Das Europäische Mausmutantenarchiv (EMMA) und neueste Entwicklungen der Cryobanking-Technologie
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- Hannah Rothbauer
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1 Das Europäische Mausmutantenarchiv (EMMA) und neueste Entwicklungen der Cryobanking-Technologie GRUNDLAGEN DER VERSUCHSTIERKUNDE ALTROMIN-SYMPOSIUM Detmold Dr. Auke Boersma 1
2 Das europäische Mausmutantenarchiv (EMMA): Hintergrund, Ziele und Status 2
3 Die Maus als Tiermodell Die Maus ist eines der wichtigsten Modelle für das Verständnis der Funktion des Säugergenoms Grundsätzliche Ähnlichkeit mit Menschen auf Genebene (>95%) und in Anatomie und Physiologie Genetische Studien seit 100 Jahren Umfassendes Toolkit für die Manipulation des Mausgenoms steht zur Verfügung, teilweise im High throughput -Verfahren ( EUCOMM, IKMC) Tausende von medizinisch relevanten Mausmutanten wurden und werden mit exponentiellem Wachstum produziert 3
4 Epidemische Zivilisationskrankheiten Mensch Maus Sehr häufig (18-25% der D BMI>30; 5(-8?) Mill. Diabetiker) Genetische Einflüsse und Umwelteinflüsse Adipositas Diabetes Multifaktoriell 4
5 Seltene genetische Erkrankungen Mensch Relativ selten Oft monogenetisch Maus Osteogenesis imperfecta ( Glasknochenkrankheit ) Waardenburg- Syndrom 5
6 Das Europäische Mausmutantenarchiv Was tun mit diesen Tausenden Mutanten? Kein einzelnes Archiv kann alle diese Mausmutanten kryokonservieren und verteilen Notwendigkeit eines zentral organisierten Archivs Ziel gemeinsames europäisches Depot von humanmedizinisch relevanten Mausmutanten aufbauen und der weltweiten wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung stellen 6
7 Das EMMA-Netzwerk FCG, Oeiras, Portugal MRC-MGU, Harwell, Großbritannien CNB-CSIC, Madrid, Spanien CNRS-TAAM, Orleans, WTSI & EMBL-EBI ( DB) Hinxton, Großbritannien IMG, Prag, Tschechien Frankreich GIE-CERBM-ICS, Straßburg, HMGU-IEG, Frankreich München, Deutschland CNR-IBC, Monterotondo, Italien KI-CMB, Stockholm, Schweden University of Oulu, Oulu, Finnland VMU-Biat, Wien, Österreich Fleming, Vari/Athens, Griechenland ARCHIVIERUNG/VERTEILUNG: (1) Helmholtz Zentrum München, IEG, München, Deutschland (2) CNR-IBC, Monterotondo, Italien (3) CNRS-TAAM, Orleans, Frankreich (4) GIE-CERBM-ICS, Illkirch bei Straßburg, Frankreich (5) MRC-MGU, Harwell, Großbritannien (6) Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Großbritannien (7) Karolinska Institutet-CMB, Stockholm, Schweden (8) FCG, Oeiras, Portugal (9) CNB-CSIC, Madrid, Spanien (10) Fleming, Vari/Athens, Griechenland (11) IMG, Prag, Tschechien (12) University of Oulu, Oulu, Finnland (13) VetMedUni Vienna, Biomodels Austria, Wien, Österreich DATENBANK: EMBL-EBI, Hinxton, Großbrittanien 7
8 EMMA Workflow: Archivierung für europäische Wissenschaftler Kostenfrei (finanziert von EU FP7) Submission mit allen relevanten Daten der Mausmutante Evaluation durch unabhängiges Gremium Versand der Mäuse EMMA-Knoten Archivierung als Embryonen oder Spermien 8
9 Online-Submission bei 9
10 Submission form 10
11 EMMA Workflow: Verteilung für Wissenschaftler weltweit ( Wissenschaftler stellt Request bei Paper work: Material Transfer Agreement von beiden Seiten unterzeichnet Innerhalb 4 Wochen: Versand des Materials / der Mäuse Wissenschaftler Kosten: für gefrorenes Material; für lebende Mäuse 11
12 Entwicklung der Submissions (kumulativ) 12
13 Entwicklung der Requests (pro Jahr) 13
