Bioinformatik: Eine Anleitung zum Lesen der Gene
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- Lars Bäcker
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1 Bioinformatik: Eine Anleitung zum Lesen der Gene Gerhard Thallinger Institut für Genomik und Bioinformatik, TU Graz 1
2 Ziele Einblick in Inhalt, Methodik, Nutzen der Bioinformatik Anleitung zur gezielten Nutzung von Tools im Netz (v.a. in Kombination mit den Übungen) Beurteilung der Qualität von Tools und Ergebnissen Befähigung zur selbständigen Lösung neuer Problemstellungen Praxisbezogene Grundlagen für Forschungsarbeiten im Bereich Biomedical Engineering, Biomedizin, Molekularbiologie, Biokatalyse, Kein Kurs zur Entwicklung neuer Datenbanken, Algorithmen, Programme,... 2
3 Inhalte Einführung in die Bioinformatik Biologische Datenbanken: Suche Biologische Datenbanken: Aufbau Prediktive Methoden basierend auf DNA- und Protein Sequenzen Next Generation Sequencing Technologien Anwendungen von NGS 3
4 Genetik und Genomik Michael Levitt 4
5 Genetik und Genomik Gen: Erbfaktor Genetik: Erforschung der Funktion von Genen Genom: Gesamte Erbinformation Genomik: Erforschung der Gesamtheit aller Gene eines Organismus (siehe auch das bm:wf Programm 5
6 Genetik Gregor Mendel Die Mathematik der Vererbung 1856: Kreuzungsexperimente mit Gartenerbsen 1866: Veröffentlichung der Versuche Mendel G, Versuche über Pflanzen-Hybriden. Verh. Naturforsch. Ver. Brünn, 1866;4:3-47 6
7 Molekulargenetik Watson JD, Crick FH, Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature, 1953;171(4356):
8 Molekulargenetik No one suggests these groupings [A, C, G, T] can yet be arranged artificially. Discovering how these chemical cards are shuffled and paired will keep the scientists busy for the next 50 years Richie Calder, News Chronicle, 15. May
9 Molekulargenetik 1966 Entschlüsselung des genetischen Codes (Nierenberg, Khorana) 1972 Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie (Lobban, Kaiser) 1977 DNA-Sequenziermethode entwickelt (Sanger) 1982 Erstes Medikament basierend auf der rekombinanten DNA-Technologie (Humaninsulin) 9
10 Genomik 1983 PCR (Polymerase Kettenreaktion): DNA- Amplifizierung (Mullins) 1984 Machbarkeitsstudie zum Human Genome Project 1990 Start des Human Genome Projects Ziel: Entschlüsselung des humanen Genoms ( bp) bis
11 1995 Genomik Zwei bakterielle Genome entschlüsselt: Mycoplasma genitalium ( bp; 0,58 Mbp), Haemophilus influenzae ( bp; 1,83 Mbp) 1996 Hefegenom entschlüsselt (12 Mbp, Gene) 1998 Genom des Fadenwurms (97 Mbp, Gene) 2000 Genom der Taufliege (180 Mbp, Gene) 11
12 2001: Das Humane Genom ist entschlüsselt! 2500 Personen, 20 Institutionen Das Buch des Lebens hat 3 Milliarden Zeichen - nur rd Gene (Taufliege: ) Lander et al., Nature. 2001;409: Venter et al., Science. 2001;291:
