Kokultivierung humaner Präadipozyten und Endothelzellen zur Züchtung von kapillarisiertem, autologem Fettgewebe

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1 Aus der Abteilung Plastische und Handchirurgie (Ärztlicher Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. G.B. Stark) der Chirurgischen Universitätsklinik Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Kokultivierung humaner Präadipozyten und Endothelzellen zur Züchtung von kapillarisiertem, autologem Fettgewebe Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Vorgelegt von Matthias Müller aus Freiburg i. Br. Freiburg i. Br. 2005

2 Dekan: Prof. Dr. med. C. Peters 1. Gutachter: PD. Dr. med. J. Borges 2. Gutachter: PD. Dr. med. E. Stickeler Jahr der Promotion: 2005

3 I Meinen Eltern

4 I Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG Weichteilgewebedefekt Geschichte der Substitution von Weichteilgewebe in der Plastischen Chirurgie Aktuelle Therapien Kultivierung fettgewebeäquivalenten Gewebes Tissue Engineering Motivation Tissue Engineering Definition Makroskopischer und mikroskopischer Aufbau des Fettgewebes Anforderungen an fettgewebeäquivalentes Gewebe Aktueller Stand der Forschung Blutversorgung bioartifiziellen Gewebes Tissue Engineering dreidimensionaler Gewebe Das vaskuläre Endothel Angiogenese 11 2 FRAGESTELLUNG 15 3 MATERIAL UND METHODEN Versuchsdesign Kultivierung von Präadipozyten und HDMVECs Kotransplantation von Präadipozyten und HDMVECs Zellisolation und Kultivierung Isolation und Kultivierung von Präadipozyten Isolation und Kultivierung von HDMVECs Herstellung der Fibrinmatrix Migrationsversuche Proliferationsversuche In vivo-versuche Sphäroid-Herstellung PKH-Färbung Konditionierung von Medium Versuchsaufbau Arbeitstechniken Kultivierung von Präadipozyten und HDMVECs Kotransplantation von Präadipozyten und HDMVECs Evaluationstechniken Casy 1 Cell Counter VEGF-Immunoassay alamarblue -Assay Morphometrische Auswertung 31

5 II 3.9 Tierexperimentelle Techniken CAM Modell Histologische Techniken Hämatoxylin-Eosin-Färbung Immunhistochemie Photodokumentation 35 4 ERGEBNISSE Kultivierung von Präadipozyten und HDMVECs Zweidimensionale Kultivierung Verhalten in dreidimensionaler Fibrinmatrix Kotransplantation von Präadipozyten und HDMVECs Kotransplantation auf das CAM-Modell 42 5 DISKUSSION Wachstumsverhalten von HDMVECs und Präadipozyten Zweidimensionale Kultivierung VEGF-Sekretion Einfluss von Fibrinmatrix und Kokultivierung auf die Prolifertionskinetik von Präadipozyten und Endothelzellen Physiologische Mechanismen der Angiogenese Das parakrine Interaktionssystem von Präadipozyten und HDMVECs HDMVECs Präadipozyten Kokultivierung der richtige Ansatz für das Adipose Tissue Engineering? Einfluss von Präadipozyten auf das HDMVEC-Migrations-verhalten in Fibrin Endothelzell-Sphäroide in Fibrin Angiogene Wirkung von Präadipozyten Quantitativer Beitrag von VEGF und bfgf zur Angiogenese Sphäroide als Transplantationsform für HDMVECs Transplantation von Endothelzellen in Fibrinmatrix Erhöhte Konstruktstabilität durch geringe fibrinolytische Aktivität von Sphäroiden Beurteilung der Ergebnisse In vitro-versuche Transplantation von Endothelzell-Sphäroiden innovativ oder auch progressiv? Ausblick Technik der Mehrfachinjektion Kombination von in- und extrinsischen Gefäßsystemen Bedeutung der vorliegenden Ergebnisse für das Tissue Engineering von Fettgewebe und andere drei-dimensionale Konstrukte Steigerung der Effizienz durch frühzeitige Kapillarisierung kleiner Konstrukte Kapillarisierung als erster Schritt bei der Verpflanzung größerer Transplantate 57 6 ZUSAMMENFASSUNG 59 7 LITERATUR 60

