In-vitro-Embryonenerzeugung bei Pferden: Stand und Perspektiven

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1 Züchtungskunde, 80, (6) S , 2008, ISSN Eugen Ulmer KG, Stuttgart In-vitro-Embryonenerzeugung bei Pferden: Stand und Perspektiven W. Kanitz 1 Herrn Prof. Dr. Drs. h.c. Georg Schönmuth zum 80. Geburtstag gewidmet 1 Einleitung Die In-vitro-Erzeugung von Embryonen ist eine Reproduktionstechnik, bei der Embryonen außerhalb des mütterlichen Organismus erzeugt werden. Eine etwas umfassendere Definition bringt zum Ausdruck, dass es sich dabei um einen Methodenkomplex handelt, bei der aus Eizellen und Spermatozoen unter Laborbedingungen präimplantative transfertaugliche Embryonen werden. Die Ziele der Verfahrensentwicklung und -anwendung bestehen in der Erweiterung von Kenntnissen über die Reproduktionsbiologie beim Pferd. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, mit dem Verfahren eine Alternative zur konventionellen Embryonengewinnung zu entwickeln, was aufgrund der nicht zufrieden stellenden Ergebnisse nach Superovulationsbehandlung von Interesse ist. 2 Verfahrensschritte Das Verfahren beginnt mit der Gewinnung und Beurteilung von Eizellen. Für eine Gewinnung von Eizellen in vitro stehen die Verfahren der Follikelaspiration am isolierten Organ, die Methode der Follikelisolierung mit anschließender Eröffnung der Follikel sowie die Methode der Follikeleröffnung mit anschließender mechanischer Bearbeitung der Follikelwand zur Verfügung (Alm et al., 1997). Sollen Eizellen von lebenden Spendertieren in vivo gewonnen werden, so wird dafür im Regelfall das Verfahren der ultraschallgeleiteten Follikelaspiration genutzt (Kanitz et al., 2000; Kanitz et al., 2003). Mit der letztgenannten Methode können durchschnittlich 3 5 Eizellen pro Spendertier und Aspirationssitzung gewonnen werden. Die Gewinnung wird an stehenden Stuten durchgeführt. Sie kann wöchentlich wiederholt werden, ist auch bei azyklischen Stuten außerhalb der Zuchtsaison anwendbar und wird von den Stuten problemlos vertragen (Kanitz et al., 2003; Gaetano et al., 2005). Die durch ultraschallgeleitete Aspiration gewonnene Follikelflüssigkeit wird unter einem Stereomikroskop durchmustert. Sie enthält in % der Fälle Cumulus-Oozyten- Komplexe (COK), d.h. Eizellen mit anhaftenden Cumuluszellen. Die Ergebnisse der ultraschallgeleiteten Eizellgewinnung werden durch die Faktoren Follikeldurchmesser, Zyklizität und Zyklusstadium, Stute sowie Intervall zwischen den Aspirationssitzungen beeinflusst (Tabellen 1 4). Die Qualität der gewonnenen Cumulus-Oozyten-Komplexe wird im Regelfall unter dem Mikroskop anhand morphologischer Kriterien bewertet. Die Zahl und die Anordnung der die Eizellen umgebenden Cumuluszellen erlaubt eine Einteilung der COK in Klassen und eine Vorhersage über deren Reife- und Intaktheitsgrad (Torner und Alm, 1995). 1 Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Forschungsbereich Fortpflanzungsbiologie, Wilhelm-Stahl-Allee 2, Dummerstorf, wkanitz@fbn-dummerstorf.de

