Zivilschutz- Forschung

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1 Zivilschutz- Forschung Schriftenreihe der Schutzkommision beim Bundesminister des Innern Herausgegeben vom Bundesverwaltungsamt Zentralstelle für Zivilschutz im Auftrag des Bundesministerium des Innern Neue Folge Band 41 W. König, A. Drynda, B. König, R. Arnold, P. Wachtler, M. Köller Einfluss von Zytokinen und Lipidmediatoren auf die Kontrolle und Regulation spezifischer Infektabwehr bei Brandverletzung ISSN

2 ZIVILSCHUTZFORSCHUNG Neue Folge Band 41

3 Zivilschutz- Forschung Schriftenreihe der Schutzkommision beim Bundesminister des Innern Herausgegeben vom Bundesverwaltungsamt Zentralstelle für Zivilschutz im Auftrag des Bundesministerium des Innern Neue Folge Band41 W. König, A. Drynda, B. König, R. Arnold, P. Wachtler, M. Köller Einfluss von Zytokinen und Lipidmediatoren auf die Kontrolle und Regulation spezifischer Infektabwehr bei Brandverletzung ISSN

4 Herausgeber: Bundesverwaltungsamt Zentralstelle für Zivilschutz Deutschherrenstr , Bonn Telefon: ( ) Telefax: ( ) Internet: Die Arbeit gibt die Meinung der Autoren wieder. Sie stellt keine Äußerung des Herausgebers dar und ist auch nicht als solche auszulegen Bundesverwaltungsamt Zentralstelle für Zivilschutz Bonn Satz und Druck: Druckhaus Dresden GmbH 4

5 Inhaltsverzeichnis Einleitung Kurze Darstellung zur Aufgabenstellung: Voraussetzungen unter denen das Vorhaben durchgeführt wurde Planung und Ablauf des Vorhabens Wissenschaftlicher und technischer Stand Zusammenarbeit mit anderen Stellen Ergebnisse Einleitung Mikrobielle Pathogenität und Pathogenitätsfaktoren Untersuchungen zu mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren Untersuchungen zum Staphylokokken Leukozidin Pathogenitätsfaktoren von Pseudomonas aeruginosa Untersuchungen zur Bedeutung mikrobieller Superantigene Modulation der Immuneffektorreaktionen durch RSV (Respiratory Syncytial Virus) Zusammenfassung: Bedeutung von Pharmaka (Zytokine, lösliche Rezeptoren, Antagonisten u.a.) Bedeutung von Wachstumsfaktoren: Untersuchungen zum PAF-Rezeptorantagonisten Zusammenfassung: Therapeutische Interventionen bei der traumabedingten Immunparalyse Untersuchungen zum Einfluss von γ-interferon beim Brandverletzten.. 23 Immunmodulation Untersuchungen zur Immunmodulation im Rahmen der Ernährungstherapie Erfolgskontrollbericht Voraussichtlicher Nutzen, insbesondere Verwertbarkeit des Ergebnisses und der Erfahrungen Kurzfassung Literatur Die Autoren Anhang

6 Einleitung Kurze Darstellung zur Aufgabenstellung: Unter dem Thema Einfluss von Zytokinen und Lipidmediatoren auf die Kontrolle und Regulation spezifischer Infektabwehr bei Brandverletzung wurde ein theoretisch klinisches und klinisch-experimentelles Projekt gefördert. Aus langjährigen Arbeiten wissen wir, dass die traumabedingte Immunparalyse, wie sie z.b. bei Polytrauma oder bei der Brandverletzung auftritt, durch eine Dysbalance und u.u. durch ein Versagen der Mediatorkaskaden zustande kommt. Am Beispiel der Brandverletzung wird dabei offensichtlich, dass nach einer Phase der Kolonisierung entweder im Rahmen der Stabilisierung der Infektabwehr keine mikrobielle Invasion stattfindet oder unter Zunahme des Pathogenitätserwerbs von Mikroorganismen und Veränderung der Infektabwehr es zur mikrobiellen Invasion kommt. Die Aufgabenstellung sollte deshalb mikrobielle Pathogenitätsfaktoren berücksichtigen, die die Immunparalyse einleiten und andererseits zellbiologische und immunologische Parameter erarbeiten, die die Immunparalyse anzeigen. Daraus resultierend sollen dann diagnostische Kriterien erarbeitet werden, die als frühe Prädiktivmarker der Immunparalyse eingesetzt werden können. Auf dem Boden der Erkenntnisse zur traumainduzierten Immunparalyse sollen für die Zukunft neue therapeutische Ansätze erarbeitet werden. Die vorliegenden Ergebnisse umfassen deshalb Arbeiten zur Validität von mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren, wobei als Indikatorzellen die Immunzellen normaler Donoren eingesetzt wurden. Die Wechselwirkung dieser mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren mit den Zielzellen erlaubt es, anhand von zellbiologischen Charakteristika die Aktivität der mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren zu beurteilen. In einem weiteren Ansatz wurden bekannte Stimulatoren eingesetzt und Zielzellen von Patienten mit Brandverletzung, Polytrauma oder großflächigen operativen Eingriffen analysiert. Aus den erzielten Ergebnissen kommen wir zu neuen Erkenntnissen hinsichtlich der Pathogenität von mikrobiellen Exoprodukten, der Bedeutung von inflammatorischen Mediatoren in der Regulation wie aber auch in der Paralyse zellbiologischer Funktionen sowie zu neuen Denkkonzepten hinsichtlich therapeutischer Ansätze zur Vermeidung der Immunparalyse. Selbstverständlich besteht auch für die Zukunft großer Forschungsbedarf. 7

