Morphologisch-funktionelle Untersuchungen am Endometrium von Maultierstuten während des Sexualzyklus und nach Progestagen-Langzeitapplikation

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1 Aus dem Institut für Veterinär-Pathologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig und dem Einsatz- und Ausbildungszentrum für das Gebirgstragtierwesen 230, Bad Reichenhall Morphologisch-funktionelle Untersuchungen am Endometrium von Maultierstuten während des Sexualzyklus und nach Progestagen-Langzeitapplikation Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) durch die Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von Kathrin Jäger aus Rotenburg a. d. Fulda Leipzig, 2009

2 Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Dekan: Betreuer: Gutachter: Prof. Dr. Arwid Daugschies Prof. Dr. Heinz-Adolf Schoon PD Dr. Claus Peter Bartmann Prof. Dr. Heinz-Adolf Schoon, Institut für Veterinär-Pathologie, Universität Leipzig PD Dr. Claus Peter Bartmann, Einsatz- und Ausbildungszentrum für das Gebirgstragtierwesen 230, Bad Reichenhall Prof. Dr. Erich Klug, Klinik für Pferde, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Tag der Verteidigung:

3 Meiner Familie

4 INHALTSVERZEICHNIS I INHALTSVERZEICHNIS...I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...V 1 EINLEITUNG LITERATURÜBERSICHT Besonderheiten der Maultiere Vergleichende Morphologie des Uterus bei Pferde- und Maultierstuten Der Sexualzyklus der Pferdestute Allgemeine Betrachtungen Regulation des Sexualzyklus der Pferdestute Hypothalamus-Hypophysensystem Östrogen- und Progesteronwirkungen Immunhistologische Untersuchungen zur Expression von Ki-67 Antigen, Östrogen- (ER) und Progesteronrezeptoren (PR) im Zyklusverlauf und in den Übergangszyklen Ki-67 Antigen Östrogen- und Progesteronrezeptoren Der Sexualzyklus der Maultierstute Allgemeine Betrachtungen Regulation des Sexualzyklus Die Endometriumbiopsie bei der Maultierstute Histomorphologie des Endometriums Immunhistologische Untersuchungen zur endometrialen Expression von Ki-67 Antigen, ER und PR Differenzierungsstörungen im equinen Endometrium Irreguläre Differenzierung Ungleichmäßige Differenzierung Sekretorische Aktivität des Uterus Allgemeine Betrachtungen Ausgewählte endometriale Proteine Uteroferrin Uteroglobin Uterokalin Calbindin Regulation der Sekretion endometrialer Proteine Nachweis ausgewählter endometrialer Proteine während des Zyklus und der Gravidität bei Pferdestuten Ausgewählte endometriale Proteine in Uterindrüsen mit periglandulärer Fibrose Die Expression ausgewählter endometrialer Proteine im fehldifferenzierten Endometrium der Pferdestute Progestagen- Langzeitapplikation bei Pferdestuten Allgemeine Betrachtungen Auswirkungen einer Progestagen-Langzeitapplikation bei der Pferdestute Klinische Aspekte... 23

5 INHALTSVERZEICHNIS Histomorphologische Aspekte zur endometrialen Funktionsmorphologie Immunhistologische Untersuchungen am Endometrium Progestagen-langzeitbehandelter Pferdestuten Kritische Betrachtung der Fragestellung dieser Studie vor dem Hintergrund der vorliegenden Literaturrecherche MATERIAL UND METHODEN Tiere, Material und Methoden Tiergut, Material und Probenherkunft Nähere Charakterisierung des Tiergutes und des Untersuchungsmaterials Probenentnahme Probenentnahme bei den zyklischen (n = 2) und den azyklischen (n = 4) Maultierstuten Regumate -Applikation bei zwei azyklischen Maultierstuten Probenaufbereitung und histologische Präparation Lichtmikroskopische Untersuchungen Immunhistologische Methoden Immunhistologische Kontrollen Auswertung der immunhistologischen Untersuchungen ERGEBNISSE Vergleichende Darstellung der Untersuchungsergebnisse aus den Gruppen der zyklischen (n=2) und azyklischen (n=4) Maultierstuten Endometriale Funktionsmorphologie der zyklischen und azyklischen Maultierstuten unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde Immunhistologische Ergebnisse unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Uteroglobin Uterokalin Uteroferrin Calbindin Zusammenfassung der immunhistologischen Ergebnisse bei allen Maultierstuten unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Parameter sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Regumate -Applikation bei zwei Maultierstuten der azyklischen Gruppe Klinisch-gynäkologische und endokrinologische Befunde vor, unter und nach der Regumate -Applikation Histologie des Endometriums vor, unter und nach der Regumate - Applikation Histologische Befunde vor der Regumate -Applikation Histologische Befunde unter der Regumate -Applikation Histologische Befunde post applicationem Zusammenfassung der histomorphologischen Hauptbefunde vor, unter und nach der Regumate -Applikation Immunhistologische Untersuchungen vor, unter und nach der Regumate - Applikation II

6 INHALTSVERZEICHNIS III UG-Nachweis vor, unter und nach der Regumate -Applikation UK-Nachweis vor, unter und nach der Regumate -Applikation UF-Nachweis vor, unter und nach der Regumate -Applikation CAL-Nachweis vor, unter und nach der Regumate -Applikation Zusammenfassung der Hauptbefunde des immunhistologischen Nachweises der vier endometrialen Proteine vor, unter und nach der Regumate - Applikation unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Parameter sowie der endometrialen Funktionsmorphologie ER-Expression vor, unter und nach der Regumate -Applikation PR-Expression vor, unter und nach der Regumate -Applikation Ki-67 Antigenexpression vor, unter und nach der Regumate -Applikation DISKUSSION Ziel der Arbeit Kritische Beurteilung des Untersuchungsgutes und der Untersuchungsmethoden Klinisch-gynäkologische und endokrinologische Befunde der zyklischen und azyklischen Maultierstuten Histomorphologie des Endometriums der zyklischen und azyklischen Maultierstuten unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde Sekretion der endometrialen Proteine UG, UK, UF und CAL in der Gruppe der zyklischen Maultierstuten unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Uteroglobin, Uterokalin und Uteroferrin Calbindin Expression von UG, UK, UF und CAL bei den zwei zyklischen Maultierstuten in Uterindrüsen mit periglandulärer Fibrose Abschließende Betrachtung der zyklischen Maultierstuten Sekretion der uterinen Proteine UG, UK, UF und CAL in der Gruppe der azyklischen Maultierstuten unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Uteroglobin, Uterokalin, Uteroferrin Calbindin Expression von UG, UK, UF und CAL bei den azyklischen Maultierstuten in Uterindrüsen mit periglandulärer Fibrose Abschließende Betrachtung der azyklischen Maultierstuten Regumate -Applikation bei zwei Maultieren aus der azyklischen Gruppe Klinisch-gynäkologische und endokrinologische Befunde vor, unter und nach der Regumate -Applikation Histomorphologie des Endometriums der beiden azyklischen Maultierstuten vor, unter und nach Regumate -Applikation unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde Sekretion von UG, UK und UF vor, unter und nach der Regumate - Applikation unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde... 94

7 INHALTSVERZEICHNIS IV Expression von CAL vor, unter und nach der Regumate -Applikation unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde Expression der ER und PR sowie von Ki-67 Antigen vor, unter und nach der Regumate -Applikation unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde Abschließende Betrachtung der zwei azyklischen Maultierstuten vor, unter und nach Regumate -Applikation ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY LITERATURVERZEICHNIS ANHANG Übersicht über die Ergebnisse der klinisch-gynäkologischen und endokrinologischen Untersuchungen bei den zwei zyklischen Maultierstuten Pikrosiriusrot-Färbung nach CONSTANTINE (1969), modifiziert nach Grüninger (1998) Verfahrensschritte der immunhistologischen Untersuchungen Vorbehandlung Besondere Verfahren Antigennachweis mittels monoklonaler Antikörper nach der PAP-Methode Antigennachweis mittels polyklonaler Antikörper nach der PAP-Methode Standard zur Nachbehandlung Verwendete Antikörper und Seren Lösungen und Puffer Für die Immunhistologie verwendete Positivkontrollen und Primärantikörper Bilddokumentation Histologische Befunde der zwei zyklischen Maultierstuten Histologische Befunde der vier azyklischen Maultierstuten Immunhistologische Befunde der zwei zyklischen und der vier azyklischen Maultierstuten Nachweis von Uteroglobin Nachweis von Uterokalin Nachweis von Uteroferrin Nachweis von Calbindin Histologische Befunde vor, unter und nach Regumate -Applikation bei zwei Maultierstuten aus der azyklischen Gruppe Immunhistologische Befunde vor, unter und nach Regumate -Applikation bei zwei Maultierstuten aus der azyklischen Gruppe Nachweis von Uterokalin Nachweis von Calbindin Nachweis von Progesteronrezeptoren DANKSAGUNG...137

8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V Abb. Abbildung AK Antikörper Aqua dest. destilliertes Wasser BSA bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise C Grad Celsius ca. circa CAL Calbindin D9k DAB 3,3`-Diaminobenzidintetrahydrochlorid ER Östrogenrezeptor(en) et al. et alii Fa. Firma FSH follikelstimulierendes Hormon g Gramm ggr. geringgradig GnRH (engl.) gonadotropin-releasing-hormon H.-E. Hämalaun-Eosin hgr. hochgradig Ig Immunglobulin Inst. f. Vet.-Path. Institut für Veterinär-Pathologie IRS Immunreaktiver Score Kap. Kapitel Ki-67 Ki-67 Antigen KM Körpermassse LH luteinisierendes Hormon M Molar mm Millimol µl Mikroliter µm Mikrometer max. maximal mg Milligramm mgr. mittelgradig min Minute(n) ml Milliliter n Anzahl

9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ng Nanogramm PAP Peroxidase-Antiperoxidase pg Pikogramm ph ph-wert PR Progesteronrezeptor(en) s. siehe S. Seite sec Sekunde(n) s.u. siehe unten Syn. Synonym Tab. Tabelle TBS tris-buffered saline UG Uteroglobin UK Uterokalin UF Uteroferrin vgl. vergleiche z.b. zum Beispiel VI

10 EINLEITUNG 1 1 EINLEITUNG Maultiere sind überwiegend unfruchtbare Arthybriden, deren endometriale Funktionsmorphologie, im Gegensatz zu jener der Pferdestuten, bisher kaum untersucht wurde. Die Infertilität dieser Tiere liegt in erster Linie in ihrem ungeraden Chromosomensatz (2n = 63) begründet, der einen adäquaten Ablauf der Meiose verhindert. Es existieren jedoch wenige Untersuchungen zum Sexualzyklus (MÖLLMAN 1991) sowie vereinzelte Berichte über fertile Maultierstuten (RONG et al. 1985, RYDER et al. 1985) und auch über den erfolgreichen Einsatz zyklischer Tiere als Rezipientinnen bei Embryotransferversuchen (DAVIES et al. 1985, ALLEN u. SHORT 1997, CAMILLO et al. 2003). Während bei der Pferdestute die Sekretion ausgewählter uteriner Proteine sowohl im Zyklusverlauf (HOFFMANN et al. 2009) als auch während der Gravidität (ELLENBERGER et al. 2008) näher charakterisiert ist, liegen zu uterinen Sekretionsprodukten bei Maultierstuten bisher noch keine Untersuchungen vor. Zu den sekretorischen Proteinen des Uterus zählen unter anderem das Lipokalin Uterokalin; Uteroglobin, das als Entzündungshemmer und Immunmodulator fungiert, sowie das Eisentransportprotein Uteroferrin, während Calbindin D9k zu einer Familie intrazellulärer kalziumbindender Proteine gehört. Ziel dieser Studie ist somit die Untersuchung der endometrialen Funktionsmorphologie bei vier azyklischen und zwei zyklischen Maultierstuten unter Berücksichtung klinisch-gynäkologischer und endokrinologischer Befunde sowie eine vergleichende immunhistologische Charakterisierung der vier oben genannten uterinen Proteine. Im zweiten Teil der Studie wird bei zwei der azyklischen Maultierstuten der Einfluss einer Progestagen- Langzeitapplikation auf die endometriale Funktionsmorphologie, auf die Sekretion von Uterokalin, Uteroglobin, Uteroferrin und Calbindin D9k, die Expression der Östrogen- und Progesteronrezeptoren sowie auf jene des Proliferationsmarkers Ki-67 Antigen mittels immunhistologischer Methoden überprüft. Aus vorherigen Studien ist bekannt, dass eine hormonelle Langzeitintervention mit Regumate bei Pferdestuten eine grundsätzlich reversible endometriale Fehldifferenzierung hervorruft, die in einem atypischen sekretorischen endometrialen Proteinmuster resultiert (KLUG et al. 1997, ELLENBERGER et al. 2004). Auch für die Expression der Steroidhormonrezeptoren und von Ki-67 Antigen ist eine gestörte Expression in fehldifferenzierten Endometrien - unter anderem im Zusammenhang mit einer Progestagen- Langzeitapplikation - beschrieben (KLUG et al. 1997, HÄFNER 1999, ELLENBERGER 2003). Daher erfolgt bei allen Maultierstuten der vorliegenden Studie die Interpretation der erhobenen Befunde im Vergleich zu den bei Pferdestuten gewonnenen Erkenntnissen.

11 LITERATURÜBERSICHT 2 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Besonderheiten der Maultiere Bei einem Maultier handelt es sich um eine Kreuzung zwischen einem Eselhengst (Chromosomensatz 2n = 62) und einer Pferdestute (Chromosomensatz 2n = 64). Ziel der Verpaarung von Esel und Pferd ist ein ausgeglichenes, charakterfestes und belastbares Maultier, das - abhängig von der Auswahl der Elterntiere - äußerst vielseitig genutzt werden kann (TRAVIS 1990, VON GUGELBERG u. BÄHLER 1994). Eine Besonderheit der Maultiere stellt ihr ungerader Chromosomensatz von 2n = 63 dar. Bei Maultierhengsten führt der unausgewogene Chromosomensatz zu einem vollständigen Meioseblock, und diese Tiere sind ausnahmslos steril (ALLEN u. SHORT 1997). Zwar werden vereinzelt reife Spermien gebildet, doch die für eine erfolgreiche Befruchtung erforderliche Spermienkonzentration wird nicht erreicht (ALLEN u. SHORT 1997). Bei Maultierstuten erfolgt ein partieller Meioseblock, was in einer stark verminderten Anzahl von Oozyten bei der Geburt resultiert und in den meisten Fällen ebenfalls Infertilität zur Folge hat (BENIRSCHKE u. SULLIVAN 1966). Allerdings gelingt in seltenen Fällen die Nachzucht eines Fohlens aus einer Maultierstute und einem Pferdeoder Eselhengst (RONG et al. 1985, RYDER et al. 1985). Diese Tatsache und der erfolgreiche Einsatz von Maultierstuten als Rezipienten im Rahmen des Embryotransfers sowohl für Esel- als auch für Pferdekonzepte beweist, dass das Genitale dieser Tiere im Zusammenspiel mit den endokrinologischen Regulationsmechanismen und einer funktionsfähigen Plazenta in der Lage ist, ein für die Versorgung der Frucht adäquates Milieu bereitzustellen (MÖLLMANN 1991, ALLEN u. SHORT 1997, CAMILLO et al. 2003). Das Sexualverhalten von Maultieren ähnelt jenem von Pferd und Esel (MÖLLMANN 1991). Für wissenschaftliche Zwecke, zum Beispiel Chromosomenanalysen (WODSEDALEK 1916) und Zuchtversuche innerhalb der Spezies oder speziesübergreifend (ALLEN u. SHORT 1997), werden diese Tiere erst seit diesem Jahrhundert eingesetzt, als Arbeits- und Transporttiere sind sie dagegen schon seit dreitausend Jahren unentbehrlich (TRAVIS 1990). 2.2 Vergleichende Morphologie des Uterus bei Pferde- und Maultierstuten Verschiedene Untersuchungen an Ovarien, Uteri und Plazenten von Maultierstuten belegen große Ähnlichkeit mit den äquivalenten Strukturen bei Pferdestuten (BENIRSCHKE u. SULLIVAN 1966, BIELANSKI 1972, MÖLLMANN 1991, ENDERS et al. 1996). Da beide Spezies zu den Equiden zählen (TRAVIS 1990), ist davon auszugehen, dass auch der histologische Aufbau des Uterus bei Maultierstuten jenen bei Pferdestuten ähnelt. Der Uterus der Pferdestute besteht aus Mukosa, Muskularis und Serosa, auch bezeichnet als Endometrium, Myometrium und Perimetrium (BARTMANN et al. 2002). Ebenso wie bei der Pferdestute (KENNEY 1978) besitzt das Endometrium der Maultierstute ein partiell ziliertes, kubisches bis hochprismatisches Epithel, das einer Basalmembran aufliegt, der die Lamina propria mit dem kapillar- und zellreichen Stratum compactum und dem zellärmeren Stratum spongiosum folgt, in das die Glandulae uterinae eingebettet sind. Diese stehen über einen in der Regel unverzweigten Ausführungsgang mit dem Uteruslumen in Verbindung, während die mittleren und basalen Anteile der Drüsen bis zu zehn Primär- und zahlreiche Sekundärverzweigungen aufweisen. Neben den für das Stratum spongiosum charakteristischen Drüsenstrukturen ist dieser Abschnitt des Endometriums reich an arteriellen, venösen und lymphatischen Gefäßen (KENNEY 1978, HUTH et al. 2008). Nach VOGEL und HUMKE (1973) grenzt bei der Pferdestute an die Lamina propria das drüsenarme, aber gefäßreiche Stratum subglandulare, das auch bei der Maultierstute deutlich ausgeprägt ist (HUTH et al. 2008). Die hierauf folgende innere zirkuläre und die

12 LITERATURÜBERSICHT 3 äußere longitudinale Schicht des Myometriums bestehen aus glatten Muskelzellen. Zwischen der inneren und äußeren Muskelschicht liegt das blut- und lymphgefäßreiche Stratum vasculosum, das sowohl bei der Pferdeals auch bei der Maultierstute der Versorgung der Uterindrüsen dient. Die Serosa liegt in Form eines einschichtigen Mesothels dem Stratum longitudinale des Myometriums außen an (LIEBICH et al. 1999, HUTH et al. 2008). 2.3 Der Sexualzyklus der Pferdestute Allgemeine Betrachtungen Die Pferdestute ist ein saisonal polyöstrisches Tier mit einer durch die Tageslichtlänge beeinflussten Hauptfortpflanzungsperiode in der nördlichen Hemisphäre von April bis Juli (BADER 1995), in welcher typischerweise der klinische Zyklusstand mit der endometrialen Differenzierung korreliert. Durchschnittlich beträgt die Länge des Zyklus bei der Pferdestute einundzwanzig bis zweiundzwanzig Tage (BADER 1995). Acht bis neun Tage werden dem Präöstrus mit drei Tagen, dem Östrus mit zwei bis drei Tagen und dem Postöstrus mit drei Tagen zugeordnet, die insgesamt durch den endometrialen Funktionszustand der Proliferation gekennzeichnet sind. Neun Tage entfallen auf den frühen und mittleren Interöstrus, in dem sich das Endometrium sekretorisch differenziert, und vier Tage auf die Involution (BRUNCKHORST u. SCHOON 1990, BRUNCKHORST et al. 1991). In den späten Herbst- und Wintermonaten sind die Ovarien und das Endometrium physiologischerweise inaktiv (ARTHUR 1958, KENNEY u. DOIG 1986, SCHOON et al. 1992, BADER 1995). Die Übergangszyklen im Spätherbst und im Frühjahr sind durch eine Asynchronizität zwischen klinischem Zyklusstand und endometrialer Differenzierung gekennzeichnet (KENNEY 1978, GROSS u. LeBLANC 1984); beispielsweise beschreibt KENNEY (1978) im Übergang von der physiologischen Decksaison zum Anöstrus sowie innerhalb atrophischer Endometrien das Vorkommen hypertropher Uterindrüsen. Beim Wechsel vom Anöstrus zur zyklischen Aktivität sind die luminalen Epithelien und die Ausführungsgänge eher aktiv als die restlichen Drüsen (KENNEY 1978, GROSS u. LeBLANC 1984, KENNEY u. DOIG 1986). Des Weiteren nimmt KENNEY (1978) an, dass individuell unterschiedlich viele Zyklen durchlaufen werden müssen, um ein inaktives Endometrium in den Zustand regulärer zy-klischer Aktivität zu versetzen. In Tab. 2.1 (s. S. 4) ist eine Übersicht über die histomorphologischen Charakteristika des endometrialen Zyklus der Pferdestute während der physiologischen Zuchtsaison dargestellt. Tab. 2.2 (s. S. 6) gibt einen Überblick über die Histomorphologie des Endometriums der Pferdestute in den Übergangszyklen (Herbst und Frühjahr) sowie während der physiologischen Inaktivität (Winteranöstrus). Legende zu Tab BRANDT (1970) 9. RAILA (2000) 2. BRUNCKHORST u. SCHOON (1990) 10. RICKETTS (1989) 3. BRUNCKHORST et al. (1991) 11. ROSSDALE u. RICKETTS (1980) 4. GORDON u. SARTIN (1978) 12. SCHOON et al. (1992) 5. HÄFNER (1999) 13. STRANKMEYER (1993) 6. KENNEY (1978) 14. VanCAMP (1988) 7. KENNEY u. DOIG (1986) 15. VOGEL u. HUMKE (1973) 8. KNUDSON u. VELLE (1961)

13 LITERATURÜBERSICHT 4 Tab. 2.1: Histomorphologische Charakteristika des endometrialen Zyklus der Pferdestute während der physiologischen Zuchtsaison luminales Epithel glanduläres Epithel Drüsenkonfiguration Stroma Mukosahöhe Präöstrus Östrus Postöstrus Sekretionsphase Involutionsphase kubisch bis zylindrisch 1,2,3,5,6,12,14 z.t. pseudogeschichtet 1,6,14 wenig Mitosen 3,12 kubisch 1,8, iso- 5 bis hochprismatisch 4, z.t. pseudogeschichtet 1,2 kleine, rundliche Kerne 5,13, relativ chromatinreich 5,8 einige Mitosen 8 beginnende Stre- 2,3,4,5,10, 12,14,15 ckung Nesterbildung durch ödematisiertes Stroma 1,5,6,7,12 meist enge Lumina ohne Sekret 4 ungleichmäßiges Ö- dem 5,6,7,12 kleine bis große 13, spindelförmige 5 Kerne zahlreiche Mitosen 3,12 zunehmende Mukosahöhe 3,12 zylindrisch, teils pseudogeschichtet 2,3,5,11,12 große, runde, hypochromatische Kerne 12,13 zahlreiche Mitosen 2,3,12 hochprismatisch 1,5,8,9,10,13, z.t. pseudogeschichtet 13 ovale bis rundovale, hypochromatische Kerne 3,9,13 wenig Mitosen 3,12 gestreckte Drüsen 1,2,3,4,5,12,14 erhöhte Drüsenzahl 1,4 und erhöhter Drüsendurchmesser 1,4,8,11 geringere Drüsendichte 4,6,14, z.t. Sekret in Lumina 11 Ödem 1,2,4,5,8,13 undifferenzierte 5 bis große 3,12 Kerne hohe Mitoserate 3,13 infolge Ödematisierung große Mukosahöhe 2,3 hochprismatisch, teils pseudogeschichtet 3,11,13 große, rundovale, hypochromatische Kerne 3 zahlreiche Mitosen 3 ähnliche Befunde wie im Östrus, jedoch intensiver in der Ausprägung: Mukosahöhe und Extension der Drüsen erreichen ihren Höhepunkt 3,4,12,14 hohe Mitoserate 9 zunächst hochprismatisch 5, später isoprismatisch bzw. kubisch 2,6,7,11,12,13,14 ovale Kerne, später rundlich 5,13 verminderte Höhe 3,9,14 basale, rundliche, mäßig chromatinhaltige Kerne 3,5,12 apikale Sekretionsvakuolen, Sekretfäden 3,4,5,9,13 Abnahme der Mitoseanzahl 8,9,12 hohe Drüsendichte 1,3,5,6,13,14 zunehmende Drüsenschlängelung 1,5,6,7,11,13,14 weite 7, sekrethaltige Lumina 13 Ödemrückgang 3,4,6,13,14 größter Kernumfang in der Sekretionsphase 3,5,12 einreihig flach 2,3,12 bis kubisch 8,13, später Zunahme der Höhe 6,7,14 kleine, dunkle, ovale bis rundliche und unregelmäßige Kerne 13 geringe Höhe 1,3,10,14 kleine, rundliche, hyperchromatische, an der Basalmembran lokalisierte Kerne 3,5,12,13 zunächst dicht gelagerte Drüsen 3,12,14, später Abnahme der Schlängelung 5,13 geringerer Durchmesser 1,5 ggr. dilatierte Lumina 13 abnehmende 6,13,14 bis fehlende Ödematisierung 1 ovale, hypochromatische Kerne 13 abnehmende Mukosahöhe flache Mukosa 3,12 3,12,13

14 LITERATURÜBERSICHT Regulation des Sexualzyklus der Pferdestute Hypothalamus-Hypophysensystem Bei der Steuerung des Zyklusgeschehens der Stute nimmt der Hypothalamus eine übergeordnete Stellung ein (THUN 1995), da in ihm das gonadotropin-releasing-hormon (GnRH) synthetisiert wird. Das GnRH gelangt durch pulsatile Freisetzung in das Portalgefäßsystem und somit zum Hypophysenvorderlappen, wo es die Sekretion der Gonadotropine follikelstimulierendes Hormon (FSH) und luteinisierendes Hormon (LH) in den peripheren Blutkreislauf induziert (ADAMS u. BOSU 1988). Unter der Einwirkung von FSH wird das Follikelwachstum am Ovar stimuliert, das mit einer follikulären Produktion von Östrogenen einhergeht. Östrogene hemmen einerseits in hohen Konzentrationen die Synthese von FSH, fördern jedoch diejenige von LH (GINTHER 1992). Unter dem Einfluss von LH kommt es zur Ausreifung eines dominanten Tertiärfollikels, schließlich zur Ovulation sowie zur Anbildung eines Gelbkörpers, der Progesteron produziert (THUN 1995). Die ansteigende Progesteronproduktion bewirkt eine verminderte LH-Freisetzung (GARCIA et al. 1979, THUN 1995). Erfolgt nach der Ovulation keine Befruchtung der Eizelle, wird circa ab dem 14. Zyklustag durch das Endometrium Prostaglandin F 2α (PGF 2α ) gebildet, das zur Luteolyse führt (GINTHER u. BERGFELT 1992). Mit Regression des Gelbkörpers sinkt die Progesteronproduktion, was gleichzeitig eine erneute Freisetzung von FSH aus dem Hypophysenvorderlappen zur Folge hat (SCHOON et al. 1992, THUN 1995).

15 LITERATURÜBERSICHT 6 Tab. 2.2: Histomorphologie des Endometriums der Pferdestute während der Übergangszyklen und während des Winteranöstrus (GOCKELN, unveröffentlicht) luminales Epithel Übergang zum Winteranöstrus zwei- bis mehrreihig, isoprismatisch; große, runde/ovale, hypochromatische Kerne; fein vakuolisiertes Zytoplasma Winteranöstrus einreihig, flach bis kubisch; kleine, runde, hyperchromatische Kerne; nicht vakuolisiertes Zytoplasma Übergang zur Aktivität teils ein-, teils mehrreihig; größere, rundovale, überwiegend hypochromatische Kerne; Zytoplasma zunehmend vakuolisiert glanduläres Epithel Drüsenkonfiguration Stroma geringgradige Polymorphie in oberflächlichen Drüsen, in tiefen Drüsen einheitlich isoprismatisches Epithel; polymorphe, basal lokalisierte, teils hypo-, teils hyperchromatische Kerne; in oberflächlichen Drüsen vakuolisiertes, in tiefen Drüsen nicht vakuolisiertes Zytoplasma von der Oberfläche in die Tiefe abnehmende Drüsendichte und Aktivität; in tieferen Bereichen des Endometriums beginnende Streckung der Drüsen; enge Lumina, teils mit Restsekret; ungleichmäßige, vereinzelt irreguläre glanduläre Differenzierung ungleichmäßiges Ödem; schmale, längsovale bis spindelförmige, hyperchromatische, ungleichmäßig dicht liegende Kerne; Kern-Plasma-Verhältnis zugunsten des Kerns verschoben in allen Drüsen des Endometriums flach bis isoprismatisch; kleine, runde, hyperchromatische Kerne; nicht vakuolisiertes, vermehrt basophiles Zytoplasma im gesamten Endometrium geringgradige Drüsendichte; überwiegend gestreckte Drüsen; enge Lumina, teils mit Restsekret kein Ödem; große, ovale, hyperchromatische, dicht gelagerte Kerne; Kern-Plasma-Verhältnis zugunsten des Kerns verschoben geringgradige Polymorphie des glandulären Epithels; von den oberflächlich zu den tiefer gelegenen Drüsen: zunehmend sekretorische Differenzierung; polymorphe, überwiegend basal lokalisierte Kerne, teils hypo-, teils hyperchromatisch; in oberflächlichen Drüsen beginnende Vakuolisierung des Zytoplasmas, später auch in tiefen Drüsen von der Oberfläche in die Tiefe zunehmende Drüsendichte und Aktivität;oberflächlich beginnende Schlängelung der Drüsen; geringgradig erweiterte Lumina, teils mit Restsekret; ungleichmäßige, vereinzelt irreguläre glanduläre Differenzierung ungleichmäßiges Ödem; Zunahme von runden, ovalen und hyperchromatischen, weniger dicht gelagerten Kernen; Kern-Plasma-Verhältnis zugunsten des Zytoplasmas verschoben Mukosahöhe abnehmende Mukosahöhe flache Mukosa Zunahme der Mukosahöhe

16 LITERATURÜBERSICHT Östrogen- und Progesteronwirkungen Östrogene werden bei der Stute vorrangig in den Granulosazellen der ovariellen Follikel synthetisiert und sind unter anderem an Tuben, Uterus, Zervix, Vagina und Vulva für die mit der Rosse assoziierten Erscheinungen verantwortlich, z.b. gesteigerte Eileitermotilität und erhöhte Kontraktionsbereitschaft des Myometriums, Proliferation und Ödematisierung des Endometriums, Proliferation und Verhornung des Vaginalepithels sowie Hyperämie und Ödematisierung der Vulva. Während der Gravidität erfolgt die Östrogensynthese zusätzlich auch in der Plazenta und durch den Konzeptus (DÖCKE 1994). Progesteron wird in den Theka- und Granulosaluteinzellen des Corpus luteum und während der Gravidität in der Plazenta gebildet und ist essentiell für die Aufrecherhaltung der Trächtigkeit. Es induziert unter anderem eine sekretorische Differenzierung des Endometriums, die mit der Bildung und Abgabe der für den Konzeptus lebenswichtigen Histiotrophe einhergeht. Darüber hinaus bewirkt Progesteron eine verminderte Spontanmotilität des Myometriums (DÖCKE 1994). HAMER et al. (1985) und STRANKMEYER (1993) untersuchen die Endometrien hormonbehandelter Stuten, um näheren Aufschluss über die Wirkung der Sexualsteroide auf den equinen Uterus zu erlangen. Saisonal azyklische Stuten zeigen nach der Verabreichung von Östradiolbenzoat eine endometriale Funktionsmorphologie, die mit jener zyklischer Stuten im Östrus vergleichbar ist. Nach Progesteronapplikation entwickelt sich eine Sekretionsmorphologie, die vom physiologischen Interöstrus nicht zu unterscheiden ist (HAMER et al. 1985). STRANKMEYER (1993) beschreibt bei ovariektomierten Stuten nach Östradiolgabe eine endometriale Differenzierung, die der des Östrus und Postöstrus gleicht, während die Befunde nach der exogenen Zuführung von Progesteron mit denen des Post- und Interöstrus zyklischer Stuten übereinstimmen. KLUG et al. (1997) weisen nach einer oralen Progestagen-Langzeitapplikation bei Pferdestuten eine irreguläre, überdeutlich sekretorische Differenzierung des Endometriums nach und beobachten in der Therapiepause eine ungleichmäßig proliferative Aktivität der Uterindrüsen. Im Gegensatz zu den oben genannten Autoren (HAMER et al. 1985, STRANKMEYER 1993) liegt in dieser Studie nach der hormonellen Behandlung eine endometriale Fehldifferenzierug vor, die sich deutlich von der physiologischen Funtionsmorphologie des Interöstrus unterscheidet (KLUG et al. 1997) Immunhistologische Untersuchungen zur Expression von Ki-67 Antigen, Östrogen- (ER) und Progesteronrezeptoren (PR) im Zyklusverlauf und in den Übergangszyklen Ki-67 Antigen Ki-67 Antigen ist ein Immunglobulin der Klasse G 1, das von proliferierenden Zellen exprimiert wird und durch monoklonale Antikörper detektiert werden kann. Im Zyklusverlauf wird nach GERSTENBERG (1999) und AUPPERLE et al. (2000) ein Peak der Ki-67 Antigen-Expression in den glandulären Epithelien des Endometriums während des frühen Interöstrus nachgewiesen, während die geringsten Werte am dreizehnten Zyklustag, also im späten In-teröstrus/Involution, bestimmt werden. Außer im Präöstrus wird in den Stromazellen während des gesamten Zyklus eine geringgradige Proliferationsaktivität registriert. Im Übergang von der Zuchtsaison zur physiologischen Inaktivität beobachtet GOCKELN (persönliche Mitteilung, Leipzig, ) eine geringgradige Proliferationsaktivität im Bereich des luminalen Epithels und der Drüsenausführungsgänge und nur vereinzelt eine proliferative Aktivität im Bereich der glandulären Epithelien und des Stromas.