2 486 W. Kanitz Tab. 1. Verteilung aspirierter Follikel auf Follikelgrößenklassen und Gewinnungsrate für COK in Abhängigkeit vom Follikeldurchmesser Allocation of follicles to classes according follicular diameter and recovery rates in dependence on diameter Follikeldurchmesser (mm) < >30 Anzahl punktierter Follikel (n) Anzahl gewonnener COK (n) Gewinnungsrate (%) 38,9 a 28,3 a 6,9 b 8,3 b <a:b> P<0,05 Tab. 2. Ergebnisse der Follikelaspiration in Abhängigkeit vom Zyklusstadium Results of follicular aspiration in dependence on stage of oestrous cycle Zyklusstadium d 5 d 12 azyklisch Anzahl Stuten (n) Anzahl aspirierter Follikel (n) Anzahl gewonnener Oozyten (n) Gewinnungsrate (%) 26,3 a 12,4 b 40,4 c <a:b, a:c, b:c> P<0.05 Tab. 3. Ergebnisse der Follikelaspiration in Abhängigkeit vom Individuum Results of follicular aspiration in dependence on individual mares Stute Anzahl Anzahl Anzahl Gewinnungsrate Aspirationssitzungen aspirierte gewonnene Follikel COK (n) (n) (n) (%) LSM SE LSM SE LSM SE Morante 11 26,5 a 2,0 6,6 a 0,9 26,4 a 3,7 Renette 6 8,6 b 2,7 1,3 b 1,2 10,2 b 5,0 <a:b> P<0,05 Tab. 4. Ergebnisse der Follikelaspiration in Abhängigkeit vom Intervall zwischen den Aspirationssitzungen Results of follicular aspiration in dependence on time interval between aspiration sessions Intervall Anzahl Anzahl Anzahl gewonnene Gewinnungszwischen Stuten Aspirations- aspirierte COK rate Aspirations- sitzungen Follikel sitzungen (n) (n) (n) (n) (%) Σ LSM Σ LSM LSM SE SE SE mindestens ,3 a 134 3,49 c 21,4 e eine Rosse 1,29 0,56 2,1 Ø 7 d ,8 b 146 2,20 d 20,7 e 1,06 0,46 1,9 <a:b> P 0,05, <c:d> P = 0,08

3 In-vitro-Embryonenerzeugung bei Pferden 487 An die Gewinnung der COK schließt sich ihre In-vitro-Reifung an. In Abhängigkeit von der erreichten intrafollikulären Entwicklung werden die COK während der Invitro-Reifung in speziellen Nährlösungen bei C über die Dauer von h inkubiert. Während dieser Zeit vollziehen sich in den Eizellen Prozesse der Kern- und Zellplasmareifung, die Voraussetzung für das Eindringen eines Spermiums und die nachfolgenden ersten Zellteilungen sind. Für eine erfolgreiche Reifung sind die zahlreichen Verbindungen zwischen den Cumuluszellen und der Eizelle sehr bedeutsam. Im Ergebnis der Eizellreifung kommt es zu morphologischen und biochemischen Veränderungen an und in den COK, die mit unterschiedlichen Methoden erkannt werden können. So liegen in den reifen Eizellen spezifische Proteinkinasen in aktiver phosphorylierter Form vor, und die respiratorische Aktivität in den Mitochondrien ist deutlich erhöht (Torner et al., 2007). Von den für eine In-vitro-Reifung ausgewählten Eizellen erreichen % das befruchtungsfähige Entwicklungsstadium der Metaphase II (Alm und Torner, 1994). Die gereiften Oozyten werden nachfolgend für eine In-vitro-Befruchtung verwendet. Voraussetzung dafür ist die Verfügbarkeit befruchtungsfähiger Spermatozoen. Als Quelle für die Gewinnung von Spermatozoen dienen frische bzw. kryokonservierte/aufgetaute Samenportionen, aus denen motile Spermatozoen mit Hilfe des so genannten Swim up-verfahrens angereichert werden. Ähnlich wie die Eizelle müssen auch Spermien reifen, bevor sie befruchtungsfähig sind. Diesen Prozess nennt man Kapazitierung. Er vollzieht sich normalerweise nach dem Deckakt oder nach Besamung im Genitaltrakt der Stute. Unter