4.6.5 Maus-Chimären Zucht von Versuchstieren

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1 Abb Anwendung moderner Biotechniken bei der Maus. a Mikroinjektion in den männlichen Vorkern der Maus. Dazu wird unter dem Mikroskop die befruchtete Eizelle mit einer Haltepipette (1) fixiert. Unter Verwendung von Mikromanipulatoren wird die sehr feine, speziell bearbeitete Injektionspipette (2) in die Eizelle (3) geschoben. Mithilfe eines elektrisch betriebenen Pumpsystems wird unmittelbar anschließend mit einem genau dosierten Überdruck das Konstrukt in den Vorkern (4) injiziert (400-fache Vergrößerung). b Injektion embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) in die Blastozyste einer Maus. Mit einer speziellen Glaspipette, die einen etwas größeren Innendurchmesser hat als die für die Mikroinjektion üblicherweise verwendeten Pipetten und die an ihrer Spitze angeschrägt ist, werden ES- Zellen in das Blastozoel injiziert. Die ES-Zellen werden in den Zellverband des Blastozysten aufgenommen, ihre Nachkommen finden sich schließlich in bestimmten Gewebebereichen des geborenen Tieres. 1: Haltepipette; 2: Blastozyst; 3: Injektionspipette; 4: injizierte ES-Zellen (400-fache Vergrößerung). c Transfer der behandelten Embryonen in den Uterus eines scheinträchtigen Weibchens. Nach Eröffnung des Rückens mit einem etwa 7 mm langen Schnitt werden Ovar (1), Ovidukt (2) und der Uterus (3) am anhängenden Fettgewebe (4) vorsichtig aus der Öffnung gezogen. Mit einer Sonde wird zunächst ein Loch in die Uteruswand gestochen, durch eine leichte Druckerhöhung in der Transferpipette (5) werden die Embryonen in den Uterus gespült (16-fache Vergrößerung). d Maus-Chimäre mit geschecktem Fell (Aufnahmen: F. Zimmermann) Maus-Chimären 28 Grundsätzlich ist eine Chimäre ein Individuum, das mehr als 2 Elternteile hat und damit aus genetisch verschiedenen Gewebetypen zusammengesetzt ist. So kommen z. B. bei menschlichen zweieiigen Zwillingen sog. Blut-Chimären vor, die während der Embryonalentwicklung durch Übertragung von Blutstammzellen vom einen auf den anderen Zwilling entstanden sind. Heute können Maus-Chimären experimentell durch Injektion 28 Chimaira ist das altgriechische Wort für Ziege und steht in der griechischen Mythologie für ein dreiköpfiges Ungeheuer. von embryonalen Stammzellen (ES-Zellinjektion) in Blastozysten oder durch Aggregationschimärie generiert werden. Bei den dabei eingesetzten ES- Zellen wurde zuvor mit molekularbiologischen Methoden ein Gen inaktiviert (Knock-out) und im Erfolgsfall tragen die aus dem ES-Zellexperiment hervorgegangenen Chimären in möglichst vielen Organbereichen, einschließlich der Keimbahn, Zellen, in denen das fragliche, funktionsunfähige Gen enthalten ist. Anhand der möglichen Veränderungen z. B. in Physiologie und Verhalten gegenüber gentechnisch unveränderten Mäusen desselben Stammes können die Folgen der Ausschaltung des fraglichen Gens untersucht und mithin Rückschlüsse auf die Funktion des Gens gezogen werden. 166

2 4.6 Spezielle Biotechniken Daher eignet sich die ES-Zelltechnik insbesondere für die Bearbeitung neurologischer Fragestellungen, aber auch zur Aufklärung der Mechanismen der Geschlechtsbestimmung, von Keimzelldifferenzierung, der Organ- und Körperentwicklung sowie einer Reihe von immunologischen Fragestellungen. Bei der ES-Zellinjektion werden mithilfe einer entsprechend modifizierten Mikroinjektionsanlage jeweils embryonale Stammzellen in Blastozysten injiziert (Abb. 4.10). Diese Stammzellen werden in den Zellverband der Blastozysten eingegliedert und finden sich später beim geborenen Tier in bestimmten Gewebebereichen wieder. Anschaulich wird dies, wenn z. B. Stammzellen aus schwarzen C 57BL/6-Mäusen in Blastozysten von weißen NMRI-Mäusen injiziert werden und die Jungtiere nach der Fellbildung ein bemerkenswert schwarz-weiß-grau geschecktes Fell aufweisen (Abb. 4.10). Wirklich erfolgreich ist ein solches Experiment erst dann, wenn die Chimärie auch Eingang in die Keimbahn gefunden hat, d. h. wenn sie sich auf die Nachkommen vererbt und