17 LITERATURÜBERSICHT 8 In Drüsen und Stroma des inaktiven Endometriums während des Winteranöstrus weisen AUPPERLE et al. (2003) nur sehr vereinzelt und GOCKELN (persönliche Mitteilung, Leipzig, ) keine Expression von Ki-67 Antigen nach. Während des Übergangs von der physiologischen Inaktivität zur zyklischen Aktivität im Frühjahr steigert sich die Proliferationsaktivität zuerst im luminalen Epithel des Endometriums, in der folgenden Zeit auch in den oberflächlich gelegenen Uterindrüsen und danach denen in der Tiefe lokalisierten (GOCKELN, persönliche Mitteilung, Leipzig, ) Östrogen- und Progesteronrezeptoren Mittels immunhistologischer Methoden ist es möglich, die Expression der Steroidhormonrezeptoren im equinen Endometrium nachzuweisen, wobei die Konzentration der Rezeptoren durch einen immunre-aktiven Score (IRS) erfasst wird. Dieser errechnet sich aus der Anzahl der positiven Zellen und ihrer Färbeintensität (BRUNCKHORST et al. 1991, AUPPERLE et al. 2000, ÖZGEN et al. 2002). Im Uterus der Stute stellt sich das Expressionsmuster der Östrogenrezeptoren (ER) und der Progesteronrezeptoren (PR) in den Drüsenepithelien und in den Stromazellen während des Zyklusverlaufs folgendermaßen dar: In den glandulären Epithelien liegt während der Proliferationsphase des Endometriums, in Präöstrus, Östrus und Postöstrus, eine starke Expression der ER und PR vor, die an Tag fünf post ovulationem ihren Höhepunkt erreicht. Im mittleren Interöstrus, der Sekretionsphase, wird eine Verminderung der ER und PR beobachtet. In beiden Zyklusphasen weist der IRS der PR höhere Werte auf als jener der ER. Im späten Interöstrus, der Involutionsphase, verläuft der Nachweis der Steroidhormonrezeptoren in den Drüsenepithelien mit negativem Ergebnis (BRUNCKHORST et al. 1991, RAILA et al. 1997, AUPPERLE et al. 2000). In den Stromazellen erreicht die Expression der ER und PR gegen Ende des Östrus zum Zeitpunkt der Ovulation in der Proliferationsphase ihre maximale Konzentration. Im frühen Interöstrus während der Sekretionsphase kommt es zu einer Verminderung des Gehaltes an ER, was in einer schwachen Anfärbung der ER der Stromazellen während der Lutealphase resultiert. Auch für PR werden im frühen In-teröstrus geringe Konzentrationen ermittelt, im späten Interöstrus in der Phase der Involution werden diese Rezeptoren jedoch mit intensiver Ausprägung exprimiert (ÖZGEN 1999, AUPPERLE et al. 2000). AUPPERLE et al. (2000) stellen einen Zusammenhang zwischen der endometrialen Expression der ER und PR und den im peripheren Blutplasma vorliegenden Hormonkonzentrationen fest: Steigende Östradiolkonzentrationen im Präöstrus induzieren einen synchronen Anstieg der ER- und PR-Konzentrationen in den glandulären Epithelien und in den Stromazellen. Gleichzeitig zum Abfall der Serumöstradiolkonzentration im frühen Interöstrus an Tag fünf erreicht die Progesteronkonzentration im Blutplasma ihr Maximum, und in den Drüsenepithelien wird die stärkste Expression der ER und PR beobachtet, die sich im Verlauf der Lutealphase allerdings wieder verringert (RAILA 1997). Diese Untersuchungen verdeutlichen, dass die Konzentration der Steroidhormonrezeptoren im equinen Endometrium durch Östradiol stimuliert und durch Progesteron downreguliert wird. Im Rahmen einer Studie mit Pferdestuten, die einer prolongierten Progestagenapplikation unterzogen wurden, gelangen KLUG et al. (1997) in Bezug auf die hormonelle Regulation der ER- und PR-Expression zu ähnlichen Ergebnissen wie AUPPERLE et al. (2000). Während gegen Ende der Behandlung die glanduläre Expression der ER und PR verringert ist, wird nach dem Absetzen von Regumate ein Anstieg der PR- Expression beobachtet. Darüber hinaus liegt während des behandlungsfreien Intervalls zum Zeitpunkt des Anstiegs der Serumöstradiolkonzentration eine Kumulation der ER in den Drüsenepithelien vor. Während der Übergangszyklen im Spätherbst und im Frühjahr sowie im Winteranöstrus beobachten verschiedene Autoren (AUPPERLE et al. 2003, GOCKELN, persönliche Mitteilung, Leipzig, ) so-

18 LITERATURÜBERSICHT 9 wohl in den Drüsenepithelien als auch in den Stromazellen deutlich variable IRS-Werte für die Expression der ER und PR. Hierbei erfolgt die Hormonrezeptorexpression in den beiden endometrialen Zellpopulationen häufig gegenläufig und ohne einheitliches Muster. Im Zyklusverlauf während der physiologischen Zuchtsaison zeigt die Regulation der Hormonrezeptorexpression eine klare Abhängigkeit von den Serumöstradiol- und progesteronkonzentrationen. Eine derartige Korrelation kann während der Übergangszyklen und des Winteranöstrus nicht ermittelt werden (AUPPERLE et al. 2003, GOCKELN, persönliche Mitteilung, Leipzig, ). 2.4 Der Sexualzyklus der Maultierstute Allgemeine Betrachtungen Über den Sexualzyklus der Maultierstute liegen bisher nur wenige Untersuchungen vor, da die Nachzucht von Maultieren aus den beiden Stammarten Pferd und Esel und nicht aus zwei Maultieren erfolgt (TRAVIS 1990). MÖLLMANN (1991) beobachtet bei Maultierstuten starke Schwankungen hinsichtlich der Länge der Zyklen, bei denen der Zeitraum zwischen zwei Ovulationen zwischen elf und neunhundert Tagen variiert, wobei auffällt, dass Zyklen mit zweiundzwanzig Tagen häufiger vorkommen. Mit Hilfe von Progesteronverlaufsprofilen weisen DAVIES et al. (1985) bei Maultierstuten maximal 1,6 Ovulationen innerhalb eines Monats nach. Mit zunehmendem Alter der Tiere verringert sich die ovarielle Aktivität deutlich. Als Ursache für die oben erwähnten Schwankungen der Zykluslänge vermutet SHORT (1975) eine unterschiedliche Empfindlichkeit der von Geburt an in geringer Zahl vorhandenen ovariellen Follikel für die Wirkung der Gonadotropine LH und FSH. Auch BARTMANN et al. (2008) beobachten bei zyklischen Maultierstuten Zykluslängen von siebenundzwanzig bis einhundertzwölf Tagen, wobei klinisch nur bei einem Maultier Anzeichen für eine Rosse um den Ovulationszeitpunkt festgestellt werden können. Des Weiteren besteht keine Übereinstimmung zwischen den Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen sowie den Befunden der klinisch-gynäkologischen Untersuchungen an Ovarien, Uterus, Zervix und Vagina dieser Tiere. Neben zyklischen Maultierstuten beobachten verschiedene Autoren (BIELANSKI u. ZAPLETAL 1968, BARTMANN et al. 2008) auch azyklische Tiere mit inaktiven Ovarien Regulation des Sexualzyklus Über die Regulation des Sexualzyklus bei Maultierstuten existieren in der Literatur nur wenige Angaben. Es wird davon ausgegangen, dass die hormonellen Regulationsmechanismen denen der Pferdestute ähneln. Obwohl der Großteil der Maultierstuten infertil ist, können diese Tiere eine voll funktionsfähige Hypothalamus- Hypophysen-Ovarien-Achse besitzen und Östrussymptome sowie Ovulationen zeigen (CAMILLO et al. 2003). Saisonal polyöstrische Maultierstuten, die einen der Pferdestute vergleichbaren Sexualzyklus zeigen, werden sehr selten beobachtet, da die Zyklen in der Mehrzahl der Fälle sehr unregelmäßig verlaufen und in der Regel keine eindeutige Beziehung zwischen Jahreszeit und Zyklusgeschehen erkennbar ist (BIELANSKI 1972). Auch BARTMANN et al. (2008) können während eines Untersuchungszeitraums von April bis November 2004 bei zyklischen Maultierstuten nur sehr vereinzelt eine Korrelation zwischen dem klinischen Zyklusstand der Tiere und den gleichzeitig gemessenen Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen ermitteln. Obwohl die Untersuchungen hauptsächlich im - zumindest für die Pferdestute (THUN 1995) - Zeitraum der physiologischen Zuchtsaison durchgeführt werden, gelangen die Autoren zu dem Schluss, dass diese Ergebnisse am ehesten mit den Befunden bei Pferdestuten in den Übergangszyklen in Herbst und Frühjahr (GOCKELN et al. 2006) vergleichbar sind. Die hormonelle Regulation des Sexualzyklus der Maultierstuten

19 LITERATURÜBERSICHT 10 weist im Rahmen dieser Studie nur wenige Übereinstimmungen mit den für Pferdestuten bekannten Abläufen auf. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen bestimmen VOLPE et al. (2005) bei zyklischen Maultierstuten Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen, die mit jenen von Pferdestuten während der physiologischen Decksaison vergleichbar sind, und weisen ein reguläres Zyklusgeschehen nach. Bei azyklischen Maultierstuten finden BARTMANN et al. (2008) klinisch weder im Uterus noch an den Ovarien Anzeichen für eine Zyklusaktivität und bestimmen parallel niedrige, wenig schwankende Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen. Diese Ergebnisse ähneln am ehesten den Befunden, die bei Pferdestuten während des Winteranöstrus oder im Anöstrus während der physiologischen Zuchtsaison erhoben werden können (HUGHES u. STABENFELDT 1977, ALLEN u. NEWCOMBE 1977, AUPPERLE et al. 2003) Die Endometriumbiopsie bei der Maultierstute Bei der Pferdestute stellt die Endometriumbiopsie, kombiniert mit einer sorgfältigen Anamnese sowie einer umfassenden klinisch-gynäkologischen Untersuchung, ein wichtiges Hilfsmittel zur Diagnose und prognostischen Einschätzung endometrial bedingter Fertilitätsstörungen dar (SCHOON et al. 1997). Mit Hilfe der histologischen Untersuchung des Bioptats kann eine Aussage über den Status praesens des Endometriums getroffen werden. RUNGE (1995) zeigt erstmals, dass ein Einzelbioptat mit einer Größe von 10 x 3 x 3mm, unabhängig von der Qualität der Befunde, bei klinisch nicht oder diffus veränderten Endometrien ein repräsentatives Bild liefert, wenn die Probe aus dem dorsalen Bereich des Übergangs von Corpus uteri zu den Cornua uteri entnommen wird. Bei klinisch auffälligen lokalen oder multifokalen Alterationen hingegen sind mindestens zwei Bioptate aus entsprechenden Arealen erforderlich, um eine repräsentative Beurteilung des Endometriums zu gewährleisten (SCHOON et al. 1992). BARTMANN et al. (2008) und HUTH et al. (2008) untersuchen anhand von Endometriumbioptaten den Funktionszustand des Endometriums bei azyklischen und zyklischen Maultierstuten, wobei die Entnahme der Bioptate dorsal aus dem Corpus uteri mit stets gleicher Größe erfolgt. Trotz einer hochfrequenten Beprobung werden bei der anschließenden klinisch-gynäkologischen und histologischen Untersuchung mit einer Ausnahme keine entzündlichen endometrialen Veränderungen beobachtet. Da in allen nacheinander entnommenen Proben der jeweiligen Maultierstuten vergleichbare histologische Befunde erhoben werden können (HUTH et al. 2008), ziehen die Autoren den Schluss, dass die Endometriumbiopsie bei diesen Tieren in Anlehnung an die bei der Pferdestute etablierten Methoden ebenfalls ein sicheres und repräsentatives diagnostisches Hilfsmittel zur Untersuchung der physiologischen endometrialen Funktionsmorphologie sowie pathologischer endometrialer Alterationen wie z. B. Endometritis, Endometrose, endometriale Fehldifferenzierungen, Angiosklerose Perivaskulitis und Lymphangi-ektasien/-zysten darstellt Histomorphologie des Endometriums Während bei der Pferdestute zur endometrialen Funktionsmorphologie in Abhängigkeit zu den Zyklusphasen und zu pathologischen Veränderungen des Endometriums umfangreiche Beschreibungen in der Literatur existieren, liegen bis zum jetztigen Zeitpunkt so gut wie keine Untersuchungen zu diesen Aspekten bei Maultierstuten vor. Lediglich HUTH et al. (2008) führen umfangreiche histologische Untersuchungen an Endometriumbioptaten von Maultierstuten durch und weisen bei azyklischen Tieren ein inaktives Endometrium mit irregulärer glandulärer Differenzierung nach. Maultierstuten mit klinisch unregelmäßigem Zyklusgeschehen zeigen histomorphologisch ein zyklusasynchron differenziertes Endometrium mit sowohl ungleich-mäßiger als auch irregulär sekretorischer, proliferativer oder inaktiver glandulärer Differenzierung, wie es bei der Pferdestute

20 LITERATURÜBERSICHT 11 bei Vorliegen eines partiell hormonrefraktären Endometriums (SCHOON et al. 1999, HÄFNER et al. 2001) oder im Rahmen hormoneller Ungleichgewicht (SCHOON et al. 1999, 2000, ELLENBERGER 2003) beschrieben ist (vgl. Kap. 2.5) Immunhistologische Untersuchungen zur endometrialen Expression von Ki-67 Antigen, ER und PR Zu diesen Untersuchungen exisitiert bisher nur eine Studie: Bei azyklischen Maultierstuten mit inaktiven Endometrien, bei denen eine irreguläre glanduläre Differenzierung vorliegt, beobachten HUTH et al. (2008) eine uneinheitliche Expression der ER und PR sowohl in den Drüsenepithelien als auch in den Stromazellen sowie eine deutliche Variabilität hinsichtlich der Proliferationsaktivität, die mittels Ki-67 Antigen-Nachweis bestimmt wird, in den endometrialen Strukturelementen. Nach Ansicht der Autoren sind die histomorphologischen und immunhistologischen Befunde azyklischer Maultierstuten am ehesten mit jenen bei Pferdestuten im Winteranöstrus und im Anöstrus während der physiologischen Zuchtsaison vergleichbar (HUTH et al. 2008). Zyklische Maultierstuten mit ungleichmäßiger oder irregulär sekretorischer, proliferativer oder inaktiver endometrialer Differenzierung zeigen immunhistologisch eine hochgradig variable Expression der ER und PR innerhalb eines Drüsenquerschnitts und zwischen den Uterindrüsen (HUTH et al. 2008). Auch in den Stromazellen wird eine äußerst uneinheitliche Steroidhormonrezeptorexpression nachgewiesen, die teilweise synchron, also mit vergleichbaren IRS-Werte in glandulären Epithelien und Stromazellen, und teils asynchron zu jener in den Uterindrüsen ausgeprägt ist. Die Proliferationsaktivität schwankt von nicht nachweisbarer bis zu mittelgradiger Ausprägung ohne Übereinstimmungen mit der Expression der ER und PR. HUTH et al. (2008) vermuten, dass die Variabilität der Steroidhormonrezeptorexpression und der Proliferationsaktivität bei diesen Maultierstuten aus der endometrialen Fehldifferenzierung resultiert und mit den immunhistologischen Befunden bei Pferdestuten in den Übergangszyklen vergleichbar ist. 2.5 Differenzierungsstörungen im equinen Endometrium Der Begriff Differenzierungsstörungen beschreibt im Folgenden Fehldifferenzierungen des equinen Endometriums außerhalb endometrotischer Drüsenareale, wobei entsprechend der Einteilung von SCHOON et al. (1999, 2000) zwischen einer irregulären und einer ungleichmäßigen endometrialen Differenzierung unterschieden wird. Während in der Humangynäkopathologie endometriale Fehldifferenzierungen umfassend dokumentiert sind und als eine Ursache der Infertilität der Frau gelten (DALLENBACH-HELLWEG 1987), spielen morphologisch-funktionelle Variationen der endometrialen Differenzierung bei der Stute bislang nur eine untergeordnete Rolle und sind hinsichtlich ihrer prognostischen Relevanz nicht eindeutig geklärt Irreguläre Differenzierung Charakteristikum einer irregulären glandulären Differenzierung ist ein nicht phasensynchrones morphologisch-funktionelles Erscheinungsbild, das potenziell alle Strukturelemente des Endometriums betreffen kann. In diesem Zusammenhang treten inaktive oder hyperaktive Drüsen mit deutlicher Sekretions- oder Proliferationsmorphologie, aber auch eine morphologische Irregularität von glandulären Epithelien und Stroma auf, die keinem physiologischen Funktionszustand mehr zuzuordnen sind (SCHOON et al. 1997). Diese Veränderungen werden bei Pferdestuten spontan häufig im Alter von 11 bis 15 Jahren - unabhängig vom vorliegenden Reproduktionsstatus - beobachtet (SCHOON et al. 1997). Als Ursache der irregulären endometrialen Differenzierung werden endokrine Imbalancen, z.b. Störungen im Bereich der Hypothalamus-Hypophysen-Ovar-Endometriumachse, vermutet (SCHOON et al. 1999), sie kann aber auch spon-

21 LITERATURÜBERSICHT 12 tan (SCHOON et al. 2000) oder iatrogen induziert infolge einer hormonellen Intervention, z.b. durch Langzeitapplikation von Progestagenen, auftreten (KLUG et al. 1997, ELLENBERGER et al. 2004). ELLENBERGER (2003) stellt durch Untersuchungen an Endometrien von Stuten mit hormonell aktiven Ovarneoplasien des Ovars fest, dass diese eine Ursache endometrialer Funktionsstörungen darstellen. AUPPERLE et al. (2003) und GOCKELN et al. (2006) finden - ebenfalls am ehesten infolge hormoneller Imbalancen - eine irreguläre glanduläre Differenzierung bei Pferdestuten in den Übergangszyklen in Frühjahr und Herbst. Im Zusammenhang mit dem Auftreten einer Hydromukometra bei der Stute vermuten ÖZGEN et al. (2002) ursächlich eine endometriale Fehldifferenzierung im Sinne einer hypersekretorischen glandulären Differenzierung, die mit einer primären lutealen Insuffizienz und einem daraus resultierenden Progesteronmangel einhergeht, der die adäquate Downregulation der endometrialen ER verhindert. HÄFNER et al. (2001) unterscheiden histomorphologisch drei Erscheinungsbilder der irregulären Fehldifferenzierung: eine irregulär proliferative, irregulär sekretorische und irregulär inaktive glanduläre Differenzierung. Bei Vorliegen einer derartigen Fehldifferenzierung wird innerhalb eines Drüsenquerschnitts eine Polymorphie der Epithelien, gekennzeichnet durch eine Variabilität hinsichtlich Anzahl, Größe, Form, Lage und Chromatingehalt der Zellkerne sowie durch unterschiedlich weite Drüsenlumina, beobachtet. Die histomorphologische Definition eines endometrialen Funktionszustandes und die Zuordnung zu einer Zyklusphase anhand allgemeiner Charakteristika, z.b. Ödematisierung des Stromas, Drüsendichte und -konfiguration, ist nur dann möglich, wenn die Irregularität nicht stärker als gering- bis mittelgradig ausgeprägt ist (HÄFNER et al. 2001). Endometrien, an denen aufgrund einer hochgradigen Fehldifferenzierung keine Einschätzung des Grundcharakters mehr möglich ist, werden als vollständig irregulär differenziert bezeichnet (HÄFNER et al. 2001, ELLENBERGER 2003). Mittels immunhistologischer Methoden weisen HÄFNER et al. (2001) innerhalb irregulär differenzierter Endometrien eine äußerst intensive glanduläre Expression der ER, gleichzeitig ein deutliches Defizit an PR und eine übermäßig hohe Ki-67 Antigen-Expression in den Drüsenepithelien nach. Die Autoren vermuten ursächlich eine übersteigerte Östrogenwirkung mit folgender mangelhafter Downregulation der ER durch Progesteron. Dies kann entweder in einer verminderten/verkürzten Progesteronwirkung infolge reduzierter Synthese begründet sein, durch eine Corpus luteum-insuffizienz oder infolge einer ungenügenden Ausstattung des Endometriums mit Progesteronrezeptoren. ELLENBERGER (2003) beobachtet bei Stuten mit Granulosazelltumoren das Auftreten einer irregulären endometrialen Differenzierung mit intensiver Expression der ER und PR sowohl in den glandulären Epithelien als auch in den Stromazellen. Basierend auf den Erkenntnissen von AUPPERLE et al. (2000) wird dies auf die durch den Ovartumor hervorgerufene hormonelle Dysregulation, insbesondere auf die niedrigen Serumprogesteronkonzentration zurückgeführt, infolge derer es zu einer fehlenden Downregulation und einer atypischen Expression der Steroidhormonrezeptoren im Endometrium kommt Ungleichmäßige Differenzierung Bei dieser Fehldifferenzierung liegen innerhalb einer Biopsie Areale mit verschiedenen Aktivitäts- und/oder Funktionszuständen nebeneinander vor. Neben Bereichen, deren Differenzierung dem ovariellen Funktionszustand entspricht, werden nichtfibrotische Drüsenareale beobachtet, die sich hinsichtlich ihrer Aktivität und/oder Funktion von diesen unterscheiden (SCHOON et al. 1999, HÄFNER et al. 2001). HÄFNER (1999) beschreibt in diesem Zusammenhang ungleichmäßig proliferativ und ungleichmäßig inaktiv differenzierte Endometrien. Oft bilden diese Drüsen mit abweichender Differenzierung nestartige Formationen, die, im Gegensatz zu endometrotischen Herden, einen fließenden Übergang zum unveränder-

22 LITERATURÜBERSICHT 13 ten Endometrium zeigen (HÄFNER et al. 2001). Als Ursache der ungleichmäßigen endometrialen Differenzierung wird ein partiell hormonrefraktäres Endometrium (SCHOON et al. 1999) als Folge eines endometrialen Defektes der Ausstattung mit Hormonrezeptoren angesehen. Hieraus resultiert eine Beeinflussung der lokalen Hormonwirkung (HÄFNER et al. 2001). Mittels immunhistologischer Methoden weisen HÄFNER et al. (2001) in Übereinstimmung mit SCHOON et al. (1999) in den Drüsen ungleichmäßig proliferativ differenzierter Areale einen deutlich gesteigerten IRS von ER sowie eine auffallend erhöhte Ki-67 Antigen-Expression im Vergleich zu den umliegenden unveränderten Drüsen nach. In ungleichmäßig inaktiv differenzierten Endometrien findet HÄFNER (1999) eine äußerst variable Expression der Östrogen- und Progesteronrezeptoren in den betroffenen glandulären Epithelien und den Stromazellen. 2.6 Sekretorische Aktivität des Uterus Allgemeine Betrachtungen Die Gravidität bei Pferdestuten ist durch eine lange Präimplantationsperiode gekennzeichnet, während der sich der Konzeptus bis Tag 36 bzw. Tag post ovulationem (STEWART et al. 1995, CROSSETT et al. 1996) kontinuierlich im Lumen des Corpus und der Cornua uteri bewegt (ALLEN 2001). Von Tag 6 bis Tag 22 der Gravidität ist der Embryo von einer azellulären Glykoproteinkapsel umgeben, die im Zuge der Implantation degradiert wird (SUIRE et al. 2001). Vor der Implantation erfolgt die Ernährung des Konzeptus durch die unter anderem von den Uterindrüsen sezernierte Histiotrophe. Diese Uterinmilch beinhaltet ein breites Spektrum nieder- bis hochmolekularer Bestandteile, die teilweise aus dem Blut stammen, und teilweise in den Drüsenepithelien synthetisiert werden (BEIER 1974, BEIER u. MOOTZ 1978). Die Histiotrophe der Stute ist reich an Proteinen (CROSSETT et al. 1996) Ausgewählte endometriale Proteine Uteroferrin Uteroferrin - im Folgetext als UF bezeichnet - wurde von MURRAY et al. (1972) erstmals in Uterusspülproben von Jungsauen zwischen Tag 12 und 16 des Zyklus nachgewiesen und stellt die am besten untersuchte Komponente der Histiotrophe der Sau dar (ROBERTS u. BAZER 1984). Dieses Protein wurde ebenfalls in uterinen Sekreten der Pferdestute gefunden, und es zeigt deutliche Übereinstimmungen mit den physikalischen, enzymatischen und immunologischen Eigenschaften des porzinen Uteroferrins (ZAVY et al. 1979a, MCDOWELL et al. 1982). Es handelt sich um ein basisches Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 35kDa, das einen Kohlenhydratanteil von 4,8% und zwei gebundene Eisenatome besitzt (MCDOWELL et al. 1982, RO- BERTS u. BAZER 1984, BAZER et al. 1991). Zwei Funktionszustände des Proteins sind beschrieben: Im sauren Milieu, z.b. im Uteruslumen oder in der Allantoisflüssigkeit, entsteht aus der Form ohne enzymatische Eigenschaften durch Reduktion eines Eisenatoms die Form des Uteroferrins, die saure-phosphatase- Aktivität besitzt (SCHLOSNAGLE et al. 1974, VALLET et al. 1996). Sowohl bei der Sau als auch bei der Stute werden UF zwei wesentliche Funktionen zugeordnet: BAZER et al. (1991) weisen mittels in vitro-versuchen eine Induktion der Proliferation und der Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen nach, wobei der Mechanismus dieser Stimulation noch nicht eindeutig geklärt werden konnte. Eine hiermit übereinstimmende Schlussfolgerung ziehen LAURENZ et al. (1997) aus Versuchen mit jungen Schweinen, bei denen durch die Applikation von UF der myelosuppressive Effekt eines Chemotherapeutikums gemildert wird. Ausgehend von diesen Ergebnissen sprechen die Autoren dem UF eine Funktion als hämatopoetischer Wachstumsfaktor zu.

23 LITERATURÜBERSICHT 14 Des Weiteren stellt UF das wichtigste Carrierprotein für den materno-fetalen Eisentransport während der Gravidität bei Sauen und Pferdestuten dar (BAZER et al. 1975, MCDOWELL et al. 1982). Das Eisen gelangt über die Plazenta zum Fetus, wo es über dessen Leber in den Eisenmetabolismus, insbesondere in die Hämatopoese während der frühen Gravidität, integriert und in das fetale Hämoglobin eingebaut wird (BAZER et al. 1975, BUHI et al. 1982, SAUNDERS et al. 1985, DUCSAY et al. 1986) Uteroglobin Die Erstbeschreibung des Uteroglobins - im Folgetext als UG bezeichnet - erfolgt 1966 durch BEIER, der Uteroglobin als Hauptbestandteil der uterinen Sekrete und der Blastozystenflüssigkeit während der Präimplantationsperiode bei Kaninchen identifiziert. In uterinen Sekreten von Frauen (MÜLLER-SCHÖTTLE et al. 1999, 2000) und Pferdestuten (MÜLLER-SCHÖTTLE et al. 2002) kann dieses Protein in geringgradiger Konzentration während des Zyklus nachgewiesen werden. Darüber hinaus beobachten HOFFMANN et al. (2009) und ELLENEBRGER et al. (2008) im Rahmen immunhistologischer Studien eine glanduläre Sekretion dieses Proteins im zyklischen Endometrium und während der Gravidität. Zudem existiert eine Synthese von UG in extrauterinen Geweben, beispielsweise in Thymus, Hypophyse, Pankreas, Prostata und Samenblasendrüse (DIERYNCK et al. 1996, MUKHERJEE et al. 1999). Des Weiteren erfolgt die Sekretion durch sekretorische Epithelien aller Organe, die mit der Außenwelt in Kontakt stehen, wie z.b. Respirations-, Gastrointestinaltrakt und Mamma. Darüber hinaus wird UG in Blut und anderen Körperflüssigkeiten nachgewiesen (DIERYNCK et al. 1996, MUKHERJEE et al. 1999). KLUG et al. (2000) schlagen daher die Bezeichnung Sekretoglobin vor. UG ist ein homodimeres Protein mit einem Molekulargewicht von < 6,5, kda (BEIER-HELLWIG et al. 1995), dessen Untereinheiten durch zwei Disulfidbrücken verbunden sind. In seinem Zentrum befindet sich eine hydrophobe Tasche (MORNON et al. 1980, MORIZE et al. 1987), die stark lipophile Liganden wie Phospholipide, Steroide und Inositole binden kann (MÜLLER-SCHÖTTLE 2002), wodurch das Protein unter anderem eine Rolle bei der Ernährung des Konzeptus übernimmt (QUINN et al. 2007). Die wichtigste Funktion von UG besteht in der hocheffektiven Hemmung der Phoshpholipase A 2 (MIELE et al. 1987, MUKHERJEE et al. 1999). Durch die Hemmung dieses Schlüsselenzyms für die Bildung proinflammatorischer Eikosanoide, den Prostaglandinen und Leukotrienen, wird eine übermäßige Aktivierung entzündlicher Prozesse verhindert. Dies ist insbesondere für Organe, die den Einflüssen der Außenwelt ausgesetzt sind, von entscheidender Bedeutung (MIELE et al. 1994). Weitere Eigenschaften von UG, die im Kontext mit Entzündungshemmung und Immunmodulation erwähnt werden, sind: Suppression der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten und Monozyten (VASANTHAKU- MAR et al. 1988), Inhibition der Thrombin-induzierten Thombozytenaggregation (MANJUNATH et al. 1987), Hemmung der Produktion und biologischen Aktivität von Interferon-γ (DIERYNCK et al. 1995), Unterdrückung der durch Interleukin-2 stimulierten Freisetzung von Tumor-Nekrose-Faktor-α und Interleukin-1β (DIERYNCK et al. 1996). Da UG in den uterinen Sekreten verschiedener Spezies (Kaninchen, Mensch, Pferd) nachweisbar ist (BEIER 1968, MÜLLER-SCHÖTTLE et al. 1999, MÜLLER-SCHÖTTLE et al. 2000, MÜLLER-SCHÖTTLE et al. 2002), vermuten mehrere Autoren eine Schutzfunktion für den Konzeptus: Beispielsweise könnte die durch UG vermittelte Abnahme der uterinen Prostaglandin-Konzentration dem Risiko eines Aborts infolge übermäßiger Kontraktilität des Myometriums oder Endometritiden entgegenwirken (KIKUKAWA et al. 1988). MUKHERJEE et al. (1983) sowie MANJUNATH et al. (1984) halten es für möglich, dass UG einen Tole-

24 LITERATURÜBERSICHT 15 ranzeffekt dem Embryo gegenüber bewirkt, indem es die immunologische Reaktion auf allogene Zellen hemmt Uterokalin Bei Uterokalin - im Folgetext als UK bezeichnet - handelt es sich um ein besonderes sekretorisches Protein im Uterus von Pferdestuten, das bis ca. Tag zwanzig der Gravidität in großen Mengen sezerniert wird (BEIER-HELLWIG et al. 1995, CROSSETT et al. 1998). UK zählt zur Familie der Lipokaline und besitzt ein Molekulargewicht von ca. 18 kda (CROSSETT et al. 1996). Es bindet zahlreiche Fettsäuren, kurzkettige Lipide sowie Retinol und weist als strukturelle Besonderheit in der Familie der Lipokaline eine sehr exponierte Tryptophan-Seitenkette auf, die wahrscheinlich während der Präimplantationsperiode für die Bindung an den equinen Trophoblasten verantwortlich ist (SUIRE et al. 2001). STEWART et al. (1995) vermuten, dass das Protein in die azelluläre Glykoproteinkapsel integriert wird, die den equinen Trophoblasten umgibt. CROSSETT et al. (1998) bestätigen dies durch den immunhistologischen Nachweis von UK sowohl in der Trophoblastenkapsel als auch in den apikalen Trophoblastenzellen. Mit der Aufnahme von UK gelangen gleichzeitig zahlreiche, für die zelluläre Differenzierung essentielle Lipide in die Trophoblastenzellen, die ohne ein solches Transportprotein aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften bei Kontakt mit der Glykoproteinkapsel des equinen Konzeptus degradiert werden. Da-rüber hinaus wird diskutiert, ob UK selbst möglicherweise eine Quelle der Proteinversorgung für den equinen Konzeptus darstellt (SUIRE et al. 2001) Calbindin Während UF, UG und UK zu den sekretorischen Proteinen des Uterus zählen, ist Calbindin D9K - im Folgetext als CAL bezeichnet - Mitglied einer Familie intrazellulärer kalziumbindender Proteine (CHRISTAKOS et al. 1989). Außer im Uterus des Pferdes (HOFFMANN et al. 2009) wird CAL auch in uterinen Sekreten des Schweins (KRISINGER et al. 1995), des Rindes (INPANBUTR et al. 1994), der Maus (TATSUMI et al. 1999) und der Ratte (DELORME et al. 1983) nachgewiesen. Das aus einer einzelnen Polypeptidkette bestehende Protein mit einem Molekulargewicht von 8,5 kda (FULLMER u. WASSERMAN 1981) besitzt zwei Domänen, die mit hoher Affinität in erster Linie Kalzium (WASSERMAN et al. 1968), aber auch andere Kationen binden (FULLMER et al. 1985). Im Endometrium der oben aufgeführten Spezies gewährleistet CAL, basierend auf dem Prinzip der erleichterten Diffusion (NIKITENKO et al. 1998), den Kalziumionen-Transport in den Uterindrüsen von der basolateralen zur apikalen Seite der Zellen (WOODING et al. 1996). Hieraus ergeben sich drei wesentliche Funktionen des im Uterus nachweisbaren CALs: Die Beeinflussung der intrazellulären Kalziumkonzentration durch Bindung freier Kalziumionen zur Gewährleistung der zellulären Homöostase (WASSERMAN et al. 1992), die Regulation der intraluminalen Kalziumkonzentration im Uterus (TATSUMI et al. 1999) sowie eine Mediatorrolle im aktiven materno-fetalen Transport von Kalzium während der Gravidität. Letztgenannte Funktion spielt in der zweiten Hälfte der Trächtigkeit eine entscheidende Rolle, da in dieser Zeit im Rahmen der Ossifikation des fetalen Skeletts der Kalziumbedarf stark ansteigt (MATHIEU et al. 1989, NIKITENKO et al. 1998). Aufgrund der Fähigkeit von CAL, die Ca 2+ -Mg 2+ -ATPase und die Ca 2+ -Pumpe in Enterozyten zu stimulieren, vermuten INPANBUTR et al. (1994), dass dieses Protein auch an der Exozytose anderer uteriner glandulärer Sekretionsprodukte beteiligt ist.

