Pathophysiologie der p.a167v-mutation von KCNJ10

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1 AUS DEM LEHRSTUHL FÜR MEDIZINISCHE ZELLBIOLOGIE PROF. DR. MED. RICHARD WARTH FAKULTÄT FÜR BIOLOGIE UND VORKLINISCHE MEDIZIN DER UNIVERSITÄT REGENSBURG Pathophysiologie der p.a167v-mutation von KCNJ10 INAUGURAL-DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER MEDIZIN (DR. MED.) DER FAKULTÄT FÜR MEDIZIN DER UNIVERSITÄT REGENSBURG VORGELEGT VON FELIZITAS TONDORF REGENSBURG 2016

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3 AUS DEM LEHRSTUHL FÜR MEDIZINISCHE ZELLBIOLOGIE PROF. DR. MED. RICHARD WARTH FAKULTÄT FÜR BIOLOGIE UND VORKLINISCHE MEDIZIN DER UNIVERSITÄT REGENSBURG Pathophysiologie der p.a167v-mutation von KCNJ10 INAUGURAL-DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER MEDIZIN (DR. MED.) DER FAKULTÄT FÜR MEDIZIN DER UNIVERSITÄT REGENSBURG VORGELEGT VON FELIZITAS TONDORF REGENSBURG 2016

4 Dekan: Prof. Dr. Dr. Torsten E. Reichert 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Richard Warth 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Jonathan Jantsch Tag der mündlichen Prüfung: Freitag, 24. Juni 2016

5 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis... I 1 Einleitung Aufbau und Funktion der Niere Allgemeines Distaler Tubulus EAST-Syndrom Phänotyp Molekulare Grundlagen KCNJ Struktur und Funktion von KCNJ-Kanälen Eigenschaften und Lokalisation von KCNJ Interaktion mit KCNJ Die Mutation A167V Schwacher Phänotyp homomerer KCNJ10 A167V-Kanäle Ausgeprägter Phänotyp durch Ko-Expression mit KCNJ Möglichkeit der veränderten Oberflächenexpression Zielsetzung Methoden Material Lösungen Zellen Sonstiges Material Zellkultur Elektroporation von CHO- und HEK-Zellen Ko-Transfektion mit KCNJ Patch-Clamp-Technik Vorbereiten der Zellen Allgemeine Funktionsweise der Patch-Clamp-Technik Ganzzellableitungen Einzelkanalmessungen Ergebnisse Ganzzellableitungen Ruhemembranpotential Strom-Spannungs-Kurven bei homomerer Expression von KCNJ Strom-Spannungs-Kurven bei Ko-Expression mit KCNJ Strom-Spannungs-Kurven bei veränderter Pipettenlösung Pharmakologie I

6 Inhaltsverzeichnis 3.3 Einzelkanalmessungen Diskussion Bedeutung von KCNJ Geringer Funktionsverlust von KCNJ10 A167V-Homomeren KCNJ10/KCNJ16-Heteromere für Nierenphänotyp pathogenetisch Einfluss von ADP auf die Funktion heteromerer A167V Kanäle Ausblick Zusammenfassung Verzeichnisse Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Anhang Danksagung Lebenslauf Eidestattliche Erklärung II

7 1. Einleitung 1 Einleitung 1.1 Aufbau und Funktion der Niere Allgemeines Die Niere erfüllt vielfältige Aufgaben, wie beispielsweise die Eliminierung harnpflichtiger Substanzen und die Regulation von Blutdruck, Blutbildung und Knochenmineralisation. Ihre wichtigste Aufgabe ist jedoch die Kontrolle des Wasser-, Elektrolyt- und Säure-Base-Haushalts. Dazu bildet sie täglich bis zu 180 l Primärharn, der in den Glomeruli aus dem Blut abfiltriert wird. Der Primärharn passiert dann das Tubulussystem. Dieses setzt sich aus funktionell und morphologisch unterschiedlichen Abschnitten zusammen, wie in Abbildung 1 verdeutlicht wird. Hier wird das innere Milieu des Körpers über die Rückresorption von Wasser und gelösten Teilchen ins Blut und über die Sekretion harnpflichtiger Substanzen in den Urin reguliert. Im proximalen Tubulus werden ca. ⅔ des filtrierten Wassers und Kochsalzes rückresorbiert. Diese hohe Transportkapazität spiegelt sich morphologisch in einem hohen, mitochondrienreichen Epithel mit verhältnismäßig lecken Schlussleisten wieder, die eine parazelluläre Diffusion von Wasser und Elektrolyten ermöglichen. Die Mitochondrien stellen Energie für die basolateral lokalisierte Na + -K + -ATPase bereit, die hier, wie auch in den meisten anderen Tubulusabschnitten, die Triebkraft für die luminalen Transportvorgänge liefert. Abbildung 1: Nephronabschnitte mit dazugehörigem Epithel. Modifiziert nach Schmidt, Lang 2007 [1]. 1

8 1. Einleitung Im flachen Epithel des dünnen Teils der Henle-Schleife finden kaum aktive Transportprozesse statt. Der dicke, aufsteigende Teil der Henle-Schleife entzieht dem Harn hauptsächlich über den Na + -K + -2Cl - -Cotransporter (NKCC2) Elektrolyte, ist aber wasserundurchlässig. Dadurch sinkt die Osmolalität in Richtung Nierenrinde wieder. Das Epithel ist hier wieder hoch und mitochondrienreich. Im distalen Tubulus und im Sammelrohr können Transportprozesse gegen einen hohen Gradienten erfolgen, da die dort ebenfalls mitochondrienreichen Tubuluszellen dichte Schlussleisten aufweisen. Hier findet in erster Linie die Feinjustierung der Urinzusammensetzung statt, es werden aber immerhin noch ca. 10 % des filtrierten Natriums rückresorbiert Distaler Tubulus Als distaler Tubulus wird der Abschnitt zwischen der Macula densa und dem Sammelrohr bezeichnet. Dazu gehören das distale Konvolut (Pars convoluta des distalen Tubulus), das Verbindungsstück (CNT, connecting tubule) und der anfängliche Teil des Sammelrohrs (CCD, cortical collecting duct) [2]. Je nach Expression unterschiedlicher Proteine wird beim distalen Konvolut noch in einen frühen und einen späten Teil unterschieden (DCT1 und DCT2, distal convoluted tubule) [3]. Die Resorption von Na + und Ca 2+ erfolgt nach Bedarf und wird über Hormone wie Aldosteron und Parathormon gesteuert. Des Weiteren wird im distalen Tubulus Mg 2+ rückresorbiert, und H + und K + werden sezerniert. Die Triebkraft für diese Transportprozesse ist wiederum die Na + -K + -ATPase. Indem sie Na + basolateral aus der Zelle ausschleust, sorgt sie dafür, dass Na + luminal durch den NaCl- Cotransporter (NCC, v.a. im DCT1) und den epithelialen Natriumkanal (ENaC, v.a. in DCT2, CNT und CCD) in die Zelle aufgenommen werden kann [3]. Dabei kann die Menge an extrazelluär verfügbarem K + für die Funktion der Na + -K + -ATPase limitierend sein. Kaliumionen können aber aus dem Zellinneren über basolaterale K + -Kanäle wieder nach draußen gelangen, um der Na + -K + -ATPase erneut zur Verfügung zu stehen. Dieses Prinzip wird als pump-leakcoupling bezeichnet [4]. Der funktionell bedeutendste dieser basolateralen K + -Kanäle ist der einwärtsgleichrichtende K + - Kanal KCNJ10, der im distalen Tubulus vor allem als Heterotetramer mit KCNJ16, einem ihm verwandten Kanalprotein, vorkommt [5,6]. Neben dem oben beschriebenen K + -Recycling sorgen diese Kanäle für ein hyperpolarisiertes Membranpotential, das als Triebkraft für den basolateralen Ausstrom von Cl - und andere Transportprozesse dient [3]. Die wichtigsten 2