erst dann im erforderlichen Umfang untersucht werden kann. Die erste Generation der aus dem ES-Zellexperiment gewonnenen Tiere sind die sog. Chimären, weil sie faktisch aus mehr als 2 Elternteilen hervorgegangen sind; die Individuen der folgenden Generationen bezeichnet man als Knock-out-Tiere. Ein anderes Verfahren mit dem gleichen Ziel wie dem der ES-Zellinjektion ist die Aggregations- Chimärie. Hierbei werden Embryonen im Morula- Stadium (4 8 Zellen) verwendet, deren Hülle, die sog. Zona pellucida, zunächst mit einem geeigneten Reagenz aufgelöst wird. In speziellen Embryonengläsern werden Klümpchen von je embryonalen Stammzellen in einem geeigneten Medium (z. B. M 16) vorbereitet. Auf beiden Seiten eines solchen Stammzellklümpchens wird dann mit der Mikrosonde je ein hüllenloser Morula- Embryo angelagert, wo er sich durch die dabei wirksam werdende Adhäsionskraft anheftet. In dieser Sandwich -Anordnung werden die Embryonen über Nacht im CO 2 -Brutschrank aufbewahrt, wobei ein Teil der embryonalen Stammzellen in den Zellverband der Embryonen aufgenommen und auf diese Weise Bestandteil des Organismus des späteren Tieres wird. Nach erfolgreicher Aggregation werden die Embryonen in scheinträchtige Empfängerweibchen implantiert und auf normalem Wege ausgetragen Genotypisierung Die Zucht genetisch veränderter Tiere bedingt die Auswahl von Tieren mit den gewünschten genetischen Eigenschaften aus der vorhandenen Population. Hierfür muss beim Generationswechsel der Genotyp der Nachkommen durch DNA-Analysen bestimmt werden. Für diese sog. Genotypisierung müssen den Tieren Gewebeproben entnommen werden, die für die Präparation von DNA verwendet werden. Meist wird diese Maßnahme mit dem Absetzen und nach der Kennzeichnung der Jungtiere durchgeführt. Sowohl für die Probengewinnung als auch für die eigentliche Genotypisierung stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Nichtinvasive Verfahren, die auf der Gewinnung von DNA aus Haarbulbi, Speichel oder Kolonepithelzellen beruhen, sind unter Praxisbedingungen schwierig durchführbar und störungsanfällig. Sie spielen deshalb im Routinebetrieb versuchstierkundlicher Einrichtungen bislang eine eher untergeordnete Rolle. Die überwiegende Zahl der tierexperimentell tätigen Wissenschaftler entfernt zur Genotypisierung von Mäusen und Ratten ein kleines Stück der Schwanzspitze (sog. Schwanzbiopsie). Üblicherweise ist ein wenige Millimeter langes Gewebestück ausreichend. Sofern die Schwanzbiopsie bei absetzreifen oder gerade abgesetzten Tieren durchgeführt wird, ist üblicherweise weder Narkose noch Analgesie erforderlich. Allerdings sollte die blutende Schnittstelle mit einem Gewebekleber verschlossen werden. Bei Entnahme größerer Gewebemengen (mehr als 5 mm Schwanzspitze) sowie bei Wiederholungseingriffen bzw. bei erwachsenen Tieren sollte eine Lokalanästhesie mit Kältespray oder alternativ eine kurze Inhalationsanästhesie vorgenommen werden (Abb. 4.11). Für die Durchführung der Schwanzbiopsie wird die Schwanzspitze auf einem Tupfer platziert und die Schwanzspitze mit einer Klinge abgesetzt. Unmittelbar anschließend erfolgt der Wundverschluss durch Aufbringen von Gewebekleber. Die Gewebeprobe muss bis zur Aufarbeitung im Labor tief gekühlt ( 18 C) aufbewahrt werden. Bei der Verwendung einer Klinge für mehrere Tiere sollte die Gefahr einer DNA-Verschleppung bedacht werden. Vereinzelt wird empfohlen, das bei der Ohrlochung zwecks Markierung der Tiere anfallende Gewebestück für die Genotypisierung einzusetzen. Hier gilt es allerdings zu bedenken, dass es beim Einsatz der Ohrlochzange bei mehreren Tie- 167

