die Objektträger 5-10 min. im PBS-Puffer belassen, dabei rühren oder leicht schütteln Zugabe von Fluoreszenz-Konjugat. Überschüssigen PBS-Puffer abschütteln und die Objektträger um die Auftragsstellen herum abtrocknen. Die Objektträger wieder in die feuchte Kammer legen und sofort, d. h. innerhalb von 15 sec, auf jede Auftragsstelle einen Tropfen Fluoreszenz-Konjugat, das den Angaben entsprechend verdünnt wurde, geben. Das Austrocknen des Substrats kann das Ergebnis beträchtlich beeinrächtigen Inkubation der Objektträger. Die Objektträger 30 min. bei Raumtemperatur (18-28 C) in der feuchten Kammer im Dunkeln inkubieren Waschen mit PBS-Puffer. Erneut waschen wie unter Punkt beschrieben. Wenn eine Gegenfärbung gewünscht wird, können bei diesem Waschschritt 2-3 Tropfen einer 1%igen Evans-Blue-Lösung pro 100mL PBS-Puffer zugegeben werden.

4 Deckgläschen aufsetzen. Jeweils nur einen Objektträger aus dem PBS-Pufferbad nehmen. Um die Auftragsstellen herum rasch abtrocknen und jeweils 1 Tropfen Eindeckmedium auf jede Auftragstelle geben. Das Deckgläschen sorgfältig auf den Objektträger legen, wobei Luftbläschen zu vemeiden sind. Eventuell vorhandene Luftblasen nicht versuchen zu entfernen. Überschüssiges Eindeckmedium mit Filterpapier entfernen Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop auswerten. Sie können im Dunkeln bei 2-8 C bis zu drei Tage ohne signifikaten Fluoreszenzverlust aufbewahrt werden. 9 ERGEBNISSE 9.1 Qualitätskontrolle 10.4 Aufgrund der nur kleinen Abstände zwischen den Auftragsstellen bei den Objektträgern mit 10 Auftragsstellen besteht eine gewisse Verschleppungsgefahr. Deshalb muss besonders sorgfältig gearbeitet werden, speziell beim Waschen, um dies zu vermeiden Die Verwendung dieser Produkte mit IFT-Reagenzien anderer Hersteller wurde nicht überprüft, ist aber nicht zwangsläufig ausgeschlossen Der Test allein ist nicht als diagnostischer Beweis ausreichend. Alle Ergebnisse sollten immer nur im Zusammenhang mit anderen Laborbefunden (Serologie, Biopsie) und dem klinischen Bild des Patienten betrachtet werden. 11 ERWARTETE ERGEBNISSE UND LEISTUNGSDATEN Patientenseren, die ANA enthalten, erzeugen eine kräftige, apfelgrüne, homogene Fluoreszenzfärbung in den Zellkernen. Die Negativkontrolle zeigt eine matt-grüne Anfärbung des Gewebes ohne erkennbare Fluoreszenz. Erscheint eine der Kontrollen nicht wie beschrieben, sollte der Testansatz verworfen und ein neuer Ansatz gemacht werden. Gesunde: Autoantikörper Häufigkeit in % Literatur ANA AMA Interpretation der Ergebnisse Negativ: Bei einem negativen Ergebnis zeigen alle Teile des Gewebes eine mattgrüne Färbung ohne erkennbare Fluoreszenz. Proben, die lediglich eine sehr schwache Fluoreszenz zeigen, sollten erneut mit einer Verdünnung von 1/40 getestet werden. Ist das Ergebnis wie zuvor, so wird die Probe als negativ angesehen. Positiv: Bei einer positiven Probe wird eine signifikante Fluoreszenz in spezifischen Gewebe-Strukturen gefunden. Folgende Fluoreszenz-Muster können auftreten: Antinukleäre Antikörper (ANA) Durch ANA werden die Zellkerne der Leberzellen angefärbt. Bei fast allen SLE- Patienten werden ANA im Serum gefunden, aber sie können ebenfalls bei verschiedenen Erkrankungen des Bindegewebes, inkl. Rheumatischer Arthritis, auftreten. ANA können auch bei der chronischen aktiven Hepatitis und primären biliären Zirrhosen und als Folge von verschiedenen Medikamenten auftreten. Zusätzliche Informationen können durch die Interpretation des ANA-Musters gewonnen werden (siehe Tabelle unten). Es wird empfohlen, dass alle positiven ANA-Seren bis zum Endpunkt austitriert werden, um sicherzustellen, dass keine gemischten Muster übersehen werden. Weiterhin sollten diese Seren auch auf Autoantikörper gegen Doppelstrang-DNA (dsdna) und extrahierbare nukleäre Antigene (ENA) untersucht werden. Muster Beteiligte Antigene Assoziierte Erkrankungen Homogen dsdna, Histone SLE Rheumatische Arthritis (RA) Mischkollagenosen Medikamenten-induzierter Lupus Peripher Native / dsdna SLE Gesprenkelt Extrahierbare nukleoläre Antigene (ENA), Ribonukleoproteine, Scl-70, SSB Sklerodermie Sjögren s Syndrom Mischkollagenosen SLE Nukleolär 4-6S RNA