7 Voraussetzungen unter denen das Vorhaben durchgeführt wurde Die Arbeitsgruppe für Infektabwehr (Leiter Prof. Dr. med. W. König) hat über Jahre die zellbiologischen und immunologischen Voraussetzungen etabliert, um die mikrobielle Pathogenität in der Wechselwirkung mit humanen Effektorzellen zu quantifizieren und zu analysieren. So wurden die Mediatorkaskaden (Lipidmediatoranalyse, Zytokinanalyse, Adhäsinrezeptoren u.a.) in der Abteilung etabliert und in vielen Patientenstudien eingesetzt. Eine sehr enge Zusammenarbeit hinsichtlich des Arbeitsprojektes war durch die Interaktion mit der Abteilung für Plastische Chirurgie (Prof.Dr.med. Steinau), den Städtischen Krankenanstalten Dortmund, Universitätsklinik Marienhospital Herne sowie der Universitätsklinik Josefs-Hospital u.a. gegeben. Durch die Interaktion mit den klinischen Kollegen der dortigen Abteilung wurde ein entsprechendes Krankengut zusammengestellt und wesentliche Fragen hinsichtlich der Wechselwirkung mikrobieller Pathogenitätsfaktoren an immungestressten Effektorzellen analysiert. Fernerhin hatten wir durch diese enge Verzahnung die Möglichkeit, neue Therapieansätze (Dipeptid, Eicosapentaensäure u.a.) in klinischen Studien zu analysieren. Im Rahmen einer Multicenterstudie, wurde der Einfluss von (-Interferon auf die Reaktivierbarkeit von humanen Effektorzellen bei Brandverletzung analysiert. Als wesentlicher Marker der zellulären Reaktivität wurde die Expression von MHCII analysiert. Planung und Ablauf des Vorhabens Im Wesentlichen wurde das Vorhaben über zwei thematisch verzahnte Bereiche durchgeführt; es hatte sich in der Vergangenheit erwiesen, dass eine moderne Betrachtung zur klinischen Pathophysiologie der Immunparalyse z.b. der Brandverletzten nur dann getroffen werden kann, wenn gleichzeitig die dazugehörige Grundlagenforschung aktiviert und gefördert wird. Aus diesem Grunde wurde das Projekt zweigleisig angelegt: a) zum einen wurde der Einfluss mikrobieller Pathogenitätsfaktoren an humanen Immuneffektorzellen analysiert, b) zum anderen wurde die Reaktivität humaner Immuneffektorzellen unter dem Trauma analysiert. Dies Vorgehen erwies sich als ausserordentlich vernünftig, da man die Reaktivität normaler Immuneffektorzellen hinsichtlich unterschiedlicher Pathogenitätsfaktoren kennen muss um dann zu analysieren, inwieweit an verschiedenen Signaltransduktions- oder Schaltelementen hinsichtlich der Mediatorgenerierung, Produktion oder des Verhältnisses der Mediatoren untereinander bei immungestressten Patienten ein Defizit, ein Überschießen oder ein Missverhältnis auftritt. Es war also unser Ziel die Ergebnisse aus beiden Bereichen so abzurunden, dass wir diese basistheoretischen Ergebnisse für die Klinik verfügbar machen, um gleichermaßen eine Vertiefung des pathophysiologischen Wissens zu erreichen. 9

8 Infolge des dualen Ansatzes (klinisch-theoretisch, klinisch) wurden die Arbeiten parallel zueinander vorangetrieben. Es wurden die klinisch-theoretischen Ansätze an normalen Spenderzellen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden normale Spender einbestellt, es wurde Blut (200 ml) entnommen. Nach bewährten Methoden der Zellauftrennung wurden die Zellen isoliert und mit den mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren, die in der Abteilung oder mit anderen Institutionen (national, international) erarbeitet wurden, inkubiert. Die Auswertungen zu den erzielten Resultaten (Lipidmediatoren, Zytokine, Lymphozyten, Funktionsanalysen u.a.) wurden in der Arbeitsgruppe für Infektabwehr durchgeführt. Parallel zu diesen Experimenten, die also stringent anhand der erhaltenen Ergebnisse weiterentwickelt wurden, waren wir auf die Spenderzellen aus den unterschiedlichen Kliniken angewiesen. Wenn diese Spender nach Rückkoppelung mit den Klinikern in den Abteilungen vorlagen, wurde Blut im Rahmen der Routineuntersuchung bei den Patienten entnommen und dann zur Arbeitsgruppe für Infektabwehr gebracht. Bei einem Großteil der Patienten haben wir den Transfer der Proben selber durchgeführt. Dies beinhaltete teilweise auch Fahrten von Bochum bis Essen (Universitätsklinik) oder von Bochum nach Dortmund (Städt. Krankenanstalten). Wissenschaftlicher und technischer Stand Die Arbeitsgruppe für Infektabwehr besteht seit Sie untersteht einem Universitätsprofessor (Prof. Dr. med. W. König). Der wissenschaftliche und technische Stand ist voll gewährleistet und viele internationale Publikationen resultierten aus der vorliegenden Förderung. Hinsichtlich der verwendeten Fachliteratur, Informations-, Dokumentationsdienste benutzen wir die moderne Kommunikation auf allen unseren Fachgebieten sowie insbesondere Kontakte zu internationalen Wissenschaftlern durch Vorstellen der Resultate bei internationalen Konferenzen. Aufgrund dieser langjährigen Interaktionen auf den vorliegenden Gebieten haben wir Kooperationen mit Arbeitsgruppen in Europa sowie in den USA aufgebaut. Zusammenarbeit mit anderen Stellen Hier sind als erstes zu nennen die Universitätskliniken der Ruhr-Universität Bochum, die Universitätsklinik in Essen, die Städtischen Krankenanstalten Dortmund; hinsichtlich der theoretisch-klinischen Arbeiten sind zu nennen die Arbeitsgruppen aus den USA (Colorado, NIH), aus Europa (Institut Pasteur, Paris, Institut für Mikrobiologie, Straßburg). 10

9 Ergebnisse Einleitung Die innovativen Erkenntnisse auf dem Gebiet der mikrobiellen Infektabwehr und hier insbesondere zur Pathophysiologie der traumabedingten Immunsuppression sind gekennzeichnet durch die vertieften Vorstellungen zu den unterschiedlichen Mediatorkaskaden. Die inflammatorischen Effektorzellen, wie z.b. Neutrophile bilden erste Abwehrbarrieren für Mikroorganismen. Mikroorganismen können durch bakterielle Pathogenitätsfaktoren ihrerseits wie auch insbesondere durch Exoprodukte (Toxine, Superantigene u.a.) die Reaktivität der Effektorzellen verändern. Unter den Immuneffektorzellen spielen nicht nur neutrophile Granulozyten, Monozyten sondern auch Entzündungszellen wie Basophile, Mastzellen und Eosinophile eine bedeutsame Rolle. Die letzteren Zellen, die zunächst vornehmlich als relevant für allergische Reaktionen bekannt waren, spielen auch bei traumainduzierten Immunreaktionen eine besondere Rolle. Nach Aktivierung von Entzündungszellen über pseudoallergische Aktivatoren kommt es zur Freisetzung vielfältiger Mediatoren. Die Freisetzung der Entzündungsmediatoren beeinflusst wiederum den Reaktivitätserwerb im Rahmen der spezifischen Infektabwehr. Die mikrobielle Infektabwehr ist gekennzeichnet durch die unspezifische sowie durch die spezifische Infektabwehr. Träger der unspezifischen Infektabwehr sind einerseits inflammatorische Immuneffektorzellen, Serumkomponenten, Zytokine u.a.; Träger der spezifischen Infektabwehr sind Lymphozyten, die einerseits die humorale oder die zellvermittelte Immunantwort einleiten; verknüpfende Komponenten für die unspezifische und spezifische Infektabwehr sind die vielfältigen Entzündungsfaktoren. (Abb.1) In der Vergangenheit war den Lipidmediatoren besondere Aufmerksamkeit geschenkt worden. Vielfältige aktivierende Stimuli können rezeptorvermittelt oder nichtrezeptorvermittelt Zellen so stimulieren, dass es über eine Phospholipaseaktivierung zu einer Translokation der 5-Lipoxygenase mit der Freisetzung von Leukotrienen kommt. Diese Mediatoren haben chemotaktische und spasmogene Einwirkungen. Nach neueren Arbeiten können Lipidmediatoren wiederum Zytokine in ihrer Aktivität regulieren. Somit entsteht ein Konzept, dass verschiedene Mediatorkaskaden interagieren, teilweise synergistisch, additiv oder sogar antagonistisch wirksam sind. (Abb.2) Mediatoren ihrerseits können wiederum andere Mediatoren freisetzen oder die Zelle primen, so dass ein exogener Stimulus nun zu einer hyperreaktiven Freisetzung von Mediatoren führt. Viele Mediatoren führen ihre zellbiologische Funktion durch rezeptorvermittelte Wechselwirkung aus. Diese Rezeptoren können nach der Aktivierung von Zellen freigesetzt werden, wie es z.b. für den Tumornekrosefaktor (TNF) gezeigt wird. Der Mediator für sich hat ein duales Gesicht. Für die Homeoestase der Infektabwehr ist die balancierte Freisetzung unterschiedlicher Mediatorkaskaden notwendig. Eine zu starke Freisetzung von Mediatoren könnte zu einer überschießenden Entzündung führen. Ein Versagen der Mediatorkaskaden leitet die Immunparalyse ein. Unter den neugenerierten Mediatoren hier handelt es sich meistens um Peptide gibt es pro- und antiinflammatorische Mediatoren. (Tabellen 1,2,3) 11