13 Chromosom 22: 8800 Seiten GATCATCATCGAATGGAGTTGAATGGAATTATCAAAGAATGGAATCCAGTGGTATCATCATCAAATGGAA CCGAATGGAATCATCAAATGGACTCAAATGGAATCATTGAATAGATTCGAATGGAATCATCATCGAATGA AATCGAATGGAAAAATTGAATGGACTCGAATGGAACCATCATTGAATGGAAACCAAAGGAATCATCATCT AATGAAATGAAATGGAATCATAGAATGGACACAAATGGAATCATCATCGAATGGTATTGAATGGAATCAT CGAAAAGAATCGACGGAATCATGATCAAATGGACTCGAATGGAATCATCATGGAATGGAATCAAATGGAA TCATCAATGAATGGAATCCAATGGTATCATCATCAAATGGAACCGAAAGGAATCATCAAGTGGACTCAAA TGGAATCATCGAATGGAATCGAATGGAATCATCATCGAATGGAATCGAATGGAAACATCGAATGGAATCG AATGGAAACATCATTGAATGGAATCATCATCAAACGGAATCTATTTGAATCCTCATTGGATAGAATCGAA TGGAATCATCAAATGGAATAGAAAGGAATCATCATCGAATGCAATCGAATAGAATCATCAAATGAAAAGG AACGGAATCATCATCGAATGGAATCGAATGGAATCATCAACGAATGGAATCGAATGGAATCATCGTCTAA TGGAATCAAATGGAATCATCAACGAATGGAATAGCATGGAATCATCGAATGGAATCTCATGGCATCATCA TCACATGGAACCGAATGGAATCATCATGGAGTGTAATCTAATGGAATCATCATTGAATGGAATCCAATGG GATCACTGAATTGAATGGAATGATCATCGAATGGAATCAAAGGGAATCATCAAATGGGATAGAAGGGAAT CATAGAATGGAATCGAATGGAATCATCGAATGGATTCAAATGGAATCACCATCAAATGGAAAAGAATGGA ATCATCAAAAGGACTCGAATGGAATCATCAAGGAATAGAATCAAATGGAATAATTGAATAGACACGAATG GAATCATCATTTAATGGAATCAAATGGAATCATCGAATGGACTCAAATGGAATCATCATTGAATGGAATC GAATGGAATCATCGAATGACATTGAATAGAATAATCAATGAATGGAATCTTAAGGAATAATCGAATGGAC TCGAATGGAATAATCGAATGGACTCGAGTGGAATCATCATCGAATGGAATCGAATGGAATCATCAAATGG ACTCAAATGGAATCATCATTGAATGGAATGGAATGAAATCATCGAATGGACTCGAGTGGAATCATCATCG AATGGAATGGAATGGAATCATCGAATGGACTCAAATGGAATCATCATCGAATGGAATGGAATGGAATCAT CGAATGGACTCGAATGGAATCATCATCAAATGGAATCTAATGGAATCATCGAAGGTACTGGAATGGAATC ATAATCAAATGGAATCGAATGGAATCATTGAATGACATCGAATGGAATCCTCATTGAATGGAATGGAATG GAGTCATCAAATGGAATCCAATGGAATCATCATCGAATGGAATCAAATGGAATCATCAAATGGAATCGAA TGGAACCATCGGATGGAATCGAATGGAATCATCATCGAATGGAATCGAATTGAATCATCGAATGGAATCG AATGCAATCATCTCAAACAGAATCAAATAGAACCATCCAATGAAATCAAATGGAATCATCATCGAATAGA ATCAAATGGAACCATAGAATGGTATCGAATGGAATCATCATCAAATGGAATCAAAAGCAAAAATCGAATG GATTCGAAAAGAATCATCAAATGGACATGAATGGAATCATCATCCAATGGAATGAAATGGAATTAACGAA TGGAATCGAATGGAATCATCATCAAATGGAATCAAATGGAATCATCTAATGGACAGTAATGGAATCCTCA TTGAATGGAATCGAATGGAATAATCAAATGGAGACGAATGGAATCCCCATCGAATGGAAGTGAATGGAAT CATCAAATGGACCCAAATGCAATCATCATCGAATGGAATTGAACAGAATCTTCGTTGAATAGACTCGAAT GGAATCATCAAATGGACTCAAATTGAATCATTGAATGGAATTGAATGGTATCATCACAGAATGAATTGAA TGGAATCATCGAATGGTCTCGAAAGGAATAATTATCAAATGCAATCGAATGTAATCACCGAATAGAATCG AATGGAATAATCATCGAATGGACTCGAATGGAATCATCATCAAATGGAATCGAATGGAATTATTGAATGG AATCGAATAGAATCATCGAATGGACTCTAATGGAATCATCGAATGGAATGTAATGGAATAATCAATGAAC TCGAATGGAATCATCATTGAATGGAAACGAATGGAATCATTGAATGGAATTGAATGGAAACATCATCGAA TGCAATCGAATGGAATCATCACCGACTTGAATAGAAAAGAATCATCAGCAAATGGAATCGAATGGAATCA TCATGGAATGGAATCCAAAGGAATCATCATTGAATGCAACCAAATGGAATCGTCATCGAATGGACCGAAA GGAGTCATCATCGAATGGAATCGCATGGAATCATCATCAAATGGAATTGAATGGAACCATCATCAAATGG 13
14 Bioinformatik Neue Disziplin an der Schnittstelle der Molekulare Biowissenschaften und Informatik mit Bezügen zu Medizin, Statistik und Mathematik Verwaltung von genomischen Daten Analyse von DNA- und Proteinsequenzen Funktionelle Vorhersagen für neuen Sequenzen Grundlagenforschung -Biologie und Medizin Biologische Anwendungen -Klassifizierung von Spezies Biotechnologische Anwendungen -Optimierung von Bioprozessen in der industriellen Produktion Medizinische Anwendungen -Molekulare Diagnostik -Stratifizierung von Patienten 14
