Applikationsfeld / Industriezweig:

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1 Applikationsfeld / Industriezweig: Chemie / Polymerindustrie Elektronik Energie Ernährung / Landwirtschaft Geologie / Bergbau Halbleiter-Technologie Klinische Chemie / Medizin / Hygiene / Gesundheitswesen Kosmetik Materialanalyse Metallurgie / Galvanik Pharmazie Raffinerien / Petrochemie Umwelt / Wasser /Abfall Andere

2 Enzyme biologische Katalysatoren in der Lebensmittelanalytik Alexandra Kästner, Applikationschemikerin Molekülspektroskopie, Analytik Jena AG, Analytical Instrumentation, Konrad-Zuse-Str. 1, Jena Dieser Artikel ist im April 2012 in der Labo erschienen. Einleitung Als biologische Katalysatoren steuern Enzyme alle Stoffwechselvorgänge im menschlichen Organismus. Sie sind unter anderem verantwortlich für die Verdauung von Nährstoffen, die Regeneration von Zellen und Gewebe, die Funktion der einzelnen Organsysteme und für die Biosynthese von Proteinen sowie Hormonen. Sie unterstützen das Immunsystem und sind beteiligt an Entgiftungsprozessen. Ohne Enzyme wären sämtliche metabolischen Vorgänge nicht möglich. Chemisch betrachtet, sind sie Eiweißmoleküle mit funktionellen Gruppen, die mit der zu analysierenden Substanz (dem Substrat) in Wechselwirkung treten und an denen sich die Stoffumsetzung vollzieht. Dabei wird das Substrat entweder selbst mittels Enzym umgesetzt oder es beeinflusst die enzymkatalysierte Reaktion. Enzyme besitzen eine ausgeprägte Selektivität für die Bindung bestimmter Moleküle und katalysieren immer eine definierte Reaktion, wie z.b. Hydrolyse, Oxidation/Reduktion oder Umlagerung, welche sich aus ihrem Namen ableiten lässt (z.b. Hydrolase, Oxidase). [1] Aufgrund dieser Eigenschaften bieten enzymatische Methoden bei der Untersuchung zahlreicher Materialien wie Lebensmittel, biologische Proben u.v.m. bedeutende Vorteile gegenüber den chemischen Verfahren. Sie finden in verschiedenen Bereichen der Industrie, Forschung und der amtlichen Überwachung Anwendung. In der Lebensmittelchemie werden enzymatische Verfahren zur Beurteilung von Lebensmitteln herangezogen. Inhaltsstoffe wie Zucker, Säuren und deren Salze, Alkohole oder andere Substanzen lassen sich durch entsprechende Probenvorbereitung auch aus komplexen Matrices quantitativ schnell bestimmen. Des Weiteren können Messungen der Aktivität bestimmter Enzyme Hinweise auf eine mikrobielle Belastung geben oder aufgrund ihrer Wärmesensitivität im Rahmen von Pasteurisierungs- oder Sterilisierungsprozessen zur Prüfung auf ausreichende Erhitzung eines Nahrungsmittels herangezogen werden [2]. 2/ 6