den Bedingungen einer Befruchtung in vitro muss jedoch auch die Kapazitierung der Spermien im Labor durchgeführt werden. Grundsätzlich geschieht das durch die gemeinsame Inkubation von Spermatozoen und kapazitierenden Substanzen (Alm et al., 2001). Als solche werden Heparin, Koffein, Progesteron, Platelet activating factor (PAF), Kalziumionophor, Epinephrin, Hypotaurin und Lipopolysacharid einzeln oder in Kombination eingesetzt. Am häufigsten werden Heparin und Kalziumionophor verwendet. Die Ergebnisse der Kapazitierung sind sehr variabel und werden beträchtlich durch den Faktor Hengst beeinflusst. Die sich nun anschließende Befruchtung beinhaltet die gemeinsame Inkubation von gereiften Eizellen und Spermatozoen unter Bedingungen, welche die Verhältnisse in vivo, also im Genitaltrakt der Stute, simulieren sollen. Die wesentlichsten Faktoren dieser Simulation sind die entsprechenden Zellkulturmedien, Medienzusätze, Temperatur, Gaskonzentrationen und die Dauer der gemeinsamen Inkubation. Obwohl die genannten Faktoren zweifelsfrei bedeutsam sind, reflektieren sie jedoch nur einen Teil der Faktoren, die in der Stute auf Eizellen und Spermien in der Phase der Reifung, Befruchtung und anschließenden Embryonalentwicklung einwirken. Eine vollständige Simulation der natürlichen Bedingungen ist in vitro jedoch nicht möglich. International werden in den führenden Laboratorien Befruchtungsraten zwischen 15 und 50 % erreicht. Die Ergebnisse sind durch eine große Variabilität gekennzeichnet. An die Phase der In-vitro-Befruchtung schließt sich die Phase der Kultivierung der Embryonen in vitro an. Innerhalb dieses Verfahrensschrittes sollen sich die Befruchtungsprodukte (Zygoten) bis zu solchen Embryonalstadien (Morula, Blastozyste) entwickeln, die problemlos nichtchirurgisch übertragen werden können. Methodisch beinhaltet dieser Abschnitt eine erneute Inkubation des frühen Embryos im Brutschrank über 7 bis 8 Tage. Im Regelfall erfolgt die Inkubation bei Temperaturen zwischen 38 und 39 C und einer Gaskonzentration von 5 % CO 2 in Luft. Für die Inkubation werden verschiedene Medien und Medienzusätze (Hormone, Wachstumsfaktoren) sowie Co-Kulturen (Granulosazellen, Oviduktepithelzellen) verwendet. Die in vitro erzeugten Embryonen können mit den gleichen Embryotransfertechniken auf Empfängertiere übertragen werden wie die nach Uterusspülung gewonnenen Embryonen. Obwohl aus dem Teilschritt Invitro-Befruchtung von Stutenoozyten bereits Fohlen resultieren, gibt es noch keine Nachkommen aus der Kombination aller Teilschritte in vitro.

4 488 W. Kanitz Aufgrund der im Vergleich zum Rind begrenzten Erfolge bei der Erzeugung von Pferdeembryonen in vitro wurde die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) in den Methodenkomplex der In-vitro-Embryonenerzeugung integriert, um die Befruchtungsund Entwicklungsraten zu verbessern. Mit ICSI, bei der eine Samenzelle in eine Eizelle injiziert wird, wird der kritische Schritt der Oozytenpenetration umgangen. Das ist dann bedeutsam, wenn Verfahren der In-vitro-Kapazitation von Spermatozoen ineffizient sind, Spermatozoen aus unterschiedlichen Gründen eine verringerte Befruchtungsfähigkeit