10 Das Konzept, das Interleukine und Zytokine aus unterschiedlichen Vorläuferzellen stammen, hat zu einer didaktischen Einteilung hinsichtlich von Schutz und Schaden geführt. Aufgrund unterschiedlicher Infektionsmodelle weiß man, dass aus T-Helferzellen des Typs 1 die Zytokine IL-2 und Interferon-γ vornehmlich gebildet werden. Diese Zytokine werden für die protektive Infektabwehr in der Regel benötigt; aus T-Helferzellen des Typs 2 werden Zytokine wie IL-4, IL-5, IL-13 freigesetzt. (Abb.3) Diese Zytokine haben im Rahmen der allergisch-entzündlichen Reaktion eine herausragende Bedeutung. Die Interleukine IL-4 und IL-13 wirken als Switch -Faktoren bei der IgE-Synthese. Interleukin-5 hat darüber hinaus pleiotrope Funktionen und findet sich bei der mikrobiell induzierten Immunsuppression von der Konzentration her erhöht. Viele dieser Mediatoren haben also überlappende Funktionen und sind für unterschiedliche Krankheitsbilder bedeutsam. Interleukin-5 führt zur Eosinophilen Akkumulation, wie es bei allergisch-entzündlichen Reaktionen aber auch beim ARDS und Polytrauma gesehen wird. TH 2 -Zellen können nach ihrer Aktivierung auch Interleukin-10 wiederum freisetzen. Das Interleukin-10 supprimiert TH- 1 vermittelte Zytokine und favorisiert damit die TH- 2 -Zellentwicklung. Aus Makrophagen und NK-Zellen wird Interleukin-12 nach der Aktivierung gebildet. Interleukin-12 wiederum induziert die Freisetzung von γ-interferon. Somit findet sich für fast jede Mediatorkaskade ein aktivierender und gegenregulatorischer Bogen. Aufgrund dieser komplexen Ergebnisse ist es also verständlich dass nach Eckpfeilern gesucht werden muss, um den Status der Infektabwehr genügend genau zu analysieren. Für die hier vorliegenden Arbeiten hat es sich als günstig erwiesen, einerseits Zytokine wie Interleukin-1, Interleukin-6 zu studieren, das Chemotaxin Interleukin-8 als einen Vertreter der chemotaktischen Peptide, den Tumornekrosefaktor, der für Schock-Sepsis verantwortlich gemacht wird, allerdings auch benefizielle Funktionen aufweist sowie Interleukin-4 und Interleukin-13, fernerhin die Zytokine Interferon-γ und Interleukin-12. (Tabelle 4) In den vergangenen Jahren hatten wir gezeigt, dass ein frühes Merkmal der verbrennungsinduzierten Immunsuppression wie auch beim ARDS darin besteht, dass Immuneffektorzellen (Neutrophile) eine verminderte Freisetzung von chemotaktisch aktivem Leukotrien B4 zeigten. Der Neutrophile Granulozyt war in seiner Reaktivität hinsichtlich der LTB 4 -Freisetzung weitestgehend inaktiviert. Eine Reduktion von LTB 4 -Rezeptoren auf der Oberfläche der Neutrophilen wurde von uns beschrieben. Darüberhinaus konnten wir zeigen, dass im Vergleich zur Überlebensgruppe bei Brandverletzten ein irreversibler Anstieg von Interleukin-6 vorlag. Hinsichtlich des Differenzierungsmarkers von B-Zellen (CD 23 ) zeigte sich im Verlauf der Brandverletzung (hier insbesondere vor der mikrobiellen Invasion) unter den Bedingungen von Schock und Sepsis eine Unfähigkeit der B-Lymphozyten nach Interleukin-4-Zugabe eine CD 23 -Expression aufzuzeigen. Auf dem Boden der hier vorliegenden Erkenntnisse ist es also verständlich, dass offenbar frühe zellbiologische Prädiktoren auftreten, die vor der mikrobiellen Invasion das Bild der drohenden Sepsis anzeigten. Die Entwicklung auf dem Gebiet zur Pathophysiologie der traumabedingten Immunsuppression war durch die Vielzahl der o.g. Zytokine erweitert worden. Neben der Wechselwirkung von Zytokinen mit Immuneffektorzellen sowie Zellen der spezifischen Abwehr kamen neue Ergebnisse zur Überlebenszeit von Zellen hinzu. Der Terminus der 12