Sklerodermie Sjögren s Syndrom SLE, RA und progressive systemische Sklerodermie Anti-Mitochondriale Antikörper (AMA) AMA führen zur Anfärbung des Zytoplasmas der hepatischen Leberzellen. Sie sind in der Regel mit der primären biliären Zirrhose assoziiert, können aber auch bei anderen Leber-Erkrankungen auftreten. Hinweis: Jedes Labor sollte eigene Richtlinien erstellen und festlegen wann ein positives Ergebnis klinisch relevant ist. 10 GRENZEN DES TESTS 10.1 Die im Fluoreszenzmikroskop verwendete Lichtquelle, Filter und Optik beeinflussen die Sensitivität des Tests. Die Qualität des Mikroskops wird maßgeblich durch die korrekte Wartung, speziell durch Zentrieren der Quecksilberlampe und deren Austausch nach der empfohlenen Brenndauer, beeinflusst Bei der Titration einer Probe bis zum Endpunkt kann sich das Fluoreszenzmuster ändern. Diese Änderung wird durch das Vorkommen von mehreren Autoantikörpern (speziell bei ANA) verursacht. Kranke: Antikörper Diagnose Häufigkeit in Literatur % ANA SLE 99 4 Mischkollagenosen 90 3 Andere Autoimmun-Erkrankungen , 5 (z.b. RA, Sklerodermie, Sjögren s Syndrom, Dermatomyositis) AMA Primäre biliäre Zirrhose > VERGLEICHSSTUDIE In einer Vergleichsstudie wurde dieser Kit mit einer kommerziell erhältlichen Referenzmethode verglichen. Es wurden 116 Patientenseren getestet und folgende Ergebnisse erhalten: Mit beiden Methoden wurden für alle 116 getesten Seren identische Ergebnisse erhalten. Es wurde für die in Abschnitt 9.2 beschriebenen Muster eine relative Sensitivität, Spezifität und Übereinstimmung von 100% gefunden. 13 REFERENZEN 1. E. M. Tan: Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, (1989). 2. Doniach et al: Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic (lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical implications. Clin. Exp. Imm. 1, (1986). 3. T. B. Wallington; H. C. Gooi: Clinical Approach. A practical approach. Eds. H. C. Gooi & H. Chapel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK (1990), Seite J. J. Cavallaro et al: Immunofluorescent detection of autoimmune diseases. Immunology Series No. 7, CDC, Atlanta, GA. 5. P. P. Seah et al: Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatits herpetiformus and adult coeliac disease. Lancet 1, (1971). 6. P. P. Seah et al: Antireticulin antibody: Incidence and diagnostic significance. Gut 14, (1973). 7. R. B. Goudie et al: Serological and histological diagnosis of primary biliary cirrhosis. J. Clin. Path. 19, (1966). 8. Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3 rd Edition) Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield KURZARBEITSANLEITUNG 14.1 Eindeckmedium auf Raumtemperatur erwärmen lassen PBS-Pufferkonzentrat mit destilliertem Wasser verdünnen Patientenseren 1/20 mit PBS-Puffer verdünnen Objektträger auf Raumtemperatur (18-28 C) erwärmen lassen Je 50µL Kontrollen und Patientenseren auftragen Minuten bei Raumtemperatur (18-28 C) in einer feuchten Kammer inkubieren Objektträger 5-10 min. mit PBS-Puffer waschen Objektträger aus dem PBS-Bad nehmen, um die Auftragsstellen herum gut abtrocknen, wieder in die feuchte Kammer legen und sofort FITC-Konjugat auftropfen Minuten bei Raumtemperatur (abdunkeln) inkubieren Wie unter Punkt 14.7 beschrieben waschen Objektträger Eindecken und Deckgläschen aufsetzen Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop auswerten Es ist zu beachten, dass Autoantikörper durch verschiedene Medikamente, einschließlich Antibiotika und Orale Kontrazeptiva, aktiviert oder induziert werden können. Insert code: CIN020, Version: 1 st April 2007, Page 4 of 6