25 LITERATURÜBERSICHT Regulation der Sekretion endometrialer Proteine Die Synthese und Abgabe, die chemischen Eigenschaften und die Zusammensetzung uteriner Sekrete wird insbesondere durch die kombinierte Wirkung von Östrogenen und Progesteron kontrolliert (HARTT et al. 2005). Tab. 2.3 (s. S. 17) gibt eine Übersicht zum Nachweis ausgewählter endometrialer Proteine während des Zyklus bei verschiedenen Spezies (Schwein, Kaninchen, Maus, Mensch). Uteroglobin, Uteroferrin: Da bei der Genexpression von UG und UF in zahlreichen Untersuchungen Gemeinsamkeiten bei verschiedenen Spezies, z.b. Pferd (MÜLLER-SCHÖTTLE et al. 2002), Schwein (SIMMEN et al. 1989) und Kaninchen (JANTZEN et al. 1987), auftreten, wird die Regulation dieser beiden Proteine gemeinsam beschrieben. Unter dem Einfluss von exogen zugeführtem Progesteron beobachten McDOWELL et al. (1987) sowie MÜLLER-SCHÖTTLE et al. (2002) einen Anstieg der Synthese beider Proteine in den glandulären Epithelien des equinen Endometriums. Bis zu einem gewissen Grad kann eine Zunahme der UG-Sekretion mit steigenden Progesteronkonzentrationen erreicht werden. Eine übermäßige Erhöhung des Hormons zeigt jedoch keine weiteren Auswirkungen auf die UG-Konzentration in uterinen Sekreten (BEIER 2000). Im Gegensatz hierzu nimmt die Sekretion von UF mit steigender Dosierung und längerer Applikationsdauer von Progesteron kontinuierlich zu (McDOWELL et al. 1987, HINRICHS et al. 1989). Bei beiden Proteinen erfolgt der Anstieg der Sekretion mit einer Zeitverzögerung von mehreren Tagen nach der Progesteronapplikation, da erst durch dieses Hormon am Endometrium die epitheliale Differenzierung in eine sekretorische Funktionsmorphologie erreicht und anschließend aufrechterhalten wird (KNIGHT et al. 1973, SCHLOS- NAGLE et al. 1974, SHEN et al. 1983, MÜLLER-SCHÖTTLE et al. 2000). In hohen Dosen hemmen Östrogene sowohl die Synthese von UG als auch von UF (SHEN et al. 1983, SIM- MEN et al. 1988). In geringen Dosen dagegen steigern sie synergistisch mit Progesteron die Proteinproduktion. (SHEN et al. 1983, SIMMEN et al. 1988, BEIER 2000). Neben Progesteron und Östrogenen spielt Prolaktin eine entscheidende Rolle bei der Regulation der UG- Synthese. Es verstärkt die durch Progesteron induzierte Synthese des UGs (RANDALL et al. 1991) und bewirkt außerdem einen deutlichen Anstieg der Sekretion des Proteins (DANIEL u. JUNEJA 1989, KLEIS- SANFRANCISCO et al. 1993). Uterokalin: Im Zyklusverlauf der Pferdestute reagiert die Synthese des UKs, im Gegensatz zu jener von UF und UG, sehr schnell auf die mit Beginn der Lutealphase ansteigenden Progesteronkonzentrationen im Blutplasma (CROSSETT et al. 1996). Bei einer exogenen Zufuhr von Progesteron wird ebenfalls eine gesteigerte Synthese des Proteins beobachtet (STEWART et al. 1995). Des Weiteren weist UK auch in den übrigen Zyklusphasen eine enge Korrelation zu den jeweiligen Serumprogesteronkonzentrationen auf (STEWART et al. 1995, CROSSETT et al. 1996, HOFFMANN 2006, HOFFMANN et al. 2009). Verschiedene Autoren vermuten, dass Progesteron nicht als einziges Hormon die UK-Sekretion reguliert (STEWART et al. 1995, CROSSETT et al. 1996, HOFFMANN 2006, HOFFMANN et al. 2009), es ist jedoch nicht geklärt, welche Hormone oder zellulären Mechanismen darüber hinaus eine Rolle spielen.

26 LITERATURÜBERSICHT 17 Calbindin: Auf die endometriale CAL-Synthese nehmen Östrogene und Progesteron speziesabhängig einen äußerst unterschiedlichen Einfluss: Im bovinen (INPANBUTR et al. 1994) und im murinen (TATSUMI et al. 1999) Uterus wirkt Progesteron stimulierend, während Östrogene allein keinen signifikanten Einfluss besitzen. Im Gegensatz hierzu zeigt das Progesteron bei der Ratte eine inhibitorische (L'HORSET et al. 1990) Wirkung, und Östradiol fördert die Proteinsynthese (DELORME et al. 1983). HOFFMANN et al. (2009) weisen bei Stuten mittels immunhistologischer Methoden interindividuelle Schwankungen in der Expressionsintensität und -verteilung des Proteins nach, vermutet wird jedoch eine Progesteronabhängigkeit der Synthese, da die Zunahme der CAL-Expression im frühen und mittleren Interöstrus mit dem gleichzeitigen Anstieg der Serumprogesteronkonzentration assoziiert ist. Tab. 2.3: Nachweis ausgewählter endometrialer Proteine während des Zyklus verschiedener Spezies (Schwein, Kaninchen, Maus, Mensch) Name Lokalisation Nachweiszeitraum UG nicht zilierte Zellen des luminalen Epithels 1 und glanduläre Epithelien 4 Golgi-Apparat, sekretorische Granula 4 frühe bis späte Lutealphase, Maximum in der späten Lutealphase 6 UF glanduläres Epithel 3 rasseabhängige Variationen im Zyklus und während der Trächtigkeit des Schweins 2 UK luminale und glanduläre Epithelien 8,9 Tag 1 bis Tag 19 post partum 9 CAL oberflächlich lokalisierte, vorwiegend jedoch tiefere glanduläre Epithelien 5 Maximum in der Lutealphase 5 1. AUMÜLLER et al. (1985) 6. MÜLLER-SCHÖTTLE et al. (1999) 2. BAZER et al. (1991) 7. MÜLLER-SCHÖTTLE et al. (2000) 3. DUCSAY et al. (1982) 8. RYON et al. (2002) 4. HEGELE-HARTUNG u. BEIER (1986) 9. LIU et al. (1997) 5. INPANBUTR et al. (1994) Nachweis ausgewählter endometrialer Proteine während des Zyklus und der Gravidität bei Pferdestuten Im Zyklusverlauf der Stute weisen BEIER-HELLWIG et al. (1995) in Uterusspülproben mittels SDS-PAGE im Östrus geringgradige Konzentrationen von UG nach, wohingegen HOFFMANN et al. (2009) aufgrund immunhistologischer Untersuchungen in diesem Zeitraum eine ansteigende Expres-sionsintensität des Proteins beobachten. MÜLLER-SCHÖTTLE et al. (2001) weisen mit Hilfe von RT-PCR, Northern-Blot Analyse sowie immunhistologischer Methoden von Tag 1-10 post ovulationem eine kontinuierliche Steigerung der UG-Konzentration in uterinen Sekreten nach. HOFFMANN et al. (2009) ermitteln im Rahmen immunhistologischer Untersuchungen im mittleren bis späten Interöstrus nach Abfall der Serumprogesteronkonzentration einen Peak der UG-Sekretion mit maximaler Sekretion in den tiefen Uterindrüsen, während in den mittleren Drüsen eine gering- bis mittelgradige und in den oberflächlichen Uterindrüsen eine schwache Sekretion

27 LITERATURÜBERSICHT 18 des Proteins vorliegt. Im Präöstrus verstärkt sich die Reaktion in den oberflächlichen Drüsen geringgradig (HOFFMANN et al. 2009). Auch für UF wird mittels Immunhistologie und Proteinbestimmung nach LOWRY (1951) die maximale Sekretionsintensität im mittleren Interöstrus bestimmt, wobei die Sekretion am deutlichsten in den mittleren und tiefen Uterindrüsen erfolgt (ZAVY et al. 1979b, HOFFMANN 2006, HOFFMANN et al. 2009). Während des späten Interöstrus, Präöstrus, Östrus und frühen Interöstrus wird UF immunhistologisch mit schwacher Intensität überwiegend in den Epithelien der oberflächlichen Drüsen nachgewiesen (HOFFMANN et al. 2009). UK wird während des Östrus mit maximal geringgradiger Intensität sezerniert, ist jedoch mittels immunhistologischer Verfahren und Western Blot nachweisbar (STEWART et al. 2000a, HOFFMANN et al. 2009). Eine Reihe von Autoren (STEWART et al. 1995, CROSSETT et al. 1996, STEWART et al. 2000a, HOFF- MANN 2006, HOFFMANN et al. 2009) haben die Proteinsekretion im Interöstrus analysiert (SDS-PAGE, Southern Blot, Western Blot, Immunhistologie) und gelangen zu folgenden Ergebnissen: Post ovulationem nimmt die Proteinsekretion korrespondierend zu der ansteigenden Serumprogesteronkonzentration kontinuierlich zu, bis sie im mittleren Interöstrus von Tag post ovulationem maximale Konzentrationen erreicht. Die stärkste Sekretion weisen HOFFMANN et al. (2009) in diesem Zeitraum in den oberflächlichen Uterindrüsen nach. Im späten Interöstrus und im Präöstrus ist in allen glandulären Epithelien ein schwaches Reaktionsmuster zu beobachten (HOFFMANN 2009). Die stärkste Expression von CAL dokumentieren HOFFMANN et al (2009) immunhistologisch im frühen und mittleren Interöstrus. Im späten Interöstrus, Präöstrus und Östrus liegt eine variable Proteinexpression im Endometrium vor, wobei deutliche interindividuelle Schwankungen in der Färbeintensität und der Anzahl der positiv reagierenden Zellen innerhalb eines Drüsenquerschnitts auftreten. Neben der intrazytoplasmatischen wird eine intranukleäre Reaktion beobachtet. Des Weiteren kann zu jedem der untersuchten Zeitpunkte im Zyklus in allen Drüsenquerschnitten der Bioptate ein mosaikartiges Reaktionsmuster beobachtet werden (HOFFMANN et al. 2009). Einen Überblick über die Sekretion der erwähnten Proteine während des Zyklus der Pferdestute bietet Tab (s. S. 19).

28 LITERATURÜBERSICHT 19 Tab. 2.4: Nachweis der endometrialen Proteine im Zyklusverlauf der Stute Name Nachweiszeitraum Lokalisation UG Sekretionsmaximum: mittlerer bis später Interöstrus 4, Präöstrus: abnehmende Sekretion 4 Östrus: variable Sekretion 4,5 Tag 1-10 p.ov.: Zunahme der Sekretion UF UK Sekretionsmaximum: mittlerer Interöstrus 4,7 später Interöstrus, Präöstrus, Östrus und früher Interöstrus: geringgradige Reaktion 4 Sekretionsmaximum: mittlerer Interöstrus ( Tag p.ov.) 1,2,3,4 später Interöstrus und Präöstrus: schwache Reaktion 4 Östrus: keine bis geringgradige Sekretion 1,3,4 Mittlerer bis später Interöstrus: überwiegend in Epithelien und Lumina tiefer Uterindrüsen 4 Präöstrus: Nachweis in allen glandulären Epithelien und Drüsenlumina 4 Östrus: vorwiegend in Epithelien mittlerer Drüsen 4 Mittlerer und später Interöstrus: in Epithelien und Lumina mittlerer und tiefer Uterindrüsen 4 Präöstrus, Östrus und früher Interöstrus: in Epithelien und teilweise in Lumina oberflächlicher Drüsen 4 Mittlerer Interöstrus: überwiegend Epithelien und Lumina oberflächlicher Uterindrüsen und luminales Epithel 3,4 später Interöstrus: alle glandulären Epithelien, kein Sekret in den Drüsenlumina 4 Östrus: Epithelien und Lumina mittlerer und tiefer Drüsen 4 2 Tage p.ov.: überwiegend Epithelien tiefer Drüsenabschnitte 3 Sekretionsmaximum: früher und mittlerer Interöstrus 4 CAL später Interöstrus, Präöstrus und Östrus: variable Proteinexpression 4 Legende zu Tab. 2.4: p.ov. = post ovulationem alle Zyklusphasen: mosaikartiger Nachweis in glandulären Epithelien und Lumina aller Drüsenabschnitte des Endometriums 4, bei ca. 10% der Drüsenepithelzellen zusätzlich intranukleäre Reaktion 4 1. STEWART et al. (2000) 4. HOFFMANN et al. (2009) 7. ZAVY et al. (1979b) 2. STEWART et al. (1995) 5. BEIER-HELLWIG et al. (1995) 3. CROSSETT et al. (1996) 6. MÜLLER-SCHÖTTLE et al. (2001) Während der frühen Gravidität weisen STEWART et al. (2000) in Uterusspülproben und ELLENBERGER et al. (2008) mittels immunhistologischer Untersuchungen das in erster Linie durch Progesteron regulierte UK in den glandulären Epithelien von Pferdestuten in hohen Konzentrationen nach. Ein zweites Sekretionsmaximum stellen ELLENBERGER et al. (2008) zum Zeitpunkt der Entwicklung der endometrial cups, die das equine Chorion-Gonadotropin (ecg) produzieren, fest. Hieraus sowie aus der Entwicklung der Gonaden resultiert ein Anstieg der Serumprogesteronkonzentration. Mit Degeneration der endometrial cups vom Trächtigkeitstag (ALLEN 2000) und dem damit verbundenen Absinken der Serumprogesteronkonzentration nimmt auch die glanduläre UK-Sekretion ab und wird bis zum Ende der Gravidität mit sehr geringgradiger Intensität nachgewiesen (ELLENBERGER et al. 2008). UG ist während der gesamten Trächtigkeit mit sehr geringgradiger Intensität in den Epithelien der Uterindrüsen nachweisbar (ELLENBERGER et al. 2008). UF wird in allen Stadien der Trächtigkeit in den glandulären Epithelien beobachtet, und seine Expression in den Drüsen nimmt mit Fortschreiten der Gravidität zu (WOODING et al. 2000, ELLENBERGER et al. 2008).

29 LITERATURÜBERSICHT 20 Vom 100. Trächtigkeitstag bis zum Ende der Gravidität wird CAL im Zytoplasma der Uterindrüsen und in den Trophoblastzellen nachgewiesen (WOODING et al. 2000). Untersuchungen zur Synthese und Sekretion von CAL zu früheren Trächtigkeitsstadien fehlen bei der Stute bisher. Einen Überblick über die Sekretion der Proteine im Uterus und der Plazenta bei der Pferdestute liefert Tab Tab. 2.5: Nachweis ausgewählter Proteine im Uterus und der Plazenta im Verlauf der Gravidität bei der Stute UK CAL 1. Sekretionsmaximum während der frühen Trächtigkeit (16. TT) 1,2 2. Sekretionsmaximum zur Entwicklung der endometrial cups ( TT) 1 nach Degeneration der endometrial cups ( TT) 4 Verminderung der UK- Sekretion 1 Name Nachweiszeitraum Lokalisation UG alle Stadien der Trächtigkeit 1 luminales Epithel, glanduläre Epithelien, Drüsenlumina, endometrial cups, Trophoblastzellen UF alle Stadien der Trächtigkeit 1,3, zunehmende Expression mit fortschreitender Gravidität 1 luminale und glanduläre Epithelien sowie Drüsenlumina, endometrial cups, Trophoblastzellen 1 luminales Epithel, glanduläre Epithelien, Drüsenlumina, endometrial cups, Trophoblastzellen TT bis Ende der Gravidität glanduläre Epithelien und Trophoblastzellen 3 Legende zu Tab. 2.5: TT = Trächtigkeitstag 1. ELLENBERGER et al. (2008) 2. STEWART et al. (2000) 3. WOODING et al. (2000) 4. ALLEN (2000) Ausgewählte endometriale Proteine in Uterindrüsen mit periglandulärer Fibrose Diese durch klinische Untersuchungen allein nicht diagnostizierbare degenerative Veränderung des Endometriums stellt eine der Hauptursachen equiner Fertilitätsstörungen dar (KENNEY u. DOIG 1986, SCHOON et al. 1995). Die Endometrose der Pferdestute bezeichnet eine periglanduläre und/oder stromale Fibrose einschließlich der glandulären Alterationen innerhalb der fibrotischen Areale (SCHOON et al. 1995, RAILA 2000). Anhand der Morphologie der Stromazellen werden aktive, inaktive und gemischte Formen unterschieden (HOFFMANN 2006). Die von der Fibrose betroffenen Drüsen können eine Hypertrophie des glandulären Epithels, Ektasien oder eine Atrophie unterschiedlichen Grades aufweisen, die mit einer vollständigen Destruktion der epithelialen Anteile und letztendlich mit einer Verödung der Drüsen einhergehen kann. Dementsprechend erfolgt die Einteilung in destruierende und nicht destruierende Endometroseformen (KENNEY 1978, HOFFMANN 2006). SCHOON et al. (1995) unterscheiden in den fibrotischen Bereichen eine zyklussynchrone (die Drüsendifferenzierung entspricht jener des umliegenden Endometriums) und eine zyklusasynchrone (veränderter Funktionszustand und/oder veränderte Aktivität) Differenzierung der involvierten Uterindrüsen. Insbesondere zyklusasynchrone Drüsen unterliegen einer von der hormonellen Regulation des übrigen Endometriums unabhängigen Differenzierungsdynamik (RAILA et al. 1997, HOFFMANN 2006). Dabei treten mit steigendem Grad der Endometrose deutlich ausgeprägte glanduläre Fehldifferenzierungen auf (SCHOON et al. 1995). Mit zunehmendem Alter der betroffenen Tiere erhöht sich auch der Grad

30 LITERATURÜBERSICHT 21 der Endometrose, jedoch besteht keine direkte Korrelation zur Anzahl der Abfohlungen (RICKETTS u. ALONSO 1991, SCHOON et al. 1997). Folge dieser endometrialen Alteration ist eine Beeinträchtigung der Fertilität durch Veränderungen des uterinen Milieus infolge einer gestörten Sekretion der endometrialen Proteine (SCHOON et al. 1995, HOFF- MANN 2006). HOFFMANN (2006) sowie LEHMANN et al. (2008) weisen in den Drüsen fibrotisch veränderter Areale ein zyklusasynchrones Expressionsmuster von UG, UK und CAL nach. Beide Autorinnen beobachten für Uteroferrin eine variable, meistens jedoch gesteigerte Sekretion innerhalb endometrotischer Herde, die drei übrigen Proteine werden überwiegend mit verminderter Intensität sezerniert. LEHMANN et al. (2008) zufolge tritt insbesondere bei güsten Stuten eine mittelgradige destruierende periglanduläre Fibrose, assoziiert mit einer deutlichen Verminderung der glandulären Uteroglobin- und Uterokalinsekretion, auf Die Expression ausgewählter endometrialer Proteine im fehldifferenzierten Endometrium der Pferdestute ELLENBERGER et al. (2004) untersuchen bei Stuten mit endometrialer Fehldifferenzierung unterschiedlicher Ätiologie (infolge Granulosazelltumoren, Langzeitintervention mit Regumate, spontan auftretende Fehldifferenzierung) immunhistologisch das uterine Sekretionsmuster von UG, UF, UK und CAL Bei Pferdestuten mit Granulosazelltumoren beobachten die Autoren eine irreguläre endometriale Differenzierung mit einer gestörten Proteinsekretion, unabhängig vom Grad der Fehldifferenzierung. Nach operativer Entferung der Tumoren normalisiert sich sowohl die endometriale Funktionsmorphologie als auch das Sekretionsmuster von UG, UF, UK und CAL. Während einer Progestagen-Langzeitbehandlung entwickelt sich eine irregulär sekretorische endometriale Differenzierung, aus der eine ungleichmäßige Sekretion von UG und UF sowohl innerhalb eines Drüsenquerschnitts als auch zwischen den Uterindrüsen resultiert. CAL und UK werden in fast allen Drüsen deutlich überexprimiert (ELLENBERGER et al. 2004). Drei Monate nach Beendigung der Therapie zeigt die Hälfte der untersuchten Stuten immer noch eine irreguläre endometriale Fehldifferenzierung mit abnormalen Sekretionsmustern der nachgewiesenen Proteine. In Endometrien mit spontan auftretender Fehldifferenzierung tritt sowohl eine irreguläre als auch eine ungleichmäßige Differenzierung (vgl. Kap. 2.5) mit atypischer Expression von UG, UF, UK und CAL auf (ELLENBERGER et al. 2004). In irregulär differenzierten Endometrien korrespondieren die Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchungen der Proteine mit den Befunden, die bei Stuten mit Granulosazelltumoren und nach Progestagen-Langzeitapplikation erhoben werden können. Im Fall einer ungleichmäßigen endometrialen Differenzierung werden UG, UF, UK und CAL in den zyklussynchron differenzierten Arealen gleichmäßig innerhalb eines Drüsenquerschnitts und bezogen auf die Gesamtheit der Uterindrüsen nachgewiesen. Areale, die eine nicht mit den ovariellen Befunden im Einklang stehende glanduläre Differenzierung aufweisen, zeigen eine zyklusasynchrone Sekretion der Proteine (ELLENBERGER et al. 2004). Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass - unabhängig von der Ätiologie der Fehldifferenzierung - eine gestörte Sekretion von UG, UF, UK und CAL im Endometrium von Pferdestuten auftritt. Dies führt zu einer quantitativ und qualitativ veränderten Zusammensetzung der uterinen Sekrete, was in Fertilitätsstörungen resultiert, da Abweichungen im uterinen Mikromilieu möglicherweise eine inadäquate Ernährung des Konzeptus zur Folge haben (ELLENBERGER et al. 2004).

31 LITERATURÜBERSICHT Progestagen- Langzeitapplikation bei Pferdestuten Allgemeine Betrachtungen Unter dem Begriff Progestagene werden synthetische Verbindungen zusammengefasst, die entweder Abkömmlinge des Testosterons oder des Progesterons darstellen und mit dem entsprechenden Steroidhormonrezeptor, z.b. dem Progesteron-, Androgen-, Glukokortikoid- oder Mineralokortikoidrezeptor, interagieren (SITRUK-WARE 2004). Bei Bindung an den Progesteronrezeptor können auf diese Weise die Wirkungen des Progesterons imitiert werden. In der Reproduktionsmedizin des Pferdes wird neben anderen Progestagenen häufig Regumate angewandt. Altrenogest (Syn. Allyltrenbolon), der Wirkstoff des Regumate, zählt zur Gruppe der 19-nor-Testosteron- Derivate und weist strukturelle Ähnlichkeiten mit dem steroidalen Anabolikum Trenbolon auf (MACHNIK et al. 2007). Es wirkt in erster Linie als Progestagen mit Antigonadotropin-Effekt, hat aber auch schwache östrogene und androgene Wirkungen (KROKER 2006). Durch eine exogene Applikation von Altrenogest werden die Plasmakonzentrationen von LH und FSH gesenkt und damit die Entwicklung ovarieller Follikel unterdrückt (GUTHRIE u. BOLT 1982, SQUIRES et al. 1983a, VIVRETTE 2004). Aufgrund des negativen Rückkopplungseffekts folgt ein Anstieg der FSH-Konzentration, der eine erneute Rekrutierung von Follikeln nach sich zieht (SQUIRES et al. 1983a). Nach dem Absetzen der exogenen Altrenogest-Zufuhr wird durch den sogenannten Rebound-Effekt die Freisetzung von LH aus dem Hypophysenvorderlappen induziert, die in einer gesteigerten Follikelreifung sowie anschließender Ovulation resultiert (VIVRETTE 2004). Seit 2005 ist Regumate Equine (2,2 mg Altrenogest/ml) in Deutschland zur Unterdrückung und Kontrolle des Östrus bei nicht wettbewerbsorientierten Stuten zugelassen (HODGSON et al. 2005, MACHNIK et al. 2007, ANON. 2008) und enthält Altrenogest in öliger Lösung zur oralen Verabreichung. Die Anwendung im internationalen Sport ist zwar möglich, muss jedoch per Medication Form 2 zum Start angezeigt sein (ANON. 2009). Das Arzneimittel wird nach Herstellerangaben in einer Dosis von 0,044 mg/kg Körpergewicht an zehn aufeinander folgenden Tagen per os eingegeben. Ein Indikationsbereich für Regumate bei der Pferdestute ist die Regulation des Zyklusgeschehens in der Übergangsphase vom Winteranöstrus zur physiologischen Zuchtsaison (SQUIRES et al. 1983b). In diesem Zeitraum kann die Zykluslänge, bedingt durch eine Imbalance zwischen hohen FSH-Konzentrationen und einer niedrigen LH-Sekretion (SQUIRES 1993), deutlich schwanken, und somit können Ovulationen ausbleiben. Mit dem Ziel, die Reproduktionsleistung zu verbessern, kann diese Übergangsphase durch die Östrusinduktion mittels Altrenogest verkürzt und eine reguläre Zyklusabfolge erreicht werden (WEBEL u. SQUIRES 1982, HODGSON et al. 2005). Eine hocheffektive Synchronisation des Zyklusgeschehens, die ohne hormonelle Beeinflussung nicht denkbar wäre, ist zwischen Donor- zur Rezipientenstute im Rahmen des Embryotransfers von entscheidender Bedeutung (HINRICHS et al. 1999). Gegenüber der bewährten Zyklussteuerung ist der Indikationsbereich der Progesteronsubstitution zur Aufrechterhaltung der Gravidität umstritten. Während z.b. JACKSON et al. (1986) sowie PARRY-WEEKS u. HOLTAN (1987) eine erfolgreiche Substitutionstherapie mit Altrenogest vom 40. bis 105. Trächtigkeitstag beschreiben, wird die Notwendigkeit einer derartigen Behandlung während der Gravidität von anderen Autoren angezweifelt (ALLEN 1984, GINTHER 1985) Auswirkungen einer Progestagen-Langzeitapplikation bei der Pferdestute Um den Einfluss einer Langzeitapplikation des Progestagens Altrenogest (Regumate Equine, Fa. Intervet, 0,044 mg/kg KM) auf das Sexualverhalten, klinische und endokrinologische Parameter sowie anhand von Endometriumbioptaten auf die endometriale Funktionsmorphologie zu untersuchen, unterziehen KLUG et al. (1997) zwei mal zwei nicht fohlenführende Warmblutstuten in der Zeit von Februar bis April in unterschied-

32 LITERATURÜBERSICHT 23 lichen Regimen einer prolongierten Applikation des Präparates. Eine Übersicht über die Behandlungsschemata ist in Tab. 2.6 dargestellt. Tab. 2.6: Zeitschema der Regumate -Dauerbehandlung (KLUG et al. 1997) Regumate -Applikation in Tagen Stuten Behandlung* Pause Behandlung* A und B C und D Legende zu Tab. 2.6: * = 0,044mg/kg Körpergewicht Altrenogest per os pro Tag Klinische Aspekte Unmittelbar nach Beginn der jeweils ersten Applikationsperiode kommt es zu einem Sistieren der Rossesymptomatik (WEBEL u. SQUIRES 1982, SQUIRES et al. 1983, KLUG et al. 1997). Zusätzlich reduzieren sich die Ovargröße und die Anzahl der ovariellen Follikel bei allen vier in Tab. 2.6 dargestellten Stuten (KLUG et al. 1997). Zwei Tage nach dem Absetzen von Regumate treten deutlich ausgeprägte Rossesymptome auf, die innerhalb der folgenden vierundzwanzig Stunden post ovulationem abnehmen. Wie GUTHRIE und BOLT (1982) sowie KROKER et al. (2006) vermuten auch KLUG et al. (1997), dass die parallel zu den jeweiligen Behandlungsperioden bestimmten niedrigen Serumprogesteronkonzentrationen auf eine applikationsbedingte Hemmung der LH-Sekretion zurückzuführen sind, woraus eine Zyklusblockade resultiert. Eine zeitgleich zur Regumate -Applikation nachgewiesene niedrige Serumöstradiolkonzentration, die unmittelbar nach Absetzen des Präparats signifikant ansteigt, um anschließend zum Zeitpunkt der Ovulation abzufallen, erklären KLUG et al. (1997) mit einem Sistieren der Follikelentwicklung durch die medikamentös induzierte Hemmung der LH-Sekretion. Folglich bleibt die finale Reifung der Follikel aus, und durch den anschließenden Wegfall des durch die Regumate -Applikation aufrechterhaltenen negativen Feedbacks in der Behandlungspause folgt die Follikelreifung und damit eine gesteigerte Östrogensynthese. Bei den beiden Stuten des Behandlungsregimes 32 Tage - 16 Tage - 36 Tage (KLUG et al. 1997) wird im Serum ein zweiter Östradiolpeak während des zweiten Behandlungsintervalls beobachtet, der durch eine Zweitfollikelbildung erklärt wird, was noch im zweiten Behandlungsintervall zur Bildung eines weiteren dominierenden Follikels führt, der auch ovuliert. Dieses Ergebnis verdeutlicht, dass exogen zugeführte Progestagene nicht in jedem Fall die Entwicklung und Ovulation aller Follikel unterdrücken können (KLUG et al. 1997) Histomorphologische Aspekte zur endometrialen Funktionsmorphologie Im Rahmen der in Kap erwähnten Studie untersuchen KLUG et al. (1997) die Auswirkungen der Progestagen-Langzeitapplikation auf die endometriale Funktionsmorphologie und beobachten - unabhängig vom Behandlungsregime - bei allen Stuten die Entwicklung einer irregulären glandulären Dif-ferenzierung mit sekretorischer Dominanz. Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass eine hormonelle Langzeitintervention mit Regumate eine deutliche Alteration der endometrialen Funktionsmorphologie hervorruft. Diese Veränderungen werden grundlegend als reversibel eingestuft, da zwei der vier Stuten drei Monate post applicationem wieder eine reguläre Funktionsmorphologie aufweisen. Bei den anderen zwei Stuten liegt jedoch nach wie vor eine irreguläre glanduläre Differenzierung vor.

33 LITERATURÜBERSICHT Immunhistologische Untersuchungen am Endometrium Progestagen-langzeitbehandelter Pferdestuten KLUG et al. (1997) weisen während des ersten Behandlungsintervalls (s. Tab. 2.6, S. 23) neben der irregulären glandulären Differenzierung des Endometriums starke Schwankungen in der Expression der Östrogen- und Progesteronrezeptoren sowie eine äußerst geringgradige Proliferationsaktivität (Ki-67 Antigen- Expression) der Drüsen nach. In der Therapiepause reagiert das Endometrium entsprechend dem Anstieg der 17β-Östradiolkonzentration im Blut mit einer gesteigerten Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 Antigen und der Steroidhormonrezeptoren. Die zweite Applikation von Regumate nach der Therapiepause (s. Tab. 2.6, S. 23) führt anfangs kurzfristig zu einem nicht erklärbaren stimulierenden Effekt sowohl auf die Proliferationsaktivität der Drüsen als auch auf die Expression der Progesteron- und in geringerem Maße auf die Expression der Östrogenrezeptoren. Im Gegensatz hierzu ist bei Therapieende eine verringerte Intensität der Rezeptorexpression und Proliferation nachweisbar. Dies wird auf eine Downregulation der Steroidhormonrezeptoren infolge der Progestagen-Langzeitapplikation zurückgeführt. ELLENBERGER et al. (2004) untersuchen in den Endometrien progestagen-langzeitbehandelter Stuten (vgl. Kap ) die endometrialen Proteine UG, UF, UK und CAL, die zu Anfang der Behandlung ein Sekretionsmuster zeigen, das jenem bei zyklischen Pferdestuten mit regulär differenzierten Endometrien ähnelt. Mit zunehmender Dauer der Regumate -Applikation entwickelt sich jedoch eine deutliche Überexpression von UK und CAL in fast allen Drüsenquerschnitten sowie eine ungleichmäßige Expression von UG und UF sowohl innerhalb eines Drüsenquerschnitts als auch zwischen den Uterindrüsen (ELLENBERGER et al. 2004). Während die zwei Stuten mit regulär differenzierten Endometrien (vgl. Kap ) drei Monate nach Beendigung der Progestagen-Langzeitapplikation eine physiologische Sekretion der untersuchten Proteine aufweisen, wird bei den zwei Stuten mit persistierender irregulärer glandulärer Differenzierung weiterhin eine atypische Sekretion der endometrialen Proteine festgestellt (ELLENBERGER et al. 2004). 2.8 Kritische Betrachtung der Fragestellung dieser Studie vor dem Hintergrund der vorliegenden Literaturrecherche Wie anhand ausgedehnter Literaturrecherchen dargestellt, existieren im Gegensatz zur Pferdestute für Maultierstuten bisher nur einzelne Arbeiten zu morphologisch-funktionellen Befunden des Endometriums, da die wirtschaftlich orientierte Nachzucht dieser infertilen Arthybriden eine im Vergleich zum Pferd untergeordnete Rolle bezüglich der Reproduktionsmedizin spielt. Obwohl die hauptsächliche Nutzung dieser Tiere als Freizeit- und Lasttiere erfolgt, werden Maultierstuten unter anderem erfolgreich im Rahmen von experimentellen Embryotransferprogrammen eingesetzt, wobei die Zyklussynchronisation mittels Progestagenen eine zentrale Rolle spielt. Detaillierte Studien zur endometrialen Funktionsmorphologie, assoziiert mit immunhistologischen Arbeiten zur Untersuchung sekretorischer endometrialer Proteine fehlen bislang. Somit erfolgt mit dieser Arbeit erstmals eine detaillerte vergleichende histologische und immunhistologische Charakterisierung des Endometriums von zyklischen und azyklischen Maultierstuten und der Vergleich der Ergebnisse mit den bei Pferdestuten beschriebenen Erkenntnissen. Darüber hinaus werden die Befunde der morphologisch-funktionellen Untersuchungen an den Endometrien von zwei azyklischen Maultierstuten dargestellt, die einer Progestagen-Langzeitapplikation unterzogen wurden.