11 Apoptose (Zelltod) wurde geprägt. Ergebnisse aus der Grundlagenforschung hatten gezeigt, dass eine DNA-Fragmentierung auftritt, die z.b. durch Toxine unter nicht-toxischem Einfluss zustande kommt. Im Rahmen dieser Fragmentierung kommt es zu einer Abnahme der zellulären Leistung mit den entsprechenden zellulären Funktionen. Weiterführende Arbeiten konnten darüber hinaus darlegen, dass die Apoptose durch Zytokine wie GM-CSF und G-CSF weitestgehend aufgehoben wird. Daraus ergab sich, dass Wachstumsfaktoren u.u. die Reaktivität von Immuneffektorzellen erhalten können. Mikrobielle Pathogenität und Pathogenitätsfaktoren In den vergangenen zwei Dekaden wurden enorme Fortschritte auf dem Gebiet der Zell- und Molekularbiologie hinsichtlich der Entzündungsmediatoren und ihrer pathophysiologischen Auswirkungen bei Infektionskrankheiten und immunpathologischen Stresssituationen erhoben. In diesem Zusammenhang kommt den Lipidmediatoren sowie in den vergangenen zehn Jahren den Zytokinen eine besondere Bedeutung zu. Die pathophysiologische Rolle der Zytokine wurde bei vielen Infektionen anhand von Infektionsmodellen analysiert. Es konnte festgestellt werden, dass beim gramnegativen septischen Schock die Lipopolysaccharide offenbar eine bedeutende Rolle spielen. Die pathologischen Auswirkungen des Endotoxinschocks wurden durch die Freisetzung von Interleukin-1, Interleukin-6 und des Tumornekrosefaktors erklärt. Diese Zytokine können wiederum andere Mediatoren induzieren, wie z.b. Prostanoide sowie auch endotheliale Adhesionsmoleküle. Die Molekularbiologie zur Kenntnis der Adhäsionsmoleküle hat dargelegt, dass Entzündungsmediatoren diese Strukturen an Endothelzellen und Epithelzellen regulieren, so dass es zu einer Stase der Leukozyten kommen kann. Als Folgereaktion kommt es zur Bildung und Freisetzung inflammatorischer Moleküle. Es ergibt sich eine Abnahme der Herzfunktion, des Blutdrucks und es kommt zu markanten Einflüssen an Immuneffektorzellen. Diese Veränderungen führen dann zum multiplen Organversagen und zum Zelltod des Patienten. Der septische Schock ist dabei eine akut auftretende Reaktion, wobei diese proinflammatorischen Zytokine ihre große Bedeutung entfalten; die Zytokine haben jedoch weitgespannte Auswirkungen und finden sich auch bei chronischen Entzündungsreaktionen und Infektionserkrankungen wie z.b. Lepra, Tuberkulose u.a. Zytokine führen ebenfalls zur Induktion der Akute-Phase -Antwort; dies ist ein integrierter Bestandteil der natürlichen Abwehr gegenüber Mikroorganismen. Durch molekularbiologische Untersuchungen hinsichtlich der mikrobiellen Erreger wie auch des Wirtes ist es heute möglich, die Bedeutung einzelner Pathogenitätsfaktoren und einzelner Zytokine tierexperimentell zu analysieren. Die Anwendung genetisch klonierter Mikroorganismen in der Wechselwirkung mit humanen Effektorzellen hat es darüber hinaus ermöglicht, eine Übertragung bisheriger und neuer Erkenntnisse zum Problem Sepsis zu erhalten. Während in den vergangenen Jahren den Endotoxinen eine ausschließliche Bedeutung zugesprochen wurde, ist heute allgemein akzeptiert, dass abseits vom Lipopolysaccharid andere mikrobielle Faktoren modulierende Funktionen ausüben und u.u. sogar wichtiger sind als das Lipopolysaccharid. Diese unterschiedlichen 13

12 mikrobiellen Faktoren können heute in vier Klassen eingeteilt werden; Adhäsine, Inversine, Aggressine und Impedine. (Abb.4 a,b) Adhäsine sind mikrobielle Pathogenitätsfaktoren, wie z.b. Fimbrien an E.coli oder Pseudomonas ssp., die sich an spezifische zelluläre Rezeptoren binden. Es handelt sich in der Regel um Karbohydrate und Karbohydrat-Wechselwirkungen, die wiederum zu zellbiologischen Veränderungen am Erfolgsorgan führen. Wir konnten nachweisen, dass definierte Adhäsine von E.coli Bakterien in sehr spezifischer Weise aus neutrophilen Granulozyten (PMN) sowie Lymphozyten, Monozyten, Basophilen (LMB), die Mediatoren wie Leukotriene und Histamin freisetzen. Damit war ersichtlich, dass die Adhäsin-Immuneffektor-Wechselwirkung zur Aktivierung der Zielzellen führt. Dies bedeutet, dass die Kolonisierung nur eine Voraussetzung für die nachfolgende Infektion ist und die entsprechende Adhäsin- Zellwechselwirkung die pathophysiologischen Reaktionen induziert. Invasine: Es sind Strukturen von Mikroorganismen, die für die Aufnahme des Mikroorganismus von wesentlicher Bedeutung sind. Es handelt sich ebenfalls um mikrobielle Oberflächenstrukturen, die in Wechselwirkung mit Epitopen der Zelle treten. Bekannt sind hier das Invasin von Listeria monocytogenes (Inv, ail) oder Yersinia ssp. (Yops), Salmonella ssp.. Invasine erlauben durch Wechselwirkung des Mikroorganismus mit den zellulären Strukturen eine Aktivierung innerhalb der Zelle, so dass der Mikroorganismus zur Aufnahme kommt. Innerhalb der Zelle kommt es zur Wechselwirkung des Mikroorganismus mit intrazellulären Strukturen und damit zu einer Modulation der zellulären Funktion. Aggressine: Es handelt sich in der Regel um mikrobielle Exotoxine oder auch Proteasen. Die Vielfältigkeit der Toxine hinsichtlich der Wechselwirkung an Immuneffektorzellen wurde in den vergangenen Jahren interdisziplinär erarbeitet. Es zeigte sich, dass viele Hämolysine durch Rezeptorwechselwirkung Zellen aktivieren können, dazu gehören z.b. das Pneumolysin oder Streptolysin O. Das letztere Toxin bindet sich an Cholesterol und führt zur Freisetzung von Leukotrienen. Andererseits können mikrobielle Exotoxine auch modulierend einwirken und die Mediatorkaskaden selektiv aktivieren oder inhibieren. Ein klassisches Beispiel ist das E.coli α-hämolysin. Dieses Toxin supprimiert z.b. die Zytokinfreisetzung. Man kann sich also vorstellen, dass E.coli Bakterien mit spezifischen Adhäsinen und der α-hämolysinausprägung zunächst Immuneffektorzellen aktivieren; die gleichzeitige Freisetzung von α-hämolysin würde die Zytokinfreisetzung supprimieren und damit die spezifische Infektabwehr inhibieren. Impedine: Dies sind Faktoren, die die zelluläre Funktion supprimieren. Auf die duale Funktion vieler mikrobieller Exotoxine wurde eingegangen. Mikrobielle Superantigene oder z.b. das Alginat von Pseudomonas ssp. also mukoide Exoprodukte können phagozytäre Funktionen inhibieren, so dass damit trotz zirkulierender Phagozyten ein Defizit ihrer Funktion eintritt. Diese Substanzen würden dann die Aufnahme der Mikroorganismen inhibieren und häufig auch durch Wechselwirkung mit intrazellulären Strukturen (niedrigmolekulare G-Proteine, Aktin, respiratorischer Burst u.a.) die essentielle Funktion der Phagozyten blockieren. Die Kenntnis dieser multiplen Faktoren ist notwendig, um sich in der Zukunft Gedanken zu machen, wie die Pathophysiologie nach Kolonisierung eines Brandverletzten das Schicksal dieses Brandverletzten entscheiden kann. Es handelt sich 14