3 Experimentelles Im folgenden Anwendungsbeispiel wurde der Sulfitgehalt eines Weißweins enzymatisch bestimmt. Sulfit bzw. Schwefeldioxid wird z.b. dem Wein als Antioxidations- und Konservierungsmittel zugesetzt oder, um geschmacklich negative Gärungsnebenprodukte zu binden. Die Menge an Gesamtschwefeldioxid (Summe aus gebundenem und freiem SO 2 ), die ein Wein enthalten darf, ist durch eine EU-Verordnung begrenzt und abhängig von der Art, der Qualitätsstufe sowie dem Zuckergehalt des Weins. [3] Für die Messung wurde das SPECORD 210 PLUS mit einem peltiertemperierten 8-fach- Küvettenwechsler mit externem Wärmetauscher verwendet. (Abb.1) Das SPECORD 210 PLUS ist ein Zweistrahlphotometer für den Wellenlängenbereich von nm, mit 4-fach variabler spektraler Auflösung und zwei temperierten Photodioden (CDD Cooled Double Detection). [4] Der peltiertemperierte 8-fach-Küvettenwechsler ist ein automatischer Probenwechsler mit acht Positionen für Küvetten mit einer Schichtdicke von 10 mm (Abb. 2). Er ermöglicht enzymatische Analysen mehrerer Proben, die sehr genaue Temperierungen erfordern. Der Küvettenblock ist über Schläuche mit einem externen Wärmetauscher verbunden, welcher der Kühlung der Rückseite des Peltierelements dient. Die Temperatursteuerung erfolgt über ein separates Regelgerät, dessen Temperatur im Bereich zwischen -5 C und C mit einer Genauigkeit von + 0,1 C geregelt werden kann. Als Regelmessfühler dient ein Messsensor, der sich an der unteren äußeren Ecke des Küvettenblocks befindet. Der Küvettenwechsler besitzt zudem zwei weitere Messfühler, jeweils zur Registrierung der Halter- oder Küvetteninnentemperatur. Für die direkte Kontrolle der Küvetteninnentemperatur ist ein Messsensor im Einsatz, der während der optischen Messung in der Küvette verbleiben kann. [5] Die enzymatischen Reaktionen erfolgen über mehrere Schritte. Im ersten Schritt der Reaktion wird Sulfit (SO 2-3 ) in Gegenwart von Sauerstoff durch das Enzym Sulfit-Oxidase (SO 2 -OD) zu Sulfat (SO 2-4 ) oxidiert (1). Das dabei entstehende Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) wird im zweiten Schritt mittels reduziertem NADPH durch das Enzym NADPH-Peroxidase (NADPH-POD) zu Wasser und NAD + umgesetzt (2). Die in dieser Reaktion verbrauchte Menge an NADH wird photometrisch bei 340 nm gemessen und ist zu der Sulfitkonzentration äquivalent. [6] SO 2 -OD 2- (1) SO 3 + O 2 + H 2 O SO H 2 O 2 NADH-POD (2) H 2 O 2 + NADH + H + 2 H 2 O + NAD + Die Bestimmung des Sulfitgehaltes, die bei einer Temperatur von 25 C durchgeführt wurde, erfolgte mittels Test-Kombination von R-Biopharm [6] und der Sulfit-Methode der WinASPECT PLUS Software. Der Weißwein erforderte keine weitere Probenvorbereitung und konnte mit 0,1 ml direkt mit den Reaktionslösungen zur Messung eingesetzt werden. Entsprechend der Testkit- Anleitung wurden jeweils 1,0 ml des Reaktionsgemisches 2 (bestehend aus Triethanolamin-Puffer und NADPH) in die Küvetten vorgelegt, für den Leerwert mit 2,0 ml destilliertem Wasser, für die 3/ 6