6 III 8 DANKSAGUNG 68 9 CURRICULUM VITAE WISSENSCHAFTLICHE PUBLIKATIONEN UND PREISE 70

7 IV GLOSSAR DER VERWENDETEN ABKÜRZUNG bfgf basic fibroblast growth factor BSA Bovines Serum Albumin CAM Chorioallantoismembran CD 31 cluster of differentiation 31 EC Endothelzelle ECBM basales Endothelzellmedium ELISA enzyme-linked immuno sorbent assay FADH Flavinadenindinucleotid FCS fetal calf serum FGFR fibroblast growth factor receptor FMNH flavinmononucleotid HDMVEC human dermal microvascular endothelial cell ICAM-1 intercellular adhesion molecule 1 IT Inkubationstag NADH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat NCS neugeborenen Kälber Serum OD optische Dichte p0, 1, 2, 3... Passage 1, 2, 3... PBS Phosphatpuffer PDGF platelet-derived growth factor PLGA Poly-Laktid-Glykolsäure PLLA Poly-L-Lactatsäure TGF transforming growth factor ß TNF tumor necrose factor u-pa Urikinase-Typ Plasminogen-Aktivator u-par Urikinase-Typ Plasminogen-Aktivator-Rezeptor VCAM-1 vascular cellular adhesion molecule 1 VEGF vascular endothelial growth factor

8 1 1 Einleitung 1.1 Weichteilgewebedefekt... und wir krachten durch die Leitplanke... und das ist noch nicht das Schlimmste; das Grässlichste ist, dass mein Gesicht komplett verunstaltet ist, wie im Stück Das Phantom der Oper... ich bin ein Monster... jedes Mal, wenn ich in den Spiegel sehe, möchte ich sterben. * Mit diesen Worten erinnert sich der Protagonist des Filmes Abre los ojos von Alejandro Amenábar an die Folgen seines Verkehrunfalls. Die Therapie von Konturunregelmäßigkeiten und Volumendefiziten stellt eine Herausforderung für die Plastische Chirurgie dar. Der Leidensdruck der Patienten ist oft sehr hoch, denn entstellende Deformationen des Gesichtes, der Extremitäten oder der Brust der Frau stigmatisieren und erschweren die Knüpfung sozialer Kontakte und können zur gesellschaftlichen Isolation sowie zur professionellen und finanziellen Benachteiligung führen [31]. Die Ursachen solcher Deformationen sind mannigfaltig: Zu den erworbenen Krankheitsbildern zählen die posttraumatischen Weichteildefekte, der Zustand nach Resektion größerer Weichteilelemente zum Beispiel im Rahmen einer Mastektomie bei Mammakarzinom, die Lipodystrophie bei antiviraler Therapie einer HIV- Infektion sowie die idiopathische, fortschreitende Gesichtsatrophie, die sich durch eine Atrophie der Haut und des Fettgewebes im Trigeminusbereicht auszeichnet [17] [38]. Zum Formenkreis der kongenitalen Erkrankungen gehören zum Beispiel die Mamahypo- und aplasie, die sich bei letzterer im Rahmen des Polandsyndromes und des Amazonensydromes manifestiert [41]. 1.2 Geschichte der Substitution von Weichteilgewebe in der Plastischen Chirurgie Die Geschichte der Versuche und Studien zur autologen Fettgewebetransplantation lässt den großen Bedarf an Techniken zur Substitution von Weichteilgewebe erahnen. Trotz der meist enttäuschenden Ergebnisse ließen Chirurgen nicht davon ab, mit immer neuen Techniken und Theorien ihrem Ziel nachzueifern. Gründer der Idee der autologen Fettgewebstransplantation * Transkribiert aus Abre los ojos von Alejandro Amenábar

