Assistierte Reproduktionstechnologien (ARTs) in der Maus: Trojanische Pferde in der Versuchstierhaltung?
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- Florian Dieter
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1 Assistierte Reproduktionstechnologien (ARTs) in der Maus: Trojanische Pferde in der Versuchstierhaltung? PD Dr. Esther Mahabir-Brenner Altromin, 3/2012
2 Ziel Risikoeinschätzung einer Übertragung von Infektionserregern auf Mäuse mittels assistierten t Reproduktionstechnologien t i (I) Spermien, Embryonen (Embryotransfer/Hygienesanierung) (II) Embryonale Stammzellen (Herstellung genmodifizierter Mäuse) Infektionserreger: Maus Hepatitis Virus (MHV), Minute Virus of Mice (MVM) 2
3 Schema eines Mausarchivs Wissenschaftler = Depositor medizinisch i i wertvolle mutante, transgene oder knock-out out Mauslinien Archivierung Embryofreezing Embryonenarchiv Spermfreezing Spermienarchiv Rederivation Auftauen in-vitro-fertilisation Embryotransfer Hygieneuntersuchung Genotypisierung Expansionszucht wissenschaftliche Gemeinschaft 3
4 Gewinnung von in vivo Embryonen und Embryotransfer Schenkel, :100 Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. Manipulating the Mouse Embryo. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2003.
5 Spermatozoa und Eizellen Blut bei der Vorbereitung der Spermatozoa Sutton et al., 2003, Human Reprod; Spermatozoa: dringen in die Eizelle hinein, sperm tracks, Mikroporen in der ZP
6 In vitro produzierte Embryonen Fertilisation medium 200µl HTF D1 Culture medium 4x 100µl KSOM D2, D3, D4, D5 Culture medium 100µl KSOM D6 Holding medium 4x 100µl M2 D7, D8, D9, D10 Holding medium 100µl M2 D11 1 h nach der Befruchtung : Eizellen mit Kumuluszellen, Spermien 4 h nach der Befruchtung: Eizellen mit abgelösten Kumuluszellen, Spermien 5 h nach der Befruchtung: Eizellen gewaschen 24 h nach der Befruchtung: 2-Zell-Embryonen, 1-Zeller und degenerierte Zellen
7 Spermatozoa Agent Size (nm) Site References MCMV Testes Dutko and Oldstone, 1979 MHV Testes and epididymis Scavizzi and Raspa, 2004, 2006 Sperm Zhang, 2008 (RADIL) MPV Sperm Agca et al, 2007 Sperm Zhang, 2008 (RADIL) Sperm Besselsen et al., 2008 MNV 30 Sperm Zhang, 2008 (RADIL) TMEV Sperm Zhang, 2008 (RADIL) MMVi Sperm, testes, epididymidis, penis, accesssory glands Janus et al Helicobacter typhlonius 300 x Testes and epididymis Scavizzi and Raspa, 2004, 2006 Helicobacter spp. Sperm Zhang, 2008 (RADIL)
8 Washing protocol 1) Percoll treatment Not effective for MPV: Agca et al.: ) Resuspension of spermatozoa in 400 µl NaCl, centrifugation at 500 x g 1, 3, or 5 washing steps: Not effective for MVMi: Janus et al., 2009
9 Untersuchungen mit Embryonen Zona Pelluzida (ZP): gilt als effektive natürliche Barriere für Keime in verschiedenen Spezies und verhindert somit deren Übertragung während des Embryotransfers Mengovirus (27-28 nm groß) und Coxsackie-B Virus (30 nm groß) überquerten die ZP von murinen Embryonen Abhängig von der Virusgröße können Mikroporen ( nm) in der ZP trotz des Waschens Viren beherbergen Lasermanipulation der ZP und in vitro Befruchtung mit Spermien und Eizellen von infizierten Mäusen (erhöhtes Risiko?) Übertragung von Infektionserregern auf Mäuse
10 Übertragung von MHV-A59 mittels in vitro produzierten Embryonen Fertilisation medium 200µl HTF D1 Culture medium 4x 100µl KSOM D2, D3, D4, D5 Culture medium 100µl KSOM D6 Holding medium 4x 100µl M2 D7, D8, D9, D10 Holding medium 100µl M2 D11 IVF with MHV-A59, Culture with MHV-A59 Zona-intact oocytes (Group 1) IVF with MHV-A59, Culture without MHV-A59 Zona-intact oocytes (Group 2) IVF with MHV-A59, Culture without MHV-A59 Laser-manipulated oocytes (Group 3) Drops with MHV-A59 - Drops without MHV-A59 D = Drop IVF mit Laser-manipulierten/intakten Eizellen und kryokonservierten Spermatozoen, 10 8 TCID 50 /ml MHV-A59, ET
11 Keine Übertragung von MHV-A59 mittels in vitro produzierten Embryonen Experimentelle Gruppen Gruppe 1 HTF, KSOM, M2 mit MHV-A59 Gruppe 2 HTF mit MHV-A59 Gruppe 3 HTF mit MHV-A59 + Laser Kontrolle (Transfer mit M2) Serokonversion (Anzahl positiver/anzahl positiver Rezipienten) Tag 21 Tag 28 Tag 42 9/14 10/14 10/14 0/12 0/12 0/12 0/14 0/14 0/14 0/8 0/8 0/8 Peters, D., Marschall, S., Mahabir, E. et al., Biol. Reprod., 74:246-52, 2006.