besitzen oder wenn nur wenige Spermatozoen zur Verfügung stehen. Letzteres hat eine besondere Bedeutung im Zusammenhang mit der Separierung von Spermatozoen auf Grund des Vorkommens von X- bzw. Y-Chromosomen. ICSI ist auch eine Methode, um Prozesse der Befruchtung zu untersuchen. Die Gewinnung und Reifung der Oozyten erfolgen wie bei der In-vitro-Embryonenproduktion beschrieben. Oozyten, die nach der In-vitro-Reifung einen perivitellinen Spalt, den ausgestoßenen 1. Polkörper sowie ein intaktes Ooplasma aufweisen, werden für das weitere Vorgehen selektiert. Im Anschluss an die Reifung werden die Oozyten durch enzymatische Behandlung und wiederholtes Pipettieren von den umgebenden Cumuluszellen befreit. Die für die ICSI verwendeten Spermien können aus dem Ejakulat, bei isolierten Organen (Schlachtung, Kastration) aus dem Hoden oder den ableitenden Samenwegen (vorwiegend dem Nebenhoden) gewonnen werden. Die Methode der Wahl ist die Benutzung von Spermatozoen aus frischen oder konservierten Ejakulaten. Für eine Anreicherung motiler Spermatozoen wird häufig das so genannte Swim up- Verfahren angewandt. Im Regelfall werden die verwendeten Spermatozoen vor ihrer Benutzung keiner Kapazitationsbehandlung unterzogen. Für die Durchführung der Mikroinjektion wird ein inverses Mikroskop mit entsprechenden Mikromanipulatoren benötigt. Unter dem Mikroskop wird ein Spermium mit dem Spermienschwanz voran in eine feine Injektionspipette mit einem Durchmesser von 5 7µm aufgenommen. Das Spermium wird danach unter Sichtkontrolle in das Zytoplasma einer Oozyte injiziert. Dazu wird die Eizelle mit einer dickeren Glaskanüle (Haltepipette) fixiert. Im Anschluss an die Übertragung der Spermatozoen werden die injizierten Eizellen aktiviert. Methodische Entwicklungen haben zur Nutzung eines Piezo-Drills bei der Injektion der Spermatozoen geführt. Dieser verursacht eine Vibration der Injektionspipette. Dadurch wird nicht nur eine leichtere Penetration der Zona pellucida ermöglicht, sondern es werden auch die Membranen von Spermium und Oozyte aufgebrochen. Über diesen Ansatz konnten die Aktivierung von Eizellen und die Teilungsraten deutlich verbessert werden (Hinrichs, 2005). Das weitere Vorgehen nach der Injektion des Spermiums ist unterschiedlich. Die aus dem Verfahren resultierenden Produkte werden z.t. unmittelbar nach ihrer Erstellung in die Eileiter synchroner Empfängerstuten übertragen. Alternativ dazu können die Produkte in den Eileiter von Zwischenträgern (Maus, Schaf) übertragen werden, um im Stadium der Morula bzw. Blastozyste zurückgewonnen und in die Zielspezies transferiert zu werden. In anderen Untersuchungen wurde vor dem Transfer eine Kultivierung der Produkte über die Dauer von 24 bis 72 Stunden durchgeführt, um Aussagen über die Teilungsrate zu erhalten und Embryonen für den Transfer zu selektieren. Die Methode der Wahl ist jedoch die Inkubation der Produkte in vitro bis zum Erreichen des Morula- bzw. Blastozystenstadiums. Auf diesem Gebiet hat es durch die Verwendung des Zellkulturmediums DMEM/F-12 deutliche Fortschritte gegeben. Embryonen in o.g. Entwicklungsstadien können problemlos nichtchirurgisch übertragen werden.