9 1. Einleitung Membranproteine des distalen Tubulus und die von ihnen transportierten Ionen sind in Abbildung 2 veranschaulicht. Störungen des distalen Tubulus, wie sie beispielsweise beim Gitelman- Syndrom, einem genetisch bedingten Ausfall des NCC, oder durch Einnahme eines Thiazid-Diuretikums (medikamentöse Hemmung des NCC) auftreten, äußern sich in Serumelektrolytverschiebungen. Es kommt vor allem zu Hypokaliämie, Alkalose, Hypomagnesiämie und Hypokalzurie. Die zu erwartende Hyponatriämie bleibt meist aus, da Na + und auch Ca 2+ im proximalen Tubulus kompensatorisch vermehrt resorbiert werden, wodurch sich auch die Abbildung 2: Transportprozesse im distalen Konvolut (DCT). Hypokalzurie erklären lässt [7]. Weiterhin wird der Na + -Verlust über eine Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS) und damit einer Erhöhung der Salzresorption über den ENaC ausgeglichen. Die gesteigerte ENaC-Aktivität im Sammelrohr führt allerdings zur Sekretion von H + und K +, was die Alkalose und die Hypokaliämie bedingt [3]. Wie es zum Mg 2+ -Verlust kommt, ist bislang nicht ganz geklärt; möglicherweise wird die Expression des luminalen Mg 2+ -Kanals TRPM6 durch Aldosteron unterdrückt [7]. 1.2 EAST-Syndrom Phänotyp 2009 wurde ein dem Gitelman-Syndrom ähnliches Krankheitsbild beschreiben, bei dem neben dem tubulären Salzverlust noch extrarenale Symptome hinzukommen: Die Patienten leiden schon als Kleinkinder unter Krampfanfällen, später fallen Gangataxie und Innenohrschwerhörigkeit auf. Diese Kardinalsymptome sind in der Krankheitsbezeichnung, dem Akronym EAST (epilepsy, ataxia, sensorineural deafness, tubulopathy), zusammengefasst [8]. Eine andere Arbeitsgruppe beobachtete darüber hinaus noch eine mentale Retardierung, die in deren Bezeichnung für diese Erkrankung, SeSAME-Syndrom (seizures, sensorineural deafness, ataxia, mental retardation, epilepsy), Eingang findet [9]. 3

10 1. Einleitung Molekulare Grundlagen Als Ursache dieser Erkrankung wurden homozygote oder compund-heterozygote Mutationen des Gens KCNJ10 gefunden. Die bisher gefundenen Mutationen R65P, C140R, T164I, A167V, R199X, R297C [9], G77R [8], R175Q [10], R65C, F75L, V259fsX259 [11], T57I [12], F75C, V91fs197X [13] betreffen Aminosäuren, die in homologen Proteinen anderer Wirbeltiere hoch konserviert sind. In elektrophysiologischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass diese Mutationen die Kanalfunktion in unterschiedlichen Schweregraden beeinträchtigen [10 16], bei einigen ist auch die Oberflächenexpression gestört [12,14 17] oder das ph-optimum stark verschoben [10,15,16]. 1.3 KCNJ Struktur und Funktion von KCNJ-Kanälen Der beim EAST-Syndrom betroffene Kanal KCNJ10 (K ir 4.1) gehört zu den einwärtgleichrichtenden Kaliumkanälen, auch als K ir -Kanäle (K ir = inwardly rectifying K + - channel) oder KCNJ-Kanäle bezeichnet. Einwärtsgleichrichtung bedeutet, dass diese Kanäle den Einstrom von Kationen wie K + bei negativer Spannung besser leiten als deren Ausstrom bei gleich großer positiver Spannung [18]. Es gibt 15 KCNJ-Kanäle in 7 Subfamilien, die in vielen Geweben eine wichtige Rolle spielen. Dazu gehören vor allem ZNS, Herz, Niere und endokrine Organe [19]. Störungen dieser Kanäle lösen spezifische Krankheitsbilder aus, z.b. das Bartter- Syndrom Typ II durch eine Mutation von KCNJ1 (K ir 1.1, ROMK) oder den kongenitalen Hyperinsulinismus durch eine Mutation von KCNJ11 (K ir 6.2) [20]. Der Aufbau von KCNJ-Kanälen ähnelt dem der meisten K + -Kanäle. Diese integralen Membranproteine sind ein aus vier Untereinheiten zusammengesetzes Tetramer [21]. Dabei können die Untereinheiten gleichartig sein (Homotetramer), oder von zwei unterschiedlichen KCNJ-Vertretern stammen (Heterotetramer). Jede Untereinheit Abbildung 3: Struktur von KCNJ-Kanälen Entnommen aus Parrock et al [13]. besteht dabei aus zwei Transmembrandomänen (M1 und M2), einer Poren-Region (H5) und den zytosolisch lokalisierten N- und C- Termini. Diese Struktur ist in Abbildung 3 dargestellt. Einige KCNJ-Kanäle können auch mit anderen, nicht verwandten Proteinen (z.b. mit G-Proteinen oder Sulfonylharnstoffrezeptoren) assoziieren, um Kanäle mit anderen Eigenschaften zu bilden [20]. 4

11 1. Einleitung Eigenschaften und Lokalisation von KCNJ10 KCNJ10 ist ein seit 1995 bekanntes Mitglied der KCNJ-Familie, das im Vergleich zu anderen KCNJ-Kanälen weniger stark einwärtsgleichrichtet [22]. Auf Einzelkanalebene ist beschrieben, dass der Kanal nahezu durchgehend geöffnet ist und einen Leitwert von circa 12 ps aufweist [23]. Abbildung 4 zeigt die zu vermutende Membrantopologie von KCNJ10. Die Stellen bekannter Mutationen sind rot markiert [3]. Abbildung 4: Membrantopologie von KCNJ10. Neben seiner Expression im distalen Tubulus der Niere [10] kommt KCNJ10 im Innenohr und im ZNS vor. Im Innenohr ist KCNJ10 in Zellen der Stria vascularis der Kochlea lokalisiert und trägt zur Bildung von Endolymphe und endokochleärem Potential bei [24]. Im ZNS findet man KCNJ10 in Gliazellen, vor allem in Astrozytenfortsätzen um Synapsen und Blutgefäße [25], sowie in Zellkörpern von Oligodendrozyten, in der Bergmann-Glia im Kleinhirn und in Müller- Abbildung 5: Auswirkung von KCNJ10-Mutationen auf die Elektrolytresorption im DCT. 5 Zellen der Retina [26]. Hier trägt KCNJ10 vermutlich vor allem dazu bei, dass K +, das sich durch das Repolarisieren der Neurone im Extrazellulärraum anhäuft, in die Gliazellen aufgenommen und umverteilt werden kann (sogenanntes K + spatial buffering ). Eine gestörte Funktion von KCNJ10 resultiert in einer verlängerten neuronalen Depolarisation und in einer herabgesetzten Krampfschwelle [9]. Die Symptome Innenohrschwerhörigkeit, Ataxie und Epilepsie, die beim EAST-Syndrom auftreten, unterstreichen die Bedeutung von KCNJ10 in ZNS und Innenohr.