3 Abb Für die Schwanzbiopsie wird der Schwanz des Tieres auf einen Tupfer platziert und mit einer sterilen Klinge die Schwanzspitze abgesetzt. Anschließend erfolgt Wundverschluss mit Gewebekleber (Aufnahme: J. Weiss). ren zur DNA-Verschleppung kommen kann, was möglicherweise eine Verfälschung der Ergebnisse der Genotypisierung zur Folge hat. Auch ist nicht immer sichergestellt, dass das bei der Ohrlochung anfallende Gewebestück ausreichende Mengen an DNA liefern kann. Das Absetzen von Zehen zu Markierungszwecken oder zur Gewinnung von Biopsiegewebe gilt nach allgemeiner Auffassung als Amputation, ist in Deutschland deshalb gemäß Tierschutzgesetz grundsätzlich verboten Embryotransfer Unter Embryotransfer versteht man die Übertragung von Embryonen in ein scheinträchtiges 29 Empfängerweibchen. Hierfür wird dieses im Rückenbereich mit einer geeigneten Schermaschine rasiert und der OP-Bereich mit 70 %igem Alkohol 29 Weibchen, die nach Verpaarung mit einem vasektomierten Bock einen Vaginalpropf aufweisen. desinfiziert. Unter Narkose wird ein kleiner Einschnitt vorgenommen, anschließend werden die zu transferierenden Embryonen mit der Transferpipette in die Ampulle des Eileiters gespült (Ovidukttransfer). Von dort gelangen sie durch den Eileiter in den Uterus, wo sie sich bei normalem Verlauf in die Schleimhaut einnisten und schließlich ausgetragen und geboren werden. Wenn es sich bei den Jungtieren um Nachkommen transgener Eltern handelt, müssen sie vor der Weiterzucht durch Analyse einer Gewebeprobe auf Transgenität untersucht werden, wobei meist zwischen 5 und 30 % der geborenen Tiere transgen sind. Bei der ES-Zellinjektion bzw. der Aggregations- Chimärie werden die Embryonen nach der Behandlung über Nacht im CO 2 -Brutschrank aufbewahrt und am nächsten Tag mittels Transferpipette direkt in den Uterus eines scheinträchtigen Empfängerweibchens überführt (Abb. 4.10). Hierzu wird zunächst mit einer Sonde ein winziges Loch in die Uteruswand gestochen, durch das die Transfer pipette in den Uterus geschoben und vorsichtig entleert wird. Der Embryotransfer dient neben dem Einsatz für die beschriebenen Biotechniken auch der Sa- 168

4 4.6 Spezielle Biotechniken nierung hygienisch kontaminierter Stämme und Linien, wobei er ein mindestens ebenso sicheres Verfahren darstellt wie die weiter oben ausgeführte Hysterektomie plus Ammenaufzucht In-vitro-Fertilisation (IVF) Im Versuchstierbereich dient die IVF vor allem dazu, das Genom von männlichen Foundern (s. o.) zu retten, die nicht oder nicht mehr vermehrungsfähig sind. Für die IVF werden die Spermien des betreffenden Männchens aus den Nebenhoden gewonnen und in einem geeigneten Medium mit befruchtungsfähigen Oozyten zusammengebracht (Abb. 4.12). Die befruchteten Eizellen werden anschließend durch Embryotransfer in scheinträchtige Empfängerweibchen transferiert und von diesen ausgetragen und geboren. a Intracytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) Die erfolgreiche Durchführung einer In-vitro-Fertilisation (IVF) hängt davon ab, dass bewegliche, befruchtungsfähige Spermien zur Verfügung stehen. Ist dies nicht der Fall, besteht die Möglichkeit, eine sog. intracytoplasmatische Spermieninjektion vorzunehmen. Hierzu werden zunächst durch eine spezielle apparative Behandlung die Schwanzteile der Spermien abgetrennt und schließlich die Spermienköpfe mittels Mikrokanüle in die unbefruchteten Eizellen injiziert. Je Eizelle wird ein Spermium injiziert, da die Befruchtung mit mehreren Spermien (Polyspermie) ein hohes Risiko von Missbildungen bzw. anderen pathologischen Veränderungen in sich birgt. Die mithilfe der ICSI befruchteten Eizellen werden in scheinträchtige Empfängerweibchen transferiert und von diesen ausgetragen und geboren Ovartransfer Der Ovartransfer wird eingesetzt, wenn ein weiblicher Founder nicht oder nicht mehr vermehrungsfähig ist. Hierzu werden dem betreffenden Tier unter Allgemeinnarkose nach Laparotomie Teile des Ovars entnommen und einem geeigneten Empfängertier (ebenfalls in Allgemeinnarkose) transplantiert. b c Abb In-vitro-Fertilisation bei der Maus a Oozyte mit zahlreichen Spermien, b Vorkernstadium, ca Stunden nach Befruchtung, c Zweizellstadium ca. 24 Stunden nach der Befruchtung (Aufnahmen: F. Zimmermann) Kryokonservierung Unter Kryokonservierung 30 von Embryonen 31 versteht man ihre Aufbewahrung in Flüssigstickstoff bei 196 C. Zu diesem Zweck werden einem 30 Griech. Kryos = Frost, Eiskälte. Konservierung (lat.) = Aufbewahrung. 31 Mit einer ähnlichen Technik können auch Spermatozyten kryokonserviert werden. 169