13 nicht um einen einzelnen mikrobiellen Faktor sondern um mehrere Faktoren; es ist nicht ein einzelnes Abwehrsystem sondern die Komplexität unterschiedlicher Mediatorkaskaden betroffen. Die Abwehrleistung des lokalen Wundfeldes wie auch der zirkulierenden Zellen sowie die Stabilität der natürlichen Immunität mit der Möglichkeit zum Aufbau der spezifischen Abwehr sind zu beachten. All diese Komponenten sind letztendlich entscheidend, ob die Kolonisierung und mikrobielle Infektion kompensiert wird oder ob es letztendlich zu einer mikrobiellen Invasion mit dem Tod des Patienten durch die Burn wound sepsis kommt. Es sind also allgemeingültige Fragen, die beim Brandverletzten wie auch beim Polytrauma zum Tragen kommt. Voraussetzung für die Beantwortung dieser Fragen ist die exakte Kenntnis der pathophysiologischen Vorgänge, die durch mikrobielle Pathogenitätsfaktoren ausgelöst werden sowie die Analyse der unterschiedlichen zellbiologischen Reaktionsformen auf mikrobielle Reize. (Abb. 5) Nur aus dieser komplexen Sicht heraus ist es möglich Prädiktivmarker der Burn wound sepsis einzuführen und innovative therapeutische Ansätze zu erarbeiten. Die hier darzustellenden Ergebnisse betreffen also 1. weiterführende Arbeiten zu den mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren in der Wechselwirkung mit humanen Immuneffektorzellen und 2. Studien zu den zellbiologischen Auswirkungen, die für den Immunstress und die Immunparalyse verantwortlich sein können sowie 3. den Einsatz neuer therapeutischer Ansätze zur Stabilisierung der Infektabwehr und zur Behandlung der traumabedingten Immunparalyse Untersuchungen zu mikrobiellen Pathogenitätsfaktoren Untersuchungen zum Staphylokokken Leukozidin Im Rahmen der mikrobiellen Kolonisierung bei Brandverletzten sind Pseudomonas ssp. und Staphylokokken prädominante Keime, die häufig im Verbund bei der mikrobiellen Invasion gefunden werden. In früheren Arbeiten hatten wir gezeigt, dass die Pathogenität der Mikroorganismen im Laufe der mikrobiellen Invasion offensichtlich zunimmt. Die Frage stellte sich, inwieweit definierte Pathogenitätsfaktoren die mikrobielle Invasion begünstigen, und welche Parameter der natürlichen Infektabwehr dabei moduliert werden. Im Folgenden wurde in einer Zusammenarbeit mit dem Institut Bactériologie der Medizinischen Fakultät der Universität Straßburg das Staphylokokken Leukozidin analysiert. Staphylokokkus aureus Stämme sind mit einer Vielzahl von Erkrankungen assoziiert, wie z.b. Lungeninfektion, Verbrennungen, Furunkel und Dermonekrosen. Die Pathogenitätsfaktoren von Staph.aureus, insbesondere die Toxine, spielen dabei eine besondere Rolle für die Auslösung des Krankheitsprozesses. In früheren Studien konnte gezeigt werden, daß Staphylokokkentoxine (z.b. α-toxin, δ-toxin, Toxic Shock Syndrome Toxin, die Immuneffektorzellen von Probanden hinsichtlich der Mediatorfreisetzung modulieren. Im Folgenden wurde das Staphylokokken Leukozidin, ein Zweikomponententoxin, analysiert. Es wurde das Panton-Valentine- Leukozidin (Luk PV) dem Leukozidin R gegenübergestellt. Diese Zweikompo- 15

14 nententoxine (S und F) interagieren synergistisch mit Leukozyten. Beide Toxine wurden von Staph.aureus V8 isoliert. Nur die gleichzeitige Interaktion von F- und S-Komponenten des Leukozidins entfaltet biologische Aktivitäten. Histologisch ist die Dermonekrose durch einen zentralen nekrotischen Herd sowie durch eine massive Infiltration von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen charakterisiert. Im Folgenden wurde analysiert, inwieweit humane Immuneffektorzellen sich hinsichtlich der Reaktivität gegenüber Staphylokokken Leukozidin verhalten. Wir können zeigen, dass das Panton-Valentine-Leukozidin pathophysiologisch aktiver als das Luk R ist. Offenbar bestimmt die Zusammensetzung der Bikomponenten Systeme die Aktivität des Toxins. In kürzlichen Arbeiten haben wir zeigen können, dass durch Austausch und Modifikation der einzelnen Toxinkomponenten die biologische Aktivität signifikant moduliert wird. Humane Immuneffektorzellen entlassen nach Wechselwirkung mit Leukozidin das chemotaktisch aktive Leukotrien B4; basophile Granulozyten entlassen Histamin (Abb. 6, 7) und unter den Zytokinen wird das chemotaktisch aktive Interleukin-8 freigesetzt. (Abb. 8) Leukozidin wirkt auch an permeabilisierten Leukozyten. Dies ist insbesondere wichtig, da im Rahmen der Wechselwirkung eines Toxins mit humanen Effektorzellen diese häufig permeabilisiert sind und damit das Toxin in die Zelle gelangt. Offenbar reicht aber der enzymatische Apparat aus, um auch bei permeabilisierten Leukozyten eine Freisetzung von Lipidmediatoren zu induzieren. Insgesamt gesehen hat Leukozidin also einen ausgeprägten proinflammatorischen Einfluss; erst in hohen Konzentrationen kommt es zur Lyse der Immuneffektorzellen. Zunächst werden also Mediatoren der Entzündung freigesetzt. Ausschlaggebend ist, dass im Rahmen der Wechselwirkung mit Leukozidin Zellen das Heatschockprotein 70 exprimieren. Leukozidin induziert ebenfalls die Apoptose von Zielzellen. Diese Apoptose wird durch Einwirkung von Wachstumsfaktoren inhibiert. (Abb. 9) Unter dem Einfluss von GM-CSF wird die Leukozidinwechselwirkung mit Effektorzellen und die Freisetzung von Mediatoren massiv verstärkt. Dies bedeutet, dass in einem bereits entzündlichen Wundfeld die Besiedlung mit Staph.aureus und die Sekretion von Leukozidin zu einer Aufschaukelung des Entzündungsprozesses führen kann. Man kann sich also vorstellen, dass am Wundfeld vielfältige Zytokine freigesetzt werden. Diese inhibieren die Apoptose. Durch Bindung des Leukozidins kommt es an den so geschützten Zellen zu einer massiven Mediatorfreisetzung, die eine weiterführende Entzündung begünstigen und damit die mikrobielle Invasion unterstützen. Pathogenitätsfaktoren von Pseudomonas aeruginosa In früheren Arbeiten hatten wir auf die Bedeutung von Pseudomonas ssp. für die Kolonisierung und mikrobielle Invasion hingewiesen. Wir konnten zeigen, dass Pseudomonas aeruginosa-stämme von Brandverletzten zwei Hämolysine sezernieren, d.h. ein hitzelabiles Hämolysin (Phospholipase C) und ein hitzestabiles Hämolysin, ein Glykolipid. Beide Hämolysine verhalten sich unterschiedlich hinsichtlich der Mediatorfreisetzung. (Abb. 10) Wir untersuchten wiederum an humanen Immuneffektorzellen (neutrophile Granulozyten, humane periphere mononukleäre Zellen) den Einfluss unterschiedlicher Pseudomonas aeruginosa- 16