12 Übertragung von MVMp mittels in vivo produzierten Embryonen Blastozysten 2-Zeller 16h 1h 16h 1h Ungewaschen/gewaschen Ungewaschen/gewaschen Ungewaschen/gewaschen Ungewaschen/gewaschen 10 2 / / / / Waschschritte: 10 bis 100-fach Virusreduzierung Serokonversion bis Tag 42 Antikörper in Nachkommen, wenn die Rezipienten bis Tag 21 serokonvertierten, seronegativ bis Tag 133 (112) nach dem ET Minimum Titer an MVM, der zur Serokonversion führte: 10 2 TCID 50 /ml Risiko einer MVM-Übertragung während des ETs, wenn der Titer 10 4 TCID 50 /ml 12 Mahabir et al., Biol. Reprod., 76: , 2007.
13 Risiko ik einer Virusübertragung mittels in vivo produzierten Embryonen hängt von der Virusgröße ab Embryonen Zunehmende Konzentration MHV MVM Zunehmende Konzentration ti nm 20 nm 10 x Waschen Embryotransfer Virusübertragung Nein Nein Nein Ja SPF SPFSPF SPF SPF SPFSPF SPF SPF SPFSPF SPF Mahabir et al. Biol. Reprod., 76: , 2007.
14 Keine Übertragung von MVMp mittels in vitro produzierten Embryonen IVF mit kryokonservierten Spermatozoen (C3HeB/FeJ), 10 4 TCID 50/ml MVMp, ET Numb ber of culture dishes s IVIA PCR D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Drops (D) of medium Kein infektiöses MVM ab Waschtropfen 6 Kein MVM in den IVF Embryonen Kein MVM in den Rezipienten und Nachkommen (PCR mit mesenterialen Lymphknoten und Dünndarm) Keine Serokonversion der Rezipienten und Nachkommen
15 Kumuluszellen verhindern eine Übertragung von MVMp mittels IVF-Embryonen IVF mit Eizellen mit und ohne Kumuluszellen (Hyaluronidase: 300 µg/ml for 2-3 min), 10 4 TCID 50 /ml MVMp, ET Group 1: IVF with MVMp, Culture without MVMp, Cumulus-enclosed oocytes Group 2: IVF with MVMp, Culture without MVMp, Cumulus-free oocytes Group 3: IVF without MVMp, Culture without MVMp, Cumulus-enclosed oocytes IVF + MVMp + Kumuluszellen dishes Number of culture IVIA PCR D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Drops (D) of medium IVF + MVMp - Kumuluszellen PCR IVIA D11: 2/11 0/11 Embryonen: 5/11 0/11 ber of culture dishes Num IVIA PCR PCR IVIA D11: 5/14 1/14 Embryonen: 4/9 0/9 0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Drops (D) of medium
16 Kumuluszellen ll verhindern eine Übertragung von MVMp mittels IVF-Embryonen Seropositive Mäuse Tage nach dem ET Experimentelle Gruppe Rezipienten Nachkommen IVF mit MVMp und mit Kumuluszellen 0/6 0/6 0/6 0/6 0/25 0/14 IVF mit MVMp und ohne Kumuluszellen 0/15 2/15 2/15 2/15 4/28 0/13 IVF ohne MVMp und mit Kumuluszellen 0/6 0/6 0/6 0/6 0/25 0/13 Seropositive Rezipienten und Nachkommen nach IVF mit Eizellen ohne Kumuluszellen Alle Rezipienten und Nachkommen waren MVM-negativ mittels PCR Kumuluszellen nehmen MVMp auf (nach Ko-inkubation mit 10 4 TCID 50 /ml MVMp für 5h) Kumuluszellen L929 Zellen Durchschnitt der Wiederholungen (4-5) 10 5 Zellen Überstand 10 5 Zellen Überstand