15 IT Anforderungen Supercomputer (z.b. Blue Gene) 1: Tianhe-2, National Supercomputer Center Guangzho 33,9 PFlops (06/2013: 1) 2: Titan Cray X7 Oak Ridge National Laboratory 17,6 PFlops (11/2012: 1) 5:JUQUEEN - Blue Gene/Q Forschungszentrum Juelich 5 PFlops (11/2012: 5) 60: Blue Gene IBM T.J. Watson Research 0,091 PFlops (06/2005: 2) 15
16 2 Web servers 2 Application servers 2 Database servers 64 bit Computing cluster (96 Cores, 1 TB RAM) 54 TB Storage (3 Systeme mit 9, 16 und 29 TB) Backup System IT Infrastruktur am IGB 16
17 Bioinformatik Können wir unsere Vergangenheit lesen? Woher kommen wir? Wer sind unsere Vorfahren? Können wir in die Zukunft sehen? Von welcher Krankheiten werde ich heimgesucht? Kann ich was dagegen tun? 17
18 Bioinformatik Können wir unsere Vergangenheit lesen? Out of Africa? Sind wir auch Nachkommen der Neandertaler? Wie verwandt sind die Schimpansen? 18
19 Out of Afrika: Die Wanderkarte im Erbgut Untersuchung der Mitrochondien DNA Homo sapiens: vor Jahren in Afrika vor Jahren: Eva vor Jahren: Individuen vor Jahren: die Welt wird besiedelt heute, Generationen später genographic.nationalgeographic.com/gen ographic/globe.html 19
20 Neandertaler Genetische Analysen fossiler Proben: Neandertaler und moderne Menschen haben sich nicht wesentlich miteinander vermischt Green RE, et al., Nature. 2006, 444(7117): Draft Neandertal Genome aus drei Individuen: nähere Verwandschaft zu Eurasiern als zu Afrikanern unterhalb der Sahara Green RE, et al., Science. 2010;328(5979):
21 Denisova (Altai) Meyer M, et al., Science 2012; 338(6104):
22 Schimpanse 99.4% der Gene bei Mensch und Schimpanse sind identisch Chimpanzee Sequencing and Analysis Consortium. Nature. 2005;437(7055): Warum können dann Affen nicht sprechen? Sprach-Gen: FOXP2 Eine Mutation bei den Schimpansen! Enard W, et al., Nature 2002;418(6900):
23 Schimpanse Maus mit humaner FOXP2-Version: andere Artikulation Enard W, et al., Cell 2009;137(5):
24 Bioinformatik Können wir in die Zukunft sehen? Von welcher Krankheiten werde ich heimgesucht? Kann ich was dagegen tun? 24
25 Genetische Ursachen von Krankheiten AIDS: 10% genetische Ursachen, 90% Umweltfaktoren Diabetes: 50% genetische Ursachen, 50% Umweltfaktoren Zystische Fibrose (Mukoviszidose): 90% genetische Ursachen, 10% Umweltfaktoren 25
26 Chronische Krankheiten Todesursache Nummer eins (Krebs, Herzkrankheiten, psychische Erkrankungen) Kombinierte Wirkung von vielen Genen, Umweltfaktoren und Verhalten Schwierige Diagnose und Therapie z..b. Krebs: 200 unterschiedliche Krankheiten die zum unkontrollierten Zellwachstum führen EU: Todesfälle pro Jahr 5% des Gesundheitsbudgets für die Behandlung von Krebserkrankungen Genomik: umfassender und systematischer Ansatz Identifikation aller Gene die die Krankheit verursachen Entdeckung neuer molekularer Ziele Dzt. werden nur 500 von den möglichen verwendet! 26