15 Stämme. Bekanntlicherweise unterscheiden wir mukoide und weniger mukoide Stämme. In Anlehnung an die Wachstumsbedingungen wird das Mukopolysaccharid von Pseudomonas aeruginosa gebildet. In klassischer Weise finden wir sehr viel Mukopolysaccharid (Alginat) bei Pseudomonas aeruginosa-stämmen von Patienten mit zystischer Fibrose. Grundsätzlich ist aber für Pseudomonas aeruginosa das Mukopolysaccharid ein wichtiger Pathogenitätsfaktor. Im Folgenden wurden klinische Isolate analysiert, die einerseits mukoid und weniger stark mukoid ausgeprägt sind. Wir überprüften an humanen Immuneffektorzellen, ob durch Wechselwirkung mit Pseudomonas aeruginosa es zur Freisetzung des chemotaktisch aktiven Interleukin-8 kommt. Bekanntlicherweise gehört dieses Zytokin zu den niedrigmolekularen Chemotaxinen und ist außerordentlich aktiv für die Akkumulation von Entzündungszellen und Adhäsinausprägung an Granulozyten und Zielzellen. In unseren Untersuchungen können wir zeigen, dass eine definierte Bakterienzellkonzentration vorliegen muss, um eine optimale Freisetzung von Interleukin-8 zu induzieren. Unsere Daten belegen, dass Pseudomonas aeruginosa Bakterien die Freisetzung von Il-8 aus Granulozyten und Monozyten induzieren; sie sind damit in der Lage die Entzündungsreaktion zu amplifizieren und zu perpetuieren, indem zusätzliche Phagozyten an den Entzündungsherd geholt werden. Die Freisetzung von Interleukin-8 wird dabei nicht durch Alginat blockiert. Die Befunde sind für die Betrachtung der mikrobiologischen Situation bei Brandverletzungen von außerordentlicher Bedeutung. Das Wundfeld ist nach ca. einer Woche mit unterschiedlichen Mikroorganismen kolonisiert; die klinische Erfahrung zeigt, dass die Kolonisierung mit Pseudomonas aeruginosa ein sehr schlechtes Zeichen darstellt, weil es häufig zur mikrobiellen Invasion kommt. Man könnte nun davon ausgehen, dass die Bakterien selber zunächst durch Pathogenitätsfaktoren die Granulozyten an den Ort der Auseinandersetzung chemotaktisch akkumulieren; damit wäre eine erste Abwehrlinie gewährleistet. Gleichzeitig werden aber durch die Wechselwirkung des Mikroorganismus mit den Phagozyten Granulozyten zerstört, es kommt zur Freisetzung von Proteasen wie natürlich auch zur Generierung von weiteren chemotaktischen Faktoren, so dass die Entzündung sich aufschaukelt. Eine aufgeschaukelte Entzündung könnte zu einer verminderten Immunabwehr im Rahmen der neutrophilen Phagozytenabwehr führen. Die mikrobielle Invasion würde trotz des Abrufens von Phagozyten damit begünstigt. Nicht nur Granulozyten sondern auch Thrombozyten sind Träger von Mediatoren. Auf der Suche nach relevanten Pathogenitätsfaktoren von Pseudomonas untersuchten wir die Bedeutung des hitzelabilen Hämolysins und eines weiteren Pathogenitätsfaktors, der Lipase. Die Phospholipasen sind ubiquitäre Enzyme. Die Aktivierung von Phospholipasen führt wiederum zur Freisetzung von ungesättigten Fettsäuren. Die individuellen Zellpopulationen können je nach ihrer Enzymausstattung die ungesättigten Fettsäuren in unterschiedliche Metabolite umwandeln. Im Folgenden zeigen wir, dass neben dem bekannten Exotoxin von Pseudomonas aeruginosa (d.h. Exotoxin A, das mukoide Polysaccharid) das hitzelabile Hämolysin von außerordentlich großer pathophysiologischer Bedeutung ist. Pseudomonas aeruginosa Stämme können zwei lipolytische Enzyme produzieren, d.h. die Phospholipase C und die Lipase. Beide Toxine werden extrazellulär sezerniert. Die Wechselwirkung mit Thrombozyten führt zu einer massiven 17

16 Freisetzung von 12-Hydroxyeicosatetraensäure (12 HETE). (Abb. 11) Dieser Metabolit ist in der Aktivierung weiterer Entzündungszellen außerordentlich reaktiv. Die hier vorliegenden Untersuchungen zeigen also sehr deutlich, dass nicht nur Pseudomonas aeruginosa als Mikroorganismus sondern die relevanten Pathogenitätsfaktoren für die Freisetzung der Entzündungsmediatoren von außerordentlicher Bedeutung sind. In weiterführenden Arbeiten konnten wir diese Ergebnisse nicht nur an Thrombozyten sondern auch an Granulozyten und Monozyten bestätigen. Die Phospholipase C in ihrer Wechselwirkung mit Lipase führt zur Generierung von chemotaktisch aktivem Leukotrien B4, von Sauerstoffmetaboliten, der Histaminfreisetzung aus Basophilen. Die Analyse der Interleukin-8- Freisetzung führte zu überraschenden Ergebnissen. Die Phospholipase selber zeigt für sich nur eine geringe Aktivierung der Interleukin-8-Freisetzung, obwohl in hohem Maße das chemotaktisch aktive Leukotrien B4 gebildet wird. In höheren Konzentrationen kam es sogar zu einer Suppression der Phospholipase C induzierten Interleukin-8-Freisetzung. (Abb.12,13) Diese duale Funktion eines Toxins hinsichtlich der Mediatorfreisetzung hatten wir auch für das E.coli α-hämolysin beobachtet. Bekanntlicherweise sind Hämolysin-produzierende E.coli-Stämme in der Wechselwirkung mit ihrem Zielorgan besonders aggressiv. Pathophysiologische Reaktionen wie Meningitis, Sepsis werden nicht nur durch spezifische Adhäsine von E.coli ausgelöst sondern auch durch E.coli zusammen mit der α-hämolysinproduktion. Die Untersuchungen belegen also, dass nicht nur die taxonomische Definition eines Mikroorganismus entscheidend ist für das, was sich beim Brandverletzten abspielt sondern dass die individuellen Pathogenitätsfaktoren mit den Komponenten der natürlichen und spezifischen Infektabwehr interagieren. Untersuchungen zur Bedeutung mikrobieller Superantigene Als Superantigene bezeichnet man eine heterogene Gruppe von Proteinen, die einen äußerst wirksamen Mechanismus der T-Lymphozytenstimulation benutzen. Sie binden über MHCII Moleküle an antigenpräsentierenden Zellen und vernetzen variable Anteile des T-Zellrezeptors auf CD4+ und CD8+-T-Zellen. Obwohl es unterschiedliche Typen von Superantigenen gibt, die untereinander kaum verwandt sind, benutzen sie die gleichen molekularen Mechanismen. (Abb. 14 a-d) Im Rahmen ihrer Bindung werden sie nicht prozessiert, wie dies für konventionelle Antigene üblich ist. Ihre pathophysiologischen Auswirkungen sind offenbar durch die ungewöhnlichen Mechanismen der T-Lymphozytenstimulierung vermittelt. Der Prototyp der Superantigene, die von Infektionserregern gebildet werden, sind Staphylokokken Enterotoxine sowie die pyrogenen Exotoxine, die aus Staphylokokken und Streptokokken gebildet werden. Andere Mitglieder dieser Familie sind das Toxic-Shock-Syndrom -Toxin von Staph.aureus und das Streptokokken Superantigen von S.pyogenes. Einige Toxine haben untereinander eine Sequenzhomologie z.b. SEA und SEB zu mehr als 50% im Unterschied zu TSST-1. In Folge der außerordentlichen Wirksamkeit der Toxine kann ein geringer bakterieller Fokus bereits zu einer generellen Aktivierung des Immunsystems führen. Eine solche polyklonale T-Zell-Aktivierung kann zur Immunsuppression führen; 18

