NAD+/NADH ADH CH 3 CH 2 OH + NAD + CH 3 CHO + NADH + H + Hier unterscheiden sich Ethanol und NAD + in der Tat funktionell nicht.

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Adam Helmuth Schulz
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1 NAD+/NADH NAD + (Nicotinamid-adenin-dinukleotid) ist das häufigste "Coenzym" enzymatischer Redox-reaktionen. Von den Lehrbüchern wird es teils als Coenzym, teils als Cosubstrat eingeordnet. Das erstere ist korrekt, wenn man die Gesamtheit der zellulären Reaktionen betrachtet, durch deren Zusammenspiel es regeneriert wird. Das letztere ist richtiger, wenn eine enzymatische Reaktion wie die der Alkoholdehydrogenase isoliert für sich betrachtet wird: ADH CH 3 CH 2 OH + NAD + CH 3 CHO + NADH + H + Hier unterscheiden sich Ethanol und NAD + in der Tat funktionell nicht. Will man die ADH-Reaktion messend verfolgen, so bereitet die Beobachtung der Änderung der Alkohol- und Acetaldehydkonzentrationen Schwierigkeiten: keines von beiden hat im sichtbaren Licht oder im UV verwertbare Extinktionseigenschaften. Dies gilt auch für das NAD +. Anders das "Coprodukt" NADH, das im nahen Ultraviolett mit einem Maximum bei 334 nm absorbiert, wo das NAD + keine Extinktion hat. Bildung und Verbrauch von NADH lassen sich in diesem Wellenlängenbereich gut beobachten und messen. Eine sehr große Zahl von Substrat- und Enzymaktivitätsbestimmungen beruht darauf. Bitte in den Lehrbüchern die Strukturen, von NAD + und NADH und ebenso von NADP + nachlesen und, wenn noch nötig, lernen. Aufgaben: 1. Aufnahme des Spektrums von NAD+ und NADH und Ermittlung von ε NADH366nm Eine NAD + und eine NADH-Lösung werden jeweils gegen eine Pufferlösung vermessen. Entweder werden NAD + und NADH unabhängig voneinander als Substanzen eingesetzt, oder das vorgelegte NAD + wird nach Aufnahme des Spektrums enzymatisch in NADH umgewandelt. So können beide Spektren in ein und derselben Lösung und Küvette aufge-nommen werden. Die beiden Möglichkeiten werden im folgenden als Alternativen 1a und 1b beschrieben. Das Spektrum wird jeweils von 450 bis 240 nm aufgenommen in Schritten von 10 nm (bei den LKB- und Zeiß-Geräten), doch sollen die Schritte zwischen den Wellenlängen je nach Verlauf der Kurve flexibel gewählt werden.

2 Reagentien und Geräte: 1 mmol/l NADH in 0,05 mol/l KPO 4 ph 7 1 mmol/l NAD + in 0,05 mol/l KPO 4 ph 7 Ethanol (absolut) ADH, ca. 10 U/ml (siehe auch Aufgabe 2) 0,05 mol/l KPO 4 ph 7 (NADH, NAD + und ADH im Eisbad, Puffer und Ethanol bei Zimmertemperatur) 2 Halbmikro-Quarzküvetten Folgende Spektralphotometer können eingesetzt werden: 1. Einstrahlphotometer LKB, allerdings nur bis 320 nm. Pharmacia Biotech Ultrospec 1000 Die Geräte sind nicht registrierend. Arbeitsablauf: Wellenlänge wählen Vergleichsküvette in den Strahlengang 0-Abgleich Meßküvette in den Strahlengang Ablesung und Eintrag in das Diagramm neue Wellenlänge wählen, usw. 2. Das registrierende Spektralphotometer Hitachi U Hier erfolgen Wellenlängen-Transport und Registrierung der Extinktionsdifferenz automatisch. Die Bedienung kann nur zusammen mit den Betreuern erfolgen, der Lerneffekt ist auf der Stufe des Grundpraktikums gering. Sozusagen aus didaktischen Gründen nicht zu empfehlen, aber technisch perfekt. Alternative 1a: Vergleichsküvette mit Phosphatpuffer. Meßküvette 1: 0,9 ml Phosphatpuffer 0,1 ml 1 mmol/l NAD+-Lösung Meßküvette 2: ebenso, aber mit 0,1 ml NADH-Lösung Die beiden Spektren werden in ein gemeinsames Diagramm eingetragen. Die Ablesungen bei 334 und 366 nm werden außerdem numerisch festgehalten und für die Berechnung von ε (für beide Wellenlängen) verwendet. Spektren im Protokoll vergleichend diskutieren!