34 MATERIAL UND METHODEN 25 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Tiere, Material und Methoden Tiergut, Material und Probenherkunft Für die Untersuchungen standen insgesamt 46 Endometriumbioptate von vier klinisch azyklischen und 51 Bioptate von zwei klinisch als zyklisch befundeten Maultierstuten im Alter von 13 bis 23 Jahren zur Verfügung. Die Tiere stammen aus dem Einsatz- und Ausbildungszentrum für Gebirgstragtierwesen in Bad Reichenhall (s. Abb. 3.1) und mussten sich bei einer Voruntersuchung als allgemeingesund sowie klinisch und bakteriologisch als geschlechtsgesund dargestellt haben. Die azyklischen Maultierstuten wurden im Rahmen der Zyklusdiagnostik regelmäßig von April bis August 2004 im Abstand von 2 bis 10 Tagen klinischgynäkologisch untersucht, bioptiert und Blutproben zur Bestimmung der Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen gewonnen (PD Dr. C.P. Bartmann, Bad Reichenhall). Bei den beiden zyklischen Maultierstuten (Maultier 1, 13 Jahre; Maultier 2, 20 Jahre) wurde nach demselben Schema verfahren, die Probenentnahme bei Maultier 1 erfolgte ebenfalls nahezu wöchentlich, bei Maultier 2 allerdings in unregelmäßigeren Abständen. Bei diesem Tier wurden insgesamt 11 Bioptate gewonnen, von denen sich nur 4 als auswertbar erwiesen, da es sich bei den übrigen um zervixnah entnommene Bioptate handelte. Maultier 1 wurde von April bis November beprobt, Maultier 2, ebenso wie die azyklischen Tiere, von April bis August. Die bei allen Tieren gewonnenen Serumproben wurden zur endokrinologischen Untersuchung (Prof. Dr. H.- O. Hoppen, Endokrinologisches Labor, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Bischofsholer Damm 15, Hannover) weitergeleitet. Auch die im zweiten Teil dieser Studie im Rahmen einer Regumate - Applikation (vgl. Kap ) bei zwei der azyklischen Maultieren gewonnenen Serumproben wurden endokrinologisch in der oben genannten Einrichtung untersucht. 3.1 Abb. 3.1: Mit Gütern beladenes Maultier aus dem Einsatz- und Ausbildungszentrum für Gebirgstragtierwesen (EAZ) 230 in Bad Reichenhall. Die Tiere werden für Einsätze des EAZ 230 in Gebieten ausgebildet, in denen die Geländestruktur oder Witterungsbedingungen den Einsatz anderer Transportmittel nicht mehr zulassen. Foto: PD Dr. C.P. Bartmann, Bad Reichenhall

35 MATERIAL UND METHODEN Nähere Charakterisierung des Tiergutes und des Untersuchungsmaterials Zyklische Maultierstuten Bei Maultierstute 1 wurden im Verlauf der Studie zwei vollständige Zyklen mit einer Länge von 112 und 60 Tagen, bei Maultierstute 2 ein vollständiger Zyklus mit einer Länge von 27 Tagen dokumentiert. Mittels rektaler und sonografischer Untersuchungen wurden bei den beiden zyklischen Maultierstuten aktive Ovarien und präovulatorische Follikel mit einem Durchmesser von 3,7 cm nachgewiesen (BARTMANN et al. 2008). Utrasonografisch war post ovulationem die Ausbildung von Corpora lutea darstellbar. Die parallel bestimmten Serumprogesteron- und östradiolkonzentrationen (s. Tab. 3.1) zeigten keine Korrelation zu dem klinisch beobachteten Zyklusgeschehen (BARTMANN et al. 2008). Tab. 3.1: Serumhormonkonzentrationen der zyklischen Maultierstuten (n = 2) Zyklusphase Progesteron [ng/ml] Östradiol [pg/ml] Östrus 0,42-2,2 9,7-11,0 Interöstrus 0,23-9,8 < 1,0-15,0 Anöstrus 1,0 6,8 Eine detaillierte Übersicht über die Befunde der klinisch-gynäkologischen und endokrinologischen Untersuchungen bei den zwei zyklischen Maultierstuten ist in Kap. 9.1 (s. Tab , Anhang S ) dargestellt. Azyklische Maultierstuten Bei den vier azyklischen Maultierstuten konnten bei der klinisch-gynäkologischen und sonografischen Untersuchung stets kleine, inaktive Ovarien sowie niedrige, wenig schwankende Serumhormonwerte (s. Tab. 3.2) dokumentiert werden (BARTMANN et al. 2008). Tab. 3.2: Serumhormonkonzentrationen der azyklischen Maultierstuten (n = 4) Tiere Progesteron [ng/ml] Östradiol [pg/ml] Maultier 3 (22 Jahre) 0,28-1,0 7,0-10,8 Maultier 4 (21 Jahre) 0,63-1,1 10,8-14,5 Maultier 5 (19 Jahre) 0,59-0,85 7,8-13,7 Maultier 6 (23 Jahre) 0,25-0,97 9,3-14, Probenentnahme Probenentnahme bei den zyklischen (n = 2) und den azyklischen (n = 4) Maultierstuten Die Entnahme der Endometriumbioptate erfolgte in allen Fällen mit Hilfe einer FERRIS-Biopsiezange (Fa. Eickemeyer, Tuttlingen) dorsal aus dem Corpus uteri mit einer Größe von 0,3 x 0,3 x 1,0 cm (PD Dr. C.P. Bartmann, Bad Reichenhall). Unmittelbar nach der Entnahme wurde die Fixierung der Proben in 4%igem Formalin vorgenommen. Eine Übersicht zur Anzahl der entnommenen Bioptate pro Maultierstute ist in Tab. 3.3 dargestellt.

36 MATERIAL UND METHODEN 27 Tab. 3.3: Anzahl der entnommenen Bioptate bei den zyklischen (n = 2) und azyklischen Maultierstuten (n = 4) Zyklische Maultierstuten Maultier 1 (13 Jahre) Maultier 2 (20 Jahre) Maultier 3 (22 Jahre) Azyklische Maultierstuten Maultier 4 (21 Jahre) Maultier 5 (19 Jahre) Maultier 6 (23 Jahre) Bioptatanzahl n = 40 n = 11* n = 11** n = 11 n = 11 n = 13 Legende zu Tab. 3.3: * = davon 7 nicht auswertbar, da zervixnahe Biopsie, ** = davon 1 nicht auswertbar, da zervixnahe Biopsie Regumate -Applikation bei zwei azyklischen Maultierstuten Aus der Gruppe der azyklischen Maultierstuten, die von April bis August 2004 klinisch-gynäkologisch und endokrinologisch untersucht sowie bioptiert wurden, erfolgte bei zwei Tieren (Maultier 4, 21 Jahre; Maultier 5, 19 Jahre) anschließend eine prolongierte orale Applikation von Altrenogest (Regumate Equine, Fa. Intervet, 0,044 mg/kg KM) über 50 Tage. Die Tiere wurden im Abstand von ca. einer Woche bioptiert, und weiterhin begleitend klinisch-gynäkologische sowie endokrinologische Untersuchungen parallel gewonnener Serumproben durchgeführt. Ebenso wurde über einen Zeitraum von 27 Tagen nach Absetzen des Medikaments im Oktober/November 2004 verfahren. Zwei Jahre post applicationem, im Oktober 2006, erfolgte bei jeder der beiden Maultierstuten die Entnahme eines weiteren Endometriumbioptats. Alle Proben wurden unmittelbar nach der Entnahme in 4%igem Formalin fixiert. Eine Übersicht zur Bioptatentnahme bei den zwei azyklischen Maultierstuten, die einer prolongierten Regumate -Applikation unterzogen wurden, liefert Tab Tab. 3.4: Bioptatentnahme bei azyklischen Maultierstuten (n = 2) vor, unter und nach der Regumate - Applikation Tiere Vor Regumate - Applikation (über 121 Tage) Unter Regumate - Applikation (über 50 Tage) Nach Regumate - Applikation Maultier 1 (21 Jahre) Maultier 2 (19 Jahre) 11 Bioptate/Tier 9 Bioptate/Tier (über 27 Tage) 4 Bioptate/Tier (nach 2 Jahren) 1 Bioptat/Tier Probenaufbereitung und histologische Präparation Die Einbettung der formalinfixierten Proben erfolgte in Paraplast (Fa. Sakura Finetek Europe B.V., Heppenheim) nach dem Standardverfahren im Hypercenter XP (Fa. Thermo Electron GmbH, Dreieich). Mit einem Schlittenmikrotom (Fa. Reichert-Jung, Wien, Österreich) wurden von den Paraplastblöcken 3-4 µm dicke Schnitte angefertigt und mit einer Hämalaun-Eosin-Färbung (H.-E.-Färbung; ROMEIS 1989) angefärbt. In ausgewählten Fällen erfolgte eine nähere Charakterisierung von Gefäßveränderungen (insbesondere der Zubildung kollagener und elastischer Fasern) mittels der von GRÜNINGER (1998) modifizierten Pikrosiriusrot-Färbung (nach Constantine, 1969). Die Verfahrensschritte der Färbung sind in Kap. 9.2 (s. Anhang S. 119) dargestellt.

37 MATERIAL UND METHODEN Lichtmikroskopische Untersuchungen Die H.-E.-gefärbten Präparate wurden mit einem Standardmikroskop der Fa. Olympus unter Verwendung von 4er-, 10er- und 40er-Objektiven lichtmikroskopisch beurteilt. An allen Endometriumbioptaten erfolgte eine histomorphologische Charakterisierung hinsichtlich der endometrialen Differenzierung. Zusätzlich fand eine Einschätzung der histopathologisch nachweisbaren Alterationen im Sinne von Endometritis, Endometrose, Angiosklerose, Perivaskulitis, Lymphangiektasien/-zysten statt. Basierend auf den Resultaten von HOFFMANN (2006) wurden bei der Bewertung der Endometrose im Endometrium der sechs Maultierstuten folgende Erscheinungsformen berücksichtigt: 1. Die aktive Endometrose. Bei dieser Form weisen die Stromazellen innerhalb fibrotischer Herde überwiegend (> 75%) eine aktive Differenzierung auf und besitzen folglich große, rundovale, hypochromatische Kerne sowie viel eosinophiles Zytoplasma und eine plumpe, bauchige Form. 2. Die inaktive Endometrose. Hier sind die beteiligten Stromazellen zu über 75% inaktiv differenziert und besitzen kleine, schmale, spindelförmige, hyperchromatische Zellkerne, wenig eosinophiles Zytoplasma und eine schlanke, elliptische Form. 3. Die gemischte Endometrose. Dieser Endometrosetyp ist durch das Auftreten von sowohl aktiv als auch inaktiv differenzierten periglandulären Stromazellen zu gleichen Teilen gekennzeichnet. Zusätzlich kann die Endometrose, die aktiv, inaktiv oder gemischt ausgeprägt sein kann, in Folge von Zerstörung der involvierten Epithelien einen destruierenden Charakter aufweisen. Die Beurteilung des Grades der periglandulären Fibrose erfolgt in Anlehnung an das Bewertungssystem von KENNEY und DOIG (1986), modifiziert nach SCHOON et al. (1992) Immunhistologische Methoden Vorversuche In Vorversuchen wurde überprüft, ob die in der Routinediagnostik des Instituts für Veterinär-Pathologie der Universität Leipzig bei Endometriumproben von Pferdestuten eingesetzten Marker mit den ent-sprechenden Vorbehandlungen und Antikörperverdünnungen mittels Peroxidase-anti-Peroxidase-Methode an den Uterusbioptaten der Maultierstuten vergleichbare Reaktionsmuster zeigen. Hierfür wurden die verwendeten Antikörper (Uteroglobin (UG), Uterokalin (UK), Uteroferrin (UF), Calbindin D9K (CAL), Östrogenrezeptor (ER), Progesteronrezeptor (PR), Ki-67 Antigen) an Uterusbioptaten von Maultierstuten auf ihre optimale Antikörperverdünnung getestet. Hauptversuche Alle Bioptate wurden immunhistologisch auf das Vorkommen der sekretorischen endometrialen Proteine UG, UK, UF sowie des kalziumbindenden Proteins CAL mittels jeweils eines polyklonalen Primärantikörpers untersucht. Bei den beiden azyklischen Maultierstuten, die eine orale Progestagen-Langzeitapplikation erhielten, wurde darüber hinaus die endometriale Expression der ER, PR sowie des Proliferationsmarkers Ki-67 Antigen mittels monoklonaler Primärantikörper immunhistologisch beurteilt. Die Durchführung der einzelnen Verfahrensschritte der immunhistologischen Untersuchungen wird in Kap. 9.3 (s. Anhang S ) beschrieben, die verwendeten Primär- und Sekundärantikörper sowie ihre Bezugsquellen sind in Kap. 9.3 (s. Tab. 9.5, Anhang S. 122) aufgeführt.

38 MATERIAL UND METHODEN Immunhistologische Kontrollen Als Positivkontrollen wurden die in Kap. 9.4 (s. Tab. 9.6, Anhang S. 124) genannten Gewebe des Pferdes mitgeführt. Als Negativkontrollen dienten die jeweils mit den Kontrollseren (Antikörper gegen das Oberflächenantigen von Hühner-Bursa-Lymphozyten (T1; HIRSCHBERGER 1987), Kaninchenserum (Code-Nr. X0902, Fa. DAKO, Hamburg) inkubierten Schnitte Auswertung der immunhistologischen Untersuchungen Als positiv wurden in der Schnittebene liegende, hell- bis dunkelbraune, feingranuläre Reaktionsprodukte bewertet, die in der Negativkontrolle nicht nachweisbar waren. Uteroglobin, Uteroferrin und Uterokalin wurden ausschließlich intrazytoplasmatisch beobachtet, während Calbindin D9K auch intranukleär darstellbar war. Eine rein intranukleäre Expression lag bei den Östrogen- und Progesteronrezeptoren sowie bei Ki-67 Antigen vor. Die Beurteilung der Steroidhormonrezeptor-Expression erfolgte semiquantitativ anhand des von ÖZGEN (1997) etablierten Immunreaktiven Scores (IRS), der mit Hilfe der aufgeführten Formel berechnet wird und einen Wert zwischen 0, also keiner immunhistologischen Reaktion, und 10, der stärksten immunhistologische Reaktion, annehmen kann. 4 IRS = 1/100 Σ {PP n x max [φ x (SI n 1),1]} n=2 Mit Laufindex = n Skalierungsfaktor φ = 5 Prozentsatz positiver Zellen = PP Färbeintensität = SI Tab. 3.5: Zuordnung von Färbeintensität und SI-Wert Laufindex n Färbereaktion SI-Wert 1 keine 0 2 schwach 1 3 mäßig 2 4 stark 3 Die Anzahl der positiv reagierenden Zellen wurde in Abhängigkeit von der jeweiligen Färbeintensität semiquantitativ eingeschätzt, in Prozentzahlen angegeben und in die oben stehende Formel eingesetzt. Die Erstellung des Sekretions-Scores (SSc) (HOFFMANN et al. 2003) erfolgte anhand der nach EL- LENBERGER (2008) modifizierten Formel (s.u.), wobei zusätzlich die Reaktionsintensität angedeutet berücksichtigt und mit dem SI-Wert 0,5 versehen wurde. Hier wurde die Anzahl der die endometrialen Proteine exprimierenden Zellen geschätzt und in Prozentzahlen angegeben. Für die Zuordnung der entsprechenden Färbeintensitäten wurde die in Tab. 3.7 (s. S. 31) aufgeführte graduelle Einteilung verwendet. Der SSc kann, ebenso wie der IRS, Werte zwischen 0 und 10 einnehmen. Das eisenhaltige Pigment Hämosiderin, das in Folge des Blutabbaus in den Makrophagen und den Epithelzellen liegen kann, ist auch in der Negativkontrolle als hellbraunes, granuläres Material nachweisbar und kann somit von einer positiven immunhistologischen Reaktion eindeutig abgegrenzt werden. Ebenfalls als negativ werden hellbraune homogene, extrazelluläre Anfärbungen im Bereich entnahmebedingter Quetschartefakte und in den A-realen mit Plasmainsudation (Ödematisierung) in den Gewebeproben bewertet.

39 MATERIAL UND METHODEN 30 Die Reaktionsmuster aller verwendeten Antikörper sind in Kap. 9.4 (s. Tab. 9.7 und Tab. 9.8, Anhang S. 124 und 125) zusammenfassend dargestellt. 5 SSc = 1/100 Σ (PP n x SI n ) n=1 Mit Laufindex = n, Prozentsatz positiv reagierender Zellen = PP, Färbeintensität = SI. Tab. 3.6.: Zuordnung von Färbeintensität und SI-Wert Laufindex n Färbeintensität SI-Wert 1 keine (negativ) 0 2 angedeutet 0,5 3 schwach 1 4 mäßig 5 5 stark 10 Tab. 3.7: Zuordnung der Färbeintensitäten zu den entsprechenden SSc-Werten SSc-Wert 0 0, Färbeintensität -- (+) + +(+) ++ ++(+) +++ Legende zu Tab. 3.7: -- = negativ; ( + ) = angedeutet; + = geringgradig; +(+) = gering- bis mittelgradig; ++ = mittelgradig; ++(+) = mittel- bis hochgradig; +++ = hochgradig Die mittels immunhistologischer Methoden untersuchten uterinen Proteine wurden sowohl im Zytoplasma der Drüsenepithelzellen als auch in den Lumina der Uterindrüsen nachgewiesen, sodass grundlegend von einer Sekretion der Proteine ausgegangen wird. Molekularbiologische Untersuchungen zur Verifizierung von Syntheseprozessen, z.b. Durchführung von Uterusspülproben und Nachweis der Pro-teinfraktionen mittels SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse, wurden jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt, sodass von einer potenziellen Sekretion gesprochen werden muss. Die Expression von Ki-67 Antigen wurde semiquantitativ anhand der deutlichen, homogen dunkelbraunen nukleären Anfärbung der endometrialen Epithelien und Stromazellen beurteilt. Während die Anzahl der positiv reagierenden Kerne der endometrialen Strukturelemente geschätzt wurde, blieb die Intensität der Anfärbung unberücksichtigt. Die Zuordnung der Anzahl positiv reagierender Zellen zu entsprechenden Zahlenwerten wurde nach der in Tab. 3.8 dargestellten Einteilung vorgenommen. Tab. 3.8: Zuordnung der Anzahl positiv reagierender Zellen zu den entsprechenden Zahlenwerten Ki-67 Antigen- Expression Anzahl positiv reagierender Zellen 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 keine sehr wenige wenige wenige bis mäßige Anzahl mäßige Anzahl mäßig bis große Anzahl große Anzahl

40 ERGEBNISSE 31 4 ERGEBNISSE 4.1 Vergleichende Darstellung der Untersuchungsergebnisse aus den Gruppen der zyklischen (n=2) und azyklischen (n=4) Maultierstuten Endometriale Funktionsmorphologie der zyklischen und azyklischen Maultierstuten unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde Zyklische Maultierstuten (n = 2) Beide Tiere zeigen, unabhängig von der klinisch dokumentierten Zyklusphase oder den endokrinologischen Parametern (s. Tab , Anhang S ), unterschiedliche endometriale Funktionszustände (s. Abb. 9.1 und 9.2, Anhang S. 128). In den meisten Bioptaten liegt bei dominierend proliferativer, sekretorischer oder inaktiver Differenzierung eine irreguläre und/oder ungleichmäßige endometriale Fehldifferenzierung vor. Eine Übersicht über die endometriale Differenzierung zu den einzelnen Bioptatentnahmezeitpunkten liefern die Tabellen (s. Anhang S ). Daneben wird bei beiden Tieren eine überwiegend mittelgradige, teils gemischte, teils inaktive sowie fokal destruierende Endometrose (s. Material und Methoden, S. 28) beobachtet. In mittelgoßen und großen arteriellen sowie venösen Gefäßen ist eine unterschiedlich stark ausgeprägte Fibroelastose im Bereich der T. media sowie der T. adventitia (Pikrosiriusrotfärbung) nachweisbar (s. Abb. 9.3, Anhang S. 128). Azyklische Maultierstuten (n = 4) Korrespondierend zu der klinisch dokumentierten Azyklie sowie relativ niedrigen, wenig schwankenden Serumhormonkonzentrationen (s. Tab. 3.2, Material und Methoden S. 26), weisen die vier Tiere ein inaktives, jedoch geringgradig irregulär differenziertes Endometrium auf (s. Abb. 9.4, Anhang S. 128). Bei allen azyklischen Maultierstuten liegt eine graduell variierende, vorwiegend gemischte und fokal destruierende Endometrose (s. Material und Methoden, S. 28) vor (s. Abb. 9.5, Anhang, S. 128). In den arteriellen und venösen Gefäßen wird eine mittelgradige Fibroelastose (Pikrosiriusrotfärbung) im Bereich der T. media und der T. adventitia beobachtet (s. Abb. 9.6, Anhang S. 128) Immunhistologische Ergebnisse unter Berücksichtigung der klinischen und endo krinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Im Folgenden werden die Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchungen bei den zyklischen (n = 2) und ayzklischen (n = 4) Maultierstuten dargestellt. Vom dominierenden Bild abweichende Befunde sind in den Tabellen des Ergebnisteils farbig hinterlegt Uteroglobin Zyklische Maultierstuten (n = 2) UG liegt überwiegend diffus verteilt im Zytoplasma der Epithelzellen in den uterinen Drüsen, sehr vereinzelt auch an der apikalen Seite der Zellen vor. Bei beiden Tieren wird sowohl innerhalb eines Drüsenquerschnitts als auch zwischen den Uterindrüsen eine geringgradig ausgeprägte, ungleichmäßige Sekretion beobachtet, multifokal befindet sich positiv reagierendes Sekret in den Drüsenlumina (s. Abb. 9.7, Anhang S.130). Die Sekretion von UG bei den beiden zyklischen Maultierstuten ist über den gesamten Untersuchungszeitraum unabhängig von dem klinisch dokumentierten Zyklusstand und den gleichzeitig bestimmten Serumhormonkonzentrationen mit wenigen Ausnahmen nur dezent ausgeprägt (s. Tab , S ). An einzelnen Tagen werden höhere SSc-Werte bestimmt, wobei ohne erkennbares Muster sowohl das luminale Epithel als auch die oberflächlichen, mittleren oder tiefen Uterindrüsen eine intensivere Expression zei-

41 ERGEBNISSE 32 gen. Die endometriale Funktionsmorphologie korreliert nicht mit der ermittelten UG-Sekretion, und auch die Hormonwerte weisen keine Schwankungen im Vergleich zu den vorher bestimmten Konzentrationen auf. In der Endometrose, die bei beiden Tieren mittelgradig inaktiv und fokal destruierend ausgeprägt ist, wird das Protein mit teils gleicher, teils abweichender Intensität nachgewiesen. (s. Abb. 9.8, Anhang S. 130).

42 ERGEBNISSE 33 Tab. 4.1: Maultierstute 1 (13 Jahre), Zyklus 1: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UG unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase Endometriale Funktions-morphologie l.e. o.d. m.d. t.d. [ng/ml] [pg/ml] SSc UG P Ö 1 AÖs inakt ,0 6,8 5 IÖs inakt ,2 7,1 12 IÖs +(+) prolif. 0, ,025 0,050 2,0 9,5 17 IÖs +(+) prolif. 0,200 0,010 0,050 0,100 3,0 4,0 21 IÖs inakt ,010 0,010 0,87 1,6 26 IÖs uglm. inakt. 0,025 0,010 0, ,75 6,1 32 IÖs uglm. inakt. +(+) irreg. 0,200 0,050 0,050 0,010 0,60 5,1 37 IÖs + sekr. + 0,010 0, ,55 1,7 43 IÖs inakt. 0,010 0,025 0, ,60 1,9 46 IÖs inakt. 0,010 0,010 0, ,48 5,2 50 IÖs uglm. sekr. +(+) irreg. 0,250 0,050 0,025 0,025 0,66 2,6 54 IÖs inakt. 0,100 0, ,010 0,23 Ø 59 IÖs inakt. 0,300 0,100 0,100 0,050 0,54 5,7 64 IÖs inakt. 0,025 0,010 0, ,65 Ø 68 IÖs inakt. 0, ,025 0,025 0,54 < 1,0 75 IÖs inakt. +(+) irreg. 0,010 0,010 0, ,68 4,6 79 IÖs + sekr. + 0,010 0,010 0, ,64 5,3 84 IÖs + sekr. + 0,010 0,100 0,050 0,025 0,58 8,0 90 IÖs (+) sekr. +(+) irreg. 0,050 0, ,59 5,8 94 IÖs + sekr. 0,025 0,050 0,025 0,010 0,65 4,7 97 IÖs uglm. prolif. +(+) irreg. 0,010 0, ,66 2,0 103 IÖs + sekr. + 0,300 0, ,65 8,0 109 PräÖs + sekr. +(+) irreg. 0,010 0, ,40 6,8 112 Ös +(+) sekr. 0,500 2,200 0,200 0,100 0,59 11,0

43 ERGEBNISSE 34 Legende zu Tab. 4.1: AÖs = Anöstrus, IÖs = Interöstrus, PräÖs = Präöstrus, Ös = Östrus, inakt = inaktiv, uglm. = ungleichmäßig, irreg. = irregulär, prolif. = proliferativ, sekr. = sekretorisch, (+) = angedeutet, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++ = mittelgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, -- = keine Reaktion vorhanden, Ø = kein Wert verfügbar, P = Progesteron, Ö = Östradiol Tab. 4.2: Maultierstute 1 (13 Jahre), Zyklus 2: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UG unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase Endometriale Funktions- SSc UG P Ö morphologie l.e. o.d. m.d. t.d. [ng/ml] [pg/ml] 0 Ös + sekr. +(+) irreg. 0,200 0,150 0,050 0,025 2,0 Ø 2 PÖs +(+) sekr. ++(+) irreg. 0,200 2,200 0, ,7 7,0 9 IÖs +(+) sekr. 0,500 0,025 0,100 0,050 9,8 7,8 16 IÖs + prolif. 0,010 0,025 0,100 0,100 0,65 Ø 23 IÖs uglm. prolif. -- 0,050 0,200 0,250 0,66 3,0 31 IÖs uglm. prolif. (+) irreg. 0,200 0,100 0,050 0,050 0,78 4,0 34 IÖs uglm. prolif. (+) irreg. 1,700 0,300 0,350 0,350 0,63 6,1 36 IÖs inakt. 0,050 0,050 0,100 0,100 Ø Ø 38 IÖs uglm. prolif. 0,025 0,100 0,010 0,010 0,64 2,8 42 IÖs uglm. prolif. 0,400 0,300 0,050 0,050 0,74 7,0 52 IÖs uglm. prolif. 0,050 0,025 0, ,69 8,0 60 Ös + sekr. 0,025 0,500 0,010 0,010 0,42 9,7 Legende zu Tab. 4.2: IÖs = Interöstrus, Ös = Östrus, PÖs = Postöstrus, inakt. = inaktiv, prolif. = proliferativ, sekr. = sekretorisch, irreg. = irregulär, uglm. = ungleichmäßig, (+) = angedeutet, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++(+) = mittel- bis hochgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, -- = keine Reaktion vorhanden, Ø = kein Wert verfügbar, P = Progesteron, Ö = Östradiol

44 ERGEBNISSE 35 Tab. 4.3: Maultierstute 1 (13 Jahre), Zyklus 3: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UG unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase 1 PÖ 3 IÖ 7 IÖ 9 IÖ Endometriale Funktionsmorphologie +(+) sekr. + sekr. +(+) irreg. +(+) sekr. + +(+) sekr. SSc UG l.e. o.d. m.d. t.d. P [ng/ml] Ö [pg/ml] 0,050 0,200 0, ,2 9,5 0,400 0,400 0,200 0,100 1,7 9,3 0,100 0,050 0, ,35 15,0 0,800 0,050 0,100 0,100 6,5 9,6 + Legende zu Tab. 4.3: IÖs = Interöstrus, PÖs = Postöstrus, sekr. = sekretorisch, irreg. = irregulär, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++ = mittelgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, -- = keine Reaktion vorhanden, P = Progesteron, Ö = Östradiol Tab. 4.4: Maultierstute 2 (20 Jahre): Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UG unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase IÖs PräÖs IÖs Endometriale Funktions- SSc UG P Ö morphologie l.e. o.d. m.d. t.d. [ng/ml] [pg/ml] Zyklus 1 + prolif. -- 0,100 0,150 0,150 1,3 14,0 inakt. -- 0,025 0, ,86 4,9 + prolif. +(+) irreg. Zyklus 2 0,200 0,500 6,300 6,300 0,96 11,9 Zyklus prolif. PÖs -- 0,800 0,800 0,800 1,6 11, Legende zu Tab. 4.4: IÖs = Interöstrus, PräÖs = Präöstrus, PÖs = Postöstrus, inakt. = inaktiv, prolif. = proliferativ, irreg. = irregulär, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, -- = keine Reaktion vorhanden, P = Progesteron, Ö = Östradiol

45 ERGEBNISSE Azyklische Maultierstuten (n = 4) Innerhalb des untersuchten Zeitraums, der für Maultierstute 3-5 elf Untersuchungstermine und für Maultierstute 6 13 Untersuchungstermine umfasst, liegt UG bei allen vier Maultierstuten diffus verteilt in den uterinen Drüsenepithelien vor, vereinzelt ist positiv reagierendes Sekret in den Lumina nachweisbar (s. Abb. 9.9, Anhang S. 130). Die Reaktion innerhalb eines Drüsenquerschnitts und zwischen den Uterindrüsen eines Bioptats erfolgt deutlich ungleichmäßig. Am ersten Tag der Untersuchungen kann bei keinem Tier eine Sekretion von Uteroglobin beobachtet werden. Die Proteinsekretion in endometrotisch veränderten Drüsen unterscheidet sich teilweise von dem Sekretionsmuster des umliegenden Endometriums. Grad, Charakter und UG-Expression in der Endometrose für die azyklischen Maultierstuten sind in Tab. 4.5 dargestellt. Bei den vier azyklischen Maultierstuten wird über den gesamten Untersuchungszeitraum eine einheitlich niedrige Expressionsintensität von UG in den Epithelien des Uterus dokumentiert (s. Tab. 4.6, S. 37). Passend hierzu liegt klinisch eine Azyklie vor, die Serumhormonkonzentrationen bewegen sich auf konstant niedrigem Niveau (s. Tab. 3.2, Material und Methoden S. 26) und die Endometrien aller Tiere sind inaktiv differenziert. Auschließlich bei Maultierstute 5 erfolgt an Untersuchungstag 8 und 10 in den oberflächlichen Drüsen eine im Vergleich zu der vorher bestimmten und folgenden Sekretionsintensität eine gering- bis mittelgradig intensivere Expression von UG, wobei sich der klinische Zyklusstand der Azyklie nicht verändert, die Serumhormonkonzentrationen nach wie vor niedrige Werte aufweisen und das Endometrium unverändert inaktiv irregulär differenziert ist (s. Tab. 4.6, S. 37). Tab. 4.5: Ausprägung und Charakter der Endometrose bei den vier azyklischen Maultierstuten sowie Sekretion von UG in den betroffenen Drüsen Maultierstute Endometrose UG-Sekretion in der Endometrose (im Vergleich zum umliegenden Endometrium) 3 +, inaktiv, teils destruierend 4 (+), gemischt, teils destruierend 5 +, gemischt, teils destruierend 6 ++(+), gemischt, teils destruierend Legende zu Tab. 4.5: (+) = dezent, + = geringgradig, ++(+) = mittel- bis hochgradig, = gleich intensiv, = geringgradig intensiver, = deutlich intensiver

46 ERGEBNISSE 37 Tab. 4.6: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UG bei den vier azyklischen Maultierstuten US- Zeitpunkte SSc-Werte Maultierstute 3 l.e. o.d. m.d. t.d. SSc-Werte Maultierstute 4 l.e. o.d. m.d. t.d. SSc-Werte Maultierstute 5 l.e. o.d. m.d. t.d. SSc-Werte Maultierstute 6 l.e. o.d. m.d. t.d , , , , ,050 0, , ,050 0, ,010 0,010 0,010 4 * * * * -- 0, , ,010 0, , , ,050 0, , ,010 0, , ,050 0, ,050 0, ,050 0, , , ,010 0, , ,050 3, ,010 0,010 0, , , , , , , ,010 0,010 0, , , , ,010 0,010 0,010 0, Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø 0,010 0,025 0, Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø 0,025 0,100 0,100 0,025 Legende zu Tab. 4.6: US-Zeitpunkte = Untersuchungszeitpunkte, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, * = nicht auswertbar, zervixnahes Bioptat, -- = keine Reaktion, Ø = kein Bioptat entnommen

47 ERGEBNISSE Uterokalin Zyklische Maultierstuten (n = 2) Im Verlauf der Untersuchungen stellt sich UK bei beiden Tieren diffus verteilt im Zytoplasma der uterinen Epithelien dar, die Sekretion innerhalb eines Drüsenquerschnitts und zwischen den einzelnen Uterindrüsen erfolgt gleichmäßig und mit überwiegend angedeuteter Intensität (s. Abb. 9.10, Anhang S. 130). In allen untersuchten Bioptaten wird in den Drüsenlumina positiv reagierendes Sekret nachgewiesen. Das Protein wird bei den beiden zyklischen Maultierstuten über den gesamten Zeitraum der Untersuchungen mit äußerst geringgradiger Intensität in den uterinen Epithelien nachgewiesen (s. Tab , S ). Ein Zusammenhang zwischen dem klinischen Zyklusstand, den Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen oder der endometrialen Differenzierung kann bei keinem der Tiere beobachtet werden. Auch bei deutlich erhöhten Progesteronkonzentrationen erfolgt keine deutliche Steigerung der UK- Sekretion (s. Tab , S ). Insbesondere bei Maultierstute 2 bestehen deutliche Diskrepanzen zwischen dem klinisch dokumentierten Zyklusstand und den histologischen sowie endokrinologischen Ergebissen (s. Tab. 4.10, S. 41). Bei beiden Maultierstuten wird UK in endometrotisch veränderten Drüsenarealen überwiegend intensiver exprimiert als im umliegenden Endometrium.