12 1. Einleitung Wie oben beschrieben ist KCNJ10 eine essentielle Komponente für die Salzresorption im distalen Tubulus. Die Auswirkungen eines mutierten Kanals auf die dortigen Transportprozesse sind in Abbildung 5 verdeutlicht. Fehlt KCNJ10, so steht zu wenig extrazelluläres K + für die Na + /K + -ATPase zur Verfügung. Na + akkumuliert somit in der Zelle, und die Triebkraft für die NaCl-Aufnahme durch den NCC fehlt. Weiterhin wird der sekundär-aktive Transport von Magnesium und Kalzium blockiert (wobei der Kalziumverlust im proximalen Tubulus überkompensiert wird), und es geht vermehrt Kalium verloren. So entsteht ein dem Gitelman- Syndrom ähnlicher Nierenphänotyp Interaktion mit KCNJ16 KCNJ10 kann mit KCNJ16 (K ir 5.1) Heterotetramere ausbilden, die sich in ihren Eigenschaften deutlich von den KCNJ10-Homotetrameren unterscheiden. Sie zeigen eine geringere Offenwahrscheinlichkeit, dafür aber einen höheren Leitwert von bis zu 43 ps [23] und eine stärkere ph-abhängigkeit [27]. Außerdem sind sie deutlich stärker einwärtsgleichgerichtet, und es können klar abgrenzbare, niedrigere Leitfähigkeitslevel beobachtet werden, sogenannte substates [23]. An der Assoziation sind vermutlich mehrere Regionen von KCNJ10 beteiligt, eine Schlüsselfunktion kommt aber der zweiten Transmembrandomäne zu [28]. Dabei assoziieren die Untereinheiten vermutlich abwechselnd miteinander, also , wie in Abbildung 6 dargestellt. Bilden hingegen vier KCNJ10-Untereinheiten einen Kanal, so wird dieser als homomerer Kanal oder Homotetramer bezeichnet. KCNJ16 alleine ist nicht dazu fähig, funktionelle Kanäle auszubilden [23]. In vivo spielt die Heteromerisation von KCNJ10 mit KCNJ16 vor allem in der Niere eine Rolle, wo die KCNJ10/KCNJ16- Heterotetramere im distalen Tubulus die wichtigsten basolateralen Kaliumkanäle darstellen [5,6]. Auch in der Retina kommen solche heterotetrameren Kanäle vor [29], in Innenohr [30] und Gehirn [27] hingegen wahrscheinlich nicht. Dort werden zwar auch beide Proteine exprimiert, haben aber vermutlich unterschiedliche physiologische Partnerproteine und Aufgaben [27,30]. Abbildung 6: Heteromerisation mit KCNJ Die Mutation A167V Schwacher Phänotyp homomerer KCNJ10 A167V-Kanäle Die Mutation A167V gehört zu den Ersten, die beschrieben wurden. Zunächst wurde Sie jedoch nur in zwei compound-heterozygoten Patienten zusammen mit der Mutation R297C 6

13 1. Einleitung gefunden [9]. Da homomere Kanäle mit dieser A167V-Mutation eine Restfunktion von ~ 60 % zeigen, wurde diese Mutation zunächst als per se benigne betrachtet [15]. Man ging davon aus, dass sie lediglich in Kombination mit einer schwerwiegenderen Mutation wie R297C krankheitsverursachend sei [16] Ausgeprägter Phänotyp durch Ko-Expression mit KCNJ beschrieben Parrock et al. 3 Patienten, die die Mutation A167V in homozygotem Zustand aufweisen und an Ataxie, Innenohrschwerhörigkeit und einem Salzverlustsyndrom leiden. Diese Symptome des EAST-Syndroms können durch eine 60 %ige Restfunktion von KCNJ10 nicht erklärt werden, denn dann müssten auch heterozygote Träger von Mutationen, die einen vollständigen Funktionsverlust bewirken, einen ähnlichen Phänotyp zeigen [13]. Sala-Rabanal et al. (2010) war bereits aufgefallen, dass KCNJ10 A167V in Ko-Expression mit KCNJ16 einen stärkeren Funktionsverlust zeigt als in homomerer Expression [15]. Parrock et al. stellten in elektrophysiologischen Untersuchungen an Xenopus Oozyten einen vollständigen Funktionsverlust der A167V-Mutante durch Heteromerisation mit KCNJ16 fest und sahen darin den Grund, weshalb ihre Patienten symptomatisch sind [13]. KCNJ10 A167V wurde bisher von 4 Arbeitsgruppen untersucht [13 16]. Die Ergebnisse weichen mitunter stark voneinander ab und sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1: Zusammenfassung publizierter Ergebnisse zu KCNJ10 A167V Expressionssystem Restfunktion (% vom WT) J10 A167V J10 A167V/J16 WT Oberflächenexpression KCNJ10 A167V Tang et al [14] HEK293 ~ 7 % ~ 23 % 1 keine drastische Einschränkung Sala-Rabanal et al [15] COSm6 ~ 60 % ~ 18 % 1 vermindert Williams et al [16] Parrock et al [13] Xenopus Oozyten Xenopus Oozyten ~ 60 % ~40 % 2 vermindert 3 ~ 60 % ~ 2 % 4 nicht untersucht Möglichkeit der veränderten Oberflächenexpression Inwiefern KCNJ10 A167V an der Zelloberfläche exprimiert wird, ist ebenfalls strittig. Einige Arbeitsgruppen sahen in ihren Expressionssystemen eine vermindert Oberflächenexpression 1 Stöchiometrie (KCNJ16:KCNJ10) = 1:1 2 Stöchiometrie (KCNJ16:KCNJ10) = 10:1 3 Zur Untersuchung der Oberflächenexpression verwendeten Williams et al. HEK293-Zellen 4 Stöchiometrie (KCNJ16:KCNJ10) = 3:1 7

14 1. Einleitung [15,16] und erachten dies zum Teil als Grund für die leichte Reduktion der Ganzzellströme bei homomerer Expression von KCNJ10 A167V im Vergleich zum Wildtyp [15]. Tanemoto et al. (2014) schlugen einen anderen Mechanismus für die Pathogenität der A167V- Mutation vor. Sie beobachteten eine gestörte Interaktion mit Proteinen, die eine gezielte Expression an der basolateralen Seite der Tubuluszellen ermöglichen. Dadurch komme es in den meisten Zelllinien (wie beispielsweise HEK-Zellen) zwar zu einer nahezu normalen Oberflächenexpression, in tubulären Zelllinien wie MDCKII (und eben in den Tubuluszellen der Patienten) aber nicht. Für die basolaterale Expression von KCNJ10 ist die Interaktion mit dem Gerüstprotein MAGI-1 wichtig. Da MAGI-1 aber basolateral fixiert ist, muss KCNJ10 zu MAGI-1 hin transportiert werden bzw. die beiden Proteine müssten bereits im endoplasmatischen Retikulum assoziieren. Diese Mechanismen könnten durch die A167V- Mutation gestört sein [17]. 1.5 Zielsetzung Die elektrophysiologischen Erkenntnisse zur A167V-Mutation sind gerade in Säugerzellen uneinheitlich. Außerdem sind die Untersuchungen zur Ko-Expression von KCNJ10 A167V mit KCNJ16 in Säugerzellen stets in einer 1:1- Stöchiometrie durchgeführt worden, da lediglich geprüft werden sollte, ob durch Ko-Expression mit KNCJ16 die Restfunktion der Mutanten erhöht werden kann. Bei einer 1:1-Stöchiometrie ist eine Verfälschung des Stromes durch eine mögliche Bildung von KNCJ10 A167V-Homomeren sehr wahrscheinlich. Daher wurden in dieser Arbeit die elektrophysiologischen Eigenschaften der A167V-Mutation eingehender untersucht. Für die Ganzzell-Messungen wurden CHO-Zellen verwendet. Diese sind ebenfalls Säugerzellen und haben den Vorteil, dass sie relativ wenige endogene Kanäle exprimieren, die den Strom verfälschen könnten. Für die heteromere Expression von KCNJ10 mit KCNJ16 wurde eine 1:10 Stöchiometrie gewählt, um die Bildung von KCNJ10-Homomeren weitestgehend zu vermeiden. Zudem wurden Einzelkanalmessungen der KCNJ10/KCNJ16 Heteromere durchgeführt, was bei der A167V-Mutation bisher nicht erfolgt ist. Weiterhin wurden mögliche aktivierende Einflüsse des zellinneren Milieus auf die Funktion der KCNJ10/KCNJ16-Heteromere untersucht. Die Kenntnis aktivierender Faktoren könnte als Basis für den gezielten Einsatz von Medikamenten zur Behandlung des EAST-Syndroms führen. 8