5 8 PROCEDURE LAMES D IMMUNOFLUORESCENCE DE FOIE DE RAT Pour usage diagnostic in vitro Code Produit: FS015._ Produit fabriqué en Angleterre par la société : The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK Distribués en France par la société : The Binding Site, 14 rue des Glairaux, BP226, Saint-Egrève Cedex. Téléphone : Fax : Binding.Site@wanadoo.fr 1 INDICATIONS Ces lames sont destinées au dépistage et à la titration des autoanticorps circulants dans le sérum humain. Elles apportent une aide au diagnostic et au traitement de plusieurs maladies autoimmunes. Les deux principaux autoanticorps détectés sont les anti-nucléaires (ANA) et les anti-mitochondries (AMA). 2 PRESENTATION GENERALE L immunofluorescence indirecte est la méthode de choix pour le dépistage et le titrage des autoanticorps circulants dans le sérum. Les coupes de tissu d origine animale, comme le rat, sont généralement préférées aux autres substrats habituellement utilisés comme les tissus humains et les préparations de cellules ; ceci est dû à l absence d interférence du système HLA et/ou des autres anticorps dirigés contre les groupes sanguins. Des autoanticorps particuliers sont associés à différentes maladies. Les ANA sont presque toujours présents dans le lupus érythémateux disséminé (LED) mais sont aussi communément trouvés chez des patients atteints de maladies rhumatoïdes et de connectivites. Les AMA sont fréquemment retrouvés dans les cirrhoses biliaires primitives mais peuvent aussi être détectés chez des patients atteints d autres maladies du foie. Une description plus détaillée de l association des autoanticorps avec certaines maladies est donnée dans la section 9 (réfs 1-7). 3 PRINCIPE Ces lames font appel à une technique d immunofluorescence indirecte. Les sérums de patients et les contrôles appropriés sont incubés sur les coupes de tissus. Les anticorps non spécifiques sont éliminés par lavage. Un conjugué approprié marqué à la fluorescéine est appliqué. Le conjugué non lié est éliminé par lavage et la lecture des lames s effectue à l aide d un microscope à fluorescence. La positivité des échantillons se traduit par un marquage fluorescent vert pomme de certaines régions de la coupe de tissu sur lesquelles sont accrochés les autoanticorps. 4 REACTIFS Lames de 5 ou 10 puits recouvertes de foie de rat emballées individuellement dans un sachet aluminium contenant un dessiccateur. 5 PRECAUTIONS Tous les échantillons doivent donc être considérés comme potentiellement infectieux et doivent être manipulés avec précaution par un personnel formé. 6 STOCKAGE ET STABILITE Les lames non ouvertes doivent être stockées à 2-8 C et peuvent être utilisées jusqu à la date de péremption. NE PAS CONGELER. Lorsque les lames sont sorties de leur étui, les utiliser immédiatement. 7 ECHANTILLONS Utiliser du sérum. Laisser le sang coaguler à température ambiante, puis séparer le sérum du caillot dès que possible pour éviter l hémolyse. Les sérums peuvent être conservés à 2-8 C pendant 7 jours avant les tests (réf. 8) ou aliquotés et congelés à -20 C minimum pour une conservation plus longue. Ne pas congeler et décongeler plus d une fois les échantillons. Il est recommandé d utiliser des sérums non lipidiques, non hémolysés et non contaminés par des bactéries, ce qui induirait des titres faibles ou des aspects de marquage non clairs. 8.1 Matériel fourni FS015.1, FS x Rat Liver Slide (5-well) ou 25 x Rat Liver Slide (10-well) (10 lames de 5 puits (FS015.1), 25 lames de 10 puits (FS015.2) de foie de rat respectivement fiche technique 8.2 Matériel nécessaire et non fourni Tampon PBS comme diluant des échantillons et pour les lavages Un flacon pour le tampon PBS Micropipettes et cônes nécessaires au dépôt des échantillons Chambre humide pour les étapes d incubation (ex : Chambre de marquage magnétique The Binding Site : réf. BD010) Microscope à fluorescence avec un filtre d excitation à 495nm et un filtre d émission à 515nm Pissette pour les lavages en PBS Il est nécessaire d avoir par ailleurs : PBS (CON3.3), contrôle négatif (CON92), contrôle positif ANA-homogène (FA105), contrôle positif mitochondrie (FA128), conjugué FITC anti-igg (H+L) humaines (FA003), bleu d Evans à 1% (CON93) et milieu de montage (CON195). 