48 ERGEBNISSE 39 Tab. 4.7: Maultierstute 1 (13 Jahre), Zyklus 1: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UK unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase Endometriale Funktionsmorphologie l.e. o.d. m.d. t.d. [ng/ml] [pg/ml] SSc UK P Ö 1 AÖs inakt. 0,200 0,150 0,200 0,200 1,0 6,8 5 IÖs inakt. + irregulär 0,400 0,200 0,200 0,250 1,2 7,1 12 IÖs +(+) prolif. 0,800 2,200 1,750 1,000 2,0 9,5 17 IÖs +(+) prolif. 0,100 0,100 0,150 0,200 3,0 4,0 21 IÖs inakt. 0,150 0,150 0,100 0,100 0,87 1,6 26 IÖs uglm. inakt. 0,200 0,200 0,200 0,200 0,75 6,1 32 IÖs uglm. inakt. +(+) irreg. 0,100 0,100 0,100 0,100 0,60 5,1 37 IÖs + sekr. + 0,100 0,100 0,100 0,100 0,55 1,7 43 IÖs inakt. 0,200 0,200 0,200 0,200 0,60 1,9 46 IÖs inakt. 0,150 0,100 0,150 0,200 0,48 5,2 50 IÖs uglm. sekr. +(+) irreg. 0,300 0,200 0,300 0,400 0,66 2,6 54 IÖs inakt. 0,050 0,050 0,050 0,050 0,23 Ø 59 IÖs inakt. 0,100 0,150 0,250 0,250 0,54 5,7 64 IÖs inakt. 0,100 0,100 0,100 0,100 0,65 Ø 68 IÖs inakt. 0,100 0,100 0,150 0,150 0,54 < 1,0 75 IÖs inakt. +(+) irreg. 0,150 0,100 0,100 0,15 0,68 4,6 79 IÖs + sekr. + 0,200 0,150 0,250 0,300 0,64 5,3 84 IÖs + sekr. + 0,100 0,200 0,200 0,200 0,58 8,0 90 IÖs (+) sekr. +(+) irreg. 0,300 0,200 0,300 0,350 0,59 5,8 94 IÖs + sekr. 0,200 0,100 0,250 0,300 0,65 4,7 97 IÖs uglm. prolif. +(+) irreg. 0,100 0,100 0,200 0,200 0,66 2,0 103 IÖs + sekr. + 0,300 0,300 0,400 0,400 0,65 8,0 109 PräÖs + sekr. +(+) irreg. 0,400 0,200 0,400 0,400 0,40 6,8 112 Ös +(+) sekr. 0,200 0,300 0,300 0,350 0,59 11,0

49 ERGEBNISSE 40 Legende zu Tab. 4.7: AÖs = Anöstrus, IÖs = Interöstrus, PräÖs = Präöstrus, Ös = Östrus, inakt. = inaktiv, irreg. = irregulär, uglm. = ungleichmäßig, prolif. = proliferativ, sekr. = sekretorisch, (+) = angedeutet, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++ = mittelgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, Ø = kein Wert verfügbar, P = Progesteron, Ö = Östradiol Tab. 4.8: Maultierstute 1 (13 Jahre), Zyklus 2: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UK unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase Endometriale Funktions- SSc UK P Ö morphologie l.e. o.d. m.d. t.d. [ng/ml] [pg/ml] 0 Ös + sekr. +(+) irreg. 0,100 0,100 0,200 0,200 2,0 Ø 2 PÖs +(+) sekr. ++(+) irreg. 0,200 0,300 0,500 0,500 5,7 7,0 9 IÖs +(+) sekr. 0,500 0,200 1,000 1,000 9,8 7,8 16 IÖs + prolif. 0,200 0,200 0,200 0,200 0,65 Ø 23 IÖs uglm. prolif. 0,200 0,200 0,300 0,300 0,66 3,0 31 IÖs uglm. prolif. (+) irreg. 0,100 0,150 0,150 0,200 0,78 4,0 34 IÖs uglm. prolif. (+) irreg. 0,400 0,300 0,400 0,500 0,63 6,1 36 IÖs inakt. 0,100 0,150 0,200 0,200 Ø Ø 38 IÖs uglm. prolif. 0,100 0,100 0,100 0,200 0,64 2,8 42 IÖs uglm. prolif. 0,100 0,100 0,150 0,200 0,74 7,0 52 IÖs uglm. prolif. 0,200 0,200 0,150 0,200 0,69 8,0 60 Ös + sekr. 0,100 0,100 0,150 0,150 0,42 9,7 Legende zu Tab. 4.8: IÖs = Interöstrus, Ös = Östrus, PÖs = Postöstrus, inakt. = inaktiv, prolif. = proliferativ, sekr. = sekretorisch, irreg. = irregulär, uglm. = ungleichmäßig, (+) = angedeutet, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++(+) = mittel- bis hochgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, Ø = kein Wert verfügbar, P = Progesteron, Ö = Östradiol

50 ERGEBNISSE 41 Tab. 4.9: Maultierstute 1 (13 Jahre), Zyklus 3: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UK unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase Endometriale Funktions- SSc UK P Ö morphologie l.e. o.d. m.d. t.d. [ng/ml] [pg/ml] 1 PÖ +(+) sekr. 0,100 0,100 0,200 0,200 1,2 9,5 3 IÖ + sekr. +(+) irreg. 0,300 0,150 0,200 0,200 1,7 9,3 7 IÖ +(+) sekr. + 0,400 0,700 0,400 0,300 0,35 15,0 9 IÖ +(+) sekr. + 0,400 0,200 0,300 0,400 6,5 9,6 Legende zu Tab. 4.9: IÖs = Interöstrus, PÖs = Postöstrus, sekr. = sekretorisch, irreg. = irregulär, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++ = mittelgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, P = Progesteron, Ö = Östradiol Tab. 4.10: Maultierstute 2 (20 Jahre): Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UK unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase IÖs PräÖs IÖs Endometriale Funktions- SSc UK P Ö morphologie l.e. o.d. m.d. t.d. [ng/ml] [pg/ml] Zyklus 1 + prolif. 0,250 0,100 0,200 0,200 1,3 14,0 inakt. 0,200 0,150 0,150 0,100 0,86 4,9 + prolif. +(+) irreg. Zyklus 2 0,200 0,200 0,400 0,400 0,96 11,9 Zyklus prolif PÖs ,050 0,050 0,050 0,050 1,6 11,8 Legende zu Tab. 4.10: IÖs = Interöstrus, PräÖs = Präöstrus, PÖs = Postöstrus, inakt. = inaktiv, prolif. = proliferativ, irreg. = irregulär, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, P = Progesteron, Ö = Östradiol Azyklische Maultierstuten (n = 4) An den elf (Maultierstute 3-5) bzw. dreizehn (Maultierstute 6) Untersuchungstagen wird in den Endometrien aller vier Tiere eine sehr dezent ausgeprägte Sekretion von UK nachgewiesen, die gleichmäßig innerhalb eines Drüsenquerschnitts und zwischen den Uterindrüsen auftritt (s. Abb. 9.11, Anhang S. 130). An zahlreichen Untersuchungstagen liegt positiv reagierendes Sekret in den Drüsenlumina vor. Die Sekretion von UK in den von einer Endometrose alterierten Drüsen im Vergleich zum unveränderten Endometrium ist in Tab (s. S. 42) sowie auf Abb. 9.12, (s. Anhang S. 130) dargestellt. Übereinstimmend mit der klinisch dokumentierten Azyklie, den konstant niedrigen Serumprogesteron- und - östradiolkonzentrationen sowie einem inaktiven Endometrium wird bei den vier azyklischen Maultierstuten

51 ERGEBNISSE 42 im Verlauf der Untersuchungen UK angedeutet intensiv in den uterinen Epithelien nachgewiesen (s. Tab. 4.12, S. 43). Tab. 4.11: Ausprägung und Charakter der Endometrose bei den vier azyklischen Maultierstuten sowie Sekretion von UK in den betroffenen Drüsen Maultierstute Endometrose UK-Sekretion in der Endometrose (im Vergleich zum umliegenden Endometrium) 3 +, inaktiv, teils destruierend und 4 (+), gemischt, teils destruierend 5 +, gemischt, teils destruierend 6 ++(+), gemischt, teils destruierend Legende zu Tab. 4.11: (+) = dezent, + = geringgradig, ++(+) = mittel- bis hochgradig, = gleich intensiv, = geringgradig intensiver, = deutlich intensiver

52 ERGEBNISSE 43 Tab. 4.12: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UK bei den vier azyklischen Maultierstuten US- Zeitpunkte SSc-Werte Maultierstute 3 l.e. o.d. m.d. t.d. SSc-Werte Maultierstute 4 l.e. o.d. m.d. t.d. SSc-Werte Maultierstute 5 l.e. o.d. m.d. t.d. SSc-Werte Maultierstute 6 l.e. o.d. m.d. t.d. 1 0,100 0,100 0,100 0,100 0,100 0,100 0,100 0,200 0,100 0,100 0,200 0,200 0,100 0,500 0,100 0, ,100 0,100 0,100 0,100 0,200 0,100 0,100 0,100 0,100 0,050 0,050 0,050 0,100 0,100 0,100 0, ,300 0,200 0,200 0,250 0,200 0,050 0,050 0,050 0,300 0,200 0,200 0,100 0,200 0,050 0,100 0,100 4 * * * * 0,500 0,300 0,300 0,300 0,200 0,100 0,100 0,100 0,200 0,050 0,100 0, ,050 0,050 0,050 0,050 0,100 0,100 0,100 0,200 0,200 0,100 0,200 0,100 0,200 0,150 0,200 0, ,100 0,250 0,300 0,300 0,300 0,200 0,200 0,300 0,200 0,200 0,200 0,250 0,300 0,250 0,250 0, ,200 0,100 0,200 0,200 0,400 0,300 0,300 0,300 0,200 0,100 0,100 0,100 0,100 0,050 0,050 0, ,200 0,100 0,100 0,100 0,400 0,300 0,300 0,300 0,200 0,100 0,200 0,250 0,100 0,100 0,200 0, ,200 0,200 0,200 0,200 0,050 0,050 0,050 0,050 0,200 0,100 0,100 0,150 0,500 0,300 0,300 0, ,400 0,100 0,100 0,200 0,150 0,100 0,100 0,100 0,500 0,200 0,300 0,300 0,100 0,100 0,250 0, ,200 1,100 0,100 0,100 0,400 0,100 0,200 0,300 0,300 0,100 0,200 0,200 0,200 0,150 0,300 0, Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø 0,100 0,100 0,150 0, Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø 0,500 0,300 0,350 0,400 Legende zu Tab. 4.12: US-Zeitpunkte = Untersuchungszeitpunkte, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, * = nicht auswertbar, zervixnahes Bioptat, -- = keine Reaktion, Ø = kein Bioptat entnommen

53 ERGEBNISSE Uteroferrin Zyklische Maultierstuten (n = 2) Im Endometrium von Maultierstute 1 wird während der Untersuchungen eine geringgradig variable Sekretion von UF beobachtet, der Nachweis bei Maultierstute 2 erfolgt mit angedeuteter, teils mit geringgradiger Intensität. UF liegt innerhalb einer Drüse gleichmäßig diffus verteilt im Zytoplasma der Epithelzellen vor (s. Abb. 9.13, Anhang S. 132). Zwischen den Uterindrüsen erfolgt die Sekretion ungleichmäßig, und an einzelnen Untersuchungstagen wird in den Drüsenlumina positiv reagierendes Sekret be-obachtet. An vereinzelten Untersuchungstagen wird bei beiden Tieren - unabhängig vom klinischen Zyklusstand, der endometrialen Differenzierung und den Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen - eine teilweise mittelgradig gesteigerte Proteinsynthese dokumentiert (s. Tab , S ). Hierbei reagieren die Uterindrüsen nicht gleichmäßig, sondern der verstärkte Nachweis erfolgt unregelmäßig im luminalen Epithel, den oberflächlichen, mittleren oder tiefen Uterindrüsen. In der Endometrose erfolgt die UF-Sekretion teilweise mit gesteigerter, verminderter oder gleicher Intensität im Vergleich zum restlichen Endometrium (s. Abb. 9.14, Anhang S. 132).

54 ERGEBNISSE 45 Tab. 4.13: Maultierstute 1 (13 Jahre), Zyklus 1: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UF unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase Endometriale Funktionsmorphologie l.e. o.d. m.d. t.d. [ng/ml] [pg/ml] SSc UF P Ö 1 AÖs inakt. 0,100 0,100 0,050 0,050 1,0 6,8 5 IÖs inakt. + irregulär 0,050 0,050 0,050 0,050 1,2 7,1 12 IÖs +(+) prolif. 0,200 1,000 0,100 0,050 2,0 9,5 17 IÖs +(+) prolif. 1,000 0,800 0,400 0,200 3,0 4,0 21 IÖs inakt. 0,050 0,100 0,050 0,050 0,87 1,6 26 IÖs uglm. inakt. 0,010 0,010 0,010 0,010 0,75 6,1 32 IÖs uglm. inakt. +(+) irreg. 0,025 0,025 0,025 0,025 0,60 5,1 37 IÖs + sekr. + 0,050 0,700 0,150 0,050 0,55 1,7 43 IÖs inakt. 0,200 1,000 0,200 0,100 0,60 1,9 46 IÖs inakt. 0,100 0,600 0,200 0,100 0,48 5,2 50 IÖs uglm. sekr. +(+) irreg. 0,100 0,600 0,300 0,100 0,66 2,6 54 IÖs inakt. 0,200 0,200 0,100 0,100 0,23 Ø 59 IÖs inakt. 1,300 0,500 0,400 0,300 0,54 5,7 64 IÖs inakt. 0,050 0,150 0,100 0,050 0,65 Ø 68 IÖs inakt. 0,050 0,050 0,025 0,025 0,54 < 1,0 75 IÖs inakt. +(+) irreg. 0,025 0,050 0,025 0,025 0,68 4,6 79 IÖs + sekr. + 0,500 1,500 0,100 0,050 0,64 5,3 84 IÖs + sekr. + 0,100 2,000 0,100 0,050 0,58 8,0 90 IÖs (+) sekr. +(+) irreg. 0,050 0,100 0,050 0,050 0,59 5,8 94 IÖs + sekr. 2,100 2,000 0,100 0,100 0,65 4,7 97 IÖs uglm. prolif. +(+) irreg. 0,300 1,000 0,100 0,100 0,66 2,0 103 IÖs + sekr. + 0,010 0,010 0,010 0,010 0,65 8,0 109 PräÖs + sekr. +(+) irreg. 0,025 0,050 0,050 0,050 0,40 6,8 112 Ös +(+) sekr. 0,025 0,500 0,200 0,200 0,59 11,0

55 ERGEBNISSE 46 Legende zu Tab. 4.13: AÖs = Anöstrus, IÖs = Interöstrus, PräÖs = Präöstrus, Ös = Östrus, inakt. = in-aktiv, irreg. = irregulär, uglm. = ungleichmäßig, prolif. = proliferativ, sekr. = sekretorisch, (+) = angedeutet, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++ = mittelgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, Ø = kein Wert verfügbar, P = Progesteron, Ö = Östradiol Tab. 4.14: Maultierstute 1 (13 Jahre), Zyklus 2: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UF unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase Endometriale Funktions- SSc UF P Ö morphologie l.e. o.d. m.d. t.d. [ng/ml] [pg/ml] 0 Ös + sekr. +(+) irreg. 0,025 0,100 0,025 0,010 2,0 Ø 2 PÖs +(+) sekr. ++(+) irreg. 0,050 0,600 0,050 0,050 5,7 7,0 9 IÖs +(+) sekr. -- 0, ,8 7,8 16 IÖs + prolif. 3,000 2,000 1,000 1,000 0,65 Ø 23 IÖs uglm. prolif. 0,050 0,100 0,050 0,050 0,66 3,0 31 IÖs uglm. prolif. (+) irreg. 0,050 0,100 0,100 0,050 0,78 4,0 34 IÖs uglm. prolif. (+) irreg. 0,300 4,200 0,100 0,100 0,63 6,1 36 IÖs inakt. 0,050 0,150 0,025 0,025 Ø Ø 38 IÖs uglm. prolif. 0,010 0,150 0,025 0,025 0,64 2,8 42 IÖs uglm. prolif. 0,010 0,050 0,025 0,010 0,74 7,0 52 IÖs uglm. prolif. 0,200 1,000 0,100 0,050 0,69 8,0 60 Ös + sekr. 0,050 0,100 0,050 0,050 0,42 9,7 Legende zu Tab. 4.14: IÖs = Interöstrus, Ös = Östrus, PÖs = Postöstrus, inakt. = inaktiv, prolif. = proliferativ, sekr. = sekretorisch, irreg. = irregulär, uglm. = ungleichmäßig, (+) = angedeutet, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++(+) = mittel- bis hochgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, -- = keine Reaktion vorhanden, Ø = kein Wert verfügbar, P = Progesteron, Ö = Östradiol

56 ERGEBNISSE 47 Tab. 4.15: Maultierstute 1 (13 Jahre), Zyklus 3: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UF unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase Endometriale Funktions- SSc UF P Ö morphologie l.e. o.d. m.d. t.d. [ng/ml] [pg/ml] 1 PÖ +(+) sekr. 3,000 6,400 1,000 0,500 1,2 9,5 3 IÖ + sekr. +(+) irreg. 0,200 4,400 0,300 0,200 1,7 9,3 7 IÖ +(+) sekr. + 0,100 0,100 0,025 0,025 0,35 15,0 9 IÖ +(+) sekr. + 0,100 0,025 0,025 0,025 6,5 9,6 Legende zu Tab. 4.15: IÖs = Interöstrus, PÖs = Postöstrus, sekr. = sekretorisch, irreg. = irregulär, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++ = mittelgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, P = Progesteron, Ö = Östradiol Tab. 4.16: Maultierstute 2 (20 Jahre): Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UF unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase IÖs PräÖs IÖs Endometriale Funktions- SSc UF P Ö morphologie l.e. o.d. m.d. t.d. [ng/ml] [pg/ml] Zyklus 1 + prolif. 0,200 0,300 0,300 0,200 1,3 14,0 inakt. -- 0,010 0,010 0,010 0,86 4,9 + prolif. +(+) irreg. Zyklus 2 0,300 1,000 1,500 0,500 0,96 11,9 Zyklus prolif PÖs ,200 1,000 1,100 1,100 1,6 11,8 Legende zu Tab. 4.16: IÖs = Interöstrus, PräÖs = Präöstrus, PÖs = Postöstrus, inakt. = inaktiv, prolif. = proliferativ, irreg. = irregulär, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, -- = keine Reaktion vorhanden, P = Progesteron, Ö = Östradiol Azyklische Maultierstuten (n = 4) Im Verlauf der Untersuchungen wird bei allen azyklischen Tieren eine überwiegend angedeutete Synthese von UF festgestellt. Innerhalb eines Drüsenquerschnitts dominiert eine gleichmäßige Proteinsynthese, bei der UF diffus verteilt in den Drüsenepithelzellen vorliegt, während die Expressionsintensität zwischen den Uterindrüsen teilweise deutlich differiert (s. Abb. 9.15, Anhang S. 132). In den Drüsenlumina wird kein Sekret beobachtet. Das Sekretionsmuster in der Endometrose weicht teilweise von jenem der unveränderten Uterindrüsen ab. Die entsprechenden Befunde bei Maultierstute 3-6 sind in Tab dargestellt.

57 ERGEBNISSE 48 Übereinstimmend mit der klinisch-gynäkologisch festgestellten Azyklie, den relativ niedrigen Serumhormonkonzentrationen und den inaktiv differenzierten Endometrien wird im Verlauf der Untersuchungen bei allen vier Tieren eine überwiegend angedeutete Sekretion von UF nachgewiesen (s. Tab. 4.18, S. 49). An einzelnen Tagen liegt eine dezent gesteigerte Proteinexpression vor, wobei keine Variationen der endometrialen Funktionsmorphologie, der endokrinologischen Werte oder des klinischen Zyklusstandes dokumentiert werden können. Tab. 4.17: Ausprägung und Charakter der Endometrose bei den vier azyklischen Maultierstuten sowie Sekretion von UF in den betroffenen Drüsen Maultierstute Endometrose UF-Sekretion in der Endometrose (im Vergleich zum umliegenden Endometrium) 3 +, inaktiv, teils destruierend, vereinzelt auch oder 4 (+), gemischt, teils destruierend 5 +, gemischt, teils destruierend, vereinzelt auch 6 ++(+), gemischt, teils destruierend, vereinzelt auch oder Legende zu Tab. 4.17: (+) = dezent, + = geringgradig, ++(+) = mittel- bis hochgradig, = gleich intensiv, = geringgradig intensiver, = geringgradig vermindert

58 ERGEBNISSE 49 Tab. 4.18: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von UF bei den vier azyklischen Maultierstuten US- Zeitpunkte SSc-Werte Maultierstute 3 l.e. o.d. m.d. t.d. SSc-Werte Maultierstute 4 l.e. o.d. m.d. t.d. SSc-Werte Maultierstute 5 l.e. o.d. m.d. t.d. SSc-Werte Maultierstute 6 l.e. o.d. m.d. t.d. 1 0,050 0,050 0,050 0,025 0,050 0,100 0,050 0,050 0,200 1,00 0,500 1,300 0,050 0,050 0,050 0, ,010 0,050 0,050 0,050 0,010 0,150 0,010 0,010 0,050 0,050 0,025 0,025 0,025 0,010 0,010 0, ,010 0,010 0,010 0,010 0,050 0,200 0,100 0,050 0,010 0, ,100 0,050 0,050 0,050 4 * * * * 0,100 0,100 0,050 0,050 0,400 0,200 0,100 0,150 0,025 0,025 0,025 0, ,010 0,100 0,050 0,025 0,050 0,600 0,600 0,600 0,050 0,100 0,050 0,050 0,010 0,050 0,025 0, ,050 0,100 0,250 0,010 0,100 0,200 0,150 0,150 0,025 0,200 0,200 0,100 0,500 0,100 0,100 0, ,050 0,300 0,050 0,025 0,025 0,050 0,050 0,050 0,050 0,150 0,050 0,050 0,250 0,025 0,025 0, ,010 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,400 1,000 0,100 0,100 0,250 0,100 0,050 0, ,025 0,100 0,050 0, ,010 0,010 0,010 0,025 0,050 0,025 0,025 0,025 0,050 0,050 0, ,025 0,050 0,025 0,025 0,100 0,025 0,025 0,050 0,010 0,010 0,010 0,010 0,050 0,050 0,025 0, ,010 0,010 0,010 0,010 0,025 0,100 0,100 0,050 0,010 0,100 0,025 0,010 0,300 1,800 0,500 0, Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø 0,050 0,100 0,025 0, Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø 0,050 0,100 0,025 0,025 Legende zu Tab. 4.18: US-Zeitpunkte = Untersuchungszeitpunkte, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, * = nicht auswertbar, zervixnahes Bioptat, -- = keine Reaktion, Ø = kein Bioptat entnommen

59 ERGEBNISSE Calbindin Zyklische Maultierstuten (n = 2) Die Expression von CAL erfolgt innerhalb des untersuchten Zeitraums bei beiden Maultierstuten mit deutlich variabler Intensität. Das Protein wird sowohl diffus intrazytoplasmatisch als auch intranukleär in den Zellen des luminalen Epithels und der Uterindrüsen nachgewiesen. Hierbei wird innerhalb einer Drüse sowie in der Gesamtheit der Drüsen eines Bioptats eine ungleichmäßige Expression dokumentiert, wobei ein mosaikartiges Reaktionsmuster in den Drüsenquerschnitten auffällt (s. Abb. 9.16, Anhang S. 132). An zahlreichen Untersuchungstagen befindet sich positiv reagierendes Sekret in den Drüsenlumina. Bei Maultierstute 1 werden teils angedeutete und teils maximale SSc-Werte bestimmt (s. Tab , S ). Von den Untersuchungsterminen mit deutlich gesteigerter CAL-Sekretion im Endometrium von Maultierstute 1 kann ausschließlich an Zyklustag 2, Zyklus 2 eine parallel deutlich erhöhte Serumprogesteronkonzentration gemessen werden (s. Tab. 4.20, S. 52). Andererseits werden an mehreren Untersuchungstagen erhöhte Progesteronkonzentrationen bestimmt (s. Tab und Tab. 4.21, S. 52 und 53), ohne dass eine Steigerung der Proteinsekretion nachweisbar wäre, sodass eine eindeutig Progesteron-abhängige Regulation nicht abgeleitet werden kann. Im Endometrium von Maultierstute 2 liegt eine in erster Linie angedeutete sowie vereinzelt geringgradige Expression von CAL vor (s. Tab. 4.22, S. 53). Insgesamt kann bei keinem Tier ein Zusammenhang zwischen der klinischen Zyklusphase, den Serumhormonkonzentrationen, der endometrialen Funktionsmorphologie und der Expression von CAL ermittelt werden. Bei beiden Maultierstuten ist in den endometrotischen Drüsenarealen die CAL-Expression gegenüber dem umliegenden Endometrium überwiegend vermindert (s. Abb. 9.17, Anhang S. 132).

60 ERGEBNISSE 51 Tab. 4.19: Maultierstute 1 (13 Jahre), Zyklus 1: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von CAL unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase Endometriale Funktionsmorphologie SSc CAL l.e. o.d. m.d. t.d. P [ng/ml] Ö [pg/ml] 1 AÖs inakt. -- 1,000 3,100 1,000 1,0 6,8 5 IÖs inakt. + irregulär 1, ,000 1,200 1,2 7,1 12 IÖs +(+) prolif. 0,100 1,000 6,000 4,800 2,0 9,5 17 IÖs +(+) prolif. -- 1,000 4,500 4,000 3,0 4,0 21 IÖs inakt. -- 0,550 3,500 2,800 0,87 1,6 26 IÖs uglm. inakt. 1,500 1,450 3,700 1,800 0,75 6,1 32 IÖs uglm. inakt. +(+) irreg. 1,500 1,500 2,300 1,800 0,60 5,1 37 IÖs + sekr ,500 0,500 0,950 0,55 1,7 43 IÖs inakt. 0, ,850 3,900 0,60 1,9 46 IÖs inakt. 0, ,500 1,500 0,48 5,2 50 IÖs uglm. sekr. +(+) irreg. 1,800 1,000 5,000 4,300 0,66 2,6 54 IÖs inakt. 0,050 0,500 2,800 2,300 0,23 Ø 59 IÖs inakt. 0,500 1,500 4,400 4,400 0,54 5,7 64 IÖs inakt. 0,100 1,850 2,200 3,100 0,65 Ø 68 IÖs inakt. 0,050 1,000 5,400 6,300 0,54 < 1,0 75 IÖs inakt. +(+) irreg. 0, ,000 2,600 0,68 4,6 79 IÖs + sekr. + 0,100 0,100 2,800 2,800 0,64 5,3 84 IÖs + sekr ,100 2,100 1,400 0,58 8,0 90 IÖs (+) sekr. +(+) irreg. 0,100 2,100 1,800 0,050 0,59 5,8 94 IÖs + sekr. -- 0,050 1,200 1,000 0,65 4,7 97 IÖs uglm. prolif. +(+) irreg. 0,050 1,000 2,000 1,000 0,66 2,0 103 IÖs + sekr. + 0,100 0,500 1,800 1,500 0,65 8,0 109 PräÖs + sekr. +(+) irreg. 0,050 0,100 2,200 1,400 0,40 6,8 112 Ös +(+) sekr. 0,200 2,100 7,500 6,700 0,59 11,0

61 ERGEBNISSE 52 Legende zu Tab. 4.19: AÖs = Anöstrus, IÖs = Interöstrus, PräÖs = Präöstrus, Ös = Östrus, inakt. = inaktiv, irreg. = irregulär, uglm. = ungleichmäßig, prolif. = proliferativ, sekr. = sekretorisch, (+) = angedeutet, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++ = mittelgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, -- = keine Reaktion vorhanden, Ø = kein Wert verfügbar, P = Progesteron, Ö = Östradiol Tab. 4.20: Maultierstute 1 (13 Jahre), Zyklus 2: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von CAL unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase Endometriale Funktions- SSc CAL P Ö morphologie l.e. o.d. m.d. t.d. [ng/ml] [pg/ml] 0 Ös + sekr. +(+) irreg. -- 3,600 6,000 4,300 2,0 Ø 2 PÖs +(+) sekr. ++(+) irreg. 0,500 5,000 9,500 9,500 5,7 7,0 9 IÖs +(+) sekr. 0,500 0,950 4,400 3,500 9,8 7,8 16 IÖs + prolif. 1,600 2,100 4,650 3,250 0,65 Ø 23 IÖs uglm. prolif. -- 0,500 3,100 2,700 0,66 3,0 31 IÖs uglm. prolif. (+) irreg. 0,100 1,400 4,000 3,800 0,78 4,0 34 IÖs uglm. prolif. (+) irreg. 0,100 1,200 3,100 2,700 0,63 6,1 36 IÖs inakt. 0,400 1,400 3,100 2,600 Ø Ø 38 IÖs uglm. prolif. -- 0,500 0,800 0,800 0,64 2,8 42 IÖs uglm. prolif. 0,050 0,950 1,800 1,800 0,74 7,0 52 IÖs uglm. prolif. 0,050 0,100 1,800 2,200 0,69 8,0 60 Ös + sekr. 0,800 0,500 1,000 1,000 0,42 9,7 Legende zu Tab. 4.20: IÖs = Interöstrus, Ös = Östrus, PÖs = Postöstrus, inakt. = inaktiv, prolif. = proliferativ, sekr. = sekretorisch, irreg. = irregulär, uglm. = ungleichmäßig, (+) = angedeutet, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++(+) = mittel- bis hochgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, -- = keine Reaktion vorhanden, Ø = kein Wert verfügbar, P = Progesteron, Ö = Östradiol

62 ERGEBNISSE 53 Tab. 4.21: Maultierstute 1 (13 Jahre), Zyklus 3: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von CAL unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase Endometriale Funktions- SSc CAL P Ö morphologie l.e. o.d. m.d. t.d. [ng/ml] [pg/ml] 1 PÖ +(+) sekr. -- 4,400 6,100 4,700 1,2 9,5 3 IÖ + sekr. +(+) irreg. -- 1,000 3,300 2,200 1,7 9,3 7 IÖ +(+) sekr. + 0,8 1,400 6,400 4,400 0,35 15,0 9 IÖ +(+) sekr. + 0,05 1,300 2,700 2,150 6,5 9,6 Legende zu Tab. 4.21: IÖs = Interöstrus, PÖs = Postöstrus, sekr. = sekretorisch, irreg. = irregulär, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++ = mittelgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, -- = keine Reaktion vorhanden, P = Progesteron, Ö = Östradiol Tab. 4.22: Maultierstute 2 (20 Jahre): Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von CAL unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Zyklustag Zyklusphase IÖs PräÖs IÖs Endometriale Funktions- SSc CAL P Ö morphologie l.e. o.d. m.d. t.d. [ng/ml] [pg/ml] Zyklus 1 + prolif. 0,200 0,600 1,000 1,500 1,3 14,0 inakt. 0, ,200 1,200 0,86 4,9 + prolif. +(+) irreg. Zyklus 2 0,100 0,200 1,600 1,400 0,96 11,9 Zyklus prolif PÖs ,500 0,500 1,6 11, Legende zu Tab. 4.22: IÖs = Interöstrus, PräÖs = Präöstrus, PÖs = Postöstrus, inakt. = inaktiv, prolif. = proliferativ, irreg. = irregulär, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, -- = keine Reaktion vorhanden, P = Progesteron, Ö = Östradiol Azyklische Maultierstuten (n = 4) Die Expression von CAL erfolgt während des gesamten Untersuchungszeitraums bei allen vier Tieren sowohl intrazytoplasmatisch als auch intranukleär sowie deutlich ungleichmäßig innerhalb eines Drüsenquerschnitts und zwischen den Uterindrüsen, wodurch, wie auch bei den zyklischen Maultierstuten, ein mosaikartiges Sekretionsmuster entsteht (s. Abb. 9.18, Anhang S. 132). Das Endometrium der vier azyklischen Maultierstuten ist an allen Untersuchungstagen inaktiv irregulär differenziert, und die Serumprogesteronund -östradiolkonzentrationen liegen konstant auf relativ niedrigem Niveau.