9 2 war im Jahre 1889 van der Meulen [8], der eine Verlagerung des freien Omentums zwischen Leber und Zwerchfell durchführte. Die erste freie Fettgewebstransplantation unternahm Neuber 1893, indem er kleine Fettgewebspartikel in einen Defekt einbrachte [64]. Lexer verwandte 1909 erstmals im Gesicht abdominales Fettgewebe zum Aufbau eines infraorbitalen Gewebedefizites [51], gefolgt von zahlreichen Versuchen weiterer Autoren an eingesunkenen Narben, am Arcus zygomaticus, am M. temporalis etc. [8]. Sie berichten von befriedigenden bis exzellenten Ergebnissen, wenngleich diese seither in experimentellen und klinischen Studien nicht reproduziert werden konnten [85] [26] [25] [65]. Die Verwendung größerer Transplantate führte in Konsequenz zu einem vollständigen Versagen der Methode. Von der ersten Mammarekonstruktion mittels autologen, freien Fettgewebes berichtet Czerny im Jahre 1895 [20], gefolgt von Lexer 1931, May 1941 und Schorcher 1957 [8]. Übereinstimmend berichten sie von guten postoperativen Ergebnissen mit anschließender, sukzessiver Volumenabnahme und zunehmender Verhärtung des transplantierten Materials. Mit der Einführung allogener Materialien zur Substitution von Weichteilgewebe nahm das Interesse an der Autotransplantation von Fettgewebe vorübergehend ab. Erst als deren routinemäßige Anwendung die unerwünschten, weiter unten erwähnten Nebeneffekte aufdeckte und die Liposuktion anfangs der 80er Jahre Einzug in den Klinikalltag hielt, rückte die Methode der autologen Fettgewebstransplantation wieder ins Zentrum des Interesses. Die Reinjektion von aspiriertem Fettgewebe erwies sich jedoch als wenig erfolgversprechend [85]. Nach Untersuchungen von Nguyen et al fanden sich aufgrund des traumatisierenden Prozesses in der Fettgewebsfraktion des Aspirates 90% deformierte und rupturierte Zellen und nur 10% unbeschädigte Adipozyten. Neun Monate nach Reinjektion waren keine vitalen Zellen mehr nachweisbar und das Transplantat war vollständig fibrosiert [25] [65]. 1.3 Aktuelle Therapien Zur Therapie von Weichteilgewebedefekten werden heute in Abhängigkeit von der Indikation alloplastische Implantate oder autologe, xenogene und allogene Transplantate verwandt. Alloplastische Materialien, wie Silikonimplantate, neigen postoperativ zur Migration. Zudem bergen sie das Risiko der Fremdkörperreaktion, der Kapselkontraktur, der allergischen Reaktion, der Infektion sowie der Ruptur im Falle der gefüllten Implantate [102] [54] [57]. Bei der Brustrekonstruktion mit Silikonimplantaten nach Mammakarzinom ist die Kapselkontraktur eine häufig beschriebene Komplikation, die sich klinisch mit chronischen

10 3 Schmerzen und Einziehungen des subkutanen Gewebes und der Haut manifestiert. Dabei entstehende Verhärtungen in der Brust lassen sich palpatorisch nicht von einem Rezidiv des Tumors unterscheiden und erschweren so die Nachsorgeuntersuchung [57]. Xenogene Materialien, wie bovines Kollagen, verfügen dagegen nicht über eine ausreichende Langzeitpersistenz und bergen die Gefahr der Krankheitsübertragung und der allergischen Reaktion [24]. Im Bereich der klassischen, autologen Gewebeverpflanzung werden bisher die freie Lappenplastik mit Gefäßanschluss und die freie Transplantation von Fettgewebe ohne Gefäßanschluss angewandt: Die Therapie mittels lokaler oder mikrochirurgisch angeschlossener, freier Lappenplastiken erfordert einen größeren chirurgischen Eingriff und ist somit mit den allgemeinen Operationsrisiken behaftet. Außerdem entstehen an der iatrogenen Wunde der Spenderstelle zusätzliche, kosmetisch unerwünschte Narben und Konturunregelmäßigkeiten [61]. Der freie Transverse Rectus Abdominalis Myokutanlappen (freier TRAM) zur Brustrekonstruktion sowie die anderen zahlreichen Lappenplastiken bei Weichteildefekten an Rupf und Extrmitäten können zudem mit einer Einschränkung der Kraftentfaltung und der Motilität der betroffenen Gelenke einhergehen [86] [47] [3]. Immer besteht die Gefahr der Thrombosierung der mikrochirurgisch anastomosierten Gefäße, was den vollständigen Lappenverlust nach sich ziehen kann [43]. Dagegen ist die freie, nicht primär gefäßangeschlossene Transplantation von Fettgewebe im Falle geringer Transplantationsvolumina, wie zum Beispiel bei Augmentationsbehandlungen von Kinn und Wangen, eine in der gegenwärtigen Plastischen Chirurgie etablierte Methode [55], während die freie Transplantation größerer Gewebeteile bisher eine untergeordnete Rolle spielt. Grund hierfür sind die meist enttäuschenden Berichte experimenteller und klinischer Follow-up Studien einer progredienten Resorption des Transplantates post operationem mit einem Volumenverlust von bis zu 60% innerhalb des ersten Jahres [70] [26] [25] [85] [65]. Peers erklärt dieses Phänomen folgendermaßen [70]: Seiner Ansicht nach korreliert das Überleben des Transplantates mit dem der einzelnen Adipozyten. Dabei hängt das Überleben der besonders stoffwechselaktiven und deswegen ischämiesensitiven Adipozyten von der frühen Blutversorgung durch einsprossende Blutgefäße ab. In den für das Transplantatüberleben besonders wichtigen ersten fünf Tagen nach Transplantation kann das Einsprossen von Gefäßen nur im Randbereich des Transplantates nachgewiesen werden [6]. Da eine Versorgung des Gewebes über Diffusion nicht ausreicht, kommt es in den Zentralbereichen des Transplantates zu ausgedehnten Fettzellnekrosen. Zeichen der weiteren