27 Darmkrebs weltweit Fälle pro Jahr Tote pro Jahr 40% überleben 5 Jahre 27
28 Darmkrebs 1932: Dukes Klassifikation 2009: modifizierte Dukes Klassifikation Prognostische Marker? 28
29 Darmkrebs 29
30 Krebs und Immunologie 30
31 Krebs und Immunologie Klinische Beobachtung: Patient A hat ein Melanom (eine Form von Hautkrebs), wird als geheilt entlassen 16 Jahre später ist Patient A Nierenspender für die Patienten B und C; Patienten B und C bekommen Immunosuppresiva Patienten B und C erkranken an einem Melanom, Immunosuppresions- Therapie wird abgesetzt MacKie et al., N Engl J Med, 2003;348(6):
32 Krebs und Immunologie Modell 1: Immunzellen im Tumor: Entzündungsreaktion, unterstützt die Tumorentwicklung Modell 2: Immunzellen im Tumor: Wächter des Immunsystems, bekämpfen die Krebszellen 32
33 Krebs und Immunologie Kooperation TU Graz und INSERM, Paris 1000 Patienten Beobachtungszeitraum 20 Jahre Untersuchung der Proben mit state-of-the-art Technologien Grosse Datenmengen die verwaltet und analysiert werden müssen 33
34 Die Suche... Klinische Daten (n>1000) FACS-Analyse mit 400 Parametern (n=50) Viele Parameter, wenig Patienten Tissue microarrays (n>500) Viele Patienten, wenig Parameter Datenbank für klinische und molekulare Daten ( Goldgrube ) Data mining ( Datenabbau ) 34
35 FACS Fluorescently activated cell sorter Fluoreszierende Marker (Osamu Shimomura, Nobelpreis für Chemie 2008) Zell-Analyse 35
36 36
37 Fluorescence Activated Cell Sorter 37
38 Tissue Microarrays Slice: 5 µm Max. Anzahl: 300 Tissue microarrays (Kononen et al., Nat Med, 1998;4(7):
39 Tissue Microarrays TAMEE: Tissue array management and evaluation environment Thallinger et al., BMC Bioinformatics, 2007;8:81 39
40 Datenbank für klinische und molekulare Daten Mlecnik et al., BMC Genomics, 2010;11(1):50 40
41 Datenbank für klinische und molekulare Daten 41
42 Datenbank für klinische und molekulare Daten 42
43 Datenbank für klinische und molekulare Daten 43
44 Bioinformatik: Eine Anleitung zum Lesen der Gene Gerhard Thallinger Institut für Genomik und Bioinformatik, TU Graz 44
45 Fallstudie Darmkrebs Klinische Daten (n>1000) FACS-Analyse mit 400 Parametern (n=50) Viele Parameter, wenig Patienten Tissue microarrays (n>500) Viele Patienten, wenig Parameter Datenbank für klinische und molekulare Daten ( Goldgrube ) Data mining ( Datenabbau ) mit Hilfe von bioinformatischen Methoden 45
46 Frühes Eindringen von Metastasen und Krankheitsverlauf Sind VELIPI positiver Darmkrebs mit Mediatoren von Enzündung und/oder Immunsuppression verknüpft? VE: vascular emboli LI: lymphatic invasion PI: perineural invasion VELIPI: VE or LI or PI 46
47 Tumor-Infiltrierende Immunzellen Unterschiedliche Marker für positive (VELIPI+) und negative (VELIPI-) Patienten VELIPI: vascular emboli (VE), lymphatic invasion (LI), perineural invasion (PI) min. expression max. expression Pagès et al. N Engl J Med, 2005;353:
