Biologische Grundlagen. Silke Trißl, April 2005
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1 Biologische Grundlagen Silke Trißl, April 2005
2 : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 2 Überblick Biologie Organismen Aufbau von Zellen Prokaryoten und Eukaryoten Genom und DNA Transkription DNA RNA Protein Proteine Regulatorische und metabolische Netzwerke Human Genome Project 2. Teil: Überblick Techniken
3 : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 3 Orgainsmen Prokaryoten Eukaryoten Archaea gram pos. Bakterien Protozoa (Einzeller) Tiere Pflanzen Pilze Algen Cyanobakterien Methanobakterien halophil Ursprünglicher Organismus
4 Beispiele Escherichia coli Bakterium (Prokaryot) lebt im Darmtrakt von Tieren und Menschen Modellorganismus der Biologie Saccharomyces cereviciae Eukaryot Bäckerhefe bildet Sporen 1µm 5µm : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 4
5 Größen in der Biologie : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 5
6 Aufbau von Zellen Prokaryoten Ringförmiges Genom kann Plasmide enthalten tragen auch Informationen (DNA) wichtig für das Klonieren Eukaryoten Genom im Zellkern besitzt noch weitere Kompartemente Golgi-Apparat (Transport) Mitochondrien (Energie) Lysosom (Verdauung) : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 6
7 Funktion der DNA DNA: Träger von Erbinformationen Codiert für funktionelle Produkte wie Proteine oder RNA Genom: Gesamtheit der DNA in einer Zelle Sprich: alle Gene in einer Zelle Millionenfach kopiert Ohne wesentliche Veränderung Wird an Tochterzellen weitergegeben : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 7
8 : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 8 Jahrestag James Watson, Francis Crick Molecular Structure of Nucleic Acids Nature, 1 Seite This structure has two helical chains each coiled around the same axis Basiert auf Arbeiten von Wilkins & Franklin Nobelpreis 1962 for their discoveries concerning the molecular structure of nucleic acids and its significance for information transfer in living material
9 : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 9 Struktur der DNA DNA Desoxyribonucleic acid Doppelsträngig Komplementäre Basen Adenin Thymin (A T) Guanin Cytosin (G C) Allgemeiner Aufbau Zuckerphosphat-Gerüst Basen Besitzt Richtung 5 3 (sprich: drei-strich) Windet sich um sich selbst
10 DNA Grundbausteine Phosphatgruppe Zucker (Desoxyribose) Base 5 -Ende: Phosphat 3 -Ende: Desoxyribose (Hydroxylgruppe) : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 10
11 5 Basen Purinbasen Adenin, Guanin Pyrimidinbasen Thymin (Uracil), Cytosin Wasserstoffbrücken halten beide Stränge zusammen 2 zwischen A T 3 zwischen G C : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 11
12 DNA Replikation Mitose: Zellverdoppelung Meiose: geschlechtliche Teilung Schritte der Replikation Auftrennen des Doppelstrangs Anlagerung eines RNA Primers Synthese des komplementären Strangs von 5 3 durch DNA Polymerase : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 12
13 Von der DNA zum Protein Transkription Abschreiben DNA fi m(essenger)rna DNA RNA Doppel- einzelsträngig Thymin (T) Uracil (U) Desoxyribose Ribose Translation Übersetzen mrna fi Protein RNA Protein 3 Basen 1 Aminosäure Σ = 4 Σ = 20 Central Dogma in Molecular Biology : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 13
14 Gen Abschnitt auf dem Genom Vorlage zur Herstellung eines funktionellen Produkts Nur RNA oder weiter zum Protein Alle direkt daran beteiligten Sequenzen 5 UTR, 3 UTR (Untranslatierte Region) Aber: Nur der Abschnitt zwischen Start- und Stopcodon wird in mrna übersetzt 5 Enhancer Startcodon Promotor Vorlage für Primärtranskript TATA Stopcodon UTR Intron Exon 3 UTR : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 14
15 Transkription DNA primäre mrna Durch RNA Polymerase Präprozessierung poly-a-schwanz am 3 Ende Cap -Struktur am 5 Ende Entfernen der Introns und zusammenfügen der Exons alternatives Splicen Unterschiedliche Exons können kombiniert werden Ergibt Proteine mit unterschiedlicher Funktion Transport der mrna ins Cytoplasma Nur bei Eukaryoten : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 15