11 4 Degeneration des Transplantates sind die Entwicklung von Ölzysten und die zunehmende Fibrosierung des Parenchyms, sodass das Fettgewebe einer nahezu vollständigen Resorption unterliegt und das erwähnte Residualvolumen sich durch die Persistenz des fibrösen Fettgewebeersatzes und der Ölzysten erklärt. Smahel kommt zu dem Schluss, dass die Summe der Eigenschaften des Fettgewebes es für die freie Transplantation unbrauchbar machen [84]. So lässt sich festsellen, dass die Vielzahl der Therapieansätze zur Weichteilsubstitution nicht allein aus der Fülle der Indikationen resultiert, sondern auch als Hinweis auf das Fehlen einer vollständig zufriedenstellenden Methode zu sehen ist Kultivierung fettgewebeäquivalenten Gewebes Tissue Engineering Motivation Über Jahrhunderte war der Einsatz der Chirurgie meist resektiver Natur, was sich erst im 19. Jahrhundert durch die Entwicklung plastisch chirurgischer Techniken zu verändern begann. Die Plastische Chirurgie machte es sich zur Aufgabe, dem Patienten nicht nur in seiner akut lebensbedrohlichen oder schmerzhaften Situation zu helfen, sondern ihm darüber hinaus durch den Einsatz neuer chirurgischer Techniken, körperliche Dysfunktion und Entstellung so weit als möglich zu ersparen und ihm so die Wiedereingliederung in das soziale Leben zu erleichtern. Limitierende Faktoren sind hier oft die mangelnde Präzision in der Wiederherstellung feiner Konturen, das Scheitern der Transplantation oder Implantation aus den in Kapitel 1.3 angegebenen Gründen, sowie die begrenzte Verfügbarkeit körpereigenen Gewebes zur Deckung größerer Defekte. In der Mitte des 20. Jahrhunderts führte der rasante Fortschritt in den Ingenieurs- und Lebenswissenschaften sowie in Zellisolations- und Zellkulturtechniken zu der Einsicht, dass die Entwicklung und Anwendung bioartifizieller Gewebe zu einer Wiederherstellung, Konservierung oder Verbesserung von Gewebefunktionen führen und somit einen Ausweg aus der oben beschriebenen Problematik darstellen könnte [87]. Heute findet zum Beispiel bioartifizielle Haut Anwendung im Klinikalltag zur Behandlung von Patienten mit großflächigen Verbrennungen [88].

12 Tissue Engineering Definition Tissue Engineering ist ein Konzept, das Techniken aus den Bio-, Ingenieurs- und Naturwissenschaften mit der Zielsetzung vereinigt, neues Gewebe zum Ersatz oder zur Unterstützung von vorhandenem Gewebe und Organen zu schaffen [49]. Dazu werden dem Patienten kleine Mengen Gewebe entnommen, die benötigten Zellen isoliert, kultiviert, eventuell genetisch modifiziert und in einer porösen Trägermatrix retransplantiert. Die nahezu uneingeschränkten Variationsmöglichkeiten jeder einzelnen Komponente erlaubt die Schaffung eines bioartifiziellen Gewebes mit definierten Eigenschaften, welches sich im Idealfall in den Empfängerorganismus integriert und Anschluss an dessen Blutgefäßsystem findet. Im Folgenden soll auf die einzelnen Aspekte des Tissue Engineering von Fettgewebe eingegangen werden Makroskopischer und mikroskopischer Aufbau des Fettgewebes Fettgewebe ist im menschlichen Körper ubiquitär und trägt beim Normalgewichtigen zwischen 15% und 25% des Körpergewichtes bei [84]. Seiner ersterkannten mechanischen Funktion verdankt es seine Klassifikation als Bindegewebe, obwohl es weitere, ebenso wichtige Funktionen in der Thermoregulation, als Energiedepot und endokrines Organ erfüllt [33] Aufbau des Fettgewebes Das einzelne Läppchen des lobulär aufgebauten Fettgewebes misst einige Millimeter im Durchmesser und besteht aus Adipozyten und einer stromal-vaskulären Fraktion. Mature Adipozyten, auch Siegelringzellen genannt, sind etwa 120 µm groß, besitzen eine große, singuläre Fettvakuole und einen randständigen Kern. Die unterstützende stromal-vaskuläre Fraktion besteht aus Kollagen Typ 3, elastischen Fasern, neurovaskulären Strukturen und Stromazellen, wie Fibroblasten und Perizyten. Zu den Stromazellen gehören auch die Adipoblasten und Präadipozyten, die als mesenchymale Vorläuferzellen der maturen Adipozyten der adipogenen Zell-Linie zuzuschreiben sind [2]. Dicke Bindegewebssepten dienen der mechanischen Stabilisierung und Abgrenzung der einzelnen Lobuli [40].