5 In-vitro-Embryonenerzeugung bei Pferden Ergebnisse Die Entwicklungen auf dem Gebiet der assistierten Reproduktion beim Pferd sind dadurch gekennzeichnet, dass es gelungen ist, Befruchtungen durch die Mikroinjektion eines einzelnen Spermiums in eine Eizelle zu erreichen. Mittels ICSI wurden darüber hinaus bereits geschlechtsgetrennte Hengstspermien in Stuteneizellen injiziert. Insgesamt lassen die bisher vorliegenden Ergebnisse eine Überlegenheit der Methode ICSI gegenüber der konventionellen In-vitro-Fertilisation erkennen (Dell Aquila et al., 1997). Die Differenzen für den Parameter Befruchtungsrate betragen in Abhängigkeit von der Qualität der verwendeten Oozyten 20 bis 30 %. Auch der Parameter Teilungsrate ist nach ICSI besser. Die Blastozystenraten nach In-vitro-Kultur liegen zwischen 23 und 44 %. Nach Anwendung des Verfahrens konnten Trächtigkeitsraten bis zu 50 % erreicht werden. Als nachteilig ist der bisher vergleichsweise hohe Anteil embryonaler Verluste zu bewerten. 4 Schlussfolgerungen und Ausblick Die In-vitro-Erzeugung von Embryonen kann eine echte Alternative zur herkömmlichen Embryonengewinnung sein. Die praktische Anwendbarkeit des Verfahrens ist jedoch noch nicht gegeben. Durch entsprechende Forschungsarbeiten sind Ergebnisverbesserungen bei allen Teilschritten des Verfahrens zu erwarten. Das Verfahren ICSI bei Pferdeoozyten ist grundsätzlich als Technik zur Embryonenerzeugung in vitro geeignet. Die einzelnen Verfahrensschritte bedürfen jedoch einer weiteren Optimierung. Zusammenfassung Der Beitrag gibt einen Überblick über den Stand und die Perspektiven der In-vitro-Embryonenerzeugung bei Pferden. Ausgehend von der Definition der Reproduktionstechnik werden nachfolgend die Verfahrensschritte besprochen und die Ergebnisse auf dem Gebiet dargestellt. Der Überblick schließt mit einem Ausblick bezüglich der Entwicklung der Technik. Schlüsselwörter: Pferd, Follikelaspiration, Embryoerzeugung in vitro, In-vitro-Reifung, In-vitro-Befruchtung, ICSI Literatur Alm, H. and H. Torner (1994): In vitro maturation of horse oocytes. Theriogenology 42, Alm, H., H. Torner, W. Kanitz, F. Becker and K. Hinrichs (1997): Comparison of different methods for recovery of horse oocytes. Equine Vet. J., Suppl 25, Alm, H., H. Torner, S. Blottner, G. Nürnberg and W. Kanitz (2001): Effect of sperm cryopreservation and treatment with calcium ionophore or heparin on in vitro fertilization of horse oocytes. Theriogenology 56(5), Dell Aquila, M. E.; Y. S. Cho, P. Minoia, S. Fusco, G.M. Lacalandra and F. Maritato (1997): Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) versus conventional IVF on abattoirderived and in vitro-matured equine oocytes. Theriogenology 47, Gaetano, M., B. Merlo, E. Iacono and S. Belluzzi (2005): Fertility in the mare after repeated transvaginal ultrasound-guided aspirations. Anim. Reprod. Sci. 88,

6 490 W. Kanitz Hinrichs, K. (2005): Update on equine ICSI and cloning. Theriogenology 64, Kanitz, W., H. Alm, F. Becker, G. Nürnberg, J. Kurth and K. Hinrichs (2000): Repeated follicle aspiration in mares: consequences for follicle growth and oocyte quality. J Reprod. Fert., Suppl. 56, Kanitz, W., F. Becker, H. Alm, H. Torner and G. Nürnberg (2003): Ovum pick up in horses: Results and consequences for follicular growth and oocyte quality. Pferdeheilkunde 19, Squires, E. L., E.M. Carnevale, P. M. McCue and J. E. Bruemmer (2003): Embryo technologies in the horse. Theriogenology 59, Torner, H. and H. Alm (1995): Meiotic configuration of horse oocytes in relation to the morphology of the cumulus-oocyte-complex. Biol. Reprod. 1, Torner, H., H. Alm, W. Kanitz, K. Göllnitz, F. Becker, R. Pöhland, K.-P. Brüssow and A. Tuchscherer (2007): Effect of initial cumulus morphology on meiotic dynamic and status of mitochondria in horse oocytes during IVM. Reprod. Dom. Anim. 42, In vitro embryo production in horses: state of the art and perspectives by W. Kanitz The paper gives a summary of the state of the art and the prospects of the in vitro embryo production in horses. After giving a definition of the reproduction technology the steps of embryo production are described and the results are represented. The review closes with conclusions regarding the development of the technology. Keywords: Horse, follicular aspiration, embryo production in vitro, in vitro maturation, in vitro fertilisation, ICSI