Manuelle Zählung der Thrombozyten. Themen. Prinzip. Material TEAS Erythrozyten, Thrombozyten, Neubauer-Kammer.

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1 Manuelle Zählung der TEAS Themen Erythrozyten,, Neubauer-Kammer. Prinzip werden in einer Neubauer-Kammer unter dem Mikroskop gezählt. Mit einer hypotonen Ammoniumoxalatlösung werden dafür die störenden Erythrozyten hämolysiert und die werden vereinzelt und abgerundet. Diese Untersuchung gehört zum kleinen Blutbild. Material Schülerset 1 Einweghandschuhe, M, Latex, 1 Stk Mikroliterpipette 10 1 µl Mikroliterpipette 1 10 µl Pipettenspitzen 2-2 μl im Halter, 96 Stk Pipettenspitzen μl im Halter, 1 Stk Einmalreaktionsgefäß, 1,5 ml, 10 Stk Zählkammer nach Neubauer mit Deckglas Petrischale Mikroskop Chemikalien 1 Thrombo-Count-Reagenz Zusätzlich erforderlich Haushaltspapier Achtung: Thrombo-Count-Reagenz (Diammoniumoxalat-Monohydrat 10 g/l Quecksilber (II)-Chlorid 10 mg/l). Aktuelle Hinweise zu Risiken, Gefahren und Vorsichtsmaßnahmen entnehmen Sie dem Sicherheitsdatenblatt aus der Reagenzpackung Abb. 1: Material P59216 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 1

2 TEAS Manuelle Zählung der Aufgaben Bestimmen Sie die zahl einer Blutprobe. Durchführung: Untersuchungsmaterial Vollblut (EDTA-Blut oder Kapillarblut) Siehe Kapitel Präanalytik. Durchführung In ein Mikroreaktionsgefäß werden 190 µl Thrombo- Count-Reagenz und 10 µl gut gemischtes EDTA-Blut oder Kapillarblut pipettiert. Es entsteht eine Verdünnung von 1 : 20. Die Lösung sehr gut mischen und Minuten bis zur vollständigen Hämolyse der Erythrozyten inkubieren. Die Zählkammer innerhalb einer Stunde füllen: Das optisch plan geschliffene Deckglas mit leichtem Druck beider Daumen auf die mit etwas Wasser angefeuchteten seitlichen Trägerschienen der Neubauer-Kammer aufschieben, auf beiden Flächen sollten dann sogenannte Newton sche Ringe sichtbar sein. Sie entstehen durch Interferenz des Lichts an der oberen und unteren Grenzfläche des Luftkeils zwischen Deckglas und Steg. Sind sie zu sehen, so liegt die Höhe des Zwischenraums zwischen den Trägerstegen und dem Deckglas in der Größenordnung der Lichtwellenlängen, ist also zu vernachlässigen. In diesem Zustand verrutscht das Deckglas beim Kippen der Zählkammer nicht. Die Lösung auf beiden Seiten in die Zählkammer einfüllen.und die darin 20 Minuten in einer feuchten Kammer sedimentieren lassen. Zum Zählen wird ein 40-er Objektiv benutzt. Ausgezählt werden im inneren Zählkreuz der Neubauerkammer die, die sich innerhalb der unten markierten 5 Gruppenquadrate mit jeweils 16 Grundquadraten befinden und ebenfalls die, die sich auf jeweils zwei aneinanderstoßenden Begrenzungslinien der Quadrate des Zählnetzes (z. B. L-förmig) befinden; die Anzahl jeweils notieren. Abb. 2: Füllen der Neubauer-Kammer Abb. 3: Neubauer-Kammer, inneres Zählkreuz. Die 5 Gruppenquadrate mit den 16 Grundquadraten, die ausgezählt werden sollen, sind grau hinterlegt. Wenn man die Mikrometerschraube des Mikroskops leicht verstellt, setzen sich die vor dem Hintergrund der oft noch sichtbaren Erythrozytenschatten als kleine, seidig aufglänzende Kugeln ab. Grundlagen Unter der zahl versteht man die Anzahl der Blutplättchen () in einem bestimmten Blutvolumen. Normal sind Konzentrationen von pro Kubikmillimeter (mm 3 ) Blut. Bei höheren Werten spricht man von Thrombozytose bzw. Thrombozythämie, bei 2 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P59216