13 6 Abb. 1: Histologie eines Fettgewebslobulus: Innerhalb der umgebenden, bindengewebigen Septen sind kreisrunde Adipozyten und zahlreiche Kapillare zu erkennen Blutversorgung Jeder Lobulus wird durch eine relativ großkalibrige, axiale Arterie versorgt, deren Kapillaren sich als feines Netzwerk um jede einzelne Fettzelle legen. Fettgewebe ist somit ein gut durchblutetes Gewebe und erreicht eine ähnliche Gefäßdichte wie Skelettmuskelgewebe, wobei der Blutfluss in positiver Beziehung zur Adipozytenzahl steht [5] [30]. Diese Beobachtung steht im Einklang mit der endokrinen Funktion und der hohen Stoffwechselaktivität des Fettgewebes. Der große Gesamtdurchmesser der Kapillaren führt zu einer Verlangsamung der Strömungsgeschwindigkeit des Blutes, was eine der Voraussetzungen für die Lipidakkumulation und somit für die Adipozytendifferenzierung im Fettgewebe bildet [84]. Auch Toldt zeigte schon 1870, dass sich Fettgewebe nur unter der Bedingung einer schon bestehenden Gefäßversorgung entwickeln kann [93] Anforderungen an fettgewebeäquivalentes Gewebe Innovative Therapieformen müssen sich stets mit bereits etablierten Therapien bezüglich Sicherheit und Ergebnis messen lassen. Das Therapierisiko von innovativen Therapien darf im Vergleich zu etablierten Verfahren nicht erhöht sein. Das impliziert, dass die Transplantation bioartifiziellen Gewebes den Empfängerorganismus nicht zum Beispiel durch Entzündungsreaktionen oder Tumorinduktion gefährden darf. Dabei muss der Gewebeersatz nicht das gesamte oben genannte Funktionsspektrum des Fettgewebes (siehe 1.4.3) abdecken. In seiner Anwendung zur Substitution von Weichteilgewebe müssen insbesondere die taktilen und optischen Aspekte denen des nativen Fettgewebes entsprechen. Desweiteren sollte die reproduzierbare, volumenpersistente

14 7 Transplantation größerer Konstrukte zum Beispiel zur Brustaugmentation mit vorhersehbaren Resultaten möglich sein, eine Anforderung, die nur über die Integration des Substitutes in den Empfängerorganismus erreicht werden kann, welche durch ein komplexes Zusammenspiel verschiedener Faktoren, wie Zellen, Trägermatrix, Vaskularisierung, Wachstumsfaktoren etc. kontrolliert, moduliert und unterstützt wird Aktueller Stand der Forschung Zellen Für das Tissue Engineering von Fettgewebsäquivalenten bieten sich mature Adipozyten und Präadipozyten an, da beide aus Fettgewebsbiopsaten oder Aspiraten gewonnen werden können. Adipozyten sind mechanisch fragil, hypoxiesensitiv und nicht teilungsaktiv [26]. Der mechanische Stress und die Ischämie während der Isolierung, Kultivierung und Transplantation führen bei Adipozyten im Vergleich zu Präadipozyten zu einer wesentlich höheren Nekroserate [26]. Dies macht Präadipozyten zu den bevorzugten Zellen des Adipose Tissue Engineering. Der Begriff Präadipozyt wurde 1926 von Wassermann eingeführt [99]. Abb. 2: Kultivierung und Differenzierung von Präadipozyten a) Spindelförmige Präadipozyten in konfluenter Kultur (x100). b) In sich differenzierenden Adipozyten bilden sich zuerst mehrere, kleinere Fetttropfen (multivakuolärer Adipozyt), bis diese zu einer Vakuole konfluieren (univakuolärer Adipozyt). Öl-rot Färbung.