17 die Superantigene können Anergie oder Tod durch Apoptose an T-Zellen induzieren. Die Injektion von Staphylokokken Enterotoxin B in Mäusen führt zu einer partiellen Depletion von V 8-T-Zellen. Die V 8+ Zellen, die immer noch in der Milz vorliegen, antworten weder auf SEB noch auf T-Zellrezeptorantikörper. Die schockähnlichen Symptome, die durch Superantigene induziert werden, kommen durch die massive Freisetzung von Lymphokinen und Monokinen zustande. Ein kritischer Mediator ist wohl TNFα. Das TNF wird wahrscheinlich von T-Lymphozyten produziert. Superantigene können immunpathologische Phänomene sowie die Aktivierung von autoreaktiven B-Zellen wie z.b. Streptokokkenerkrankungen induzieren. In jüngster Zeit gibt es Hinweise, dass mikrobielle Superantigene auch für die Induktion und Persistenz der atopischen Dermatitis mitverantwortlich sein sollen. Im Folgenden untersuchten wir die Wechselwirkung von Toxic-Shock-Syndrom-Toxin und einiger Mutanten hinsichtlich der Mediatorfreisetzung aus humanen Immuneffektorzellen. Die mutierten TSST-Moleküle erhielten wir in der Zusammenarbeit mit Dr. Bonventre, USA. Diese Untersuchungen sind in sofern relevant weil man sich vorstellt, dass durch Veränderung von Superantigenen neue immuntherapeutische Anwendungen zu erreichen sind. Unsere Untersuchungen zeigen sehr deutlich, dass TSST-1 hinsichtlich der Freisetzung von unterschiedlichen Zytokinen (IL-6, TNF u.a.) hochaktiv ist und an wesentlichen Eckpunkten der natürlichen wie auch spezifischen Immunität Einfluss hat. Es gibt TSST-Mutanten, die diesen Einfluss nicht mehr haben. Die Frage stellt sich, inwieweit solche Mutanten in Zukunft für die Blockierung von Rezeptorstrukturen eingesetzt werden können, die durch mikrobielle Superantigene normalerweise okkupiert werden. Man könnte sich vorstellen, dass diese Mutanten sich binden und damit das natürliche Superantigen keine Bindungsstelle mehr hat und damit keine Reaktivität auslöst. (Abb.15 a) Weiterführende Arbeiten wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Ulrich, NIH, USA, durchgeführt. Mit Dr. Ulrich wurden Mutanten des Staphylokokken Enterotoxin B (SEB) analysiert. (Abb. 15 b,c) Wir können zeigen, dass die Zytokinfreisetzung (TNF, IL-10, IL-12) von der Sekretion wie auch von der molekularbiologischen Expression durch diese Mutanten moduliert werden. In diesem Zusammenhang soll betont werden, dass Zytokine wie Interleukin-12 Hoffnungsträger sind, da sie die protektive Immunität offenbar erhöhen. Interleukin-12 induziert offenbar auch Interferon-γ. Interleukin-10 andererseits wirkt antiinflammatorisch aber begünstigt durch eine Stabilisierung des TH 1 -Zellpools die Aktivität eines TH 2 -Zellpools. Inwieweit durch eine verstärkte oder modulierte Interleukin-10-Freisetzung Zytokine freigesetzt werden, die eine Allergisierung favorisieren, kann an diesem Punkt nicht gesagt werden. Andererseits wissen wir heute dass Zytokine, die zu einer Allergisierung führen, wiederum potente inflammatorische Aktivität ausüben und im Rahmen der Immunsuppression offenbar eine große Rolle spielen. So findet man z.b. das Interleukin-4 nicht nur bei allergischen Prozessen sondern auch bei der Immunsuppression (HIV). Die hier vorgestellten Untersuchungen zeigen also sehr deutlich, dass pathogene Mikroorganismen ihrerseits über unterschiedliche Faktoren mit den Immuneffektorzellen in Wechselwirkung treten. Bei gramnegativen Bakterien spielt sicher das zellgebundene und lösliche Polysaccharid eine Rolle. Wenig bearbeitet wurden Strukturkomponenten der Mikroorganismen oder auch sezernierte Exopro- 19

18 dukte (Phospholipase, Lipasen u.a.). Das Zusammenwirken dieser Exoprodukte und Superantigene führt zu einer Modulation der Immunantwort. Für die künftige pathophysiologische Betrachtung von Schock und Sepsis wird man also nicht allein von dem klassischen Bild einer gramnegativen Sepsis (LPS) induzierten pathophysiologischen Veränderung ausgehen müssen, vielmehr wird man das Konzept vertreten müssen, dass mehrere Pathogenitätsfaktoren am Wirkort relevant sind und Immuneffektorzellen modulieren. Modulation der Immuneffektorreaktionen durch RSV (Respiratory Syncytial Virus). Virale Infektionen sind eine zusätzliche Komplikation bei immunsupprimierten Patienten; da RSV pathophysiologisch im frühen Lebensalter aber auch rekurrierend und rezidivierend bei Erwachsenen häufig der bakteriellen und respiratorischen Infektion vorausgeht, haben wir die Wechselwirkung von RSV mit bronchialen Epithelzellen und Immuneffektorzellen analysiert. Es wurde überprüft, ob die Wechselwirkung mit RSV Mediatoren der Entzündung entlässt. Dies ist in der Tat der Fall. Das chemotaktisch aktive Interleukin-8 wie auch der Tumornekrosefaktor (TNF) und lösliche Zytokinrezeptoren werden zeit- und dosisabhängig entlassen. Man muss sich also vorstellen, dass die Wechselwirkung des Epithels mit dem RSV zu einer Freisetzung von Entzündungsmediatoren führt. Diese sorgen für ein inflammatorisches Entzündungspotential. Diese Entzündungszellen können sich durch Aufregulation unterschiedlicher Adhäsine unterhalb des Epithels anlagern und innerhalb ihrer Aktivierung das Epithel durch weitere Mediatoren beeinflussen. RSV führt aber auch zu einer gezielten Freisetzung von Interleukin-10. (Abb. 16) Ein wichtiger Pathogenitätsfaktor ist hierbei das G-Protein. Mittels des isolierten G-Proteins konnten wir nachweisen, dass in der Tat das antiinflammatorische Zytokin Interleukin-10 freigesetzt wird. Man kann sich also vorstellen, dass bei schweren polytraumatischen Situationen (ARDS u.a.) Zytokine wie Interleukin-10 letztendlich ein TH 2 - Pattern favorisieren. Dieses TH 2 -Zytokin- Pattern konnte in der Tat im Rahmen der viralen Infektion nachgewiesen werden. Interleukin-5 führt z.b. zu einer Akkumulation von Eosinophilen. Diese Daten belegen und unterstreichen die Befunde, dass beim ARDS in der Lungenlavage es massiv zu einer Eosinophilie kommt. Die so aktivierten Eosinophilen führen wiederum mittels ihrer kationischen Proteine zu ernsten pulmonalen pathophysiologischen Veränderungen. Zusammenfassung: Anhand unterschiedlicher mikrobieller Pathogenitätsfaktoren haben wir zeigen können, dass neben Endotoxin wichtige Pathogenitätsfaktoren die Reaktivität von Immuneffektorzellen modulieren. Die Aktivierung von Entzündungsmediatoren ist eine wichtige Voraussetzung für die Balancierung der Infektabwehr. Eine überschießende Reaktion führt zu deletären Reaktionen. Eine persistierende Wechselwirkung von Pathogenitätsfaktoren mit humanen Immuneffektorzellen 20