8.3 Procédure Contrôle de qualité Un contrôle positif et un contrôle négatif doivent être déposés lors de chaque série Milieu de montage : Sortir le milieu de montage du réfrigérateur pour qu il atteigne la température ambiante (18-28 C) avant d être utilisé Diluer le PBS concentré. Diluer le PBS dans de l eau distillée (1 volume de PBS pour 19 volumes d eau) et mélanger. Le PBS est utilisé pour diluer les échantillons et comme tampon de lavage Dilution des échantillons. Dépistage : Diluer les échantillons au 1/20 (mettre 10μL de sérum dans 190μL de PBS dilué). Titration : Faire une gamme de dilution du sérum en PBS (1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320). Par exemple : Prendre 100µL de la dilution au 1/20 et ajouter 100µL de PBS pour obtenir une dilution au 1/40. Procéder ainsi pour les dilutions en cascade Lames. Les ramener à température ambiante (18-28 C) avant de les sortir de leur emballage. Les marquer puis les déposer dans la chambre humide avant le dépôt des contrôles positif et négatif (1 goutte) dans les puits appropriés. Déposer μL d échantillon dilué dans les autres puits Incubation des lames. Incuber les lames pendant 30 minutes en chambre humide à température ambiante (18-28 C) Lavage. Sortir les lames de la chambre humide et les rincer rapidement à l aide d une pissette contenant le tampon PBS. Ne pas diriger le jet directement sur les puits. Mettre les lames sur un portoir et les immerger en PBS sous agitation lente pendant 5 à 10 minutes Addition du conjugué fluorescent. Eliminer l excès de PBS et sécher le pourtour des puits à l aide des buvards fournis. Remettre les lames en chambre humide et couvrir immédiatement chaque puits avec une goutte de conjugué fluorescent dilué. NE PAS LAISSER LES PUITS A L AIR PENDANT PLUS DE 15 SECONDES. Le séchage des puits affecte sérieusement les résultats Incubation des lames. Incuber les lames pendant 30 minutes en chambre humide à température ambiante (18-28 C). Recouvrir la chambre humide de papier pour éviter l exposition à la lumière Lavage. Procéder comme à la section Contre-coloration possible en ajoutant 2 à 3 gouttes de bleu d Evans à 1% par 100mL de PBS avant l immersion des lames Montage des lames. Sortir les lames une à une du PBS. Sécher rapidement le pourtour des puits puis déposer une goutte de milieu de montage dans chaque puits. Déposer la lamelle en évitant la formation de bulles d air. Ne pas essayer d éliminer les bulles d air éventuellement apparues. Essuyer l excès de milieu de montage. 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6 Lecture des lames. La lecture se fait à l aide d un microscope à fluorescence. Les lames peuvent être stockées 3 jours à 2-8 C à l obscurité sans perte significative de fluorescence. 9 RESULTATS 9.1 Contrôle de qualité Le contrôle positif du kit doit donner une fluorescence verte pomme homogène du noyau. Le contrôle négatif peut présenter un très léger bruit de fond vert pâle sur toutes les coupes de tissu, mais en aucun cas une fluorescence franche. Si les puits de contrôle ne correspondent pas à la description ci-dessus, le test doit être considéré comme invalide et il est conseillé de le répéter. 9.2 Interprétation des résultats Négatif. Le contrôle négatif peut présenter un très léger bruit de fond vert pâle sur toutes les coupes de tissu, mais en aucun cas une fluorescence franche. Les réactions faibles doivent être répétées mais à une concentration plus élevée (ex : 1/40). Si le nouveau test paraît identique au précédent, il est considéré comme négatif. Positif. Un échantillon est considéré positif lorsqu une fluorescence significative apparaît dans les organelles de régions spécifiques des tissus donnant un des aspects suivants : Anticorps anti-nucléaires (ANA) Les ANA reconnaissent les noyaux des cellules du foie. Presque tous les patients atteints de LED ont des ANA dans leur sérum mais les ANA peuvent aussi être trouvés dans différentes connectivites comprenant l arthrite rheumatoïde. Les ANA peuvent être détectés également chez des patients atteints d hépatite chronique en phase active et de cirrhose biliaire primitive ou en réponse à certains médicaments. Des informations supplémentaires peuvent être obtenues par l interprétation des aspects nucléaires des ANA (voir au-dessous). Sur tous les échantillons ANA positifs, il est recommandé de faire une titration en point final, ce qui permet de mettre en évidence d autres autoanticorps qui auraient pu ne pas être décelés. Il est également conseillé de rechercher les autoanticorps contre l ADN double brin et les antigènes nucléaires solubles. Aspect Antigène communément Maladie associée impliqué Homogène ADN