3 Manuelle Zählung der TEAS niedrigeren Werten von Thrombopenie (oder auch Thrombozytopenie). Im Einzelnen bedeutet "Thrombozytose" eine Erhöhung der zahl. Zu dieser Erhöhung kann es beispielsweise als Reaktion auf eine ausgedehnte Operation oder eine größere Blutung kommen, um den entstandenen Verlust an Blut (und damit auch an Blutplättchen) wieder auszugleichen. Aber auch nach einer großen körperlichen Anstrengung oder bei Entzündungen kann eine Thrombozytose festgestellt werden. Eine Verminderung der im peripheren Blut wird Thrombopenie (auch Thrombozytopenie) genannt. Ursachen können unter anderem sein angeborene Bildungsstörungen im Knochenmark, verkürzte Lebensdauer der verschiedener Genese und autoimmune Erkrankungen. Bei automatisierten Zählmethoden kann es außerdem zu einer EDTA-induzierten Pseudothrombozytopenie kommen; hierbei verklumpen die in Gegenwart von EDTA und können nicht mehr einzeln gezählt werden. Deshalb muss bei unrklärliche niedrigen zahlen im automatisierten Blutbild immer auch eine zusätzliche manuelle Zählung erfolgen. Die Zählkammer ist ein Objektträger mit einer um 0,1 mm vertieften Fläche in der Mitte, die eine Netzeinteilung trägt. Mit dem Auflegen des Deckglases schließt sich die Kammer und die Zellen können gezählt werden. Auswertung Berechnung Aus der Fläche (1/4 mm 2 ) und der Höhe (1/10 mm) eines Kleinstquadrats lässt sich dessen Volumen als 1/40 µl bestimmen. Da ein Gruppenquadrat aus 16 kleinen Grundquadraten besteht, hat es ein Volumen von 1/250 µl und fünf Gruppenquadrate beinhalten 1/50 µl, was 0.02 µl entspricht. Die werden in den 5 Gruppenquadraten gezählt, also in 0.02 µl Blut. Durch folgende Umrechnung mit dem Verdünnungsfaktor 20 erhält man die Anzahl pro µl Blut N: n ist die gezählte Anzahl in 0,02 µl 1:20 verdünntem Blut und N die Anzahl pro µl Blut. Referenzwerte Normal sind Konzentrationen von pro µl Blut. Bei Neugeborenen liegt der Wert mit etwas darunter. Weitere Informationen zu den Referenzwerten: siehe Vorbemerkungen, S. x. Achtung: Die angegebenen Normalwerte beziehen sich auf die westeuropäische Bevölkerung! Note Fehlerquellen der Kammer-Methoden Die hier aufgeführten Fehlermöglichkeiten gelten für alle Kammermethoden und müssen bei Störungen beachtet werden: - Blut angeronnen - falsches Verdünnungsvolumen P59216 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 3

4 TEAS Manuelle Zählung der - Benutzung von ungeeichten, defekten, spülfeuchten, ungereinigten Gerätschaften - mangelhafte Durchmischung - Deckglas falsch auf die Kammer aufgelegt - Kammer nicht luftblasenfrei gefüllt - Kammer überfüllt - Sedimentationszeit zu kurz - Zählung in der Kammer falsch durchgeführt - Falscher Verdünnungsfaktor zur Berechnung benutzt Das kleine Blutbild kann mit den Versuchen P , P59215, P59213, und P59212 erstellt werden, für das große Blutbild ist überdies noch Versuch P59214 nötig. Fragen: - Welches Reagenz wird für die zählung in der Kammer benötigt und was bewirkt es? Ammoniumoxalatlösung hämolysiert die roten Blutkörperchen. - Welche Blutuntersuchungen zählen neben der zählung zum kleinen Blutbild und welche noch zusätzlich zum großen? Das kleine Blutbild umfasst die Zählung der zellulären Blutbestandteile (Leukozyten, Erythrozyten und ), sowie eine Bestimmung der Hämoglobinkonzentration im Blut und die Bestimmung des MCV, eine Berechnung des Hämatokrit (HK) und der Erythrozyten-Indizes MCH und MCHC. Das große Blutbild enthält zusätzlich zum kleinen Blutbild eine Differenzierung der Leukozyten in ihre wichtigsten Untergruppen, ergänzend kann zum großen Blutbild noch eine Retikulozytenzählung durchgeführt werden. - Worauf muss bei der Füllung der Zählkammer geachtet werden? Das Deckglas muss so aufgelegt sein, dass Newton sche Ringe entstehen. Die Kammer darf keine Luftblasen enthalten und darf auch nicht überfüllt sein. 4 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P59216

5 Manuelle Zählung der TEAS Protokoll Sie können Ihre Ergebnisse in der folgenden Tabelle notieren: 1. Bestimmung Kammer Anzahl Gesamtzahl: 2. Bestimmung Kammer Anzahl Gesamtzahl: Fragen - Welches Reagenz wird für die zählung in der Kammer benötigt und was bewirkt es? - Welche Blutuntersuchungen zählen neben der zählung zum kleinen Blutbild und welche noch zusätzlich zum großen? P59216 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 5

6 TEAS Manuelle Zählung der - Worauf muss bei der Füllung der Zählkammer geachtet werden? 6 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P59216