5 Spendertier Embryonen in 2- bis 8-Zell-Stadien operativ entnommen (siehe auch Generierung transgener Tiere) und in eine genau abgestimmte Mischung aus Medium und Frostschutzmittel überführt; das Frostschutzmittel entzieht den Embryonen das Wasser und verhindert, dass sich in ihnen gefährliche Kristalle bilden. In einer speziellen Apparatur werden die Embryonen dann nach einem genauen Zeitschema auf Tiefkühltemperatur gebracht und anschließend zur längerfristigen Aufbewahrung in Flüssigstickstoff überführt. Zur sog. Revitalisierung werden die Embryonen auf Zimmertemperatur gebracht und über mehrere Verdünnungsschritte wird das Frostschutzmittel entfernt. Dadurch erreichen die Embryonen wieder ihren ursprünglichen Wassergehalt und werden anschließend mittels Embryotransfer in scheinträchtige Empfängerweibchen überführt und von diesen ausgetragen. Mithilfe der Kryokonservierung können zurzeit nicht benötigte Spezialstämme oder transgene Linien in sogenannten Kryo-Tierstammbanken über längere Zeit erhalten werden, ohne dass mit diesen Tieren weitergezüchtet werden muss. Infolge der ausfallenden Generationsfolgen ist das Risiko auftretender Mutationen gegenüber einer normalen Weiterzucht stark reduziert. Auch für Transportzwecke eignen sich kryokonservierte Embryonen, wobei das Infektionsrisiko minimal gehalten werden kann. Wiederholungsfragen 1. Was versteht man unter Ammenaufzucht? 2. Welche Methoden der Schnittentbindung gibt es? 3. Was ist ein transgenes Tier? 4. Wie wird ein Embryotransfer durchgeführt? 5. Was versteht man unter Kryokonservierung und wie wird sie durchgeführt? Literatur Nagy A, Gertsenstein M, Vinersten K, Behringer R. Manipulating the Mouse embryo a laboratory manual. NY: Cold Spring Harbor; 2002 Joyner AL. Gene Targeting A Practical Approach. Oxford: University Press; 2000 Clarke AR. Transgenesis Techniques Principles and Protocols. Humana Pres; 2001 Pinkert CA. Transgenic Animal Technology. A Laboratory Handbook. Academic Press; Zucht der wichtigsten Versuchstierarten Maus Heute existieren mehr als 500 Inzuchtstämme und viele tausend verschiedene transgene bzw. Knockout-Linien der Maus mit unterschiedlichen Eigenschaften; jährlich kommen viele neue hinzu. Der älteste Inzuchtstamm (DBA) wurde in den Jahren von Little entwickelt. Dies bedeutet bei ca. 3 Generationen pro Jahr, dass dieser Stamm bis zum Jahr 2000 über 230 Generationen 32 in reiner Inzucht betrieben wurde. Daneben werden zahlreiche Auszuchtstämme verwendet. Geschlechtsreife, Brunstzyklus und Paarung Der Zeitpunkt der Geschlechtsreife ist bei der Maus abhängig vom Stamm, vom Ernährungszustand und der Zahl der Wurfgeschwister. Mäuse aus kleinen Würfen im guten Ernährungszustand werden schneller geschlechtsreif als Mäuse von größeren Würfen in schlechtem Ernährungszustand. Die Öffnung der Vagina erfolgt mit etwa 35 Tagen bei einer Spanne von Tagen. 1 2 Tage nach der Öffnung stellt sich die erste Brunstperiode ein. Die Männchen werden mit ca. 4 Wochen (28 35 Tage) geschlechtsreif. Die maximale Fertilität der Mäuse liegt im Alter zwischen 100 und 300 Tagen. Wenn der Brunstzyklus nicht durch Trächtigkeit, Scheinträchtigkeit oder andere, ggf. soziale Ursachen unterbrochen wird, kommt ein Weibchen alle 4 5 Tage in die Brunst (Östrus) und ist paarungsbereit. Die Paarung selbst findet i. d. R. während der Dunkelphase statt. Östruszyklus und Ovulationszeitpunkt werden bestimmt durch den jeweiligen Hell-Dunkel- Rhythmus. Um einen regulären Östruszyklus aufrechtzuerhalten, bedarf es einer Hellphase von Stunden und einer Dunkelphase von Stunden Dauer. Das Erreichen der Östrus phase, Paarung und Ovulation finden üblicherweise während der Dunkelphase statt. Eine stattgefundene Paarung bei der Maus (stets werden Weibchen zum Männchen in dessen Käfig gesetzt und nicht umgekehrt!) kann man üblicherweise am Vorhan- 32 Zur Veranschaulichung: Bei einer angenommenen Generationendauer von 30 Jahren ist die Menschheit heute in der 67. Generation seit Christi Geburt! 170