15 8 Hausberger beschrieb 1955, dass sich Präadipozyten als mesenchymale Vorläufer der Fettzellen durch Differenzierung in diese umzuwandeln vermögen [36]. Im Jahre 1971 wurde von Smith das erste Protokoll zur Präadipozytenisolierung und kultivierung publiziert [87]. Die Möglichkeit, Präadipozyten in vitro zu vermehren und zu differenzieren, beschrieb Poznanski 1973 [73]. Green zeigte in seiner Arbeit von 1979, dass in athymische Nacktmäuse subkutan injizierte Präadipozyten sich innerhalb eines Zeitraumes von sechs Wochen zu Fettzellen differenzieren [32] Matrizes Zur Lokalisierung großer Zellmengen am Transplantationsort dienen im Tissue Engineering dreidimensionale Gerüste, die artifiziellen Extrazellulärmatrizes, die vielfältigen Anforderungen genügen müssen: Die verwendeten Materialen dürfen nicht toxisch oder kanzerogen, müssen aber biokompatibel, steril und chirurgisch handhabbar sein. Sie müssen das Einsprossen von Granulationsgewebe ermöglichen, über eine mechanische Stabilität verfügen und biologisch abbaubar sein. Im Idealfall geht dabei der Abbau der Trägermatrix zeitlich mit der Sekretion natürlicher Extrazellulärmatrix durch die transplantierten Zellen einher, sodass bei konstantem Volumen alles körperfremde Material eliminiert wird. Eine hochporöse Struktur des Materials erleichtert dabei das Einsprossen von Gefäßen und ermöglicht die Aufnahme großer Zellzahlen und deren Ernährung über Diffusionsprozesse. Im Tissue Engineering von Fettgewebeäquivalenten werden dazu den verschiedenen Anforderungen entsprechend unterschiedliche Materialien verwendet Ex vivo kultivierte Konstrukte Zur Herstellung ex vivo geformter, besiedelter und kultivierter Konstrukte werden z.b. Poly- Laktid-Glykolsäure (PLGA) Matrizes, Kollagen- und Hyaluronsäureschwämme verwendet [68] [69] [97] [96]. Dies setzt jedoch eine genaue Kongruenz von Konstrukt und Gewebeschaden voraus und benötigt bei Transplantation größerer Konstrukte Hautschnitte mit der Konsequenz kosmetisch unerwünschter Narben.

16 Injizierbare Konstrukte Das Prinzip injizierbarer Konstrukte beinhaltet die Applikation von Präadipozyten-Matrix- Suspensionen mittels gewebeschonender, minimalinvasiver Techniken und deren idealerweise langsamen Aushärtung in situ, um so eine Modulierung seitens des Chirurgen zu ermöglichen. Der Empfängerorganismus dient den Präadipozyten als Bioreaktor und induziert deren Differenzierung zu maturen Adipozyten [89]. Als biogenes Material erfüllt Fibrin natürlicherweise viele der geforderten Kriterien, ist als Arzneimittel zugelassen, birgt aber aufgrund seines humanen Ursprungs auch die Gefahr der Krankheitsübertragung. In seinen zwei gut handhabbaren, flüssigen Komponenten Fibrinogen und Thrombin ist es injizier- und während des Aushärtens in situ formbar. Die Modifikation der Konzentration, des ph-werts und der Ionenkonzentration dieser Komponenten erlaubt die Einflussnahme auf die histoinduktiven, angioinduktiven sowie mechanischen Eigenschaften des Fibrins und somit deren Anpassung an die individuellen Anforderungen [42] [50] [16] [34] [63] [21]. Dies macht Fibrin zur idealen Matrix des Adipose Tissue Engineering. In Versuchen der eigenen Arbeitsgruppe wurden nach Biopsie humanen Fettgewebes Präadipozyten isoliert und mittels Zellkulturtechniken vermehrt. Anschließend wurden die humanen Präadipozyten in Fibrinogen suspendiert und athymischen Nacktmäusen zusammen mit Thrombin subkutan injiziert. Die histologisch Auswertung zeigte, dass Präadipozyten in Fibrin in situ zu maturen Adipozyten differenzieren und ein fettgewebsähnliches Äquivalent bilden (siehe Abb. 3) [13]. 1.5 Blutversorgung bioartifiziellen Gewebes Tissue Engineering dreidimensionaler Gewebe Derzeit gibt es kaum ein Gewebe, dessen Möglichkeiten des Ersatzes durch Tissue Engineering-Konstrukte nicht erforscht wird. Obwohl die Isolierung und Züchtung zahlreicher Zellarten wie Osteoblasten, Chondrozyten, Präadipozyten, Hepatozyten etc. inzwischen zu den Routinearbeiten vieler Zell-Laboratorien gehören, befinden sich bisher nur bioartifizieller Epidermis- und Knorpelersatz in klinischer Anwendung. Diese Diskrepanz resultiert aus der Histologie der Gewebe: Bei Epidermis und Knorpel handelt es sich um