3 Alternative 1b: Vergleichsküvette mit Phosphatpuffer. Meßküvette: 0,78 ml Phosphatpuffer 0,02 ml Ethanollösung 0,1 ml 1 mmol/l NAD+ Das Spektrum wird wie bei 1a registriert. Danach wird die Wellenlänge = 334 nm eingestellt. In die Küvette werden nun 0,1 ml ADH eingemischt. Es wird abgewartet, bis sich die Extinktion nicht mehr erhöht. Danach wird das NADH-Spektrum wie bei 1a über dem NAD + -Spektrum registriert. Die Frage, ob unter diesen Bedingungen alles NAD + in NADH überführt wird, wird im Begleitseminar diskutiert. Es geht dabei um die Lage des chemischen Gleichgewichtes der ADH-Reaktion, die verhindert, daß die Alternative 1b zur Ermittlung von ε herangezogen werden kann. 2. Bestimmung der Enzymaktivität am Beispiel der Alkoholdehydrogenase aus Hefe: Bei diesem zweiten Beispiel dient ebenfalls die Zunahme des Produktes als Meßgröße. Das Meßprinzip - Photometrie bei 366 nm - folgt aus den Erfahrungen der Aufgabe 1. Zur Anwendung einer diskontinuierlichen Methode (wie bei der Alkalischen Phosphatase) besteht hier kein Anlaß. Der benötigte Extinktionskoeffizient ist im Abschnitt "Allgemeine und technische Hinweise" genannt und erläutert. Im Gegensatz zur Aufgabe "Alkalische Phosphatase" soll jetzt die lineare Abhängigkeit zwi-schen eingesetzter Enzymmenge und der Meßgröße E/min untersucht und demonstriert werden, auf die Variation der Meßbedingungen (ph, Temperatur, usw.) wird verzichtet. Die Enzymaktivitäts-Bestimmungsmethode ist bei entsprechender Variation des Substrats und der Bedingungen auch auf jede andere Dehydrogenase, die Elektronen auf NAD+ oder NADP+ überträgt, anwendbar. Im Praktikum können deshalb ggf. auch andere Dehydrogenasen mit ihren Substraten und mit den nötigen näheren Anweisungen ausgegeben werden. Wer daran Interesse hat und zur Verfügung stehende Zeit dazu verwenden will, kann sich davon überzeugen, daß die Alkoholdehydrogenase in Bezug auf ihr

4 Kohlenstoffsubstrat nicht sehr streng spezifisch ist. Sie katalysiert auch die Oxidation von Methanol und Propanol. Reagentien und Geräte: Puffer: Pyrophosphat-Glycin ph 8.8: 10 g Na4P2O7. 10 H2O und 0,5 g Glycin in ca. 250 ml Aqua bidest lösen, mit 1 mol/l HCl auf ph 8.8 einstellen und auf 300 ml auffüllen NAD + -Lösung: 0,01 mol/l in 0.05 mol/l KPO4-Puffer ph 7 Ethanol (unvergällt) ADH (Handelspräparat oder Präparat aus dem Fortgeschrittenen-Praktikum) Die ausgegebene ADH ist soweit verdünnt worden, daß 0,1 ml ADH ungefähr E 366 /min = 0,1 ergeben (= ca. 0,03 U/0,1 ml). Durch geeignete Vorversuche wurde zunächst die Aktivität ungefähr gemessen. Zur Verdünnung wurde folgende Puffermischung verwendet: 10 ml 0,01 mol/l KPO4 ph 7 + 1,0 ml Serumalbumin (10 mg/ml) + 5 µl DTE (Dithioerythritol, 30 mg/ml). ADH, Ethanol und NAD + -Lösung (nicht der Pyrophosphatpuffer) bleiben im Eisbad (Reagenzgläser). Photometer: Einstrahlphotometer, 366 nm, evtl. mit angeschlossenem Schreiber. Plastik-Küvetten. Angaben in ml Küvette Puffer 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 NAD+ 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 H2O 0,19 0,18 0,15 0,12 0,10 0,05 0 Ethanol 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 ADH(Start) 0,01 0,02 0,05 0,08 0,10 0,15 0,20 vor Enzymzugabe Extinktion notieren (= Reagentienleerwert) Messung: Zu messen ist die Steigung der Extinktionszunahme. Dazu wird in Abständen von 15 bis 30 Sek. (Stoppuhr) abgelesen, wenn kein Schreiber oder Drucker zur Verfügung steht. Die Ablesewerte werden entweder als Tabelle notiert oder - besser - sofort in

5 ein Extinktions-Zeit-Diagramm eingetragen. Liegen die Punkte in diesem Diagramm nicht auf einer Geraden, sondern auf einer Kurve abnehmender Steigung, so ist die Tangente im Anfangspunkt zu zeichnen (näheres im Praktikumsseminar). Auswertung: Aus jeder der 8 Kurven wird die Steigung (in E/min) ermittelt. Diese Werte werden in einem neuen Diagramm gegen die Enzym-Menge (in ml) aufgetragen. Gesucht ist die Enzymaktivität in U/ml (vergl. Einleitung zur Aufgabe "Alkalische Phos-phatase). Literatur: H. U. Bergmeyer & K. Gawehn (Hrg.). Grundlagen der enzymatischen Analyse. Verlag Chemie, Weinheim, 1977 (u. folgende Auflagen).

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