16 Translation Übersetzung Nukleotidsequenz der mrna zu Aminosäuresequenz der Proteine Je 3 Basen (Codon) codieren für 1 Aminosäure Wie viele mögliche Kombinationen? Triplett 3 Stellen 4 mögliche Buchstaben (A, T (U), G, C) 4 3 = 64 mögliche Kombinationen Aber nur 20 Aminosäuren Redundanz im genetischen Code : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 16
17 Aminosäuren 20 verschiedene Aminosäuren Hydrophil (wasserliebend) Hydrophob (wasserabstoßend) Sauer (geladen, hydrophil) Basisch (geladen, hydrophil) Redundanz im Genetischen Code Base Nr. 3: wobble Kann häufig ausgetauscht werden ohne Konsequenzen hydrophil hydrophob sauer basisch : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 17
18 Redundanz im Code Org1: Org2: Org3: Org4: Org5: AUU AGU UGG GAU AAA UUA GCU AUA UCU UGG GAC AAG CUG GCC AUC UCU UGG GAU AAG CUU GCG AUU AGC UGG GAC AAA CUC GCA AUC UCC UGG GAU AAG UUG GCU Protein: Ile Ser Trp Asp Lys Leu Ala : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 18
19 Proteine Grundgerüst Synthese erfolgt am Ribosom trna Besitzt Anticodon Hat Aminosäure Einzelne Aminosäuren durch Peptidbindung verbunden kovalente Verbindung mrna Ribosom Anticodon Aminosäure trna Abfolge an Aminosäuren = Primärstruktur : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 19
20 Sekundärstruktur von Proteinen a-helix Wasserstoffbrücken ß-Faltblatt Wasserstoffbrücken : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 20
21 : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 21 Tertiärstruktur Tertiärstruktur: Räumliche Anordnung der Sekundärstrukturelemente 1b71 aus Protein Data Bank
22 Tertiärstruktur - Kräfte Wechselwirkungen zwischen Teilen der Proteinkette Disulfidbrücken kovalente Bindung sehr stabil E=380 kj/mol Wasserstoffbrücken sehr häufig E=4 kj/mol Ionenbindung E=12.5 kj/mol Van-der-Waals allgemeine Interaktion zwischen Atomen E=0,4 kj/mol Hydrophobe Interaktion Abstoßung vom Wasser : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 22
23 Quartärstruktur Anordnung von mehreren Proteinketten Beispiel Hämoglobin Besteht aus 4 Ketten Wichtig für den Sauerstofftransport im Blut : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 23
24 Mutationen in DNA Auswirkungen Stille Mutation keine Auswirkung auf Protein Echte Mutation Ersetzen von Aminosäuren durch Ähnliche keine Auswirkung auf Struktur keine Auswirkung auf Funktion durch Unähnliche Auswirkung auf Struktur Verlust / Verbesserung der Funktion : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 24
25 Proteinfunktionen Struktur Zellwand, Membrane, Zellkern, Organellen, Signaltransduktion Signalerkennung (von Außen), Transduktion, intrazelluläre Reaktion, Metabolismus Atmung, Energieproduktion, Nährstoffumwandlung, Abbau von chem. Substanzen, Housekeeping Proteinsynthese und -abbau, DNA Verdopplung, Zellzyklus,... Transport mrna vom Zellkern zum Ribosom, Proteine vom Ribosome zur Zellwand, : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 25
26 Regulatorische Netzwerke Einflüsse regulieren die Transkription von Genen Äußere (Chemische Stoffe, Temperaturen, Strahlung) Innere (Stoffwechselprodukte) Gene haben einen unterschiedlich hohen Expressionslevel Menge an vorhandener mrna Ändert sich über Zeit und Zellart : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 26
27 Metabolische Netzwerke Glykolyse Umwandlung von Glukose zu Pyruvat unter Engergiegewinnung Start-, Zwischen- und Endprodukte regulieren auch die Transkription : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 27
28 Human Genome Project Begonnen 1986 Geplante Fertigstellung 2005 Ziel: Finden aller Gene des Menschen Weltweite Kollaboration 20 große Institutionen In Deutschland: seit 1996 etwas 60 Mbp Fertiggestellt Draft im Jahr 2000: (90% draft, 30% finished, 99.99% accuracy) Beinahe fertig 2001 (analyzed draft) Wirklich fertig : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 28
29 : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 29 Menschliche Genom Menschen Homo sapiens ~ bp (Basenpaare) Entspricht ~ 2 m DNA Verteilt auf 22 Chromosomen + 2 Geschlechtschromosomen Länge: Mbp ~ Gene (war mal bei ~ ) ~ Proteine ~ Proteinformen
