Zur Interaktion des delta-endotoxins

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1 Diss.ETH Nr Zur Interaktion des delta-endotoxins von Bacillus thuringiensis mit monoklonalen Antikörpern und Lipiden ABHANDLUNG zur Erlangung des Titels eines DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN der EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZÜRICH vorgelegt von MAJA HUBER-LUKAÖ dipl.natw.ethz geboren am 7. April 1958 von Zürich Angenommen auf Antrag von: Prof. Dr. L. Ettlingen Referent PD Dr. P. Lüthy, Korreferent 1984

2 ZUSAMMENFASSUNG 8 Hybridzellinien, die 5 verschiedene monoklonale Antikörper gegen das delta- Endotoxin von Bacillus thuringiensis var. thuringiensis synthetisieren, wurden zur Massenproduktion der Antikörper in BALB/c Mäusen gezüchtet. Die Antikörper wurden mittels Antigen-Affinitätschromatographie gereinigt. Die Homogenität der Antikörperpräparationen wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, isoelektrischer Fokussierung und Isotypenbestimmung bestätigt. Alle Antikörper setzen sich aus VI schweren und «leichten Immunglobulinketten zusammen. Im indirekten ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) wurde nachgewiesen, dass alle Antikörper sowohl an das delta-endotoxin als auch an das Protoxin binden. Da die antigenen Determinanten der Antikörper schon auf dem Protoxinmolekül zugänglich sind, muss das Toxin, zumindest teilweise, auf dem Protoxin exponiert sein. Bindungsexperimente mit Hitze- oder mit SDS-denaturiertem Antigen deuten darauf hin, dass die Antikörper gegen konformationelle Determi nanten gerichtet sind. In reziprok durchgeführten kompetitiven Radioimmunoassays wurde deutlich, dass die Antikörper 94.1, 38.2 und 54.1 um die Bindung an das Antigen kompetieren, während Antikörper 94.2 und 44.1 gegen strukturell von einander unabhängige Epitope gerichtet sind. Alle monoklonalen Antikörper erkennen Determinanten, die für das Kristallprotein der Varietät thuringiensis charakteristisch sind. Im Gegensatz zu spezifischem Ziegenserum kreuz reagieren sie weder mit delta-endotoxinen noch Protoxinen der Varietäten kurstaki, dendrolimus, sotto, kenyae, galleriae, entomocidus, tolworthi, darmstadiensis oder toumanoffi, noch binden sie an das israelensis Toxin. Die molekulare Spezifität der Antikörper wurde untersucht, indem die Bindung der Antikörper an proteolytische Abbauprodukte des H-1 Protoxins mit Hilfe indirekter Immunpräzipitation ermittelt wurde. Alle monoklonalen Antikörper binden an die zwei stabilen Zwischenprodukte der Thermolysinverdauung mit MG 72'000 und 63*000, die somit die gleichen Determinanten wie das Trypsinaktivierte delta-endotoxin aufweisen. Das kleinste Proteolyseprodukt, welches noch die Epitope aller monoklonalen Antikörper besitzt, wurde mit Pronase erhalten und hat ein MG von 27*000. Der Einfluss der Antigen-Antikörper-Bindung auf die biologische Aktivität des delta-endotoxins wurde im Biotest mit Larven von Pieris brassicae geprüft. Während Antikörper 38.2, 44.1 und 54.1 die Toxizität nicht beeinträchtigen, inhibiert Antikörper 94.1 die Toxin wirkung teilweise und Antikörper 94.2 neutralisiert das Toxin vollständig.

3 i -95- Das delta-endotoxin zeigt eine ähnliche Wirkung auf Darmepithelzellen von sensitiven Insekten wie einige cytolytische Bakterientoxine, die vor allem die Membranpermeabilität von Vertebratenzellen schädigen. Da die meisten dieser Toxine mit Membranlipiden der Zielzellen interagieren, wurde unter sucht, ob das delta-endotoxin an Darmlipide von P.brassicae bindet. Die extrahierten Darmlipide wurden dünnschichtchromatographisch aufgetrennt und die Bindung von I-delta-Endotoxin an die einzelnen Lipide auf den Kieselgelplatten wurde autoradiographisch nachgewiesen. Das I-delta-Endo toxin bindet an 2 Glycerophospholipide, 1 Sphingophospholipid und 2 alkali- stabile, neutrale Lipide. Die Bindung des I-delta-Endotoxins beschränkt sich jedoch nicht nur auf Lipide empfindlicher Insekten. Es interagiert ebenso mit Lipiden von nicht sensitiven Spodoptera littoralis und Diabrotica balteata Larven wie auch mit Cholesterin, Phosphatidyläthanolamin, Phosphatidylcholin und Sphingomyelin von Vertebraten. Mit Hilfe I-monoklonaler Antikörper wurde nachgewiesen, dass nicht markiertes, natives delta-endotoxin an die gleichen Lipide bindet wie das I-delta-Endotoxin. Im analogen Testsystem wurde auch gezeigt, dass iodiertes H-1 Protoxin und H-14 Toxin ebenfalls an die gleichen Lipide binden wie das H-1 delta-endotoxin. Im Gegensatz zum H-14 Toxin wird das H-1 delta-endotoxin aber weder durch Invertebraten- noch durch Vertebratenlipide in Liposomenform neutralisiert. Dies lässt darauf schliessen, dass die Lipide nicht die primären, physiologischen Toxinrezepto ren sind. Möglicherweise gibt aber auch das vereinfachte Testsystem die in vivo Bedingungen ungenügend wider, indem es die Umgebung, Konformation und Zugänglichkeit der Lipide im Membrangerüst nicht berücksichtigt.