15 2. Methoden 2 Methoden 2.1 Material Lösungen Tabelle 2: Ringerlösung Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) Hepes 238,31 1,192 5 NaCl 58,44 8, K 2 HPO 4 228,23 0,365 1,6 KH 2 PO 4 136,09 0,054 0,4 D-Glucose 198,00 0,990 5 MgCl 2 (1 M Stocklösung) 203,30 1,0 1 CaCl 2 (1 M Stocklösung) 147,02 1,3 1,3 Milli-Q H 2 O ad 1000 ml NaOH ph 7,4 einstellen Tabelle 3: Ringer Hochkalium 15 Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) Hepes 238,31 1,192 5 NaCl 58,44 7, ,6 KCl 74,56 0,850 11,4 K 2 HPO 4 228,23 0,365 1,6 KH 2 PO 4 136,09 0,054 0,4 D-Glucose 198,00 0,990 5 MgCl 2 (1 M Stocklösung) 203,30 1,000 1 CaCl 2 (1 M Stocklösung) 147,02 1,300 1,3 Milli-Q H 2 O ad 1000 ml NaOH ph 7,4 einstellen Tabelle 4: Ringer Hochkalium 50 Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) Hepes 238,31 1,192 5 NaCl 58,44 5,762 58,44 KCl 74,56 3,46 46,4 K 2 HPO 4 228,23 0,365 1,6 KH 2 PO 4 136,09 0,054 0,4 D-Glucose 198,00 0,990 5 MgCl 2 (1 M Stocklösung) 203,30 1,000 1 CaCl 2 (1 M Stocklösung) 147,02 1,300 1,3 Milli-Q H 2 O NaOH ad 1000 ml ph 7,4 einstellen 9

16 2. Methoden Tabelle 5: Barium in Ringer Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) BaCl 2 (1 M Stocklösung) 244,27 0,050 1 Ringer-Lösung (siehe Tabelle 2) ad 50 ml Tabelle 6: Diazoxid in Hochkalium 50 Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) Diazoxid (10-2 M Stocklösung) 230,7 0,050 0,01 Ringer Hochkalium 50 (siehe Tabelle 4) ad 50 ml Tabelle 7: Tolbutamid in Hochkalium 50 Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) Tolbutamid (10-1 M Stocklösung) 270,4 0,005 0,01 Ringer Hochkalium 50 (siehe Tabelle 4) ad 50 ml Tabelle 8: Pipettenlösung 4 Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) D-Kaliumgluconat 234,25 2, KCl 74,56 0, NaH 2 PO 4 137,99 0,017 1,2 Na 2 HPO 4 177,99 0,085 4,8 D-Glucose 198,00 0,099 5 EGTA 380,40 0,038 1 Na 2 ATP 551,00 0,165 3 MgCl 2 (1 M Stocklösung) 203,30 0,238 2,38 CaCl 2 (1 M Stocklösung) 147,02 0,073 0,726 Milli-Q H 2 O ad 100 ml KOH, HCL ph 7,2 einstellen Tabelle 9: Mg 2+ -freie Pipettenlösung Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) D-Kaliumgluconat 234,25 2, KCl 74,56 0, NaH 2 PO 4 137,99 0,017 1,2 Na 2 HPO 4 177,99 0,085 4,8 D-Glucose 198,00 0,099 5 EGTA 380,40 0,038 1 Na 2 ATP 551,00 0,165 3 CaCl 2 (1 M Stocklösung) 147,02 0,073 0,726 Milli-Q H 2 O KOH, HCL ad 100 ml ph 7,2 einstellen 10

17 2. Methoden Tabelle 10: Pipettenlösung mit ADP und Phosphat Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) D-Kaliumgluconat 234,25 0, KCl 74,56 0, NaH 2 PO 4 137,99 0,004 1,2 Na 2 HPO 4 177,99 0,021 4,8 K 2 HPO 4 228,23 0,017 3 D-Glucose 198,00 0,025 5 EGTA 380,40 0,095 1 Na 2 -ATP 551,00 0,021 1,5 K-ADP 501,32 0,019 1,5 MgCl 2 (1 M Stocklösung) 203,30 0,060 2,38 CaCl 2 (1 M Stocklösung) 147,02 0,018 0,726 Milli-Q H 2 O ad 25 ml KOH, HCL ph 7,2 einstellen Tabelle 11: Pipettenlösung mit ADP Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) D-Kaliumgluconat 234,25 0, KCl 74,56 0, NaH 2 PO 4 137,99 0,004 1,2 Na 2 HPO 4 177,99 0,021 4,8 D-Glucose 198,00 0,025 5 EGTA 380,40 0,095 1 Na 2 ATP 551,00 0,021 1,5 K-ADP 501,32 0,019 1,5 MgCl 2 (1 M Stocklösung) 203,30 0,060 2,38 CaCl 2 (1 M Stocklösung) 147,02 0,018 0,726 Milli-Q H 2 O ad 25 ml KOH, HCL ph 7,2 einstellen Tabelle 12: Pipettenlösung mit niedrigem ATP-Gehalt Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) D-Kaliumgluconat 234,25 0, KCl 74,56 0, NaH 2 PO 4 137,99 0,004 1,2 Na 2 HPO 4 177,99 0,021 4,8 K 2 HPO 4 228,23 0,017 3 D-Glucose 198,00 0,025 5 EGTA 380,40 0,095 1 Na 2 ATP 551,00 0,021 1,5 MgCl 2 (1 M Stocklösung) 203,30 0,045 2,38 CaCl 2 (1 M Stocklösung) 147,02 0,018 0,726 Milli-Q H 2 O KOH, HCL ad 25 ml ph 7,2 einstellen 11

18 2. Methoden Tabelle 13: Referenzelektrodenlösung Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) KCl 74,56 3, Milli-Q H 2 O ad 50mL Tabelle 14: CHO-Medium Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) FCS 50,0 L-Glutamin (2*10-2 M) 5,00 2 Natrium-Pyruvat (10-2 M) 5,00 1 Penicillin/Streptomycin-Lösung 2,50 50 I.E./100 µg/ml MEM Alpha Medium ad 500mL Tabelle 15: HEK-Medium Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) FCS 50,0 Penicillin/Streptomycin-Lösung 5, I.E./200 µg/ml MEM Alpha Medium ad 500mL Tabelle 16: Coating-Medium Stoff Molekulargewicht (g/mol) Einwaage (g) eingesetzte Stocklösung (ml) Konzentration (mmol/l) BSA 1,875 Kollagen 1,000 Fibronektin 0,500 Penicillin/Streptomycin-Lösung 0,5 50 I.E./100 µg/ml F-12 Nutrient Mixture Medium ad 50mL Zellen Tabelle 17: Zellarten Zellinie Hersteller CHO Ovarialzellen des chinesischen Hamsters Cell Lines Service, Eppelheim, D HEK Humane embryonale Nierenzellen Cell Lines Service, Eppelheim, D Tabelle 18: Plasmide Insert Vektor Resistenz Mutation hkcnj10 pires CD8 Ampicillin - (WT) hkcnj10 pires CD8 Ampicillin A167V hkcnj16 pires CD8 Ampicillin - (WT) 12