30 : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 30 Menschliche Gene ~ Gene Niemand weis wirklich wie viele Länge zwischen 100bp und 2Mbp (Introns+Exons) Durschschnittliche Länge der codierenden Region: 1400 bps Duchschnittl. Proteinlänge 447 Aminosäuren Durschnittl. Gen hat 9 Exons Nur 3 % des menschlichen Genoms ist kodierend Rest: junk? Viele Repeats, Transposons Regulatorische Elemente Pseudogene Chromosomale Struktur: Zentromere und Telomere
31 Chromosome bei Eukaryoten Stark strukturiert während der Metaphase Doppelsträngige DNA Perlschnurform des Chromatin Chromatinfibrille Fibrille wird weiter strukturiert Chromosom : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 31
32 Genomsequenzierung Jedes Chromosom isolieren Chromosom in kleine Stücke brechen Jedes Stück DNA sequenzieren Die einzelnen Stücke zu einem zum Chromosom zusammenfügen (Assembly) gatcaattatagttgacttcagtcctgcctgattcatctcca aaaatgtagtctgcctgattcatctcccaaaaatgtagctc cgcttaaaggagctttcaagttgggggtggtgggccattc agtgttgtcactaacagatgcatcttgtgggggtaaaatgt cccaaagtatcttttcttgcttatgttcataagggcgctggtc tggaatgtgccacatctgttctcactctgccatggactcctg gaccctctgtgtgtccctttgtatcctggtagcgagtgagtc ctcatgatttatcatcctcatgctgggcctctgtatagatga : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 32
33 DNA schneiden Restriktionsenzyme Erkennen Sequenzabschnitte auf der DNA Schneiden an der Stelle Blunt (gerader Schnitt) Sticky (überhängende Enden) Länge der Erkennungssequenz steuert die DNA Fragmentgröße 4 Basen 256 bp Fragmente 6 Basen 4,000 bp Fragmente 8 Basen 65,000 bp Fragmente : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 33
34 Chromosome zerschneiden Chromosom mit einem rare Cutter behandeln Erkennungssequenz 8 bp Enzym- und DNA Konzentration steuern, so dass Nicht alle Stellen schneiden In jedem Strang andere Stellen Chromosom DNA Stücke schneide klonieren DNA Stücke voneinander trennen jedes einzeln in Zellen klonieren Hefezellen : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 34
35 Chromosomen zerkleinern YAC Yeast Artificial Chromosome Enthält < bp chromosomale DNA Je YAC nur einen Abschnitt BAC Bacterial Artificial Chromosome < bp erneut geschnittene DNA Plasmid < bp Wird in Bakterien eingebracht : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 35
36 : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 36 Klonieren mit Plasmiden DNA geschnitten mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen (REs) Ligation in vorbereiteten Vektor DNA Ligase Vektor wird in Bakterienzelle gebracht Typisch: E. coli EcoRI EcoRI BamHI DNA schneide Fragmen Vektor = Plasmid Bekannte Sequenz Ebenfalls mit REsgeschnitten Trägt Antibiotikaresistenz EcoRI Vektor (Plasmid) BamHI Antibiotikaresistenz ligiere
37 : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 37 Klonieren cont. Jedes Bakterium nimmt nur ein Plasmid auf Ausplattieren der Bakterien Auf Nährboden Agar Nährstoffe Antibiotikum Inkubieren (wachsen lassen) E. coli: 37 C, über Nacht Jede einzelne Bakterie wächst zu einer sichtbaren Kolonie (Klon) Nur Bakterien mit Plasmid können wachsen
38 : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 38 Zur Erinnerung YACs und BACs so geschnitten, dass überlappende Stücke entstehen schneiden YAC1 YAC2 YAC3 YAC6 YAC4 YAC7 YAC5
39 Wie viele Klone? Cosmid (40 Kbp) BAC (250 Kbp) YAC (1000 Kbp) Drosophila Mbp Homo sapiens Mbp Theoretischer Wert Überlappung von Klonen Hohe Überdeckung notwendig (6 10-fach) : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 39
40 : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 40 Contig Mapping Herstellung von vielen Klonen Überlappende Klone Redundanz Klone mit gleichen Fragmenten Klone mit Teilfragmenten Finden der wichtigsten Klone Bearbeitung vom möglichst wenigen Klonen Aber: weiterhin Überlappung Überprüfung auf bekannte Sequenzen PCR Hybridisierung bekannte Sequenzen Array mit Klonen