48 Immunpolizei: Effector Memory T-Zellen Disease-free and overall survival of CD45RO hi patients CD45RO Tissue MicroArray (TMA) analysis (n=353 patients) % Survival P<0.001 CD45RO-hi CD45RO-lo Survival (months) % Recurrence-Free P<0.001 CD45RO-hi CD45RO-lo Disease Free Survival (months) Pagès et al. N Engl J Med, 2005;353:
49 Konklusion Negative Korrelation zwischen Memory T Zellen und frühe metastatische Invasion sowie dem Krankheitsverlauf bei Patienten mit Darmkrebs. Der Zellmarker CD45RO der Memory T-Zellen stellt einen unabhängigen prognostischen Faktor dar. 49
50 Welche Rolle spielen die Subtypen der T-Zellen und deren Lokalisierung? 50
51 Adaptive Immunabwehr und klinische Vorhersage Galon J, et al. Science.2006;313(5795):
52 Kombinierte Analyse von Tumor-Regionen verbessert die Vorhersage Galon J, et al. Science.2006;313(5795):
53 Patienten Stratifizierung Tumor histopathology A 1 UICC-TNM UICC-TNM Staging system Disease-Free Survival I II III 0 IV Survival (months) CD3 CT CD3 IM evaluation plus CD45RO CT CD45RO IM evaluation C Disease-Free Survival I III II IV IV CD3 CT Hi CD3 IM Hi CD45RO CT Hi CD45RO IM Hi II I III CD3 CT Lo CD3 IM Lo CD45RO CT Lo CD45RO IM Lo Survival (months) ns ns ** Galon et al. Science.2006;313(5795):
54 Krebs Immunologie Zellen verhalten sich wie erloschene Sterne: noch lange nachdem sie verglüht sind, sehen wir sie leuchten Wie können in die Zukunft sehen: bei welchen Patienten werden sich wieder Tumore entwickeln entprechende Therapie rechtzeitig wählen 54
55 Ausblick Mechanismen der (De)Aktivierung der T-Zellen? Immunotherapie? Krebsimpfung? 55
56 Medizin der Zukunft Trend 1: Biotechnologie Neuartige Therapien -Biotherapeutika -Tumorvakzine Trend 2: Individuelle Medizin Pharmakogenomik -Erwünschte und unerwünschte Wirkungen der Medikamente durch genetische Merkmale -USA: 100 Millionen $ pro Jahr werden vergeudet Maßgeschneiderte Behandlung -personalisiert und ohne Nebenwirkungen 56
57 Science Fiction oder Realität? Trend 1: Biotechnologie Gezielte Tumorbehandlung (Targeted Therapy) mit Biotherapeutika -Herceptin (Brustkrebsmedikament): Therapie nach Test auf HER2 -Erbitux: Darmkrebs Trend 2: Individuelle Medizin DNA-Chip für Diagnostik: Roche AmpliChip CYP % Verbesserung der Wirksamkeit der Therapie 10-15% Vermeidung von Nebenwirkungen DNA-Chip für Krebs-Diagnostik: AmpliChip p53 57
58 Science Fiction oder Realität? Trend 2, Individuelle Medizin: Individuelle Genome? Gesamtkosten für das humane Genom: 3 Milliarden Dollar Kostenreduktion durch Technologieentwicklung 58
59 Science Fiction oder Realität? X-Prize Foundation: Größter Preis in der Medizingeschichte 4. Oktober 2011: Archon X PRIZE for Genomics Preis von 10 Millionen Dollar für den Bewerber der:... to create technology that can successfully sequence 100 human genomes less than 30 days......at a demonstrated cost of no more than $ per genome... no more than one error per 1,000,000 bases 59