19 2. Methoden Sonstiges Material Tabelle 19: Geräte Gerät Analysenwaage (GR-120) Elektroporationsgerät (Neon) Inkubator (Heraeus) Invertmikroskop (Axiovert 10) Invertmikroskop (Axiovert 200) Magnetrührer Mikromanipulator Milli-Q-Anlage (Biocel A10) Oszilloskop ph-meter Puller (DMZ Universal Puller) Pumpe (PPS2) Sterilbank (Holten LaminAir 1.2) Verstärker (ähnlich EPC-7) Verstärker (EPC-10) Vortexer (Vortex Genie) Waage (EK-600H) Wasserbad (W19) Wipp-Schüttler (Minirocker MR1) Hersteller A&D Instruments, Tokio, J Life Technologies GmbH, Darmstadt, D Fisher Scientific GmbH, Schwerte, D Zeiss, Jena, D Zeiss, Jena, D Heidolph Instruments, Schwabach, D Scientifica, Uckfield, UK Millipore, Schwalbach/Ts., D Hameg Instruments, Mainhausen, D Schott Geräte, Mainz, D Zeitz Instruments GmbH, Martinsried, Deutschland Multi Channel Systems GmbH, Reutlingen, D Fisher Scientific GmbH, Schwerte, D U. Fröbe und R. Busche, Institut für Physiologie, Freiburg, D HEKA Elektronik, Lambrecht, D Scientific Industries, New York, USA A&D Instruments Ltd., Tokio, J Haake, Karlsruhe, D BioSan, Riga, LV Tabelle 20: Verbrauchsmaterial Produkt Deckgläser rund Glaskapillaren (GC 150-F 7.5) Kulturflaschen Kulturschalen Pipettenspitzen Reaktionsgefäße (1,5µL) Hersteller Marienfeld Laboratory Glassware, Lauda-Königshofen, D Harvard Apparatus LTD, Edenbridge, UK Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, D Fisher Scientific GmbH, Schwerte, D Sarstedt, Nümbrecht, D Eppendorf, Hamburg, D Tabelle 21: Substanzen Produkt Hersteller BaCl 2 Merck KGaA, Darmstadt, D Bovines Fibronektin Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA Bovines Serumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO USA CaCl 2 Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D D-Glucose Merck KGaA, Darmstadt, D Diazoxid Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA D-Kaliumgluconat Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA DynaBeads (anti-cd8) Invitrogen, Karlsruhe, D EGTA Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA F-12 Nutrient Mixture Medium Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland Fötales Kälberserum (FCS) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland HCl Merck KGaA, Darmstadt, D Hepes AppliChem, Darmstadt, D K 2 HPO 4 Merck KGaA, Darmstadt, D 13

20 2. Methoden Tabelle 21: Substanzen (fortgesetzt) Produkt K-ADP KCl KH 2 PO 4 KOH Kollagen (aus Kälberhaut) L-Glutamin, 200 mm MgCl 2 Na 2 -ATP NaCl NaOH Na-Pyruvat, 100 mm Lösung Penicillin-Streptomycin-Lösung Silikon-Hochvakuumfett Tolbutamid Trypsin-EDTA-Lösung (10-fach) 0,5 % Trypsin, 5,3 mm EDTA Hersteller Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA Merck KGaA, Darmstadt, D Merck KGaA, Darmstadt, D Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA Gibco Cell Culture Systems - Invitrogen, Karlsruhe, D Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA VWR Chemicals, Leuven, B Merck KGaA, Darmstadt, D Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA Gibco Cell Culture Systems - Invitrogen, Karlsruhe, D Merck KGaA, Darmstadt, D Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA Gibco Cell Culture Systems - Invitrogen, Karlsruhe, D Tabelle 22: Verwendete Software Produkt LabChart 7 Patch-Master v2x35 Hersteller ADInstruments GmbH, Spechbach, D HEKA Elektronik, Lambrecht, D 2.2 Zellkultur Elektroporation von CHO- und HEK-Zellen Um die elektrophysiologischen Eigenschaften von KCNJ10- und KCNJ10/KCNJ16-Kanälen zu untersuchen, wurden diese in immortalisierten Zelllinien überexprimiert. Zur Messung der Ganzzellströme wurden CHO-Zellen verwendet. Für die Einzelkanalmessungen wurden HEK- Zellen gewählt, da diese in Patch-Clamp Experimente häufiger zu erfolgreichen Experimenten führen als CHO-Zellen. Da hier nur einzelne Kanäle vermessen werden, spielt der höhere Anteil endogener Kanäle keine Rolle. Die Transfektion dieser Zellen wurde mittels Elektroporation durchgeführt. Bei dieser Methode wird die Zellmembran durch einen kurzen Strompuls vorrübergehend für Fremd-DNA permeabel gemacht. Nach der Aufnahme des Plasmids exprimiert die Zelle dann für eine gewisse Zeit die darauf enthaltenen Gene (transiente Transfektion). Für dieses Verfahren wurden die Zellen in Suspension gebracht und dann die gewünschte Menge des entsprechenden Plasmids zugegeben. Bei den HEK-Zellen war das 1 µg Plasmid, bei 14

21 2. Methoden den CHO-Zellen 0,6 µg Plasmid + 0,4 µg leerer Vektor (pires CD8). Das Elektroporationsprotokoll sah bei den CHO-Zellen 2 Pulse mit einer Spannungsstärke von 1400 V und einer Dauer von 20 ms vor, bei den HEK-Zellen 2 Pulse von 1150 V und ebenfalls 20 ms. Direkt im Anschluss wurden die Zellen in mediumgefüllte Schälchen mit beschichteten Glasplättchen gegeben. Diese Glasplättchen sind mit Kollagen und Fibronektin überzogen, damit die Zellen besser anwachsen können. Danach wurden die Zellen im Brutschrank bei 37 C und 5 % CO 2 inkubiert und am nächsten Tag für die Experimente verwendet Ko-Transfektion mit KCNJ16 Bei der Ko-Transfektion von KCNJ10 mit KCNJ16 ist problematisch, dass sich nicht nur die gewünschten KCNJ10/KCNJ16-Heteromere bilden, sondern dass auch immer die Möglichkeit besteht, dass sich vier KCNJ10-Untereinheiten zu einem homomeren Kanal zusammenlagern. Gerade im Fall der A167V-Mutation ist dies kritisch, da die Homomere relativ große Ströme zulassen. Diese würden die möglicherweise geringen Ströme der Heteromere überlagern und die Messung verzerren. Diese Gefahr besteht bei der KCNJ16-Untereinheit nicht, da KCNJ16 allein keine funktionellen Kanäle bildet. Um eine Verfälschung der Messung durch KCNJ10-Heteromere zu vermeiden, wurde KCNJ16 in 10-fachem Überschuss eingesetzt. Im Falle der HEK-Zellen wurde also 0,1 µg KCNJ10- Plasmid und 0,9 µg KCNJ16-Plasmid eingesetzt. Bei den CHO-Zellen waren es 0,06 µg KCNJ10-Plasmid und 0,54 µg KCNJ16-Plasmid. 2.3 Patch-Clamp-Technik Vorbereiten der Zellen Um sicherzustellen, dass bei den Versuchen nur die erfolgreich transfizierten Zellen verwendet wurden, mussten diese kenntlich gemacht werden. Das gelang mit Hilfe von Anti-CD8-Dyna- Beads, kleinen Kügelchen, die mit Antikörpern gegen das humane Oberflächenprotein CD8 beschichtet sind. Die tranfizierten Zellen exprimierten CD8, da es auf dem bicistronischen Plasmid mitkodiert war. Anti-CD8-Dyna-Beads binden somit spezifisch nur an Zellen, die ein oder mehrere Plasmide aufgenommen und CD8-Oberflächenproteine gebildet haben. Pro Schale wurde 1 µl Dyna-Bead-Suspension in 1 ml Ringerlösung gelöst, gevortext und nach Absaugen des Mediums auf die Zellen gegeben. Nach 2 min Inkubationszeit auf einer 15