63 ERGEBNISSE 54 In der Endometrose ist die Sekretion von CAL bei allen vier azyklischen Maultierstuten überwiegend vermindert, in einigen endometrotischen Drüsen erfolgt sie gleich intensiv wie im umliegenden Endometrium (s. Tab. 4.23). CAL wird in den Endometrien der vier azyklischen Maultierstuten insgesamt mit schwacher Intensität exprimiert (s. Tab. 4.24, S. 55). Die Nachweisintensität schwankt zwischen angedeuteten und geringgradigen Werten; bei Maultierstute 6 wird am 5. Untersuchungstag eine gering- bis mittelgradig intensive Sekretion in den mittleren Uterindrüsen bestimmt, ohne dass eine Veränderung der endometrialen Differenzierung oder der Serumhormonkonzentrationen vorliegt (s. Tab. 4.24, S. 55). Tab. 4.23: Ausprägung und Charakter der Endometrose bei den vier azyklischen Maultierstuten sowie Sekretion von UF in den betroffenen Drüsen Maultierstute Endometrose UF-Sekretion in der Endometrose (im Vergleich zum umliegenden Endometrium) 3 +, inaktiv, teils destruierend 4 (+), gemischt, teils destruierend, vereinzelt auch 5 +, gemischt, teils destruierend, vereinzelt auch 6 ++(+), gemischt, teils destruierend Legende zu Tab. 4.23: (+) = dezent, + = geringgradig, ++(+) = mittel- bis hochgradig, = gleich intensiv, = geringgradig vermindert

64 ERGEBNISSE 55 Tab. 4.24: Immunhistologische Ergebnisse zur Sekretion von CAL bei den vier azyklischen Maultierstuten US- Zeitpunkte SSc-Werte Maultierstute 3 l.e. o.d. m.d. t.d. SSc-Werte Maultierstute 4 l.e. o.d. m.d. t.d. SSc-Werte Maultierstute 5 l.e. o.d. m.d. t.d. SSc-Werte Maultierstute 6 l.e. o.d. m.d. t.d ,200 0,300 0, , ,300 0, ,000 2,200 2, ,550 0,500 0,300 0, , ,600 0, ,500 0, ,250 0, ,000 1,000 4 * * * * 0, , , ,100 0, ,200 1, ,500 0,100 0,500 0,500 2,500 2, ,300 0,400 0,400 0,500 0, ,800 0, ,000 0,550 1,000 0, ,300 0,050 0,100 1,450 1,400 0,100 0,500 1,850 1, ,150 0,500 0,500 0,500 0,400 0,400 0,500 0,500 0,300 0,100 0, ,250 1, ,00 1,000 0, ,350 1,000 0,400 0,300 0,300 0,800 1,750 1,750 1, , ,400 0,600 0,600 0,200 0,400 0, ,500 0, ,550 2,850 0, , ,550 0,600 0, ,400 1,950 1, ,150 0,200 0, , ,500 0, ,400 0, Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø ,550 0, Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø 0,050 0,200 1,400 1,400 Legende zu Tab. 4.24: US-Zeitpunkte = Untersuchungszeitpunkte, SSc = Sekretions-Score, l.e. = luminales Epithel, o.d. = oberflächliche Drüsen, m.d. = mittlere Drüsen, t.d. = tiefe Drüsen, * = nicht auswertbar, zervixnahes Bioptat, -- = keine Reaktion, Ø = kein Bioptat entnommen

65 ERGEBNISSE Zusammenfassung der immunhistologischen Ergebnisse bei allen Maultierstuten unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Parameter sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Sowohl bei den beiden zyklischen als auch bei den vier azyklischen Maultierstuten wird die uterine Sekretion von UK, UG und UF im gesamten Untersuchungszeitraum mit überwiegend angedeuteter bis geringgradiger Intensität nachgewiesen. Die Synthese von UG erfolgt sowohl innerhalb eines Drüsenquerschnitts als auch zwischen den Uterindrüsen deutlich ungleichmäßig. UK wird in allen Epithelien des Endometriums gleich intensiv exprimiert, während UF von Epithelzellen einer Drüse gleichmäßig, bezogen auf die Gesamtheit der Uterindrüsen aber uneinheitlich nachweisbar ist. Die Sekretion von CAL wird bei den beiden zyklischen Maultierstuten mit deutlich variabler Intensität, bei den vier azyklischen Maultieren mit überwiegend angedeuteter bis geringgradiger Intensität beobachtet. Bei allen Tieren ist die Sekretion innerhalb einer Drüse hochgradig ungleichmäßig, wodurch ein mosaikartiges Bild entsteht. Auch zwischen den Uterindrüsen erfolgt die Sekretion uneinheitlich. Bei den zyklischen Maultierstuten korreliert die Sekretion der untersuchten endometrialen Proteine insgesamt nicht mit den parallel bestimmten Serumprogesteron- oder östradiolkonzentrationen. Darüber hinaus entsprechen die gleichzeitig bestimmten Serumhormonkonzentrationen nicht der klinischen Zyklusphase. Die bei den azyklischen Maultierstuten dokumentierte, überwiegend schwache Proteinsekretion stimmt mit dem klinischen Zyklusstand, den inaktiven, irregulär differenzierten Endometrien und den relativ niedrigen Serumhormonkonzentrationen überein. 4.2 Regumate -Applikation bei zwei Maultierstuten der azyklischen Gruppe Nach einer Untersuchungsperiode von 121 Tagen erhielten aus der Gruppe der azyklischen Tiere Maultierstute 4 und Maultierstute 5 über 50 Tage eine tägliche orale Dosis Altrenogest (Regumate Equine, Fa. Intervet, 0,044 mg/kg KM). Die beiden Tiere wurden in diesem Zeitraum an den Behandlungstagen 1, 4, 8, 15, 22, 29, 37, 44 und 50 bioptiert, klinisch-gynäkologisch untersucht und parallel die Serumprogesteronund -östradiolkonzentration bestimmt. Post applicationem wurden beide Maultierstuten an den Tagen 8, 14, 21, 27 ebenfalls in dieser Weise untersucht und beprobt, sowie zwei Jahre nach Beendigung der Studie erneut einmalig bioptiert (s. Material und Methoden S. 27) Klinisch-gynäkologische und endokrinologische Befunde vor, unter und nach der Regumate -Applikation Sowohl vor, während als auch nach der Progestagen-Langzeitapplikation konnten im Rahmen der begleitenden klinisch-gynäkologischen Untersuchungen weder eine Rossesymptomatik noch eine ovarielle Aktivität dokumentiert werden. Bei beiden Maultierstuten wurden niedrige Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen bestimmt, die über den gesamten Untersuchungszeitraum nur sehr geringgradigen Schwankungen unterlagen (s. Tab. 4.25, S. 57).

66 ERGEBNISSE 57 Tab. 4.25: Serumhormonkonzentrationen der zwei azyklischen Maultierstuten vor, unter und nach der Regumate -Applikation Vor Regumate - Applikation (121 Tage) Unter Regumate - Applikation (50 Tage) Nach Regumate - Applikation (27 Tage, 2 Jahre) Maultierstute 4 Progesteron Östradiol [ng/ml] [pg/ml] Maultierstute 5 Progesteron Östradiol [ng/ml] [pg/ml] 0,63-1,1 10,8-14,5 0,59-0,85 7,8-13,7 0,62-0,97 11,1-14,4 0,50-0,67 8,2-12,9 0,80-0,95 10,6-14,1 0,64-0,79 11,0-13, Histologie des Endometriums vor, unter und nach der Regumate -Applikation Histologische Befunde vor der Regumate -Applikation Beide Stuten zeigen vor der Behandlung ein inaktives, geringgradig irregulär differenziertes Endometrium (s. Abb. 9.19, Anhang S. 134), in dem einzelne Drüsen durch eine geringgradig ausgeprägte Endometrose verändert sind (s. Kap ). Eine Übersicht über die wichtigsten histomorphologischen Befunde hinsichtlich der endometrialen Funktionsmorphologie vor, unter und nach der Regumate -Applikation liefert Tab (s. S. 58) Histologische Befunde unter der Regumate -Applikation Die zu Beginn der Progestagen-Langzeitapplikation geringgradig irregulär inaktiv differenzierten Endometrien der beiden azyklischen Maultierstuten entwickeln unter der Behandlung eine überdeutliche sekretorische Akivität mit hochgradiger Irregularität im Bereich der glandulären Epithelien (s. Abb. 9.20, Anhang, S. 134). Gegen Ende der Progestagen-Langzeitapplikation tritt neben der irregulär und ungleichmäßig sekretorischen endometrialen Differenzierung bei beiden Tieren auch ein irregulär und ungleichmäßig proliferativer endometrialer Funktionszustand auf. Die Drüsendichte steigert sich im Verlauf der Medikation und nimmt gegen Ende der Behandlung wieder ab, bis sie - wie zu Beginn der Regumate -Applikation- wieder geringgradig ausgeprägt ist. Das Stroma ist bis auf die ersten beiden Untersuchungstage aktiv differenziert und überwiegend unterschiedlich stark ödematisiert. Die Endometrose zeigt im Verlauf der Untersuchungen bei keiner der beiden Maultierstuten auffällige Abweichungen in Grad oder Charakter. Bei Maultierstute 5 tritt ausschließlich an Tag 4 der Regumate - Applikation eine geringgradige oberflächliche eitrige, teils erosive Endometritis auf, im weiteren Verlauf der Studie werden dagegen keine entzündlichen Infiltrate mehr beobachtet. Eine detaillierte Übersicht über die histomorphologischen Befunde an den Tagen 1, 4, 8, 15, 22, 29, 37, 44 und 50 der Regumate -Applikation geben die Tabellen 4.27 und 4.28 (s. S. 59 und 60). Aufgrund ähnlicher Ergebnisse an verschiedenen Untersuchungstagen werden die Befunde zusammengefasst dargestellt und abweichende Resultate zusätzlich aufgeführt.

67 ERGEBNISSE 58 Tab. 4.26: Dominierende histomorphologische Charakteristika der endometrialen Differenzierung bei den azyklischen Maultierstuten (n = 2) vor, unter und nach Progestagen-Langzeitapplikation Vor Regumate - Applikation (über 121 Tage) Unter Regumate - Applikation (über 50 Tage) Nach Regumate -Applikation (über 27 Tage und nach 2 Jahren) Maultierstute 4 und 5 Maultierstute 4 und 5 Maultierstute 4 Maultierstute 5 lum. Epith. Glanduläres Epithel Drüsenkonfiguration Stroma Funktionszustand einreihig, isoprismatisch, ggr. irregulär isoprismatisch, ggr. irregulär, wenig Zytoplasma, kleine, hyperchromatische Zellkerne kleine Lumina, Drüsen teils gestreckt, teils leicht geschlängelt teils inaktiv mit kleinen, hyperchromatischen, spindelförmigen Kernen, teils aktiv mit großen, hypochromatischen, rundovalen Kernen; ggr. Ödem irregulär inaktiv ein- bis zweireihig, i- soprismatisch, ggr. irregulär zuerst isoprismatisch und ggr. irregulär mit kleinen, hyperchroma-tischen Kernen; später hochprismatisch mit hgr. polymorphen Kernen, hgr. Sekret-vakuolen im Zytoplasma, Auftreten zahlreicher sogenannter Stiftchenzellen zuerst kleine Lumina, später weite, unregelmäßig geformte Lumina, deutliche Schlängelung der Drüsen, gegen Ende der Behandlung Verkleinerung der Lumina, Streckung der Drüsen zuerst inaktiv, später aktiv differenziert mit großen, rundovalen hypochromatischen Kernen; teils ggr.-mgr. Ödem bei Behandlungsbeginn irregulär inaktiv, später irregulär sekretorisch, gegen Behandlungsende ungleichmäßig proliferativ ein- bis zweireihig, flach bis isoprismatisch, teils ggr. irregulär zuerst isoprismatisch und ggr. irregulär mit hypochromatischen, ggr. polymorphen Kernen und wenig Zytoplasma; später hochprismatisch und mgr. irregulär mit hypochromatischen Kernen und feinvakuolisiertem Zyto-plasma zuerst kleine Lumina, Drüsen gestreckt, später teils weite, teils enge Lumina zuerst teils flach, teils isoprismatisch und ggr. irregulär mit hyperchromatischen, ggr. polymorphen Kernen; später isoprismatisch und ggr.-mgr. irregulär mit hyperchromatischen, deutlich polymorphen Kernen und wenig Zytoplasma kleine Lumina, Drüsen gestreckt aktiv differenziert mit rundovalen, deutlich hypochromatischen Kernen unmittelbar post applicationem irregulär proliferativ, später wechselnd irregulär sekretorisch und irregulär inaktiv unmittelbar post applicationem ungleichmäßig proliferativ, später irregulär inaktiv Endometrose dezent bis ggr., vereinzelt ggr.-mgr. teils inaktive, teils gemischte, fokal destruierende Endometrose Legende zu Tab. 4.26: lum. Epith. = luminales Epithel; ggr. = geringgradig, ggr.-mgr. = gering- bis mittelgradig, mgr. = mittelgradig, hgr. = hochgradig

68 ERGEBNISSE 59 Tab 4.27: Detaillierte Übersicht über die histomorphologischen Befunde am Endometrium der beiden azyklischen Maultierstuten unter der Regumate -Applikation (Teil I) Luminales Epithel Tag 1 und 4 Tag 8 Tag 15 und 22 Tag 29 einreihig, isoprismatisch, regulär; runde, hypochromatische, zentral lokalisierte Kerne; ggr. vakuolisiertes Zytoplasma einreihig, isoprismatisch, regulär; hyperchromatische, basal liegende Kerne; homogen eosinophiles Zytoplasma einreihig, isoprismatisch, ggr. irregulär; hyperchromatische, basal oder apikal lokalisierte Kerne; feinwabiges Zytoplasma ein- bis zweireihig, isoprismatisch, ggr. irregulär; hyperchromatische, basal oder apikal lokalisierte, ggr. polymorphe Kerne; feinwabiges Zytoplasma Drüsendichte ggr.-mgr. hgr. hgr. hgr. Glanduläres Epithel überwiegend isoprismatisch und einreihig; zahlreiche stiftförmige, schlanke Zellen mit mgr. polymorphen, hyperchromatischen Kernen; wenig homogen eosinophiles Zytoplasma Drüsenkonfiguration isoprismatisch, einreihig; kleine, ovale, teils stiftförmige hyperchromatische, basal liegende Kerne; ggr. vakuolisiertes Zytoplasma kleine, ovale Lumina, Drüsen gestreckt oder leicht geschlängelt iso- bis hochprismatisch, einreihig; zahlreiche stiftförmige, schlanke Zellen mit hyperchromatischen, langgestreckten, teils basal, teils zentral liegenden Kernen; im Zytoplasma große Sekretvakuolen mgr. erweiterte Lumina, teils mit fädigem Sekret, zunehmende Schlängelung der Drüsen hochprismatisch, einreihig; überwiegend stiftförmige, schlanke Zellen mit hgr. polymorphen, hyperchromatischen, basal liegenden Kernen; im Zytoplasma große Sekretvakuolen weite, unregelmäßig geformte Lumina mit fädigem Sekret, Drüsen deutlich geschlängelt engere Lumina, beginnende Streckung der Drüsen Stroma Funktionszustand aktiv differenziert, große, hypochromatische Kerne, zahlreiche Lymphangiektasien, kein Ödem Maultierstute 4: sekretorisch, mgr. irregulär Maultierstute 5: Übergang Sekretion/Proliferation, ggr. irregulär ggr., inaktiv Endometrose inaktiv, kleine, spindelförmige Kerne, kein Ödem inaktiv, ggr. irregulär ggr.-mgr., überwiegend inaktiv, fokal destruierend, überwiegend im Bereich basaler Einzeldrüsen aktiv differenziert, große, hypochromatische Kerne, mgr.-hgr. Ödem sekretorisch, mgr. irregulär ggr., gemischt, teils destruierend aktiv differenziert, große, hypochromatische Kerne, mgr. bis hgr. Ödem, vereinzelte Lymphangiektasien sekretorisch, mgr.-hgr. irregulär ggr.-mgr., teils inaktiv, teils gemischt, fokal destruierend, überwiegend im Bereich basaler Einzeldrüsen Legende zu Tab. 4.27: ggr. = geringgradig; mgr. = mittelgradig; hgr. = hochgradig

69 ERGEBNISSE 60 Tab 4.28: Detaillierte Übersicht über die histomorphologischen Befunde am Endometrium der beiden azyklischen Maultierstuten unter der Regumate -Applikation (Teil II) Tag 37 Tag 44 Tag 50 Luminales Epithel ein- bis zweireihig, isoprismatisch, ggr. irregulär; hyperchromatische, basal, apikal oder in der Mitte der Zellen liegende Kerne; feinwabiges Zytoplasma einreihig, isoprismatisch, ggr. irregulär; hyperchromatische, basal, apikal oder in der Mitte der Zellen liegende Kerne; feinwabiges Zytoplasma ein- bis zweireihig, isoprismatisch, ggr. irregulär; hyperchromatische, basal, apikal oder in der Mitte der Zellen liegende Kerne; feinwabiges Zytoplasma Drüsendichte mgr. ggr.-mgr. ggr.-mgr. Glanduläres Epithel hochprismatisch, einreihig; zahlreiche stiftförmige, schlanke Zellen mit mgr. polymorphen, basal liegenden, hyperchromatischen Kernen Drüsenkonfiguration isoprismatisch, überwiegend einreihig; ovale, hyperchromatische, basal, zentral oder apikal lokalisierte Kerne; Epithelzellen und Kerne geringgradig polymorph enge Lumina, Drüsen gestreckt isoprismatisch, ein- bis zweireihig; ovale, hyperchromatische, zentral liegende Kerne; Epithelzellen und Kerne gering- bis mittelgradig polymorph enge Lumina, Drüsen gestreckt teils geschlängelte Drüsen mit erweiterten, unregelmäßig geformten Lumina, daneben gestreckte Drüsen mit engeren Lumina Stroma aktiv differenziert, große, hypochromatische Kerne, ggr. Ödem, vereinzelte Lymphangiektasien aktiv differenziert, große, hypochromatische Kerne, ggr. Ödem, vereinzelte Lymphangiektasien aktiv differenziert, große, hypochromatische Kerne, ggr. bis mgr. Ödem, vereinzelte Lymphangiektasien Funktionszustand Endometrose Maultierstute 4: ungleichmäßig proliferativ, ggr. irregulär Maultierstute 5: proliferativ, ggr. irregulär ggr., gemischt, überwiegend im Bereich basaler Einzeldrüsen Maultierstute 4: proliferativ, ggr.-mgr. irregulär Maultierstute 5: ungleichmäßig proliferativ, ggr. irregulär ggr., gemischt, überwiegend im Bereich basaler Einzel-drüsen Maultierstute 4: sekretorisch, mgr. irregulär Maultierstute 5: ungleichmäßig sekretorisch, ggr. irregulär ggr., teils gemischt, teils inaktiv, überwiegend im Bereich basaler Einzeldrüsen Legende zu Tab. 4.28: ggr. = geringgradig; mgr. = mittelgradig; hgr. = hochgradig

70 ERGEBNISSE Histologische Befunde post applicationem Unmittelbar nach Beendigung der Regumate -Applikation liegt bei Maultierstute 4 ein irregulär proliferativer endometrialer Funktionszustand vor. Gegen Ende der Untersuchungsperiode post applicationem ist das Endometrium irregulär sekretorisch oder irregulär inaktiv differenziert. Das Endometrium von Maultierstute 5 zeigt direkt post applicationem eine ungleichmäßig proliferative, und an allen folgenden Untersuchungsterminen eine irregulär inaktive Differenzierung (s. Abb. 9.21, Anhang S. 134). Bei den zwei Tieren wird eine geringgradige gemischte Endometrose dokumentiert, die überwiegend im Bereich basaler Einzeldrüsen auftritt und mit jenen Befunden vergleichbar ist, die vor und unter der Regumate -Applikation erhoben wurden. In Tab (s. S. 62) werden die Ergebnisse beider Maultierstuten aufgrund ihrer Ähnlichkeit gemeinsam dargestellt und abweichende Befunde explizit hervorgehoben.

71 ERGEBNISSE 62 Tab 4.29: Ausführliche Darstellung der histomorphologischen Befunde am Endometrium der beiden azyklischen Maultierstuten nach der Regumate -Applikation Luminales Epithel Drüsendichte Nach 8 Tagen Nach 14 Tagen Nach 21 Tagen Nach 27 Tagen Nach 2 Jahren ein- bis zweireihig, ein- bis zweireihig, einreihig, isoprismatisch, einreihig, isopris- einreihig, flach flach, ggr. irregulär; flach, ggr. irregulär; teils regumatisch, teils regu- bis isoprisma- rundliche, hyperchromatische, rundliche, hylär, teils ggr.-mgr. lär, teils ggr. irtisch, regulär; teils perchromatische, irregulär; rundliche, regulär; ovale, runde, hyperchromatische, basal, teils apikal zentral lokalisierte hyperchromatische, hyperchromatische, liegende Kerne; Kerne; homogen zentral lokalisierte zentral lokalisierte zentral lokalisierte homogen eosinophiles eosinophiles Zyto- Kerne; feinwabiges, Kerne; feinwabiplasma Kerne; Zytoplasma plasma eosinophiles Zytoges, eosinophiles homogen eo- Zytoplasma sinophiles Zytoplasma ggr. ggr.-mgr. Maultierstute 4: ggr. Maultierstute 5: mgr.-hgr. Maultierstute 4: ggr. Maultierstute 5: mgr. ggr. Glanduläres Epithel Drüsenkonfiguration ggr. polymorph, isoprismatisch; ovale bis längliche, hyperchromatische, basal gelegene Kerne; homogen eosinophiles Zytoplasma Drüsen gestreckt, kleine Lumina ggr.-mgr. polymorph, isoprismatisch; rundliche hypochromatische, basal gelegene, ggr.-mgr. polymorphe Kerne; homogen eosinophiles Zytoplasma Drüsen überwiegend gestreckt, weite Lumina ggr. polymorph, isoprismatisch; runde bis ovale, hypochromatische, basal liegende, ggr. polymorphe Kerne; feinwabiges Zytoplasma Drüsen gestreckt, kleine Lumina, vereinzelt eingedicktes Restsekret ggr. polymorph, iso- bis hochprismatisch; runde, hypochromatische, basal lokalisierte, ggr. polymorphe Kerne; feinvakuoläres Zytoplasma Drüsen leicht geschlängelt, weite Lumina ggr. polymorph, flach; runde, zentral lokalisierte, hyperchromatische, ggr. polymorphe Kerne; homogen eosinophiles Zytoplasma Drüsen gestreckt, kleine Lumina Stroma Funktionszustand aktiv differenziert; große, hypochromatische, ovale Kerne; ggr. Ödem; vereinzelte Lymphangiektasien Maultierstute 4: proliferativ, ggr. irregulär Maultierstute 5: ungleichmäßig und irregulär proliferativ inaktiv; kleine hyperchromatische, spindelförmige Kerne; ggr.-mgr. Ödem; zahlreiche Lymphangiektasien Maultierstute 4: sekretorisch, mgr. irregulär Maultierstute 5: inaktiv, ggr, irregulär aktiv differenziert; große, hypochromatische, ovale Kerne; mgr. Ödem; vereinzelte Lymphangiektasien Maultierstute 4: inaktiv, ggr. irregulär Maultierstute 5: ungleichmäßig und irregulär inaktiv aktiv differenziert; große, hypochromatische, ovale Kerne; mgr. Ödem; vereinzelte Lymphangiektasien Maultierstute 4: sekretorisch, ggr.- mgr. irregulär Maultierstute 5: inaktiv, ggr. irregulär aktiv differenziert; große, hypochromatische, ovale Kerne; kein Ödem inaktiv, ggr. irregulär Endometrose Maultierstute 4: dezent, gemischt, überwiegend im Bereich basaler Einzeldrüsen, fokal destruierend Maultierstute 5: ggr., gemischt, überwiegend im Bereich basaler Einzeldrüsen, fokal destruierend Legende zu Tab. 4.29: ggr. = geringgradig, mgr. = mittelgradig, hgr. = hochgradig

72 ERGEBNISSE Zusammenfassung der histomorphologischen Hauptbefunde vor, unter und nach der Regumate -Applikation Vor der Behandlung mit Regumate stellt sich das Endometrium der beiden azyklischen Maultierstuten über den gesamten Untersuchungszeitraum von 121 Tagen inaktiv und geringgradig irregulär differenziert dar. Nach 8 Behandlungstagen mit Regumate tritt in den Endometrien beider Tiere eine irregulär sekretorische Differenzierung auf, deren Irregularität und sekretorische Aktivität sich bis zum 29. Behandlungstag deutlich steigert. Bis zum 44. Behandlungstag liegt in den Endometrien beider Maultierstuten eine irregulär und ungleichmäßig proliferative Differenzierung vor, bis am letzten Behandlungstag (Tag 50) bei Maultierstute 4 wieder eine irregulär beziehungsweise bei Maultierstute 5 eine ungleichmäßig sekretorische endometriale Differenzierung dokumentiert wird. 8 Tage post applicationem sind die Endometrien beider Tiere irregulär und/oder ungleichmäßig proliferativ differenziert. Bis Tag 27 post applicationem liegt bei Maultierstute 4 abwechselnd eine irregulär sekretorische oder irregulär inaktive Differenzierung vor, bei Maultierstute 5 ist das Endometrium irregulär und ungleichmäßig inaktiv differenziert. 2 Jahre nach Beendigung der Progestagen-Langzeitapplikation wird bei den zwei Maultierstuten ein geringgradig irregulär inaktiv differenziertes Endometrium beobachtet, wie es auch vor Beginn der Behandlung auftrat. Klinisch zeigen beide Tiere sowohl unter der Regumate -Applikation als auch post applicationem eine Azyklie mit relativ niedrigen Serumöstradiol- und -progesteronkonzentrationen Immunhistologische Untersuchungen vor, unter und nach der Regumate - Applikation Die Darstellung der Proteinsekretion im Endometrium der beiden azyklischen Maultierstuten erfolgt aus Übersichtsgründen in Fom von Säulendiagrammen, in denen die Sekretion der Proteine in Abhängigkeit von den Untersuchungszeitpunkten aufgeführt ist. Auch wenn eine detaillierte Beschreibung der Proteinsekretion im Endometrium der beiden azyklischen Tiere vor der Regumate -Applikation schon unter Kap erfolgte, werden diese Werte der Vollständigkeit halber hier nochmals mit angegeben UG-Nachweis vor, unter und nach der Regumate -Applikation Der Nachweis von UG vor, unter und nach der Progestagen-Langzeitapplikation erfolgt überwiegend mit sehr geringgradiger Intensität. Die Verteilung von UG zu allen Untersuchungszeitpunkten im Zytoplasma der Drüsenepithelzellen ist diffus und sowohl innerhalb einer Drüse als auch in der Gesamtheit der Uterindrüsen im Endometrium deutlich ungleichmäßig. Vor, unter und nach der Progestagen-Langzeitapplikation wird die UG-Sekretion im Endometrium von Maultierstute 4 und 5 überwiegend mit sehr geringgradiger Intensität dokumentiert (s. Abb. 4.1 und Abb. 4.2, S. 66 und 67). Bei Maultierstute 4 kann ausschließlich an Behandlungstag 37, bei Maultierstute 5 an den Behandlungstagen 8, 15 und 29 eine geringgradige Sekretion im Bereich der oberflächlichen und mittleren Drüsen nachgewiesen werden, während tiefe Uterindrüsen und luminales Epithel das Protein mit angedeuteter Intensität sezernieren. Drüsen mit periglandulärer Fibrose synthetisieren das Protein bei Maultierstute 4, bei der eine angedeutete, gemischte, fokal destruierende Endometrose vorliegt, weniger intensiv als das umliegende Endometrium. Im Endometrium von Maultierstute 5, das eine geringgradige gemischte, teils destruierende Endometrose zeigt, ist die Synthese in den degenerativ geschädigten Drüsen teilweise gesteigert, teils vermindert.

73 ERGEBNISSE UK-Nachweis vor, unter und nach der Regumate -Applikation Im Verlauf der Untersuchungen dominiert in den Endometrien beider azyklischer Maultierstuten eine dezente Sekretion von UK. Das Protein liegt diffus verteilt im Zytoplasma des luminalen Epithels sowie der Drüsenepithelzellen vor und zeigt ein gleichmäßiges Verteilungsmuster innerhalb eines Drüsenquerschnitts und zwischen den Uterindrüsen. Vor, unter und nach der Progestagen-Langzeitaplikation wird die Sekretion von UK mit konstant angedeuteter Intensität nachgewiesen (s. Abb , Anhang S. 134). Ausnahmen bilden bei Maultierstute 4 die Behandlungstage 29, 37, 50 sowie 2 Jahre post applicationem (s. Abb. 4.3, S. 68), bei Maultierstute 5 werden an den Tagen 15, 29 und 2 Jahre post applicationem von der überwiegend angedeuteten UK-Sekretion abweichende Befunde erhoben (s. Abb. 4.4, S. 69). Bei beiden Maultierstuten liegt an den oben genannten Tagen eine geringgradige Synthese von UK insbeondere im Bereich der mittleren und tiefen Uterindrüsen vor. 2 Jahre post applicationem erfolgt ein geringgradig intensiver Nachweis im Bereich des luminalen E- pithels, die Uterindrüsen reagieren angedeutet intensiv. Im Endometrium von Maultierstute 4 weisen fibrotische Drüsennester eine überwiegend gleich intensive, in einigen Fällen auch eine im Vergleich zu den übrigen Uterindrüsen verminderte Uterokalinsekretion auf, bei Maultierstute 5 liegt sie größtenteils gleich intensiv, vereinzelt auch gesteigert oder vermindert vor UF-Nachweis vor, unter und nach der Regumate -Applikation Über den Zeitraum der gesamten Untersuchungsperiode überwiegt eine dezent ausgeprägte UF-Sekretion. Das Protein wird gleichmäßig diffus verteilt im Zytoplasma der Epithelzellen einer Drüse nachgewiesen, wobei sich die Sekretionsintensität in der Gesamtheit der Uterindrüsen teilweise deutlich uneinheitlich darstellt. Vor der Progestagen-Langzeitapplikation erfolgt die Uteroferrinsekretion bei beiden Maultierstuten mit minimaler Intensität (s. Kap ). Unter der Progestagen-Langzeitapplikation steigert sich bei Maultierstute 4 die UF-Sekretion am Behandlungstag 15 und 44 auf geringgradige, sowie am Behandlungstag 50 in den oberflächlichen Uterindrüsen auf gering- bis mittelgradige Werte (s. Abb. 4.5, S. 70). Bei Maultierstute 5 werden am Behandlungstag 4 und 29 geringgradige SSc-Werte in allen Uterindrüsen bestimmt (s. Abb. 4.6, S. 71). Während der gesamten Untersuchungen post applicationem liegt eine überwiegend angedeutete UF-Sekretion im Endometrium von Maultierstute 4 vor, und auch bei Maultierstute 5 wird das Protein mit dezenter Intensität nachgewiesen. Drüsen mit periglandulärer Fibrose zeigen bei beiden Maultierstuten sowohl eine gleich intensive Sekretion wie das übrige Endometrium als auch in einzelnen Arealen eine gesteigerte oder verminderte Synthese von UF CAL-Nachweis vor, unter und nach der Regumate -Applikation Bei beiden Maultierstuten erfolgt der Nachweis von CAL im Verlauf der gesamten Studie innerhalb einer Drüse äußerst ungleichmäßig, was ein mosaikartiges Sekretionsmuster in den Drüsen erzeugt. Neben der diffusen Verteilung von CAL im Zytoplasma wird das Protein auch in den Zellkernen des luminalen Epithels und der Drüsenepithelzellen beobachtet. Innerhalb des Endometriums wird eine geringgradig variable Sekretion des Proteins dokumentiert, die deutlichste Reaktion findet sich im Bereich der mittleren und tiefen Uterindrüsen.