41 : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 41 PCR: Polymerase chain reaction Vervielfältigen von DNA in vitro (im Reagenzglas) Ausgehend von einer Vorlage PCR benötigt DNA Template (doppelsträngig) 2 DNA Primer Einzelsträngig Komplementär zu einer bekannten Sequenz Zwischen 15 und 25 Nukleotide lang DNA Polymerase dntp s (Desoyxnukleotide) datp, dctp, dgtp, dttp
42 PCR Ablauf Denaturieren Auftrennen des Doppelstrangs Annealen Anlagern der Primer an komplementäre DNA (~ 55 C) Elongation Verlängern des Strangs durch DNA Polymerase Vervielfältigung 1. Zyklus: 2 Doppelstr. 2. Zyklus: 4 Doppelstr. 20. Zyklus: T( C) : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 42 t
43 Länge von DNA bestimmen DNA Negativ geladen Wandert im elektrischen Feld zum Pluspol Agarose Gel Hoch vernetzt Hindert DNA am wandern Kurze kommen eher durch als lange DNA Stücke DNA wird auf Gel aufgetragen und sichtbar gemacht Länge: Vergleich gegen Standard : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 43
44 Länge von DNA bestimmen DNA Negativ geladen Wandert im elektrischen Feld zum Pluspol Agarose Gel Hoch vernetzt Hindert DNA am wandern Kurze kommen eher durch als lange DNA Stücke DNA wird auf Gel aufgetragen und sichtbar gemacht Länge: Vergleich gegen Standard : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 44
45 DNA Sequenzierung (nach Sanger) Abfolge von Basen in DNA Sequenz lesen Sequenzierreaktion (basiert auf PCR) mit DNA Template (doppelsträngig) 1 Primer DNA Polymerase dntp s ddntp s (Didesoxynukleotide) Brechen Kettenverlängerung ab Sind markiert Früher: radioaktiv Heute: fluoreszent (1 Farbstoff je Base) : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 45
46 DNA Sequenzierung cont. PCR ergibt DNA Stücke mit unterschiedlicher Länge Markiert Werden über ein Acrylamid-Gel aufgetrennt - + Laser : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 46
47 DNA Sequenzierung cont Markierten Basen werden durch Laser detektiert Ergibt 4 Tracefiles (Für jede Base eines) Tracefiles werden zum Chromatogramm zusammengesetzt Leseweite ~ 500 bp : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 47
48 Großer Fortschritt Früher: Radioaktiv Handarbeit Heute: 4 Floureszensfarbstoffe vollautomatisch : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 48
49 Assembly Wir haben jetzt sequenzierte Stücke DNA ~ 500 bp groß Überlappend Wir wissen, sie kommen aus einem BAC, bzw. einem YAC Algorithmisches Problem: Sequence assembly setze die 500 bp großen Stücke wieder zu einem BAC bzw. YAC zusammen Aber: nicht überall funktioniert diese Strategie Chromosome walking : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 49
50 Auswirkungen vom HGP Datenflut Datenbanken & Bioinformatik Datenbasis für Finden von Genen Alle Gene finden Zusammenwirken von Genen erkennen Erkennen von Genen, die mit Erbkrankheiten in Verbindung stehen Erkenntnis über ähnliche/gleiche Gene in anderen Organismen Experimente mit Modellorganismen Maus, Hefe, E. coli : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 50
51 : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 51 Finden von Genen Aus einem Gen entsteht ein funktionelles Produkt (Protein) mrna muß existieren 5 3 CAP AAAAA 3 TTTTT 5 mrna durch reverse Transkription in cdna umschreiben poly-t Primer cdna klonieren und sequenzieren
52 Expressionslevel von Genen Microarrays enthält kurze Abschnitte von bekannten Genen Spots (Proben) pro Array jeder Spot enthält mehrere Kopien Array mit DNA Proben : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 52
53 Microarray-Experiment mrna in cdna umschreiben von gesunden und kranken Zellen cdna dabei markieren (fluoreszent) cdna auf Chip auftragen und hybridisieren cdna Stücke an Proben binden restliche cdna abwaschen Messen der Intensität je Spot Vergleich Gesund Krank : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 53
54 Ergebnis von Microarray-Experimenten Image mit Intensitäten für jede Probe Rot: Kontrolle Grün: Sample Interpretation der Ergebnisse Vergleich von vielen Patienten Vergleich von Genen : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 54
55 Fragen? : Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 55
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