22 2. Methoden Wippe wurden die Zellen weitere 5 min mit Ringerlösung gewaschen, um nicht gebundene Beads zu entfernen. Für die Experimente wurde das Glasplättchen mit den Zellen in die Messkammer ( Bad ) eines Patch-Clamp-Messplatzes eingebracht. Dieser ist mit einem inversen Mikroskop ausgestattet, was bedeutet, dass die Objektive unter dem Objekttisch angebracht sind. Dadurch bleibt oberhalb der Messkammer Platz, um an den Zellen zu arbeiten. Das Bad verfügt über einen Zuund Ablauf, wobei die Zulaufgeschwindigkeit 2 ml/min betrug. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. An einem Tag wurden immer sowohl Wildtyp als auch Mutante untersucht Allgemeine Funktionsweise der Patch-Clamp-Technik Die Patch-Clamp-Technik ist eine Methode der Elektrophysiologie, die es ermöglicht, Ströme durch einzelne Kanäle einer Zellmembran zu messen. Diese Ströme liegen im Bereich von wenigen Picoampere und können leicht durch Leckströme direkte Ströme zwischen Pipette und Bad überlagert werden. Daher versucht man bei der Patch-Clamp-Technik, solche Leckströme zu verhindern, indem man den zu vermessenden Membranfleck (Patch) elektrisch isoliert. Dazu ist die Messelektrode in einer dünnen Glaspipette untergebracht (siehe Abbildung 7). Deren Öffnung ist etwa 1µm groß und hat einen Widerstand von wenigen MΩ. Für die hier beschriebenen Messungen wurden Pipetten mit einem Widerstand von 6-10 MΩ verwendet. Diese Pipette wird mit Hilfe eines Mikromanipulators unter lichtmikroskopischer Kontrolle sehr nah an eine Zelle, die sich in einem Bad befindet, Abbildung 7: Patchpipette im Bad. herangeführt. Dann wird ein leichter Unterdruck angelegt, sodass sich die Zellmembran sehr eng an die Pipettenspitze heftet. Diesen Zustand bezeichnet man als Gigaseal, weil die Pipette nun so stark gegen das Bad, in dem sich die Referenzelektrode befindet, elektrisch abgedichtet ist, dass der Widerstand zwischen Pipette und Badlösung im Gigaohmbereich liegt. Nun können keine seitlichen Leckströme die Messung mehr verfälschen. Zudem ist der Messplatz von einem faradayschen Käfig umgeben, um das elektromagnetische Hintergrundrauschen des öffentlichen Stromnetzes abzuschirmen. 16

23 2. Methoden Weiterhin basiert die Patch-Clamp-Technik auf dem Voltage-Clamp-Prinzip. Das bedeutet, dass die Zelle oder der Membranfleck unter der Pipette auf einem bestimmten Potential gehalten ( geklemmt ) wird. So lassen sich die Ströme, die beim Anlegen bestimmter Spannungen fließen, messen, woraus das Leitfähigkeitsprofil der gesamten Zelle oder eines einzelnen Kanals bestimmt werden kann. Anstatt bestimmte Spannungswerte zu klemmen, kann man auch den Strom auf dem Wert null halten, um das Ruhemebranpotential der Zelle messen (Current- Clamp, CC-Zero-Modus). Ein Patch-Clamp-Versuch besteht oft aus einer Abfolge von verschiedenen Klemmspannungen und dem CC-Zero-Modus, was als Patch-Protokoll bezeichnet wird Ganzzellableitungen Bei Ganzzellableitungen (Whole-cell-Modus) ist die Patchpipette und damit die Elektrode leitend mit dem Zellinneren verbunden (Siehe Abbildung 8C). Das erreicht man, indem man nach erfolgreichem Herstellen eines Gigaseals erneut einen Unterdruck anlegt. Dieser ist relativ stark und sorgt dafür, dass der Membranfleck unter der Pipette einreißt. Da das Zellvolumen im Vergleich zum Pipettenvolumen relativ klein ist, gleicht sich die Zusammensetzung des Zytoplasmas bald der der Pipettenlösung an. Daher sollte die Pipettenlösung dem Zytosol möglichst gut nachempfunden sein. Abbildung 8: Patch-Clamp-Konfigurationen. Für die Ganzzellmessungen wurden CHO-Zellen verwendet, da diese relativ wenige eigene Kanäle exprimieren und damit das Messergebnis nur geringfügig beeinflussen. Das verwendete Protokoll sah Klemmspannungen von -120 mv, -90 mv, -60 mv, -30 mv, 0 mv und +30 mv vor, die jeweils für 2 s gehalten wurden. Dann folgte für 10 s ein Wechsel in den CC-Zero- Modus (Strom auf 0 Ampere geklemmt). Dieses Protokoll wurde bis zum Ende des Experiments fortlaufend wiederholt. Dabei wurde ca. alle 2 min die Badlösung gewechselt. Zunächst bestand die Badlösung aus Kontrolllösung (Ringer), anschließend aus Ringer-Hochkalium 15 (15 mm K + ), dann aus Ringer-Hochkalium 50 (50 mm K + ). Die erhöhten K + -Konzentrationen bewirken größere Einwärtsströme und erlauben oft eine bessere Beurteilung der Einwärtsgleichrichtung des Kanals. Nachdem unter erneuter Gabe von Kontrolllösung das Erreichen des ursprünglichen 17

24 2. Methoden Membranpotentials abgewartet wurde, folgte die Gabe von 1 mm Bariumlösung (in Ringer). Barium ist ein kompetitiver Hemmstoff für Kaliumkanäle. Daher konnte der Anteil des Stromes, der unter Barium verschwand, als durch KCNJ10 bzw. KCNJ10/KCNJ16 verursacht betrachtet werden. Der Verlauf eines solchen Experiments ist in Abbildung 9 gezeigt. Abbildung 9: Beispielhaftes Ganzzellexperiment. Ein Teil der Experimente mit KCNJ10/KCNJ16-Heteromeren wurde mit veränderten Pipettenlösungen durchgeführt, um deren Einfluss auf die Kanalfunktion zu überprüfen. Dabei wurden folgende Varianten getestet: 1. Magnesium-freie Pipettenlösung 2. Pipettenlösung mit je 1,5 mm ADP und ATP (statt 3 mm ATP) und 3 mm Phosphat 3. Pipettenlösung mit je 1,5 mm ADP und ATP 4. Pipettenlösung mit 1,5 mm ATP Des Weiteren wurde der Einfluss der Arzneistoffe Diazoxid und Tolbutamid auf die Funktion der KCNJ10/KCNJ16-Heteromere getestet. Diazoxid ist ein Kaliumkanalöffner und Antihypoglykämikum, das unter anderem in der Therapie von Insulinomen zum Einsatz kommt. Tolbutamid ist ein Sulfonylharnstoff, also ein orales Antidiabetikum, das durch Bindung an die SUR1-Untereinheit der K ATP -Kanäle in ß-Zellen des Pankreas diese Kanäle blockt. Beide Stoffe waren in einer Konzentration von 10 µm in Ringer-Hochkalium 50 gelöst. Hier wurde im Protokoll auf die erneute Gabe von Kontrolllösung und die Hemmung durch Barium verzichtet. 18

25 2. Methoden Stattdessen wurde nach Ringer-Hochkalium 50 die Diazoxid-Lösung gegeben, dann wieder Ringer-Hochkalium 50 und zum Schluss die Tolbutamid-Lösung Einzelkanalmessungen Für die Einzelkanalmessungen wurden HEK-Zellen verwendet, die mit KCNJ10/KCNJ16 kotransfiziert waren. Die Experimente wurden im Cell-attached Modus durchgeführt, bei dem nach Bildung des Gigaseals der Membranfleck unter der Pipette auf unterschiedliche Spannungen geklemmt wird. Diese Konfiguration ist in Abbildung 8B dargestellt. In einem solchen Patch waren meist ein bis drei Kanalproteine enthalten. Weil die Experimente sehr inhomogen verliefen, konnte kein Protokoll etabliert werden. 19

26 3. Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Ganzzellableitungen Ruhemembranpotential Das Membranpotential von Zellen entsteht durch die ungleiche Verteilung verschiedener Ionen auf beiden Seiten der Zellmembran und durch die jeweilige Leitfähigkeit der Membran für diese Ionen. Da die transfizierten CHO-Zellen durch die hohe Expression von KCNJ10- bzw. KCNJ10/KCNJ16-Kanälen fast ausschließlich für K + leitfähig sein sollten, müsste ihr Ruhemembranpotential nahe dem Diffusionspotential von K +, also bei ca. -90 mv liegen. Ein depolarisierteres Membranpotential zeugt von einer verminderten Kaliumleitfähigkeit durch funktionell eingeschränkte Kanäle. Das Membranpotential der Zellen wurde im CC-Zero-Modus der Patch-Clamp-Experimente unter Kontrolllösung (Ringer, also [K + ] = 5 mm) bestimmt. Bei den mit KCNJ10 Wildtyp transfizierten Zellen lag es bei -81,96 (± 2,16) mv, bei den mit A167V transfizierten Zellen bei 81,88 (± 1,86) mv. Die ko-transfizierten Zellen wiesen beim Wildtyp ein Membranpotential von -81,72 (± 1,78) mv auf, bei den Zellen, die KCNJ10 A167V und KCNJ16 ko-exprimierten lag es jedoch nur bei -44,07 (± 2,86) mv. Zusätzlich wurde das Membranpotential unter 1 mm Ba 2+ in der Badlösung gemessen. Dieses kommt durch die endogenen Kanäle der CHO-Zellen zustande. Eine Änderung des Membranpotentials durch die Gabe von Barium weist darauf hin, dass das ursprüngliche Membranpotential zum Teil durch KCNJ-Kanäle bedingt war. Abbildung 10 fasst diese Ergebnisse zusammen. Abbildung 10: Ruhemembranpotentiale transfizierter CHO-Zellen. 20