4 Probe mit 1,9ml destilliertem Wasser versetzt und jeweils 0,01 ml Suspension 3 (bestehend aus NADH-POD) zugefügt. Die Referenzmessung erfolgte gegen Wasser. Alle Reagenzien wurden mittels Rührspatel vermischt, und nach einer Inkubationszeit von 5 min konnte die Extinktion E 1 gemessen werden. Durch die Zugabe von 0,05 ml der Suspension 4 (SO 2 -OD) wurde die enzymatische Reaktion anschließend gestartet und nach einer weiteren Inkubationszeit von 30 min die zweite Exktinktion (E 2 ) gemessen. Zusätzlich wurde ein Sulfit-Kontrollstandard als Probe mitgeführt, um die Richtigkeit der Analyse zu überprüfen. Die Abarbeitung der gesamten Methode erfolgte dabei automatisch durch die WinASPECT PLUS Software. Ergebnisse und Auswertung Zur Ermittlung des Sulfitgehaltes werden für den Leerwert und die Proben die Extinktionsdifferenzen berechnet. Anschließend wird die Extinktionsdifferenz des Leerwertes von den Extinktionsdifferenzen der Proben abgezogen: E = (E 1 E 2 ) Probe - (E 1 E 2 ) Leerwert Die Sulfitkonzentration wird nach der allgemeinen Formel berechnet: c V MG ε d v 1000 [ g / l] = E wobei V = Testvolumen [ml] v = Probenvolumen [ml] MG = Molekulargewicht der zu bestimmenden Substanz [g/mol] SO 2 64,06 g/mol d = Schichtdicke [cm] ε = Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm = 6,3 [l mmol -1 cm -1 ] Die Berechnung der Extinktionsdifferenzen und der Sulfitkonzentration erfolgt im Anschluss an die Messung automatisch durch die Software. Für die Weißweinprobe wurde ein Sulfitgehalt von 60,1 mg/l ermittelt. Die Höchstmenge an Schwefeldioxid in Weißwein mit weniger als 5 g Restzucker/l liegt bei 200 mg/l. Da Sulfit zu den allergieauslösenden Stoffen gehört, müssen Weine, die eine Konzentration von mehr als 10 mg/l SO 2 enthalten, gemäß der EU- Lebensmittelkennzeichnungsrichtlinie entsprechend ausgewiesen sein. Jeder Wein enthält natürlicherweise SO 2, welches in geringen Konzentrationen (bis zu 40 mg/l) unter normalen physiologischen Bedingungen bei der Gärung entsteht. [3] 4/ 6

5 Zusammenfassung Durch ihre Wirkungs- und Substanzspezifität ermöglichen Enzyme eine Vielfalt gleichzeitiger Stoffwechselvorgänge im menschlichen Organismus. In der Routineanalytik sind enzymatische Methoden daher von großer Bedeutung. Durch die Messung der Extinktionsänderung im UV- Bereich absorbierender Coenzyme sind nahezu alle Substanzen, die von Enzymen umgesetzt werden können, photometrisch bestimmbar. Die Analyse mit Hilfe von Enzymen ist schnell und ohne aufwendige Probenvorbereitung durchführbar. Sie läuft unter physiologischen Bedingungen ab. Die Reagenzien sind ungefährlich und einfach zu handhaben. Ferner ist die Erfassung einzelner Substanzen in Gemischen möglich. Dank einer umfangreichen Sammlung enzymatischer Methoden in der WinASPECT PLUS Software erfolgt die Bestimmung der jeweiligen Substanz mit entsprechender Messeinstellung, Probenfolge und Auswertung automatisch. Zubehör SPECORD PLUS: Abb. 1 SPECORD PLUS mit peltiertemperiertem Küvettenhalter mit externem Wärmetauscher Abb.2 Peltiertemperierbarer 8-fach Küvettenwechsler 5/ 6

6 Literatur [1] Kurzes Lehrbuch der Biochemie für Mediziner und Naturwissenschaftler, P. Karlson, D. Doenecke, J. Kohlmann, 14. Auflage, Thieme Verlag, 1994 [2] Enzymatische Lebensmittelanalytik, Dr. G. Henniger, Methoden der enzymatischen Bioanalytik und Lebensmittelanalytik, Heftreihe Boehringer Mannheim [3] Sulfit im Wein, Dr. K.Mahlmeister, Dr. H. Wachter - Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, [4] SPECORD PLUS Handbuch, Analytik Jena [5] SPECORD PLUS Zubehör Handbuch, Analytik Jena [6] Anleitung Sulfit UV Test- Combination zur Bestimmung von schwefliger Säure (Gesamt-SO2) in Lebensmitteln und anderen Probematerialien, Best. Nr , R-Biopharm Ausdruck und Weiterverwendung mit Quellenangabe gestattet Analytik Jena AG Herausgeber: Analytik Jena AG Konrad-Zuse-Straße Jena Telefon Telefax info@analytik-jena.com 6/ 6