74 ERGEBNISSE 65 Vor der Progestagen-Langzeitapplikation liegt eine geringgradig variable, insgesamt niedrig ausgeprägte CAL-Expression in den Endometrien der zwei Maultierstuten vor (s. Kap und Abb. 9.25, Anhang S. 136). Unter der Behandlung steigen die SSc-Werte bei beiden Tieren ab dem 8. Behandlungstag auf maximale Werte an (s. Abb. 4.7 und Abb. 4.8, S und Abb. 9.26, Anhang S. 136). Bei Mauliterstute 4 wird zum Ende der Behandlung eine nach wie vor hochgradige CAL-Expression dokumentiert, bei Maultierstute 5 vermindert sich die Reaktionsintensität bis zum 50. Behandlungstag geringgradig. Post applicationem schwankt die Expression von CAL bei Maultierstute 4 zwischen mittelgradiger und mittel-/hochgradiger Intensität, vermindert sich an Tag 27 post applicationem auf gering- bis mittelgradige SSc-Werte und wird 2 Jahre post applicationem mit angedeuteter Intensität dokumentiert. Im Endometrium von Maultierstute 5 vermindert sich der CAL-Nachweis von mittel- bis hochgradiger Intensität an Tag 8 post applicationem auf gering- bis mittelgradige Werte (2 Jahre post applicationem; s. Abb. 9.27, Anhang S. 136). Innerhalb fibrotischer Herde ist die Sekretion von Calbindin D9k im Vergleich zu den umliegenden Drüsen im Endometrium beider Maultierstuten deutlich vermindert.

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83 ERGEBNISSE Zusammenfassung der Hauptbefunde des immunhistologischen Nachweises der vier endometrialen Proteine vor, unter und nach der Regumate -Applikation unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Parameter sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Der Nachweis der vier untersuchten Proteine erfolgt bei den zwei azyklischen Maultierstuten vor der Progestagen-Langszeitapplikation in Übereinstimmung mit der klinisch diagnostizierten Azyklie, relativ niedrigen Serumhormonkonzentrationen sowie einem irregulär inaktiv differenzierten Endometrium mit überwiegend angedeuteter bis geringgradiger Intensität. Unter der Behandlung mit Regumate ändert sich der klinische Zyklusstand der Azyklie nicht, und auch die Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen unterliegen überwiegend keinen deutlichen Schwankungen. Histomorphologisch entwickelt sich im Verlauf der Behandlung eine hochgradig irregulär sekretorische endo-metriale Differenzierung, verbunden mit einer deutlichen Intensivierung der CAL-Expression. Der Nachweis von UG, UK und UF erfolgt unter der Behandlung mit überwiegend angedeuteter Intensität, an einzelnen Untersuchungstagen wird eine geringgradige Erhöhung der SSc-Werte dokumentiert, wobei kein Bezug zu den klinischen Parametern hergestellt werden kann. Post applicationem zeigen die zwei Maultierstuten klinisch weiterhin eine Azyklie, und die Endometrien sind bei Beendigung der Studie irregulär inaktiv differenziert. Übereinstimmend mit diesen Befunden sowie den basalen Serumhormonkonzentrationen vermindert sich die CAL-Expression diskontinuierlich, ist jedoch insgesamt geringgradig intensiver ausgeprägt als jene vor der Regumate -Applikation. Vor, unter und nach der Progestagen-Langzeitapplikation ist die Sekretion von UK innerhalb eines Drüsenquerschnitts sowie bezogen auf die Gesamtheit der Uterindrüsen gleichmäßig ausgeprägt. UF wird zwar innerhalb einer Drüse gleichmäßig, in der Gesamtheit der Uterindrüsen jedoch ungleichmäßig sezerniert. UG und CAL werden sowohl in einer Drüse als auch im umliegenden Endometrium ungleichmäßig nachgewiesen. In Drüsen mit periglandulärer Fibrose stellt sich die Sekretion der untersuchten endometrialen Proteine, verglichen mit dem umliegenden Endometrium, teilweise deutlich vermindert, teils gleich intensiv oder gesteigert dar ER-Expression vor, unter und nach der Regumate -Applikation An allen Untersuchungterminen wird eine deutlich uneinheitliche ER-Expression im luminalen Epithel, den Drüsenepithelien und den Stromazellen beobachtet. Die Expression in den Drüsen erfolgt dabei sowohl innerhalb einer Drüse als auch zwischen den Uterindrüsen ungleichmäßig. Vor der Behandlung mit Regumate ist die Reaktion der Stromazellen bei beiden Maultierstuten insgesamt intensiver ausgeprägt als in den Drüsen, sodass eine asynchrone ER-Expression zwischen diesen zwei endometrialen Strukturelementen vorliegt. Unter und nach der Progestagen-Langzeitapplikaiton steigern sich sowohl die IRS-Werte der Drüsen als auch jene des Stromas. Das luminale Epithel reagiert im Vergleich zu den Uterindrüsen stets mit geringerer Intensität. Eine detaillierte Darstellung der immunhistologischen Untersuchungsergebnisse zur Expression der ER in den Endometrien der zwei azyklischen Maultierstuten erfolgt in den Abb. 4.9 und 4.10 (s. S. 77 und 78). Vor der Progestagen-Langzeitapplikation wird die Expression der ER bei beiden Maultierstuten in den uterinen Epithelien und den Stromazellen mit deutlich variabler Intensität nachgewiesen, wobei die Expression im Stroma dominiert. In den Drüsen schwanken die IRS-Werte von angedeuteter bis mittelgradiger Intensität.

84 ERGEBNISSE 75 Unter der Regumate -Applikation liegt weiterhin eine deutliche Varianz der IRS-Werte vor. Im Vergleich zu vor der Behandlung ist die ER-Expression im Bereich der Drüsen deutlich, im Stroma und dem luminalen Epithel geringgradig gesteigert. Bei beiden Maultierstuten zeigen die IRS-Werte der Uterindrüsen an zahlreichen Tagen unter der Behandlung höhere Werte als in den Stromazellen. Post applicationem erreicht die ER-Expression in den Uterindrüsen bei Maultierstute 4 teilweise maximale Werte, während die ER in den Stromazellen mit vergleichbarer Intensität wie unter der Behandlung exprimiert werden. Das luminale Epithel reagiert nach wie vor mit geringgradiger Intensität. Die Expression der ER in den uterinen Epithelien und den Stromazellen bei Maultierstute 5 ähnelt jener unter der Regumate - Applikation. In den von einer Endometrose alterierten Uterindrüsen erfolgt die Expression der ER bei beiden Tieren sowohl in den Drüsen als auch in den Stromazellen mit herabgesetzter Intensität im Vergleich zum umliegenden Endometrium, vereinzelt werden auch Drüsen mit gleichstarker ER-Expression beobachtet PR-Expression vor, unter und nach der Regumate -Applikation Über den gesamten Zeitraum der Studie ist die Expression der PR in allen endometrialen Strukturelementen deutlich ungleichmäßig ausgeprägt. Zwischen den Uterindrüsen und den Stromazellen erfolgt die PR- Expression bei beiden Maultierstuten vor der Behandlung überwiegend asynchron, unter und nach der Progestagen-Gabe mehrheitlich synchron. Die IRS-Werte des luminalen Epithels sind überwiegend niedriger als jene der Drüsenepithelzellen. Eine detaillierte Darstellung der immunhistologischen Untersuchungsergebnisse zur Expression der PR in den Endometrien der zwei azyklischen Maultierstuten liefern die Abb und 4.12 (s. S. 79 und 80). Vor der Behandlung liegt in den Epithelien des Endometriums beider azyklischer Maultierstuten eine sehr geringgradige bis geringgradige PR-Expression vor, in den Stromazellen dominiert ein geringgradiger, vereinzelt ein mittelgradig intensiver Nachweis (s. Abb. 9.28, Anhang S. 136). Die Expression der PR innerhalb einer Drüse und in der Gesamtheit der Uterindrüsen ist deutlich ungleichmäßig. Unter der Progestagen-Langzeitapplikation schwanken die IRS-Werte im Bereich der Düsen bei beiden Tieren von sehr geringgradigen bis zu mittelgradigen Werten, bei Maultierstute 4 werden teilweise hochgradige Werte dokumentiert. Die Stromazellen exprimieren die PR bei beiden Tieren mit von geringgradig bis zu hochgradig intensiv variierender Intensität, ohne dass ein Bezug zur endometrialen Differenzierung oder den Serumhormonkonzentrationen an den einzelnen Untersuchungstagen hergestellt werden kann. Im Vergleich zu dem Zeitraum vor der Regumate -Gabe liegt unter der Behandlung eine insgesamt gesteigerte PR-Expression in den Endometrien beider Maultierstuten vor (s. Abb. 9.29, Anhang S. 136). Post applicationem ähneln die Befunde jenen, die unter der der Progestagen-Langzeitapplikation erhoben werden, wobei sich bei Maultierstute 4 die Expressionsintensität in den Drüsen und im Stroma bis zum letzten Untersuchungstermin im Vergleich zum Zeitraum unter der Behandlung geringgradig steigert. Die Expressionsintensität der PR in den Drüsen und den Stromazellen bei Maultierstute 5 gleicht jener unter der Behandlung. Die IRS-Werte in den Stromazellen zeigen bei beiden Maultieren geringgradig höhere Werte als in den Drüsen, und auch im Vergleich zu unter der Behandlung steigert sich die Expressionsintensität (s. Abb. 9.30, Anhang S. 136). In der Endometrose exprimieren die Drüsenepithelien PR bei beiden Tieren mit gleichstarker oder verminderter Intensität, in den beteiligten Stromazellen wird eine verminderte Hormonrezeptorexpression beobachtet.

85 ERGEBNISSE Ki-67 Antigenexpression vor, unter und nach der Regumate -Applikation Im Verlauf der Studie dominiert in den Endometrien der beiden azyklischen Maultierstuten eine sehr geringgradige Expression von Ki-67 Antigen in den Zellkernen des luminalen Epithels, der Drüsenepithel- und Stromazellen (s. Abb und Abb. 4.14, S. 81 und 82). An einzelnen Tagen wird ohne Regelmäßigkeit sowohl vor der Behandlung mit Regumate als auch unter der Progestagen-Langzeitapplikation sowie post applicationem eine Steigerung der Proliferationskativität im Bereich der Uterindrüsen beobachtet. In endometrotisch veränderten Drüsen liegt bei Maultierstute 4 in der überwiegenden Anzahl der Epithelzellen keine Expression von Ki-67 Antigen vor. Die Stromazellen in der Endometrose reagieren negativ. In der Endometrose bei Maultierstute 5 ist die Expression des Proliferationsmarkers teils deutlich gesteigert, teils gleichstark oder auch vermindert. In den Stromazellen dieser Areale wird bis auf eine einmalige angedeutete Reaktion an Tag 4 post applicationem keine Expression nachgewiesen.

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92 DISKUSSION 83 5 DISKUSSION 5.1 Ziel der Arbeit Ziel dieser Arbeit ist: die immunhistologische Untersuchung der sekretorischen uterinen Proteine UG, UK, UF und des kalziumbindenden Proteins CAL im Endometrium von vier azyklischen sowie zwei zyklischen Maultierstuten unter Berücksichtigung klinisch-gynäkologischer, endokrinologischer Parameter und der endometrialen Funktionsmorphologie, der Vergleich der erhobenen Befunde mit den bisher bekannten Ergebnissen bei Pferdestuten, den Einfluss einer Progestagen-Langzeitapplikation bei zwei der azyklischen Maultierstuten auf die endometriale Funktionsmorphologie, die Sekretion der oben erwähnten uterinen Proteine, die Expression der Östrogen- und Progesteronrezeptoren sowie die des Proliferationsmarkers Ki-67 Antigen zu untersuchen und anschließend die erhobenen Befunde mit den bei Pferdestuten beschriebenen Ergebnissen zu vergleichen. 5.2 Kritische Beurteilung des Untersuchungsgutes und der Untersuchungsmethoden Für die Untersuchungen standen ausschließlich Endometriumbioptate von Maultierstuten zur Verfügung, die ausführlich klinisch-gynäkologisch und endokrinologisch untersucht wurden. Die Probenentnahme begann am Ende der Übergangsperiode im April 2004 und endete im November desselben Jahres, sodass bei der Interpretation der Befunde bei den zwei zyklischen Maultierstuten mögliche jahreszeitlich bedingte Einflüsse, entsprechend dem Zyklusgeschehen bei der Pferdestute, mit berücksichtigt werden konnten. Um eine Beeinträchtigung der lichtmikroskopischen Auswertungen durch Autolysevorgänge zu minimieren, und weil die Steroidhormonrezeptoren und das Ki-67 Antigen eine Halbwertszeit von unter einer Stunde besitzen (BOJAR 1988), wurden die Bioptate aller Tiere unmittelbar nach der Entnahme in 4%igem Formalin fixiert. Mit der vorliegenden Arbeit erfolgt erstmals eine vergleichende Studie hinsichtlich der endometrialen Funktionsmorphologie inklusive immunhistologischer Untersuchungsergebnisse unter Einbezug klinischgynäkologischer Befunde und endokrinologischer Parameter bei Maultierstuten. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass es sich bei den durchgeführten Untersuchungen um Verlaufsuntersuchungen handelt, bei denen sich die Untersuchungsfrequenz und -wiederholung an der klinisch-sonografischen Situation und Zyklusbeurteilung orientierte. Dementsprechend wurden die Uterusbioptate je nach Verfügbarkeit der Tiere im Abstand von drei bis sieben Tagen entnommen (PD Dr. C.P. BARTMANN, Bad Reichenhall), und die Untersuchungsergebnisse sind somit im Sinne einer Momentaufnahme des endometrialen Status praesens zu interpretieren. Darüber hinaus steht mit n = 6 Maultierstuten (Zyklische Maultierstuten n = 2, azyklische Maultierstuten n = 4) nur eine sehr kleine Gruppe von Probandinnen zur Verfügung, die aus einer Herde von vierzig Tieren nach dem Zufallsprinzip ausgewählt wurden. Daher erfolgt eine detaillierte Deskription der histomorphologischen und immunhistologischen Befunde, jedoch keine statistische Auswertung des erhobenen Datenmaterials. Die Ergebnisse erlauben also keinen statistisch abgesicherten Rückschluss auf die in der Gesamtpopulation vorkommenden zyklischen und azyklischen Maultierstuten.

93 DISKUSSION Klinisch-gynäkologische und endokrinologische Befunde der zyklischen und azyklischen Maultierstuten Verschiedene Autoren beobachten sowohl azyklische Maultierstuten als auch Tiere mit vorhandener Zyklusaktivität, bei denen der Zeitraum zwischen zwei Ovulationen äußerst variabel ist. Zudem kann keine eindeutige Beziehung zwischen Jahreszeit und Zyklusgeschehen hergestellt werden (BIELANSKI u. ZAPLETAL 1968, BIELANSKI 1972, DAVIES et al. 1985, BRUNO u. DARZYNKIEWICZ 1992). Ähnliche Befunde werden auch bei den zwei zyklischen Maultierstuten der vorliegenden Studie erhoben, bei denen zwar sonografisch Follikel und Corpora lutea auf den Ovarien nachgewiesen werden, bei denen jedoch die Zykluslänge deutlich variiert, und auch während der physiologischen Zuchtsaison keine regelmäßige Abfolge von Ovulationen beobachtet werden kann (s. Tab , Anhang, S ). Darüber hinaus schwanken bei diesen zwei Tieren die Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen in unregelmäßigen Abständen. Klinisch liegt meistens keine Kongruenz zwischen den klinisch bestimmten Zyklusphasen und den parallel bestimmten Serumhormonwerten vor. Dies beobachtet auch MÖLLMANN (1991) bei zyklischen Maultierstuten. Im Gegensatz zu den Ergebnissen bei den beiden zyklischen Maultieren der vorliegenden Studie und den Ergebnissen von MÖLLMANN (1991) bestimmen VOLPE et al. (2005) bei zyklischen Maultierstuten Hormonprofile, die mit jenen zyklischer Pferdestuten vergleichbar sind, mit klarem Peak der Östradiolkonzentration im periovulatorischen Zeitraum sowie einem gegenläufigen Progesteronprofil mit Plateauphase im Interöstrus. In der Literatur existieren bislang noch keine gesicherten Angaben für die Ursache dieser auffallenden interindividuellen Schwankungen in Bezug auf Zykluslänge und Serumhormonkonzentrationen. Anhand der eigenen Untersuchungergebnisse kann eine gewisse Ähnlichkeit mit den Befunden bei Pferdestuten in den Übergangsperioden in Herbst und Frühjahr festgestellt werden, da in diesem Zeitraum ein unregelmäßiges Zyklusgeschehen in Verbindung mit endometrialen Fehldifferenzierungen auftreten kann (GOCKELN et al. 2006). Allerdings wird keine derartig deutliche Diskrepanz zwischen klinischem Zyklusstand und Serumhormonkonzentrationen beobachtet (NAGY et al. 2004) wie bei den zwei in dieser Studie untersuchten Tieren. Bei den vier azyklischen Maultierstuten aus der vorliegenden Studie werden in dem Zeitraum von April bis August 2004 bei der klinisch-gynäkologischen und sonografischen Untersuchung - passend zum Zyklusstand - stets kleine, inaktive Ovarien sowie relativ niedrige, wenig schwankende Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen nachgewiesen (BARTMANN et al. 2008). Dies entspricht den Beobachtungen anderer Autoren (CAMILLO et al. 2003), die bei Maultieren im Zeitraum von Mai und Juni ebenfalls keine Zyklusaktivität dokumentieren. Vergleichbare Befunde bei Pferdestuten werden während des physiologischen Winteranöstrus erhoben: In dieser Periode, unter der man die Zeit von der letzte Ovulation in September/Oktober bis zur ersten Ovulation im folgenden März/April versteht, überschreiten die ovariellen Follikel eine Größe von 20 mm nicht, und es werden sehr niedrige LH-, Östradiol- und Progesteronkonzentrationen im Blutserum bestimmt (HUGHES et al. 1977, GINTHER 1992).

94 DISKUSSION Histomorphologie des Endometriums der zyklischen und azyklischen Maultierstuten unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde Die endometriale Differenzierung bei der Pferdestute variiert charakteristischerweise vor allem in Abhängigkeit von den Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen, wobei während der physiologischen Zuchtsaison jede Zyklusphase durch eine synchrone, einheitliche Differenzierung aller Strukturelemente des Endometriums gekennzeichnet ist (BRUNCKHORST et al. 1991, STRANKMEYER 1993, RAILA et al. 1997, AUPPERLE et al. 2000). Bei den zwei zyklischen Maultierstuten dieser Studie stimmen überwiegend Zyklusphase und parallel bestimmte Serumhormonkonzentrationen sowie die endometriale Funktionsmorphologie nicht überein, sodass bei diesen Tieren anhand klinischer Untersuchungsergebnisse kein Rückschluss auf den endometrialen Funktionszustand erfolgen kann (HUTH et al. 2008). Weiterhin können die histologischen Ergebnisse bei den zwei zyklischen Maultierstuten für eine Einschätzung klinischer und endokrinologischer Befunde nicht herangezogen werden. Darüber hinaus wird eine ungleichmäßige und irreguläre Differenzierung des Endometriums mit inaktivem, proliferativem oder sekretorischem Grundcharakter bei den zwei zyklischen Maultierstuten beobachtet. Über die Ursache der endometrialen Fehldifferenzierung kann bei diesen beiden Tieren nur spekuliert werden. Die endokrinologischen und sonografischen Untersuchungen zeigen, dass an den Ovarien eine hormonelle Aktivität vorliegt, die durch einen entsprechenden Regelkreis mit dem übergeordneten Hypothalamus- Hypophysensystem aufrechterhalten werden muss (ADAMS u. BOSU 1988, GINTHER u. BERGFELT 1992). Es liegen allerdings keine Informationen über die Serumkonzentrationen von GnRH, LH oder FSH vor, die möglicherweise einen Anhaltspunkt für Störungen der Hypothalamus-Hypophysen-Ovarien-Uterus- Achse geliefert hätten, was bei Pferdestuten unter anderem für eine irreguläre endometriale Fehldifferenzierung verantworlich gemacht wird (SCHOON et al. 1999). Mit Sicherheit können aber hormonelle Imbalancen aufgrund von Progestagen-Applikationen (ELLENBERGER et al. 2004) oder hormonell aktiven ovariellen Neoplasien (ELLENBERGER 2003) als Ursache der irregulären Fehldifferenzierung bei diesen zwei Maultierstuten ausgeschlossen werden, da keine hormonelle Behandlung durchgeführt wurde, und an den Ovarien im Rahmen der klinisch-gynäkologischen Untersuchung keine potenziell endokrin aktiven pathologischen Prozesse, z.b. Neoplasein oder Zysten, vorlagen (persönliche Mitteilung PD Dr. C.P. BARTMANN, Leipzig, ). Für die ungleichmäßige endometriale Differenzierung ist bei Pferdestuten bekannt, dass sie aus einem partiell hormonrefraktären Endometrium resultiert, in dem eine fehlerhafte Ausstattung mit Hormonrezeptoren vorliegt (SCHOON et al. 1999, HÄFNER et al. 2001). In Übereinstimmung hiermit weisen HUTH et al. (2008) in den Endometrien der zwei zyklischen Maultierstuten aus der vorliegenden Studie ebenfalls eine deutlich variable Expression von ER und PR in den glandulären Epithelien und den Stromazellen nach, sodass auch bei diesen beiden Maultieren ein Defekt der endometrialen Hormonrezeptorausstattung als Ursache für die bei diesen Tieren vorliegende ungleichmäßige endometriale Differenzierung in Betracht gezogen werden muss. Ob darüber hinaus Defekte bei der Bindung von Östradiol und Progesteron an ihre Rezeptoren im Endometrium vorliegen und auf dieser Ebene eine Wirkungsbeeinträchtigung der beiden untersuchten Steroidhormone vorliegt, kann im Rahmen dieser Studie nicht geklärt werden. In Übereinstimmung mit HUTH et al. (2008) werden Ähnlichkeiten zwischen den histomorphologischen Befunden an den Endometrien der zwei zyklischen Maultierstuten aus der vorliegenden Studie und jenen Beobachtungen, die bei Pferdestuten während der Übergangszyklen in Herbst und Frühjahr gemacht werden, gesehen. In dieser Zeit treten bei Pferdestuten häufig fehldifferenzierte Endometrien auf (persönliche Mittei-

95 DISKUSSION 86 lung Prof. H.-A. SCHOON, Leipzig, ). Die Bioptate der Maultierstuten, die für die vorliegende Studie entnommen wurden, stammen jedoch aus dem Zeitraum der physiologischen Zuchtsaison. Eventuelle Ähnlichkeiten bei den Ergebnissen dieser zwei zyklischen Maultierstuten mit Befunden aus den Übergangszyklen bei Pferdestuten müssen folglich als Ausdruck des nachgewiesenen hochgradig ungleichmäßigen Zyklusgeschehens angesehen werden, bei dem weder, wie bei Pferdestuten, eine gleichmäßige saisonale Polyöstrie dominiert (BADER 1995), noch eine Kongruenz klinisch-gynäkologischer, endokrinologischer und histologischer Befunde nachgewiesen werden kann. Die Endometrien der vier azyklischen Maultiere stellen sich passend zur klinisch dokumentierten Azyklie, den kleinen Ovarien ohne Funktionskörper und den basalen Serumhormonkonzentrationen inaktiv dar, was mit einer immunhistologisch durch HUTH et al. (2008) nachgewiesenen fehlenden oder äußerst vereinzelt auftretenden Expression von Ki-67 Antigen korreliert. Daneben liegt eine geringgradig irreguläre glanduläre Differenzierung vor, bei der Parallelen zu den Befunden bestehen, die bei Pferdestuten während des Winteranöstrus erhoben werden (AUPPERLE et al. 2003). Bei allen sechs Maultierstuten wird eine qualitativ und quantitativ variierende Endometrose diagnostiziert. Wahrscheinlich handelt es sich bei der Endometrose der Maultierstuten (HUTH et al. 2008) ebenso wie bei Pferdestuten um eine altersassoziierte, degenerative endometriale Alteration (KENNEY 1978, SCHOON et al. 1995), da alle Tiere eine in Grad und Charakter variierende Endometrose zeigen und älter als 13 Jahre sind. Eine weitere degenerative Veränderung wird in Form einer mittelgradigen Fibroelastose der Gefäßwände der mittelgroßen und großen arteriellen sowie venösen Blutgefäße der Endometrien aller sechs Maultierstuten nachgewiesen. Interessanterweise werden laut SCHOON et al. (1995) und GRÜNINGER et al. (1998) Intima-, Media- und Adventitiafibroelastosen in erster Linie im Endometrium multiparer Pferdestuten beobachtet, wohingegen ältere Maidenstuten in der Regel eine Intima- und perivaskuläre Sklerose zeigen (GRÜ- NINGER et al. 1998). Dass es sich bei den gefäßassoziierten Alterationen, die in den Endometrien der sechs Maultierstuten aus dieser Studie nachgewiesen wurden, um graviditätsbedingte Erscheinungen handelt, ist sicher auszuschließen, da keines der Tiere je trächtig war (persönliche Mitteilung PD Dr. C.P. BARTMANN, Leipzig, ). Somit scheint es sich zwar auch um altersassoziierte Läsionen zu handeln, die sich jedoch qualitativ eindeutig von den bei Pferdestuten beobachteten Befunden unterscheiden, und möglicherweise eine speziesspezifische pathologische Veränderung der uterinen arteriellen und venösen Gefäße bei Maultieren darstellen. Trotz der großen Anzahl von Bioptaten, die bei den sechs Maultierstuten entnommen wurden, wird mit Ausnahme von Maultierstute 5, die einmalig eine geringgradige Endometritis zeigt, weder klinisch noch histologisch eine Endometritis festgestellt, sodass die Endometriumbiopsie auch bei diesen Tieren in Übereinstimmung mit BARTMANN et al. (2008) als diagnostisches Hilfsmittel zur Dokumentation des endometrialen Status praesens eingesetzt werden kann. Zwar liegen bezogen auf die Gesamtpopulation der Maultiere keine derartig fundierten Erkenntnisse in Bezug auf die Repräsentativität eines Endometriumbioptats vor wie bei Pferdestuten (SCHOON et al. 1992, RUNGE 1995), jedoch erweisen sich die histomorphologischen Befunde an den Endometrien der sechs in dieser Studie untersuchten Maultierstuten als einheitlich (HUTH et al. 2008), da bis auf die wechselnde Funktionsmorphologie keine Abweichungen hinsichtlich der dokumentierten endometrialen Alterationen (z.b. Fehldifferenzierung, Endometrose) dokumentiert werden. Aufgrund dieser Ergebnisse, und da sowohl die Lokalisation der Bioptatentnahme als auch die Größe der Proben wie bei Pferdestuten gewählt wurde, kann davon ausgegangen werden, dass die bei Pferdestuten gewonnenen Erkenntnisse auf Maultierstuten übertragbar sind.

96 DISKUSSION Sekretion der endometrialen Proteine UG, UK, UF und CAL in der Gruppe der zyklischen Maultierstuten unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Uteroglobin, Uterokalin und Uteroferrin Es handelt sich um sekretorische Proteine des Uterus, die sowohl während des Zyklus als auch in der Gravidität bei Pferdestuten im Endometrium nachgewiesen werden. Neben zahlreichen weiteren Funkti-onen, die in Kap ausführlich beschrieben sind, wird ihnen eine essentielle Rolle beim Schutz und der Ernährung des Konzeptus, insbesondere während der Präimplantationsperiode und der frühen Gravidität zugeordnet (ZAVY et al. 1979b, BEIER-HELLWIG et al. 1995, STEWART et al. 1995, STEWART et al. 2000a, STEWART et al. 2000b, WOODING et al. 2000, ELLENBERGER et al. 2008, HOFFMANN et al. 2009). Ein gemeinsames Merkmal aller drei Proteine ist die positive Korrelation ihrer Sekretionsintensität mit der Serumprogesteronkonzentration, die sich in einem Sekretionsmaximum im mittleren Interöstrus des Zyklus der Pferdestute und einem entsprechend geringem Nachweis während des Östrus widerspiegelt (CROSSETT et al. 1996, STEWART et al. 2000a, MÜLLER-SCHÖTTLE et al. 2001, HOFFMANN 2006, HOFFMANN et al. 2009). In den Endometrien der beiden zyklischen Maultiere dieser Studie wird für die drei Proteine überwiegend eine sehr geringgradige Sekretion nachgewiesen. Darüber hinaus stimmen klinischer Zyklusstand, parallel bestimmte Serumhormonkonzentrationen und uterine Sekretion der Proteine lediglich an einzelnen Tagen überein. Somit kann der für die Pferdestute bekannte Einfluss des Progesterons auf die Synthese dieser drei Proteine (ZAVY et al. 1982, STEWART et al. 1995, MÜLLER-SCHÖTTLE et al. 2002) sowie die für die Regulation der Sekretion von UG und UF bekannte Interaktion der Östrogene mit Progesteron bei den beiden zyklischen Maultierstuten dieser Studie nur sehr eingeschränkt bestätigt werden. Wie schon erwähnt, sind jedoch auch klinisch dokumentierte Parameter wie Zyklus-, Östrus- und Interöstruslänge sowie die gleichzeitig bestimmten Serumhormonkonzentrationen nur entfernt mit den bei Pferdestuten beobachteten Intervallen und Werten während der Saison vergleichbar. Abweichungen in den Unter-suchungsergebnissen der endometrialen Sekretionsaktivität könnten somit durchaus hierauf zurückgeführt werden. Bei den zwei zyklischen Maultierstuten dieser Studie erfolgt der Nachweis von UK im Endometrium sowohl innerhalb eines Drüsenquerschnitts als auch zwischen den Uterindrüsen gleichmäßig, was dem Sekretionsmuster in den glandulären Epithelien bei Pferdestuten entspricht (HOFFMANN et al. 2009). Im Gegensatz hierzu stellt sich die Sekretion von UG und UF überwiegend deutlich uneinheitlich dar. Eine mögliche Erklärung hierfür bietet die bei beiden Tieren nachgewiesene endometriale Fehldifferenzierung, da für Pferdestuten bekannt ist, dass eine irreguläre endometriale Differenzierung in einem atypischen Sekretionsmuster uteriner Proteine resultiert (ELLENBERGER et al. 2004). In ungleichmäßig differenzierten equinen Endometrien ist die ordnungsgemäße Wirkung der für die Regulation der Proteinsekretion essentiellen Steriodhormone an den Drüsenepithelzellen beeinträchtigt (SCHOON et al. 1999), worauf möglicherweise der ungleichmäßige Nachweis der untersuchten Proteine zwischen den Uterindrüsen in den Endometrien der beiden zyklischen Maultiere dieser Studie zurückzuführen ist Calbindin Calbindin D9k stellt im Gegensatz zu UG, UF und UK kein sekretorisches uterines Protein, sondern ein intrazelluläres kalziumbindendes Transportmolekül dar (CHOI u. JEUNG 2008). Das Protein wird im Uterus verschiedenster Spezies nachgewiesen (DELORME et al. 1983, MATHIEU et al. 1989, INPANBUTR et al.

97 DISKUSSION , TATSUMI et al. 1999), wo es sowohl die intrazelluläre als auch die intraluminale Kalziumkonzentration reguliert und in der Gravidität den transplazentaren Transport von Kalzium gewährleistet (BRUNS et al. 1988). Bei der Pferdestute wird CAL während des Zyklus und der Gravidität sowohl in den uterinen Drüsenepithelzellen als auch intranukleär nachgewiesen (WOODING et al. 2000, HOFFMANN 2006, HOFF- MANN et al. 2009). Übereinstimmend mit den Befunden bei Pferdestuten (ELLENBERGER et al. 2004), wird im Rahmen der vorliegenden Studie in den fehldifferenzierten Endometrien der beiden zyklischen Maultierstuten eine äußerst variable Expression von CAL dokumentiert. Eine Korrelation mit den Ergebnissen der klinischen und endokrinologischen Untersuchungen oder der endometrialen Funktionsmorphologie ist nicht zu ermitteln. Somit kann anhand dieser Ergebnisse keine eindeutige Aussage über den Einfluss der Steroidhormone auf die Regulation der Sekretion von CAL bei diesen Maultierstuten getroffen werden. Weder kann ein eindeutig inhibitorischer Einfluss des Progesterons, wie bei der Sau (KRISINGER et al. 1995) und bei der Ratte (L'HORSET et al. 1993), noch eine Stimulation der Synthese durch dieses Hormon, wie bei Maus (TATSUMI et al. 1999), Kuh (INPANBUTR et al. 1994) und Pferdestute (HOFFMANN et al. 2009), eindeutig nachgewiesen werden. Ebenso unklar bleibt der Einfluss des Östradiols auf die CAL-Expression bei diesen beiden zyklischen Maultierstuten, da sie durch hohe Östradiol-Konzentrationen weder eindeutig downreguliert noch deutlich verstärkt zu werden scheint, wie dies bei der Ratte nachgewiesen wurde (DELORME et al. 1983). Möglicherweise könnte dieses variable Expressionsmuster auf die bei den zwei Maultieren dokumentierte endometriale Fehldifferenzierung mit einer zu postulierenden Beeinträchtigung der hormonellen Signaltransduktion zurückzuführen sein, da HUTH et al. (2008) in den Endometrien beider Tiere eine deutlich variable Expression der Steroidhormonrezeptoren nachweisen. Das mosaikartige Expressionsmuster von CAL in den endometrialen Epithelien, das für die Pferdestute (HOFFMANN et al. 2009) beschrieben ist, wird auch bei diesen beiden zyklischen Maultierstuten beobachtet und steht vermutlich nicht in Verbindung mit der endometrialen Fehldifferenzierung, da es auch bei Pferdestuten mit regulär differenzierten Endometrien in dieser Form beobachtet wird (HOFFMANN et al. 2009). Im Gegensatz zu den Ergebnissen von HOFFMANN et al. (2009), die in den Endometrien von Pferdestuten eine einheitliche CAL-Expression in allen Abschnitten des Endometriums beobachtet, dominiert bei den zwei zyklischen Maultierstuten dieser Studie die Sekretion im Bereich mittlerer und basaler Uterindrüsen. Dies stützt die von GILBERT (1992) aufgestellte Hypothese funktioneller Unterschiede zwischen oberflächlich und tief gelegenen glandulären Epithelien im Sinne eines variablen Ansprechens der Drüsenepithelzellen auf die Schwankungen der Serumhormonkonzentrationen im Zyklusverlauf, wodurch die Sekretionsintensität zwischen oberflächlich und tief gelegenen Uterindrüsen differiert. Darüber hinaus liegt bei diesen zyklischen Maultierstuten, ebenso wie bei Pferdestuten (WOODING et al. 2000, HOFFMANN 2006, HOFF- MANN et al. 2009), eine positive Reaktion im Bereich der Zellkerne der uterinen Epithelien vor, deren Funktion oder Entstehung im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen nicht näher bestimmt werden kann Expression von UG, UK, UF und CAL bei den zwei zyklischen Maultierstuten in Uterindrüsen mit periglandulärer Fibrose In Übereinstimmung mit HOFFMANN et al. (2009) sowie LEHMANN et al. (2008) wird in der Endometrose abhängig von ihrem Ausprägungsgrad überwiegend ein von den umliegenden Drüsen abweichendes Sekretionsmuster aller untersuchten endometrialen Proteine nachgewiesen.