27 3. Ergebnisse Strom-Spannungs-Kurven bei homomerer Expression von KCNJ10 Strom-Spannungs-Kennlinien (oder auch U/I-Diagramme) beschreiben den Zusammenhang zwischen angelegter Klemmspannung und der gemessenen Stromantwort der Zelle. Ist dieser Zusammenhang vollkommen linear, dann bedeutet das, dass die Leitfähigkeit der Membran bei allen Spannungen gleich hoch ist und damit keinerlei Gleichrichtung vorliegt. Am Schnittpunkt mit der X-Achse lässt sich die Spannung ablesen, bei der kein Nettostrom fließen würde, was definitionsgemäß dem Ruhepotential entspricht. Die gezeigten U/I-Diagramme (Abbildung 11) entstanden durch die Auswertung der während des Klemmprotokolls gemessenen Ströme. Dabei wurden jeweils die Ströme bei Kontrolllösung, Hochkalium 15, Hochkalium 50 und Barium in Ringer als eigene Kurven aufgetragen. Der Strom unter dem Einfluss von Barium entspricht im Wesentlichen dem Strom durch endogene Kanäle der Zelle Bei den Zellen mit homomeren KCNJ10-Kanälen zeigte sich eine schwach ausgeprägte Einwärtsgleichrichtung. Bei einer Klemmspannung von -120 mv reduzierte die Mutante den Strom auf im Mittel 64 % des Stroms der Wildtyp-exprimierenden Zellen. Abbildung 11: U/I-Diagramme bei homomerer Expression von KCNJ10. 21

28 3. Ergebnisse Strom-Spannungs-Kurven bei Ko-Expression mit KCNJ16 Durch die Ko-Expression von Wildtyp-KCNJ10 mit KCNJ16 zeigten sich deutlich einwärtsgleichgerichtete Ströme (siehe Abbildung 12A). Im Vergleich dazu waren die Ströme, die bei Ko-Expression der A167V-Mutante mit KNCJ16 gemessen wurden, merklich geringer (siehe Abbildung 12B). Der Stromfluss konnte zwar durch Verwendung von Hochkalium- Lösung erhöht werden, er bleib aber dennoch deutlich unter Wildtyp-Niveau. Bei -120 mv betrug der Strom durch die A167V-Heteromere im Mittel 11 % des Wildtyp-Stroms, der bariumsensitive Strom sogar nur knapp über 1 %. Abbildung 12: U/I-Diagramme bei heteromerer Expression mit KCNJ Strom-Spannungs-Kurven bei veränderter Pipettenlösung Diese Experimente wurden nur mit Zellen durchgeführt, die KCNJ10/KCNJ16-Heteromere exprimierten, denn in homomerer Expression hatte sich ein ohnehin nur geringerer Unterschied zwischen Mutante und Wildtyp gezeigt. Um eine Aktivierung der KCNJ10 A167V/KCNJ16- Heteromere zu erreichen, wurden verschiedene Parameter der Pipettenlösung variiert. Zuerst wurde eine Magnesium-freie Pipettenlösung verwendet. Dies lag nahe, da die Einwärtsgleichrichtung der KCNJ-Kanäle zu Teil durch Magnesium bedingt ist [18], Magnesium den Kanal also zumindest in der Auswärtsrichtung blockt. Abbildung 3 zeigt die Position des Mg 2+ -Ions in der Kanalpore. Magnesium blockt den Kanal von intrazellulär, und die Pipettenlösung beeinflusst das intrazelluläre Milieu. Daher wäre bei einer Magnesium-freien Pipettenlösung zumindest ein Verlust der Einwärtsgleichrichtung und eventuell eine allgemeine Aktivierung des Kanals zu erwarten. 22

29 3. Ergebnisse Bei Verwendung der Magnesium-freien Pipettenlösung konnte jedoch keine Verbesserung der Kanalfunktion bei den A167V-Heteromeren festgestellt werden. Deren Strom bei -120 mv lag im Mittel bei 14 % der mit Wildtyp transfizierten Zellen (siehe Abbildung 13B). Es war, wenn überhaupt, nur ein geringer Verlust der Einwärtsgleichrichtung bei den Wildtyp- Heteromeren auszumachen (siehe Abbildung 13A). Abbildung 13: Ströme bei Magnesium-freier Pipettenlösung. Als nächstes wurde versucht, in der Pipettenlösung den Zerfall von ATP zu ADP und Phosphat nachzuahmen. Dazu wurde die Hälfte des ATPs durch ADP ersetzt und zusätzlich 3 mm Phosphat eingesetzt. Hierunter nahm der Strom durch die A167V-Heteromere stark zu, sodass, wie aus Abbildung 14 hervorgeht, kaum mehr ein Unterschied zwischen Mutante und Wildtyp auszumachen war. Abbildung 14: Ströme bei Pipettenlösung mit je 1,5 mm ATP und ADP und zusätzlich 3 mm Phosphat. 23

30 3. Ergebnisse Um Herauszufinden, ob diese Aktivierung allein durch die Änderungen der ATP- bzw. ADP- Konzentration zustande kam, oder ob das zusätzliche Phosphat auch eine Rolle spielt, wurden im darauf folgenden Versuch wieder je 1,5 mm ATP und ADP eingesetzt, das zusätzliche Phosphat aber weggelassen. Auch hier sah man die Aktivierung der Mutante im Vergleich zu ihren Strömen unter Verwendung der normalen Pipettenlösung (siehe Abbildung 15B). Abbildung 15: Ströme bei Pipettenlösung mit je 1,5 mm ATP und ADP. Zur Klärung der Frage, ob denn nun das Verhältnis von ADP zu ATP eine Rolle für die beobachtete Funktionsverbesserung spielte, oder ob einzig die Reduktion von ATP um die Hälfte ausschlaggebend war, wurde abschließend eine Pipettenlösung mit 1,5 mm ATP verwendet. Wie Abbildung 16B zeigt, waren hierbei die durch die mutierten A167V- Heteromere verursachten Ströme wieder sehr gering. Abbildung 16: Ströme bei Pipettenlösung mit 1,5 mm ATP. 24