17 Ovaries, Oocytes, and Embryos Virus Size (nm) Infection of oocytes/ embryos Zona Penetration Reference LCMV Oocytes and embryos yes Mims, 1966 Polyoma trophoderm no Abramzuck et al, 1978 Sendai Embryos yes Lavilla-Apelo et al, 1991,1992 Tuffrey et al, 1972 MCMV Microinjected oocytes Tebourbi et al 2002 MHV Ovary Scavicci and Raspa, 2004 Ovary and oocytes Zhang, 2008 (RADIL) MMV embryos Mahabir et al., 2007 Cumulus cells Mahabir et al., 2009 Ovary, oviduct, uterus, Oocytes Janus et al., 2009 MPV Ovary and oocytes Agca et al., 2007 Oocytes and embryos Zhang, 2008 (RADIL) MNV 30 Oocytes and embryos Zhang, 2008 (RADIL)
18 Untersuchungen mit embryonalen Stammzellen Intensiver Gebrauch und Austausch von ES-Zellen zwischen Laboratorien Unbekannter mikrobiologischer Status der ES-Zellen Mangel an Information über die Effekte von Viren auf ES-Zellen Risiko einer Ausbreitung von Kontaminationen Effekte von MHV-A59, MVMp auf ES-Zellen (TBV-2, 129S2/SvPas, GGTC): - Wachstum - Keimbahntransmission
19 ES-Zellen sind restriktive Wirte für MVM, restrictive virus-cell interaction P13, Feeder-frei auf Gelatin (+5), 10-1 TCID 50 /ES-Zelle, Passage alle 2 Tage, 4-5 Passagen produktive Infektion mit MHV-A59 jedoch nicht mit MVMp Passage MHV-A59 (TCID 50 /ml) MVMp (TCID 50 /ml) Culture 1 Culture 2 Culture 1 Culture 2 P >10 10 > P > P P P n. d. n. d Cel l number (mean ± SEM M) Weniger ES-Zellen mit MHV-A59 abc a Control MMV ab ab MHV abc abc abc abc bc bc bc c P P P P Passage number Mahabir et al., Transgenic Research, 18: 45-57, 2009.
20 Keine Keimbahntransmission nach Blastozysteninjektion mit MHV A59- (P13+5+4) und MVMp- (P13+5+5) exponierten ES-Zellen Period of culture and viral dose per mesc 6h P13+5+4/5 Parameter TCID 50 MHV Control Control TCID 50 ES TCID 50 TCID 50 ES MVM Medium MHV MVM Medium Progeny/embryos transferred (%) 34/50 30/50 16/30 16/110 22/120 19/40 (68) b (60) b (53) b (15) c (18) c (48) b Seropositive litters (no. mice) 0/5(0) a 0/5(0) 0/3 (0) 5/5 (16) b 0/6 (0) 0/4 (0) Germline chimeras/chimeras 8/17 3/3 3/3 0/0 (0) 0/0 (0) 5/8 Progeny/germline chimera Mahabir, E., Transgenic Research, 18: 45-57, 2009.
21 1) Mäuse Aktuelle Hygienezeugnisse Mäuse unter Quarantäne stellen Risikominimierungik i i i 2) Hygiene Hygienesanierung, KEINE lebenden Mäuse 10-fache Waschschritte, 1:100 Verdünnung, in-vivo- oder in-vitro-produzierte Embryonen Transfer von einem Mindestvolumen an Medium zusammen mit Embryonen Hygieneuntersuchung von jedem Rezipienten nach dem Absetzen (wt-nachkommen) Mikrobiologische Untersuchung von biologischen Materialien (ES-Zellen): PCR, MAP-Test 3) Haltung IVC Haltung 4) Management Standard Operating Procedures (SOPs) Umsetzung der Forschungsergebnisse > aktueller Stand Beitrag zum 3R-Konzept: reduction, refinement, replacement
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