17 10 Abb. 3: Minimalinvasive Transplantation von Präadipozyten in Fibrin. a) Doppelspritzeninjektionssystem für Fibrinkleber. Bestehend aus einer Halterung für zwei identische Spritzen und einem gemeinsamen Stempel, sodass gleiche Volumina der beiden Fibrinkleberkomponenten (Fibrinogenfraktion, Thrombinfraktion mit Zellresuspendat) über ein gemeinsames Anschlussstück in einer Kanüle gleichmäßig durchmischt und injiziert werden können. b) Subkutanes Fettgewebe (rot eingefärbt, oben) und differenzierte Adipozyten nach Subkutaninjektion einer Präadipozyten-Fibrin-Suspension in eine Nacktmaus (rot eingefärbt, unten). Öl-rot Färbung (x25). zweidimensionale Gewebe, die aus nur wenigen Zellreihen bestehen. Die Zellen erfahren über Diffusion eine suffiziente Ernährung und benötigen somit kein eigenes Gefäßnetz. Da die Diffusionstrecke, über die eine ausreichende Versorgung der Zellen gewährleistet werden kann, sich auf etwa 3 mm beschränkt, reicht der Diffusionsprozess zur Ernährung größerer, dreidimensionaler Transplantate, wie es bei bioartifiziellem Knochen, Muskel und Fettgewebe der Fall wäre, alleine nicht aus [59]. Gefäße aus umliegendem Gewebe sprossen erst mit einer Verzögerung von bis zu acht Tagen ein und gelangen zunächst nur in den Randbereich des Konstruktes [6], sodass vor allem Zellen im Zentrum der Transplantate unzureichend versorgt werden und absterben. In den bereits erwähnten Versuchen (siehe Kapitel ) wurden Präadipozyten-Fibrin-Konstrukte mit einem Volumen von 500 µl subkutan injiziert. Trotz der Diffusions-begünstigenden Struktur des Fibrins und der damit verbundenen, guten Nährstoffversorgung, entstanden auch schon bei diesen vergleichsweise kleinen Konstruken zentrale Zellnekrosen [13]. Die Strategien des Tissue Engineering zur schnellen Vaskularisierung der Konstrukte beinhaltet die Beschleunigung und Verstärkung der Angiogenese durch das Einbringen

18 11 angiogener Wachstumsfaktoren oder durch die Transfektion der inokulierten Zellen mit Genen angiogener Wachstumsfaktoren. Ein völlig andersgearteter Ansatzpunkt bietet die Möglichkeit der Kotransplantation mit Endothelzellen, um unmittelbar nach Transplantation eine Organisation der eingebrachten Endothelzellen zu kapillarartigen Strukturen zu bewirken. Das sich so bildende, kapillarartige Netz könnte in situ Anschluss an Gefäße finden, die aus umliegendem Gewebe einsprossen. Im Idealfall wäre auf diese Weise schon wenige Stunden nach Transplantation eine ausreichende und gleichmäßige Blutversorgung des gesamten Transplantates möglich Das vaskuläre Endothel Endothelzellen kleiden als einlagige Zellschicht mit einer Dicke von 0,1-1 µm das Lumen aller Blut und Lymphgefäße des Organismus aus. Die Funktionen des Endothels sind vielfältig: Es bildet eine antikoagulatorisch wirksame Oberfläche, regelt über die Ausschüttung vasoaktiver Substanzen den Gefäßtonus und ermöglicht über die Expression verschiedener Adhäsionsmoleküle die streng lokalisierte Rekrutierung von Zellen des Immunsystems [74]. Eine für das Tissue Engineering entscheidende Funktion ist die Gewährleistung des Sauerstoff- und Nährstoffaustausches zwischen Gewebe und Blut in den Kapillarnetzwerken Angiogenese Definition Das Gefäßsystem im Erwachsenen unterliegt physiologischerweise kaum Veränderungen. Die Neubildung von Blutgefäßen findet beim erwachsenen Menschen außer im ovarialen Zyklus, in der Entwicklung der Plazenta und im Wachstum des Fettgewebes [19] vor allem unter pathologischen Bedingungen wie Tumorwachstum und Wundheilung statt. Während der Embryonalentwicklung nimmt die Neubildung von Blutgefäßen jedoch eine zentrale Rolle ein. Dabei wird zwischen Vaskulogenese und Angiogenese unterschieden. Die Vaskulogenese beschreibt den ersten Prozess der vaskulären Entwicklung, der exklusiv im Embryo stattfindet. Dabei proliferieren und differenzieren endotheliale Vorläuferzellen, so genannte Angioblasten, und lagern sich schließlich zu einem primitiven Gefäßplexus im Mesoderm