60 Fiktion oder Realität? Sequenzierung eines humanen Genoms: 2007: 3 Monate, 1 Million 2008: $ : $ : 5.000$ : 1.000$!!!! Bioinformatik: Schlüsseldisziplin für PPP-Medizin: Personalisierte Prediktive Preventive } Medizin 60
61 Bioinformatik 61
62 Geschichte der Bioinformatik Margaret Dayhoff - Atlas of Protein Sequence and Structure, PAM Matrices 1978 ( Dayhoff MO, Schwartz RM, Orcutt BC. A Model of Evolutionary Change in Proteins. In: Atlas of Protein Sequence and Structure. National Biomedical Research Fundation. 1978;
63 Geschichte der Bioinformatik Temple Smith, Mike Waterman - Global alignment algorithm (1981) Smith TF, Waterman MS. Identification of common molecular subsequences. J Mol Biol. 1981;147(1):
64 Geschichte der Bioinformatik William R. Pearson - FASTA file format - FASTA algorithm (1988) Pearson WR. Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA. Methods in Enzymology, 1990;183:
65 Geschichte der Bioinformatik David J. Lipman -ENTREZ ( 65
66 Geschichte der Bioinformatik Stephen S. Altschul and colleagues. -BLAST (basic local alignment search tool) (1990) Altschul SF, et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990;215(3):
67 Bioinformatik Signifikante Änderungen in den experimentellen Lebenswissenschaften: Stark gestiegener Umfang von biologischen Daten durch Höhere Anzahl von Forschern Neue experimentelle Hochdurchsatz Technologien Änderungen in der Datenqualität Gleichartige Daten unter kontrollierten Bedingungen erzeugt Daten oft ohne Bezug zur (oft unbekannten) biologischen Funktion 67
68 Die Datenexplosion in der Bioinformatik 68
69 Bioinformatik Datenraum > 2000 Datenbanken > 6000 Gbyte Verdoppelung jedes Jahr (e.g. 8 Gbyte Sequenzdaten pro Woche)! 69
70 Bioinformatik Datenraum bei Homo sapiens Gene 320 Zelltypen 10 experimentelle Bedingungen 100 chemische Verbindungen 38.4 Gigabytes (4 Bytes pro Datenpunkt) 70
71 Bioinformatik 71
72 Bioinformatik G. von Heijne, S. Brunak, G. Cameron, A. Tramontano, G. Vriend (ESF): The use of computational techniques to handle, analyze, and add value to the flood of data coming from modern genomics and proteomics Theoretische Analyse von makromolekularen Sequenzen und Strukturen Assembly, Annotation, Analyse und Vergleich von genomischen Daten Modellierung von Proteinstrukturen Organisation von biologischem Wissen in Datenbanken Anwendung und Entwicklung von Werkzeugen für das data mining Identifikation von Targets für die Entwicklung von Heilmitteln Analyse von DNA Microarrays und Next Generation Sequencing Daten Analyse von metabolischen und funktionellen Netzwerken 72
73 Bioinformatik Gene Funktion 73
74 Bioinformatik: Eine Anleitung zum Lesen der Gene Gerhard Thallinger Institut für Genomik und Bioinformatik, TU Graz 74
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