31 3. Ergebnisse 3.2 Pharmakologie Die beobachte Aktivierung der A167V-Heteromere durch ADP legte die Möglichkeit der pharmakologischen Aktivierung nahe. Daher wurde die Auswirkung des Kaliumkanalöffners Diazoxid und die des Sulfonylharnstoffs Tolbutamid auf die Ganzzellströme bei heteromerer Expression von KCNJ10/KCNJ16 getestet. Die Wirkstoffe wurden in einer Konzentration von 10 µm appliziert. Gelöst wurden sie in Hochkalium 50, da hierrunter die Ströme am stärksten sind und man deshalb am ehesten einen Effekt sehen würde. Wie Abbildung 17 zeigt, konnte bei keiner der beiden getesteten Substanzen eine signifikante Veränderung der Ströme festgestellt werden. Abbildung 17: Ganzzellströme vor und nach Gabe von Diazoxid bzw. Tolbutamid bei 50 mm K + und einer Klemmspannung von-120 mv. 3.3 Einzelkanalmessungen Die in den Ganzzellexperimenten gesehene Verminderung des Stroms durch die Mutante kann entweder durch eine verringerte Offenwahrscheinlichkeit der Kanäle oder aber durch einen geringeren Leitwert des Kanals zustande kommen. Welches von beiden zugrunde liegt, kann durch Einzelkanalmessungen geklärt werden. Zunächst wurde versucht, die Kanäle in der Inside-out-Konfiguration zu vermessen. Hierbei wird aus der Cell-attached-Konfiguration heraus die Pipette schnell nach oben von der Zelle wegbewegt, und so der sich darunter befindliche Membranfleck herausgerissen (exzidierter Patch). Die Innenseite der Membran zeigt nun ins Bad, die Außenseite zur Pipette. Die Insideout-Konfiguration hat den Vorteil, dass man die zytosolischen Bedingungen rasch ändern kann und so beispielsweise die Bariumhemmbarkeit und die ph-abhängigkeit der Kanäle gut untersuchen kann. Bedauerlicherweise zeigte sich in diesen Versuchen ein erheblicher Run-Down der Kanalaktivität. Das heißt, dass kurz nach Bildung des exzidierten Patchs bereits keine Kanalereignisse mehr detektierbar waren. Ein Beispiel hierfür zeigt Abbildung

32 3. Ergebnisse Abbildung 18: Run-Down nach Bildung der Inside-Out Konfiguration. Der Grund hierfür liegt vermutlich darin, dass im Zytosol Faktoren vorliegen, die die Kanäle für Ihre Funktion benötigen. Um die Kanäle wieder zu aktivieren, wurde die Badlösung durch Pipettenlösung einschließlich ATP ersetzt, was aber auch nicht zum Erfolg führte. Um trotzdem Experimente durchführen zu können, wurde in der Cell-attached-Konfiguration weitergearbeitet. Diese Konfiguration hat den Vorteil, dass die zytosolische Seite unverändert bleibt und die Kanäle so in ihrer natürlichen Umgebung arbeiten können. Der Nachteil ist, dass man ph-abhängigkeit und Bariumhemmbarkeit nur schlecht untersuchen kann. Ein Beispiel für eine Cell-attached-Messung zeigt Abbildung 19. Hier sind mehrere Kanäle im Membranfleck unter der Pipette enthalten. Abbildung 19: Multichannelpatch (J10/J16-Wildtyp-Heteromere). Allerdings waren auch diese Messungen nicht unproblematisch: Zwar war immer wieder deutliche Kanalaktivität vorhanden (sowohl beim Wildtyp als auch bei der Mutante), streckenweise fehlte sie dann aber wieder völlig. Aus diesem Grund ließen sich keine Absolutwerte für die Offenwahrscheinlichkeit ermitteln. Man kann lediglich sagen, dass die Offenwahrscheinlichkeit bei den mutierten Kanälen im Vergleich zu den Wildtypkanälen tendenziell verringert schien. Die Abbildungen 20 und 21 zeigen typische Aufzeichnungen der Kanalaktivität von Wildtyp und Mutante, die mutmaßen lassen, dass die Offenwahrscheinlichkeit bei der Mutante verringert ist. 26

33 3. Ergebnisse Abbildung 20: Einzelkanalmessung von KCNJ10/KCNJ16 Wildtyp- Kanälen. Abbildung 21: Einzelkanalmessungen von KCNJ10 A167V/KCNJ16 Kanälen. Bei den Wildtyp-Kanälen (Abbildung 19) ist immer mindestens ein Kanal geöffnet (1), häufig auch zwei (2) oder sogar drei (3). Bei den A167V-Heteromeren ist, wenn überhaupt, nur ein einziger Kanal geöffnet. Gelegentlich lässt sich hier eine geringere Amplitude beobachten (s1), was vermutlich ein sogenanntes sub-state ist (siehe Abschnitt 1.3.3). Solche sub-states weisen die Wildtyp-Kanäle natürlich auch auf, in einer Darstellung wie Abbildung 19 lassen sie sich aber durch die häufigen Öffnungs- und Schließereignisse nur schwer ausmachen. Bei einer höheren Auflösung sind sie deutlich besser zu erkennen, wie Abbildung 22 zeigt. Abbildung 22: Einzelkanalmessung von Wildtyp-Heteromeren mit sub-states. 27

34 3. Ergebnisse Um zu sehen, ob die A167V-Heteromere nur in Ihrer Offenwahrscheinlichkeit eingeschränkt sind, oder ob auch der Strom, der bei Kanalöffnung durch sie fließen kann, reduziert ist, vergleicht man den Leitwert (elektrischerleitwert G = 1 R = I U ) des mutierten Kanals mit dem des Wildtyps. Bei den Wildtyp-Kanälen betrug er 43,8 (± 4,8) ps, bei den mutierten Kanälen waren es 42,7 (± 3,9) ps (in beiden Fällen n = 6). Somit unterschieden sich die mutierten Heteromere in ihrem Leitwert nicht von den Wildtyp-Kanälen. 28

35 4. Diskussion 4 Diskussion 4.1 Bedeutung von KCNJ10 Der Kaliumkanal KCNJ10 ist für die Funktion von ZNS, Niere und Innenohr essentiell [3]. Im ZNS, v.a. im Kleinhirn und in der Retina, ist er in Gliazellen exprimiert. Dort trägt er dazu bei, die durch neuronale Aktivität steigende extrazelluläre K + -Konzentration durch Aufnahme von K + -Ionen in die Astrozyten wieder auszugleichen ( K + -spatial-buffering ) [26]. Im Innenohr ist KCNJ10 für die Sekretion von K + -Ionen in die Endolymphe zuständig, und damit an der Erzeugung des endokochleären Potentials beteiligt [24]. Besonders wichtig ist er aber für die Funktion des distalen Tubulus der Niere. Hier erlaubt er den basolateralen Ausstrom von K + - Ionen, damit diese der Na + /K + -ATPase zur Verfügung stehen können ( pump-leak-coupling ). Die extrazelluläre K + -Konzentration ist für Arbeit der Na + /K + -ATPase limitierend, und ohne deren regelrechte Funktion kommen die meisten Transportprozesse im distalen Tubulus zum Erliegen [3]. In der Niere kommt KCNJ10 zusammen mit KCNJ16, einem verwandten Kanalprotein, vor. Zusammen bilden sie ein Heterotetramer, dessen Eigenschaften sich von denen des KCNJ10-Homomers unterscheiden [27]. Diese Heterotetramere bilden die entscheidenden basolateralen Kaliumkanäle im distalen Tubulus [5] und Sammelrohr [6] der Maus. Die in dieser Arbeit beschriebenen Erkenntnisse heben die Bedeutung der KCNJ10/KCNJ16-Heteromere auch beim Menschen hervor. Für die basolaterale Kaliumleitfähigkeit und damit für die gesamte Funktion des distalen Tubulus sind diese heteromere unentbehrlich. 4.2 Geringer Funktionsverlust von KCNJ10 A167V-Homomeren Bislang wurden die Symptome, die beim EAST/SeSAME-Syndrom auftreten, vor allem auf die Fehlfunktion von homomeren KCNJ10-Kanälen zurückgeführt [3,8,9]. Im letzten Jahr wurde jedoch eine Gruppe von Patienten beschreiben, die am EAST-Syndrom leiden und in der KCNJ10-Untereinheit die homozygote Mutation A167V aufweisen [13], eine Mutation mit immerhin ⅔ Restfunktion in homomerer Expression [13,15,16]. Diese Mutante wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht. In den Ganzzellexperimenten zur Funktion von KCNJ10-Homomeren konnte die in der Literatur beschriebene leichte Einschränkung der Funktionalität, die durch die A167V-Mutation ausgelöst wird, bestätigt werden. Das Membranpotential der mit KCNJ10 A167V transfizierten Zellen unterschied sich nicht von dem der mit KCNJ10 Wildtyp transfizierten Zellen. Die 29