19 12 zusammen [78]. Darauf folgend kommt es zur Weiterentwicklung des primitiven Gefäßplexus durch Angiogenese, welche sich als die kontinuierliche Entwicklung neuer Blutgefäße (z.b. durch Aussprossung) aus bereits existierenden definieren lässt [77]. Dabei lysieren von Endothelzellen sezernierte Proteasen die Basalmembran. Endothelzellen proliferieren, migrieren in die umgebende Extrazellulärmatrix und lagern sich zu einem neuen Gefäß zusammen. Durch Kontakt mit Perizyten wird das Endothel stabilisiert (siehe Abb.4). Reifung des Endothels Abb. 4: Die angiogene Kaskade Angiogenese-Modelle Es existieren eine Vielzahl verschiedener Modelle, um den Ablauf der Angiogenese zu untersuchen Zweidimesionale Modelle Zweidimensionale Modelle wie Proliferatiosversuche, lateral sheet migration assays oder tube forming assays sind reduktionistisch und reflektieren nur einzelne Aspekte der angiogenen Kaskade Migration, Proliferation und Differenzierung wieder. Dennoch leisteten diese Modelle zum Beispiel zur Untersuchung von Angiogeneseinhibitoren ihren Dienst [44] [4] [52] [9].

20 Dreidimensionale Modelle Um die Untersuchungssysteme der in vivo Situation weiter anzugleichen, wurden dreidimensionale Zellkultursysteme entwickelt. Werden Endothelzellen in Einzelzellsuspension in Konstrukte auf der Grundlage extrazellulärer Matrizes eingebracht, begehen sie innerhalb kurzer Zeit Apoptose [82] [72] [81] [46]. Die Präsenz angiogener Wachstumsfaktoren führt in Kollagen-, Kollagen/Fibronectin- und Matrigel-Matrizes zum Überleben und zur Ausbildung kapillarähnlicher Strukturen [67] [82] [101] [48]. In Fibringelen bewirken Wachstumsfaktoren das Überleben und die Proliferation von Endothelzellen, nicht aber deren Differenzierung. Bach et al. kultivierte zuerst Endothelzellen bis zum Erreichen der Konfluenz auf Fibrin, bevor sie mit einer zweiten Lage Fibrin überschichtet wurden [4]. Dagegen etablierte Nehls et al eine Methode, in der mit Endothelzellen bewachsene Microcarrier in Fibrin einbracht wurden [62]. In beiden Fällen sprossten kapillarähnliche Strukturen in das Fibringel ein. Unentbehrliche Voraussetzung für die Differenzierung scheint darum in Fibrin das Bestehen von Zell-Zell-Kontakten zu sein [4] [42] [62] [45]. Ein diese Voraussetzungen ermöglichendes Modell, basierend auf Zell- Agglomeraten, soll im Folgenden kurz beschrieben werden: Das Sphäroidmodell Werden Endothelzell-Suspensionskulturen unter Bedingungen kultiviert, die eine Zusammenlagerung fördern, formen sie Zellkugeln, so genannte Sphäroide. Diese Methodik wurde von Pepper et al. erstmals 1991 beschrieben und von Korff et al detailliert charakterisiert [71] [46]. Innerhalb dieser Sphäroide bilden die Endothelzellen eine einlagige, differenzierte, oberflächliche Zellschicht und einen unorganisierten Kern (siehe Abb. 5). Stehen die Zellen des Kerns nicht unter dem Einfluss so genannter survival factors, wie vascular endothelial growth factor (VEGF) und basic fibroblast growth factor (bfgf), begehen sie innerhalb weniger Tage Apoptose. Die oberflächlichen Zellen zeigen Differenzierungsmerkmale, wie sie bisher in keinem anderen Angiogenese-Modell gezeigt werden konnten: Analog zur Situation in vivo strecken sich die Endothelzellen, bilden stabile Zell-Zell-Kontakte und werden unabhängig von survival factors. Die polare Ausrichtung endothelialer Oberflächenmoleküle der äußeren Zellschicht entspricht deren Anordnung in den Endothelzellen der Blutgefäße. Das Sphäroid Innere, wo die Hüllzellen intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) und vascular cellular adhesion molecule 1 (VCAM-1) exprimieren, entspricht somit dem Lumen des Gefäßes, die

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