14 Weitere EMMA-Ziele und Aktivitäten Gnotobiotischer Service: Erstellung keimfreier Mäuse Disseminierung von Wissen: Cryo-Kurse Bereitstellung von SOP s auf EMMA protocols Entwicklung von Wissen Technology Development 14
15 Neueste Entwicklungen der Cryobanking- Technologie 15
16 Milestones Kryokonservierung Maus 1958 Ovargewebe 1972 Embryonen Slow Freezing (Whittingham, Leibo, Mazur) Mausembryobanken in UK, USA, Japan 1985 Embryo Vitrifikation 1999 Minimalvolumen-Vitrifikation 2010 Hochosmolalitäts-Equilibrium- Vitrifikation 16
17 Kryokonservierung Mausspermien - Milestones 1990 erste erfolgreiche Kryokonservierung von Mausspermien (3 jap. Gruppen unabh. voneinander) 1990er Jahre: Nakagata-Methode (CPA: 18% Raffinose, 3% Magermilch) wird Standard bei C57BL/6 und 129 nur unbefriedigend 1995 Intrazytoplasmatische Spermieninjektion 1997 Partielle Zona Dissection Steigerung der Befruchtungsrate Ab 2008 Zugabe von bestimmten Substanzen in Medien Steigerung der Befruchtungsrate 17
18 Embryonenproduktion und Freezing Embryonengewinnung Mäuse In-vitro (IVF) 2-Zellembryonen Morulae In vivo Verpaarung Maus nach 1 Tag nach 3 Tagen Embryofreezing oder Vitrifikation 18
19 Sperm Freezing & IVF vs. EF Vorteile Weniger Spendertiere nötig Schnell (<1Std.) Embryonen werden nur bei Bedarf erzeugt Ökonomisch ABER ZU BEACHTEN: IVF (In vitro Fertilisation) muss etabliert sein IVF-Weibchen zukünftig kommerziell verfügbar? ( nur Standard-Backgrounds) Bestimmte Backgrounds (C57BL/6 und 129) immer noch problematisch 19
20 Sperm Freezing Nebenhoden Feinpräparation Aufschneiden im CPA Standard-CPA: 18% Raffinose, 3% Magermilch; Modified CPA : Monothioglycerol, L-Glutamin Straw mit Spermienprobe LN2 Dampf (bis -160 C Abschätzung der Spermienmotilität EMMA und neuste Entwicklungen der Cryobanking Technologie LN2-Tank
21 Wiederbelebung von Spermien: In vitro Fertilisation (IVF) Zeitlicher Ablauf Tag 3: IVF Schalen Tag 4: Spermien auftauen Tag 4 Spermien in IVF-Schale Tag 1 18:00 PMSG Tag 3 18:00 HCG ab 7:30 Gewinnung der Eileiter Cumulus-OozytenKomplexe Tag 4: Waschen der Oozyten / Zygoten in frisches Medium (HTF oder KSOM) 3 Wo. ET Tag 5 8:00 Uhr 2-Zeller ET EMMA und neuste Entwicklungen der Cryobanking Technologie
22 IVF mit gefrorenem Sperma: Stamm-Unterschiede Die meistbenutzten Backgrounds, C57BL/6 und 129 erzielten in der frozen sperm-ivf Raten <10% ( Black6-Problem ) 22
23 Lösung 1: New Jax (MTG) method Verbesserung der Befruchtungsrate bei allen Stämmen durch Zusatz von MTG (Monothioglycerol) zum CPA 129X1/SvJ ~ 25% C57BL/6J ~40% Ostermeier GC, Wiles MV, Farley JS, Taft RA (2008) Conserving, Distributing and Managing Genetically Modified Mouse Lines by Sperm Cryopreservation. PLoS ONE 3(7) 23
24 Lösung 2: CARD Methode (C57BL/6J) Zusatz von L-Glutamin zum CPA Spermien-Präinkubation mit MBCD (Methyl-betacyclodextrin) reduziertem Glutathion CARD: Center for Animal Resources and Development, Kumamoto University, Japan; Toru Takeo and Naomi Nakagata Reduced Glutathione Enhances Fertility of Frozen/Thawed C57BL/6 Mouse Sperm after Exposure to Methyl-Beta-Cyclodextrin Biol Reprod November (5)
25 Wenn alle Stricke reißen Assisted Fertilization Laser IVF Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) 25
26 Detaillierte SOPs auf 26
27 Aktueller Stand des Cryobanking Tendenz zu Sperm Freezing (JAX oder CARD Methode) Vorteilhaft bei High Throughput Erzeugung von Mausmutanten (EUCOMM-Projekt) Embryo-Freezing: Europa und USA routinemäßig Slow Freezing, Japan Vitrifikation Versand von Frisch-Embryonen (gekühlt) als Alternative 27
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