double brin, histones LED Arthrite rhumatoïde (RA) Connectivites Lupus induit par des médicaments Périphérique ADN double brin, natif LED (Rim) Moucheté Antigènes nucléaires solubles, Protéines ribonucléiques, Scl-70, SSB Sclérodermies Syndrome de Sjögren, Connectivites LED Nucléolaire 4-6S ARN Sclérodermie Syndrome de Sjögren LED, RA et sclérose systémique progressive Anticorps anti-mitochondries (AMA) Le cytoplasme des cellules hépatiques est reconnu par les AMA. Les AMA sont fortement associés à la cirrhose biliaire primitive mais peuvent également apparaître dans d autres maladies du foie. Note : Chaque laboratoire doit établir son propre seuil de positivité par rapport à la clinique. 10 LIMITES DE LA PROCEDURE 10.1 La qualité des filtres, des optiques et de la source lumineuse peut influencer la sensibilité du test. Les performances du microscope sont dépendantes de la maintenance et en particulier du centrage de la lampe à vapeur de mercure ainsi que de son changement après la période recommandée Les aspects de marquage peuvent changer lorsqu un échantillon est titré jusqu à son point final. Ceci est dû à la présence de plusieurs autoanticorps, notamment pour les ANA Les autoanticorps peuvent être activés ou induits par un grand nombre de médicaments tels que contraceptifs oraux ou antibiotiques Du fait de la courte distance entre les puits sur les lames de 10 puits, il est possible d observer des contaminations. Afin d éviter ceci, soigner surtout le lavage des puits Ces réactifs n ont pas été testés avec des réactifs d autres fabricants mais ceci ne doit pas être exclu Ce test seul ne permet pas de faire un diagnostic. D autres facteurs comme l histoire clinique, d autres tests sérologiques et les résultats de biopsies doivent être pris en considération. 11 VALEURS ATTENDUES ET PERFORMANCES Valeurs attendues Valeurs anormales Autoanticorps Pourcentage d apparition Référence ANA 0-2% 2 AMA 0-8% 7 Anticorps Diagnostic clinique Pourcentage Référence d apparition ANA LED 99% 4 Connectivites mixtes 90% 3 Autres maladies 15-50% 3, 5 autoimmunes (RA, sclérodermie, syndrome de Sjögren, dermatomyosite) AMA Cirrhose biliaire primitive >95% 3 12 ETUDE COMPARATIVE Une étude comparative a été faite sur 116 échantillons cliniques en utilisant ce coffret et une méthode de référence commercialement disponible. Les 116 échantillons ont donné des résultats identiques par les deux méthodes. Pour les aspects décrits dans la section 9.2, la sensibilité, la spécificité et la concordance relatives étaient de 100%. 13 BIBLIOGRAPHIE 1. Tan, E. M. (1989). Antinuclear Antibodies : Diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, Doniach, D. et al (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic (lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical implications. Clin. Exp. Imm. 1, Wallington, T. B. & Gooi H. C. (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H. C. & Chappel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. pp Cavallaro, J. J. et al (1976). Immunofluorescent detection of autoimmune diseases, Immunology Series No. 7. CDC, Atlanta, GA. 5. Seah, P. P. et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis herpetiformus and adult coeliac disease. Lancet 1, Seah, P. P. et al (1973). Antireticulin antibody: Incidence and diagnostic significance. Gut 14, Goudie, R. B. et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary cirrhosis. J. Clin. Path. Lancet. 19, Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3 rd Edition) Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield RESUME 14.1 Ramener le milieu de montage à température ambiante Diluer le PBS dans de l eau distillée Diluer le sérum des patients au 1/20 en PBS Ramener les lames à température ambiante (18-28 C) Déposer 50µL de contrôle positif, contrôle négatif et de sérum dilué dans les puits appropriés Incuber 30 minutes en chambre humide Laver 5 à 10 minutes en PBS Sécher le pourtour des puits et déposer immédiatement une goutte de conjugué sur chaque puits Incuber comme en Laver comme en Monter les lames Observation sous microscope à fluorescence. Insert code: CIN020, Version: 1 st April 2007, Page 6 of 6