19 führt zur Anergie und damit zur Immunparalyse. Diese Immunparalyse gibt der mikrobiellen Invasion Vorschub und dem Wachstum von opportunistischen Keimen. Es muss deshalb das Ziel sein, neben einer taxonomischen Beobachtung von Mikroorganismen an der Wundfläche die Pathologie der Entzündung durch unterschiedliche Pathogenitätsfaktoren verstehen zu lernen. Die Grundlagen eines besseren Verständisses werden dann zu innovativen therapeutischen Ansätzen führen sowie diagnostische Prädiktivmarker im Verlauf der Brandverletzung auch klinisch ermöglichen. Bedeutung von Pharmaka (Zytokine, lösliche Rezeptoren, Antagonisten u.a.) Unsere Untersuchungen haben dargelegt, dass die Wechselwirkungen unterschiedlicher Entzündungsmediatoren (Zytokine, Lipidmediatoren, zelluläre Adhäsionsmoleküle, lösliche Rezeptormoleküle u.a.) für die Balance der Infektabwehr wie aber auch für das Versagen der natürlichen und spezifischen Infektabwehr verantwortlich ist. Das Interleukin-4 als Wachstumsstimulationsfaktor hat eine herausragende Bedeutung. Interleukin-4 findet sich nicht nur als Switch - Faktor sondern spielt auch im Rahmen der Suppression eine große Rolle. Die Inkubation von Interleukin-4 verändert das nachfolgende zell- und molekularbiologische Zytokinmuster nach Stimulation mit mikrobiellen Superantigenen. Interleukin-4 führt im Verlaufe der Wechselwirkung zu einer massiven Suppression. Daraus ergeben sich u.u. Möglichkeiten, durch Wegfangen von Interleukin-4 mittels mutierter Moleküle oder löslicher Il-4-Rezeptoren therapeutisch in vivo einmal eingreifen zu können. Anhand eines Brandverletzten wurden die Zellen ex vivo in vitro mit dem IL-4-Mutantenmolekül inkubiert und die Freisetzung von Mediatoren analysiert. (Abb.17) Auch hier eröffnen sich neue Perspektiven, die einer weiteren Analyse und Untersuchung bedürfen. Bedeutung von Wachstumsfaktoren: Die Wechselwirkung mikrobieller Exoprodukte führt nicht nur zur Aktivierung von Immuneffektorzellen sondern auch zum beschleunigten Zelltod, d.h. zur Apoptose. Im Rahmen dieser kurzen Lebenszeit kommt es zu einem Abknicken der Mediatorfreisetzung. Ein Versagen der natürlichen Infektabwehr ist die Folge. Die Zugabe von Wachstumsfaktoren könnte die Phagozyten stabilisieren. In Untersuchungen ex vivo in vitro zeigten wir, dass Toxine die Effektorzellen deaktivieren. Die Wechselwirkung von Effektorzellen mit Wachstumsfaktoren führt zu einer gesteigerten Freisetzung von Mediatoren. Hier liegt also nahe, dass u.u. Wachstumsfaktoren für therapeutische Ansätze von außergewöhnlicher Bedeutung sein könnten. Neben Zytokinen stellt sich die Frage, ob eine antientzündliche Therapie die zellbiologische Leistung moduliert. (Abb. 18) 21

20 Untersuchungen zum PAF-Rezeptorantagonisten Wir überprüften einen neuentwickelten PAF-Rezeptorantagonisten, der stereospezifisch mit dem PAF-Rezeptor interagiert sowie seinen Stereoisomer. Der Thrombozyten-aggregierende Faktor (PAF) aktiviert Immuneffektorzellen. Es kommt nach Wechselwirkung mit dem PAF-Rezeptorantagonisten zu einer zeitabhängigen Inhibition von Leukotrien B4 sowie auch Interleukin-8 aus PMN und LMB.(Abb.19,20) Diese Untersuchungen zeigen sehr deutlich, dass Substanzen, die Mediator-spezifisch ausgerichtet sind, aufgrund der Wechselwirkung mit bisher nicht bekannten zellbiologischen Strukturen die Freisetzung anderer Mediatoren moduliert. Der hier beschriebene PAF-Rezeptorantagonist könnte deshalb von außergewöhnlich großer Bedeutung sein, da Mediatoren abseits von PAF durch diese Substanz moduliert werden. Es bleibt abzuwarten, welche Bedeutung der PAF-Rezeptorantagonist für die Behandlung akuter sowie auch chronisch entzündlicher Reaktionen hat. In Anlehnung an die hier vorgestellten Daten überprüften wir auch einen H1-Rezeptorantagonisten, d.h. das Cetirizin. Das Cetirizin ist ein H1-Antagonist. Cetirizin moduliert humane Immuneffektorzellen. Es inhibiert die Freisetzung des chemotaktisch aktivem Leukotrien B4 wie auch des chemotaktisch aktiven Interleukin-8. Unsere Untersuchungen zeigen also sehr deutlich, dass ein klassisches Antihistaminikum offenbar abseits seiner bisherigen Spezifität (H-1) hinsichtlich der Modulation von Immuneffektorzellen außerordentlich wirksam ist. Zusammenfassung: Innovative therapeutische Ansätze können in der Entwicklung von Zytokinen, löslichen Zytokinrezeptoren oder auch Antizytokinen liegen. Die letztgenannte Therapie ist sicherlich sehr kostenaufwendig. Exakte Vorstellungen zu der Strukturwechselbeziehung eines Zytokins mit dem Rezeptor sind dagegen außerordentlich wichtig. Klassische oder neu zu entwickelnde Pharmaka könnten mit Rezeptorstrukturen von Zellen interagieren und damit die entzündliche Ausprägung von Immuneffektorzellen modulieren. In diesem Zusammenhang kommt also nicht nur Zytokinen, die zellulär protektiv oder Mediator neutralisierend sind, eine große Bedeutung zu sondern auch klassischen oder neu zu entwickelnden Pharmaka, die in einem breiteren Sinne entzündungsinhibierend sind ohne dass damit eine u.u. bestehende Immunsuppression weiterhin begünstigt wird. Zu bedenken ist hier, dass Mediatoren der Entzündung benötigt werden, um ein Gleichgewicht der Infektabwehr zu erzielen. Mediatoren haben also auch benefizielle Funktionen. Es ist notwendig dies Gleichgewicht herzustellen. 22