4 SUMMARY 8 hybrid cell lines secreting 5 different monoclonal antibodies against the delta-endotoxin of Bacillus thuringiensis var. thuringiensis were grown in BALB/c mice for large scale production of the antibodies. The ascites-produced antibodies were purified by antigen affinity chromatography. The homogeneity of the antibody preparations was confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, and determination of the antibody isotype. All monoclonal antibodies consist of immunoglobulin Vi heavy and * light chains. The indirect ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) showed that all antibodies against the delta-endotoxin bind also to the protoxin. Since the antigenic determinants are already accessible on the protoxin molecule the toxin must be exposed on the protoxin at least partially. Binding experiments with heat- or SDS-denatured antigen indicated that the antibodies are directed against conformational determinants. Reciprocal competitive radioimmunoassays provided evidence that antibodies 94.1, 38.2, and 54.1 compete for binding to the antigen, whereas antibodies 94.2 and 44.1 are directed against structurally nonoverlapping, distinct epitopes. All the antibodies recognize antigenic determinants characteristic of the crystal protein of the variety thuringiensis. In contrast to specific goat antiserum they do not cross-react neither with delta-endotoxins nor protoxins of the varieties kurstaki, dendrolimus, sotto, kenyae, galleriae, entomocidus, tol worthi, darmstadiensis, or toumanoffi, nor do they bind to the israelensis toxin. The molecular specificity of the antibodies was examined by investigating the binding of the antibodies to proteolysis products of the H-1 protoxin by indirect immunoprecipitation. All the monoclonal antibodies bind to two stable fragments with MW 72*000 and 63'000 which were obtained by digesting the protoxin with thermolysin. Therefore, these fragments contain the same antigenic determinants as the trypsin activated delta-endotoxins. The smallest proteolytic product comprising the epitopes of all the antibodies has a MW of 27*000 and resulted from the digestion of protoxin with pronase. The influence of the antigen-antibody binding was tested in the bioassay with larvae f Pieris brassicae. Antibodies 38.2, 44.1, and 54.1 do not affect the toxin activity. Antibody 94.1 inhibits toxicity partially, whilst antibody 94.2 neutralizes the delta-endotoxin completely. The delta-endotoxin acts on midgut epithelial cells of sensitive insects showing similar effects to some cytolytic bacterial toxins which destroy the membrane permeability of vertebrate cells. Since most of these to xins interact with membrane lipids of their target cells, the binding

5 -97- of the delta-endotoxin to gut lipids of larvae of P.brassicae was investigated. The extracted gut lipids were separated on silica gel plates by thin layer chromatography and the binding of I-delta-endotoxin to individual lipids was demonstrated by autoradiography. It was found that I-delta-endotoxin binds to 2 glycerophospholipids, 1 sphingophospholipid, and 2 alkali-stable neutral lipids. However, the binding of I-delta-endotoxin is not limited to lipids of sensitive insects. It also interacts with lipids of insensitive Spodoptera littoralis and Diabrotica balteata larvae as well as with cholesterol, phosphatidyl ethanolamine, phosphatidyl choline, and sphingomyelin of vertebrates. Using I-monoclonal antibodies it was shown that native, not labelled delta- endotoxin binds to the same lipids as I-delta-endotoxin. In an analogous test System it was also found that I-H-1 protoxin and I-H-14 toxin bind to the same lipids as the H-1 delta-endotoxin. In contrast to H-14 toxin the H-1 delta-endotoxin is not neutralized by lipids of neither invertebrates nor vertebrates in form of liposomes. Therefore, these lipids do not seem to be the physiological receptors of the H-1 delta-endotoxin. However, the simplified test System used does not necessarily reflect the vn vivo conditions because it does not consider the environment, conformation, and accessibility of these lipids in the membrane bilayer.