98 DISKUSSION 89 Die Ergebnisse bei den zwei zyklischen Maultierstuten der vorliegenden Studie stützen die Beobachtungen von SCHOON et al. (1995) bei Pferdestuten, dass endometrotisch veränderte Drüsen nicht in demselben Umfang der physiologischen endokrinen Regulation unterliegen wie das umgebende Endometrium, woraus sich die dokumentierten Abweichungen der Nachweisintensität der Proteine ergeben können. Sehr wahrscheinlich hat die veränderte Sekretion der Proteine in der Endometrose bei den zyklischen Maultierstuten, ebenso wie bei Pferdestuten (HOFFMANN et al. 2009), eine Änderung der Zusammensetzung des uterinen Mikromilieus zur Folge. Dies könnte in Verbindung mit den oben aufgeführten endometrialen Differenzierungsstörungen die Chance auf eine Konzeption sowie eine erfolgreiche Trächtigkeit vermindern, da der Embryo bei Equiden aufgrund der langen Präimplantationsperiode auf die Ernährung durch uterine Sekrete angewiesen ist (ALLEN 2000) Abschließende Betrachtung der zyklischen Maultierstuten Die Ergebnisse bei den beiden zyklischen Maultierstuten ähneln in ihrer Gesamtheit den Befunden, die bei Pferdestuten in den Übergangszyklen in Herbst und Frühjahr erhoben werden, wo häufig endometriale Fehldifferenzierungen auftreten (GOCKELN et al. 2006). Bei Pferdestuten existieren zwar bis jetzt keine vergleichbaren Untersuchungen zur Synthese/Sekretion von Uteroglobin, Uterokalin, Uteroferrin und Calbindin D9k in den Übergangszyklen; es ist jedoch denkbar, dass bei den zwei zyklischen Maultierstuten dieser Studie aufgrund der endometrialen Fehldifferenzierung und der starken Variabilität der Steroidhormonrezeptorexpression (HUTH et al. 2008) eine gleichmäßige und adäquate Sekretion der uterinen Proteine nicht möglich ist. Bei Maultieren spielt zwar der ungerade Chromosomensatz mit 2n = 63 eine zentrale Rolle bei den möglichen Ursachen für die Besonderheit des Fortpflanzungsgeschehens (WODSEDALEK 1916), jedoch besteht aufgrund der bei diesen beiden Maultierstuten gewonnenen Erkenntnisse der Verdacht, dass auch bei dieser Spezies endometriale Fehldifferenzierungen in Verbindung mit der veränderten Sekretion der untersuchten uterinen Proteine eine Konzeption sowie eine erfolgreiche Gravidität erschweren könnten. Um dies zu verifizieren, sind jedoch umfassende Untersuchungen sowohl an zyklischen als auch an trächtigen Tieren notwendig. 5.6 Sekretion der uterinen Proteine UG, UK, UF und CAL in der Gruppe der azyklischen Maultierstuten unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde sowie der endometrialen Funktionsmorphologie Uteroglobin, Uterokalin, Uteroferrin Im Zusammenhang mit diesen drei sekretorischen Proteinen des Uterus beschreiben verschiedene Autoren Progesteron als das zentrale Hormon für die Regulation ihrer Synthese/Sekretion im equinen Endometrium, wo eine Erhöhung der Hormonkonzentration eine gesteigerte Proteinsekretion und niedrige Hormonwerte eine geringgradigere Abgabe in das Drüsenlumen bewirken (MCDOWELL et al. 1987, BEIER-HELLWIG et al. 1995, CROSSETT et al. 1996, MÜLLER-SCHÖTTLE et al. 2002, HOFFMANN 2006, HOFFMANN et al. 2009). Bei allen vier azyklischen Maultierstuten aus der vorliegenden Studie werden während des gesamten Untersuchungszeitraums basale Serumprogesteronkonzentrationen bestimmt und inaktiv, jedoch geringgradig irregulär differenzierte Endometrien vorgefunden. In Übereinstimmung mit den histomorphologischen Befunden, der klinisch dokumentierten Azyklie und den bei Pferdestuten bekannten Erkenntnissen erfolgt auch bei diesen Maultierstuten die Sekreton von UG und UK mit äußerst schwacher Intensität. Hieraus kann jedoch im Umkehrschluss keine Abhängigkeit der Proteinsynthese von der Serumprogesteronkonzentration abgeleitet werden, da bei den zwei zyklischen Maultierstuten dieser Studie eine eindeutige Regulation der

99 DISKUSSION 90 endometrialen Proteinsekretion unter anderem durch Progesteron, wie sie für die Pferdestute bekannt ist, nicht bestätigt werden konnte. UF wird zu einzelnen Untersuchungszeitpunkten mit geringgradig gesteigerter Intensität sezerniert, wobei jedoch im zeitlichen Umfeld der entsprechenden Tage weder signifikante Schwankungen der Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen noch eine Veränderung der inaktiven endometrialen Funktionsmorphologie oder eine Veränderung der klinisch beobachteten Azyklie nachgewiesen werden können. Dementsprechend bieten die im Rahmen der klinischen, endokrinologischen und pathohistologischen Untersuchungen erhobenen Befunde oder die in der Literatur beschriebenen Regulationsmechanismen durch Progesteron und Östradiol (MCDOWELL et al. 1987, BEIER 2000) keine Erklärung für die Schwankungen der UF- Sekretion. Spekuliert werden kann lediglich über den - im Rahmen dieser Studie nicht berücksichtigten - Einfluss des Prolaktins, das laut FLISS et al. (1991) in vitro in den endometrialen Epithelien von Jungsauen gemeinsam mit Östradiol eine Verstärkung der UF-Promotor-Aktivität induziert. Um diesen Aspekt zu klären, sind weiterführende molekularbiologische Untersuchungen notwendig. Bei allen vier azyklischen Maultierstuten erfolgt der Nachweis von UK im Endometrium sowohl innerhalb eines Drüsenquerschnitts als auch zwischen den Uterindrüsen gleichmäßig und diffus im Zytoplasma der uterinen Epithelien, was dem Sekretionsmuster in den glandulären Epithelien bei Pferdestuten entspricht (HOFFMANN et al. 2009). UG und UF liegen zwar auch diffus verteilt im Zytoplasma des glandulären und luminalen Epithels vor, im Gegensatz zu UK erfolgt die Sekretion dieser beiden Proteine jedoch deutlich uneinheitlich. Wie schon bei den zwei zyklischen Maultierstuten, die für diese Studie untersucht wurden, stellt auch bei den vier azyklischen Tieren die nachgewiesene endometriale Fehldif-ferenzierung in Anlehnung an die Erkenntnisse bei Pferdestuten (ELLENBERGER et al. 2004) eine mögliche Erklärung für diesen Befund dar Calbindin In Bezug auf die Synthese dieses intrazellulären Kalzium-Transportmoleküls im Uterus existieren zwischen verschiedenen Spezies deutliche Unterschiede. Bei der Sau zeigt Progesteron einen inhibitorischen Einfluss (KRISINGER et al. 1995), bei der Maus, der Kuh und der Pferdestute eine deutliche Abhängigkeit von den Serumprogesteronkonzentrationen der einzelnen Zyklusphasen (INPANBUTR et al. 1994, TATSUMI et al. 1999, HOFFMANN 2006, HOFFMANN et al. 2009). Die Expression von CAL im Endometrium von Maultierstute 3, 4 und 5 wird einheitlich mit insgesamt maximal geringgradiger Intensität nachgewiesen, was mit den endokrinologisch bestimmten niedrigen Serumprogesteronkonzentrationen übereinstimmt und zu den Ergebnissen von HOFFMANN et al. (2009) passt, die bei Pferdestuten sehr geringgradige SSc-Werte mit dem Absinken der Serumprogesteronkonzentrationen im Östrus er-mittelt. In den Epithelzellen der Uterindrüsen von Maultierstute 6 erfolgt vereinzelt eine gering- bis mittelgradige Expression des kalziumbindenen Proteins, wobei keine auffälligen Abweichungen der Serumprogesteronkonzentration oder eine Variation der endometrialen Funktionsmorphologie im Vergleich zu den anderen azyklischen Maultieren festgestellt werden können. Eine derartige interindividuelle Variabilität des CAL-Nachweises sowohl hinsichtlich der Expressionsintensität als auch der Anzahl der positiv reagierenden Drüsenepithelzellen beschreiben auch HOFFMANN et al. (2009) bei Pferdestuten. Während die Autorenn dieses Phänomen auf den kurzen Zeitraum zurückführen, in dem die Pferdestuten beprobt wurden, ist es bei Maultierstute 6 aus dieser Studie wahrscheinlicher, dass die CAL-Expression im Endometrium bei diesem Tier durch die glanduläre Fehldifferenzierung beeinträchtigt ist. Wie schon bei Pferdestuten (WOODING et al. 2000, HOFFMANN 2006, HOFFMANN et al. 2009) und den zwei zyklischen Maultierstuten dieser Studie beobachtet, liegt auch bei den azyklischen Maultieren ein mosaikartiges Expressionsmuster von CAL sowohl innerhalb eines Drüsenquerschnitts als auch in den endo-

100 DISKUSSION 91 metrialen Epithelien eines Bioptats vor. HOFFMANN et al. (2009) vermuten bei Pferdestuten die Ursache hierfür in einer unterschiedlichen Syntheseaktivität der Epithelzellen einer Drüse und zwischen den Uterindrüsen. Bei den vier Maultierstuten der vorliegenden Studie erscheint jedoch die Beeinträchtigung der zellulären Funktionen durch die konstante Azyklie und die dokumentierte Fehldifferenzierung wahrscheinlicher, da auch ELLENBERGER et al. (2004) in fehldifferenzierten Endometrien von Pferdestuten eine gestörte Calbindin D9k -Sekretion beobachten. Im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen kann, wie schon bei den zyklischen Maultieren und bei Pferdestuten (WOODING et al. 2000, HOFFMANN 2006, HOFFMANN et al. 2009), die Ursache für den intranukleären Nachweis von CAL nicht abschließend geklärt werden Expression von UG, UK, UF und CAL bei den azyklischen Maultierstuten in Uterindrüsen mit periglandulärer Fibrose Während die Expression von UF und UK in der Endometrose ebenso geringgradig ausgeprägt ist wie im umliegenden Endometrium, wird UG von den fibrotisch veränderten Drüsen teilweise mit geringgradig gesteigerter, CAL dagegen mit überwiegend verminderter Intensität exprimiert. Zwar existieren noch keine vergleichbaren Untersuchungen bei azyklischen Pferde- oder Eselstuten, jedoch liegt bei den vier azyklischen Maultieren dieser Studie der Verdacht nahe, dass eine Alteration der Drüsenepithelzellen auf der Ebene der Hormonrezeptorexpression besteht, wie sie auch bei zyklischen Pferdestuten beobachtet wird, und was in Differenzierungsstörungen sowie einer Beeinträchtigung zellulärer Funktionen resultiert (LÖFFLER u. PETRIDES 1998, RAILA et al. 1998, HUTH et al. 2008) Abschließende Betrachtung der azyklischen Maultierstuten Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass die vier azyklischen Maultierstuten inaktive Ovarien, basale Serumhormonkonzentrationen (BARTMANN et al. 2008) und ein inaktives, fehldifferenziertes Endometrium mit entsprechend niedriger Sekretion der endometrialen Proteine UG, UK, UF und CAL besitzen. Die Expression der Steroidhormonrezeptoren erfolgt variabel bei nicht vorhandener oder nur vereinzelt nachweisbarer Proliferationsaktivität (HUTH et al. 2008). In ihrer Gesamtheit ähneln diese Befunde den Ergebnissen, die AUPPERLE et al. (2003) bei Pferdestuten im Winteranöstrus bzw. während des Anöstrus in der physiologischen Zuchtsaison gewinnen. Die klinischen und endokrinologischen Befunde bei diesen azyklischen Maultierstuten unterstützen die Beobachtungen verschiedener Autoren (DAVIES et al. 1985, MÖLLMANN 1991). Im Rahmen der histomorphologischen und immunhistologischen Untersuchungen konnte erstmals gezeigt werden, dass bei diesen Tieren - übereinstimmend mit den klinischen Befunden - inaktive sowie geringgradig fehldifferenzierte Endometrien mit degenerativen Alterationen in Form einer Endometrose und einer Fibroelastose im Bereich der arteriellen und venösen Gefäße vorliegen. Obwohl es vereinzelt Berichte über fertile Maultierstuten gibt (ANDERSON 1930, BALDWIN, JR. 1939, RONG et al. 1985, RYDER et al. 1985), darf aufgrund der im Rahmen dieser Studie gewonnenen Ergebnisse bezweifelt werden, dass das Endometrium azyklischer Maultierstuten dem Konzeptus ein uterines Milieu bietet, das sowohl für den Zeitraum der Präimplantationsperiode als auch bis zum Ende der Gravidität seine adäquate Versorgung sichert.

101 DISKUSSION Regumate -Applikation bei zwei Maultieren aus der azyklischen Gruppe Klinisch-gynäkologische und endokrinologische Befunde vor, unter und nach der Regumate -Applikation In Anlehnung an die bei Pferdestuten vorgenommenen experimentellen Progestagen-Langzeitapplikationen (KLUG et al. 1997), erhielten auch die beiden azyklischen Maultierstuten dieser Studie eine tägliche orale Behandlung mit Altrenogest (Regumate Equine, Fa. Intervet, 0,044 mg/kg KM). Darüber hinaus existieren jedoch im Aufbau der vorliegenden Studie, im Vergleich zu dem Versuchsdesign bei Pferdestuten, Unterschiede, die in Tab. 5.1 dargestellt sind. Tab. 5.1: Vergleichende Darstellung des Versuchsaufbaus einer Regumate -Langzeitbehandlung bei Pferde- (KLUG et al. 1997) und Maultierstuten* Regumate -Behandlung Pferdestuten Regumate -Behandlung Maultierstuten* Tiergut Applikationsregime(s) Zeitraum der Studie 4 zyklische Warmblutstuten d 22 d 12 d Februar bis April (5-14 Jahre) 32 d 16 d 36 d 2 azyklische Maultierstuten + August bis Oktober (19 und 21 Jahre) 50 d Legende zu Tab. 5.1: * = Tiere der vorliegenden Studie; d = Tage; + = Verabreichung von Altrenogest (Regumate Equine, Fa. Intervet, 0,044 mg/kg KM) per os; -- = Behandlungspause Während KLUG et al. (1997) bei Pferdestuten unmittelbar nach Beginn der Progestagen-Langzeitapplikation eine signifikante Reduzierung der Ovargröße sowie basale Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen und nach Absetzen des Medikaments die Ausprägung von Rossesymptomen sowie Ovulationen in Verbindung mit einem Anstieg der Östradiolkonzentration auf östrische Werte feststellen, wird bei den beiden azyklischen Maultierstuten des vorliegenden Experiments keine Veränderung der Ovargröße oder die Ausbildung von Funktionskörpern beobachtet. Auch die Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen der beiden azyklischen Maultierstuten unterliegen - im Gegensatz zu den bei Pferdestuten bestimmten Konzentrationen nach Absetzen von Regumate (KLUG et al. 1997) - nicht den Schwankungen, die aufgrund des Wirkungsprinzips dieses Progestagens (s. Kap ) zu erwarten gewesen wären. Eine mögliche Erklärung hierfür bietet die Tatsache, dass es sich bei den Pferdestuten, die in der zum Vergleich herangezogenen Studie verwendet wurden, bei Behandlungsbeginn um weitgehend zyklische Tiere handelt, während bei den beiden Maultierstuten weder in dem Zeitraum der Studie noch in den davorliegenden Jahren klinische Anzeichen eines Zyklusgeschehens sowie die damit verbundenen Variationen der Sexualhormonkonzentrationen im Blut nachgewiesen werden konnten (persönliche Mitteilung PD Dr. C.P. BARTMANN, Leipzig, ). Diese Vermutung wird durch die Beobachtungen von DAVIES et al. (1985) gestützt, die im Rahmen eines Embryotransfers unter anderem azyklische Maultierstuten als Rezipientinnen verwenden, und bei diesen Tieren ebenfalls keine Ausbildung von Funktionskörpern oder eine Veränderung der Größe der Ovarien, weder in den Monaten vor Beginn des Experiments noch während der Verabreichung von Regumate zur Synchronisation mit den Donorstuten feststellen. Ebenso berichten verschiedene andere Autoren im Zusammenhang mit der Verabreichung von Regumate bei Pferdestuten über eine Abhängigkeit des Behandlungserfolges von dem Vorhandensein aktiver Ovarien und dem Vorliegen eines Zyklusgeschehens (ALLEN et al. 1980, TURNER et al. 1981, SQUIRES et al. 1983a).

102 DISKUSSION Histomorphologie des Endometriums der beiden azyklischen Maultierstuten vor, unter und nach Regumate -Applikation unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde Bei den zwei azyklischen Maultieren dieser Studie liegt bereits vor Beginn der Regumate -Applikation ein geringgradig irregulär differenziertes Endometrium vor. Mögliche Ursachen hierfür wurden bereits in Kap diskutiert. Im Gegensatz zu den zwei azyklischen Maultieren sind die Endometrien der Pferdestuten, die KLUG et al. (1997) für eine Progestagen-Langzeitapplikation verwenden, regulär differenziert. Sowohl bei den zwei a- zyklischen Maultierstuten dieser Studie als auch bei den Pferdestuten aus dem vergleichbaren Experiment (KLUG et al. 1997) entwickelt sich unter der Regumate -Applikation eine teilweise überdeutliche und stark irreguläre sekretorische endometriale Differenzierung, womit eine vergleichbare Auswirkung von Regumate (Altrenogest) auf die endometriale Funktionsmorphologie bei zwei zu den Equiden gehörigen Spezies aufgrund dieser Ergebnisse sehr wahrscheinlich ist. Im Gegensatz zu den Pferdestuten, die KLUG et al. (1997) in ihrer Studie untersuchen, zeigen die zwei azyklischen Maultierstuten des vorliegenden Versuchs keine Veränderung des klinisch dokumentierten Zustands der Ayzklie, der Serumhormonkonzentrationen oder Änderungen in der Ovardimension, sodass bei diesen Tieren der Einfluss eines exogen applizierten Progestagens ausschließlich an der Entwicklung einer irregulär sekretorischen endometrialen Funktionsmorphologie erkennbar ist. Hervorzuheben ist bei den zwei Maultierstuten der vorliegenden Studie, dass am siebenunddreißigsten Behandlungstag, abweichend von der irregulär sekretorischen endometrialen Differenzierung, die an vorangegangenen Untersuchungsterminen nachgewiesen wurde, eine ungleichmäßig beziehungsweise irregulär proliferative Funktionsmorphologie dokumentiert wird. Aufgrund der schon vor der Progestagen-Langzeitapplikation nachgewiesenen endometrialen Fehldifferenzierung und der von HUTH et al. (2008) bei diesen Maultierstuten beschriebenen äußerst uneinheitlichen Expression der ER und PR kommt es möglicherweise zu einer Beeinträchtigung der Steroidhormonwirkung in den glandulären Epithelien, was die unterschiedlichen Funktionszustände innerhalb eines Bioptats erklären könnte. Gestützt wird diese Vermutung durch die Beobachtungen von SCHOON et al. (1999), die ein entsprechendes Phänomen in ungleichmäßig differenzierten Endometrien von Pferdestuten beobachten. Bei Pferdestuten, die drei Monate nach Beendigung einer Regumate -Langzeitgabe bioptiert wurden (KLUG et al. 1997), erweist sich die unter der Behandlung aufgetretene irreguläre endometriale Differenzierung als partiell reversibel. Diese Beobachtung entspricht den Befunden an den Endometrien der zwei azyklischen Maultiere dieser Studie. Bei Maultierstute 4 ist das Endometrium wechselnd irregulär inaktiv oder deutlich irregulär sekretorisch differenziert, bei Maultierstute 5 überwiegt nach Beendigung der Medikation eine geringgradig irregulär inaktive endometriale Funktionsmorphologie. Die Fehldifferenzierung, die zwei Jahre nach der Progestagen-Applikation nachweisbar ist, entspricht sowohl qualitativ als auch quantitativ den Veränderungen, die vor Beginn der Regumate -Langzeitgabe vorlagen. Eine Entscheidung hinsichtlich einer vollständigen Reversibilität der unter der Behandlung aufgetretenen irregulären endometrialen Differenzierung kann bei diesen zwei Maultierstuten nicht getroffen werden, da bereits zu Behandlungsbeginn eine glanduläre Fehldifferenzierung vorliegt. Die unter der Regumate -Applikation aufgetretene überdeutliche irreguläre Sekretionsmorphologie kann jedoch nach Absetzen des Medikaments nicht mehr nachgewiesen werden. Folglich liegt die Schlussfolgerung nahe, dass eine hormonelle Langzeitintervention bei Maultierstuten ähnlich wie bei Pferdestuten die Ausprägung der Irregularität endometrialer Epithelien zumindest für den Zeitraum der Behandlung steigert. Die einmalig bei Maultierstute 5 aufgetretene Endometritis zu Beginn der Regumate -Langzeitapplikation ist entsprechend den Vermutungen von KLUG et al. (1997), die ein ähnliches Phänomen bei Pferdestuten beobachten, wahrscheinlich als Abwehrreaktion des Endometriums auf latent vorhandene Keime zu interpretie-

103 DISKUSSION 94 ren. Des Weiteren kann bei einem transvaginalen Zugang zum Uterus nicht ausgeschlossen werden, dass Keime eingebracht werden, die bei immunsuppressiver Sekretionssituation haften (DEEGEN et al. 2002) Sekretion von UG, UK und UF vor, unter und nach der Regumate -Applikation unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde Für diese drei sekretorischen Proteine des Uterus ist bei der Pferdestute vor allem eine progesteronabhängige Regulation ihrer Synthese/Sekretion beschrieben (ZAVY et al. 1982, STEWART et al. 1995, MÜLLER- SCHÖTTLE et al. 2002, HOFFMANN 2006, HOFFMANN et al. 2009). Dementsprechend werden die drei Proteine in den Endometrien der zwei azyklischen Maultierstuten dieser Studie vor der Progestagen- Langzeitapplikation bei parallel bestimmten niedrigen Serumhormonkonzentrationen und inaktiver irregulärer endometrialer Differenzierung lediglich mit schwacher Intensität und ungleichmäßiger Expression nachgewiesen. Im Verlauf der Regumate -Behandlung steigert sich die Sekretion aller drei Proteine nur leicht, wobei die ungleichmäßige glanduläre Expression von UG nach wie vor dokumentiert wird. UK wird auch unter der Progestagen-Applikation gleichmäßig in allen Drüsen exprimiert, bei UF hingegen ist dies nur innerhalb eines Drüsenquerschnitts der Fall. ELLENBERGER et al. (2004) beobachten im Rahmen immunhistologischer Untersuchungen des Endometriums Progestagen-langzeitbehandelter Pferdestuten unter der Behandlung ebenfalls eine deutlich uneinheitliche Sekretion von UG und UF sowohl innerhalb eines Drüsenquerschnitts als auch zwischen den Uterindrüsen. Dies wird auch bei den im Rahmen dieser Studie untersuchten Maultieren nachgewiesen und ist am ehesten als Folge der Fehldifferenzierung zu interpretieren. UK dagegen zeigt bei Pferdestuten unter Regumate -Behandlung ein abweichendes Reaktionsmuster: ELLENBER- GER et al. (2004) dokumentieren in den Endometrien der Pferdestuten eine Hypersekretion von UK. Bei den zwei azyklischen Maultierstuten hingegen steigert sich unter der Behandlung die Sekretionsintensität dieses Proteins trotz überdeutlicher irregulärer Sekretionsmorphologie des Endometriums nur geringgradig. Aus diesen Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass eine Langzeitbehandlung mit Regumate bei den zwei azyklischen Maultierstuten dieser Studie zwar mit einer überdeutlichen endometrialen Sekretionsmorphologie einhergeht, aber im Gegensatz zu den bei Pferdestuten beschriebenen Erkenntnissen (ELLENBERGER et al. 2004) lediglich mit einer geringgradig gesteigerten Sekretion von UG, UK und UF assoziiert ist. Möglicherweise exisitieren außer dem Einfluss des Progesterons noch weitere Regulationsmechanismen für die Synthese und Sekretion der untersuchten Proteine, die jedoch mittels der durchgeführten Untersuchungen dieser Studie nicht aufgedeckt werden konnten. Nach dem Absetzen von Regumate kann in den Endometrien von zwei der vier Pferdestuten eine persistierende irreguläre endometriale Differenzierung in Verbindung mit einer atypischen Sekretion von UG, UF und UK beobachtet werden (KLUG et al. 1997, ELLENBERGER et al. 2004). Diese Ergebnisse sind mit den im Rahmen der hier vorliegenden Studie gewonnenen Erkenntnissen nur bedingt vergleichbar. Bei diesen zwei Maultierstuten wird post applicationem, passend zur klinischen Azyklie, ein geringgradig irregulär inaktiv differenziertes Endometrium mit einer dezent ausgeprägten, ungleichmäßigen Sekretion der drei Proteine vorgefunden. Die bei diesen Tieren beobachtete endometriale Fehldifferenzierung in Verbindung mit einer atypischen Proteinsekretion ist jedoch nicht abschließend interpretierbar, da sie zwar im Vergleich zu dem Zeitraum unter der Regumate -Behandlung abnimmt, jedoch schon vor der Behandlung bestand, und auch in den Proben vor der Progestagen-Gabe ein gestörtes Sekretionsmuster der Proteine vorlag.

104 DISKUSSION Expression von CAL vor, unter und nach der Regumate -Applikation unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde In den Endometrien progestagen-langzeitbehandelter Pferdestuten weisen ELLENBERGER et al. (2004) immunhistologisch eine deutlich übersteigerte Expression von CAL nach. Wie schon von HOFFMANN (2006) vermutet, legen auch diese Ergebnisse den Verdacht nahe, dass die Expression dieses Proteins durch Progesteron positiv beeinflusst wird. Der Nachweis von CAL im Endometrium der zwei azyklischen Maultierstuten der vorliegenden Studie erfolgt vor Beginn der Regumate -Gabe erwartungsgemäß mit maximal geringgradiger Intensität, wobei die Sekretion sowohl innerhalb eines Drüsenquerschnitts als auch zwischen den Uterindrüsen hochgradig ungleichmäßig erfolgt. Das schon von anderen Autoren beschriebene (WOODING et al. 2000, HOFFMANN 2006) charakteristisch mosaikartige Reaktionsmuster innerhalb einer Drüse wird auch in den Endometrien der zwei azyklischen Maultierstuten beobachtet. Analog zu den Ergebnissen von ELLENBERGER et al. (2004) bei Pferdestuten steigert sich auch bei den zwei azyklischen Maultierstuten der vorliegenden Studie unter der Medikation die Expression von CAL um das 25- bis 50-fache im Vergleich zu den vor der Behandlung bestimmten SSc-Werten. Hieraus lässt sich schließen, dass das exogen applizierte Progestagen Regumate auch bei diesen zwei Maultierstuten zu einer Stimulierung der CAL-Synthese und -expression bei irregulär sekretorischer endometrialer Dif-ferenzierung führt. Im Gegensatz zu den bei Pferdestuten beschriebenen Erkenntnissen (ELLENBERGER et al. 2004), werden jedoch keine Änderungen der Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen oder der ovariellen Aktivität dokumentiert. Nach Beendigung der Regumate -Gabe wird sowohl in den Endometrien von zwei Pferdestuten (ELLENBERGER et al. 2004) als auch in den Uterindrüsen der im Rahmen dieser vorliegenden Studie untersuchten Maultierstuten eine atypische Sekretion von CAL dokumentiert. Bei den zwei azyklischen Maultierstuten nimmt zwar die Expressionsintensität des Proteins im Vergleich zu derjenigen unter der Regumate -Behandlung wieder deutlich ab, zeigt aber bis Tag 27 post applicationem insgesamt geringgradig höhere SSc-Werte als vor der Medikation. Insgesamt weichen diese Befunde von den Ergebnissen der sekretorischen Proteine UG, UF und UK ab, deren Nachweis in den uterinen Epithelien post applicationem bei basalen Serumprogesteron- und -östradiolkonzentrationen ebenso dezent erfolgt wie vor der Behandlung. zwei Jahre post applicationem wird CAL im Endometrium von Maultierstute 4 mit vergleichbarer Intensität wie vor der Regumate -Gabe nachgewiesen, bei Maultierstute 5 werden zu diesem Untersuchungstermin geringgradig höhere SSc-Werte bestimmt als vor der Behandlung. Diese Befunde sind schwer interpretierbar, da in dem Zeitraum zwischen dem 27. Tag post applicationem und dem Entnahmetermin zwei Jahre post applicationem keine weiteren Bioptate untersucht wurden. Die schwache CAL-Expression im Endometrium von Maultierstute 4 zwei Jahre nach der Progestagen- Langzeitapplikation weist darauf hin, dass die unter der Behandlung hochgradig gesteigerte Sekretion nach der Behandlung wieder absinkt. Bei der geringgradig erhöhten Expression im Endometrium von Maultierstute 5 zwei Jahre post applicationem ist nicht entscheidbar, ob es sich um eine gleichbleibend erhöhte Sekretion des Proteins oder lediglich um einen Sekretionspeak ohne Korrelation zu Zyklusphase und Serumhormonkonzentrationen handelt, wie er auch vor der Regumate-Applikation vereinzelt beobachtet wurde. Des Weiteren könnte vermutet werden, dass auf molekularbiologischer Ebene gattungsspezifische Unterschiede in der Expression zwischen Maultieren und Pferden bestehen, da für CAL eine große Variation hinsichtlich seiner Lokalisation in unterschiedlichen Geweben, seiner Regulation sowie seiner Expressionsintensität bei verschiedenen Tierarten beschrieben wird (DELORME et al. 1983, INPANBUTR et al. 1994, KRISINGER et al. 1995, TATSUMI et al. 1999, HOFFMANN 2006, HOFFMANN et al. 2009).

105 DISKUSSION Expression der ER und PR sowie von Ki-67 Antigen vor, unter und nach der Regumate -Applikation unter Berücksichtigung der klinischen und endokrinologischen Befunde In der Literatur existieren mehrere Angaben zu Untersuchungen einer atypischen Steroidhormonrezeptorexpression in fehldifferenzierten Endometrien von Pferdestuten, wobei in Bezug auf die Ursachen mehrere Faktorenkomplexe unterschieden werden: Hormonell aktive Dysfunktionen des Ovars (ELLENBERGER 2003), der saisonale Übergang von der physiologischen Zuchtsaison zum Winteranöstrus und der Beginn der saisonalen Aktivität im folgenden Frühjar (GOCKELN, persönliche Mitteilung, Leipzig, ), die physiologische Inaktivität während des Winteranöstrus und die pathologische Inaktivität des Endo-metriums während der physiologischen Zuchtsaison (AUPPERLE et al. 2003) sowie eine durch Progestagenapplikation hervorgerufene endometriale Fehldifferenzierung (KLUG et al. 1997). Die Ätiopathogenese für die aufgeführten potenziellen Ursachen der endometrialen Fehldifferenzierungen wird in hormonellen Imbalancen und/oder einem (partiell) hormonrefraktären Endometrium gesehen. In Übereinstimmung mit den Befunden, die AUPPERLE et al. (2003) bei Pferdestuten während des Winteranöstrus oder im Anöstrus während der physiologischen Decksaison beobachten, variieren die IRS-Werte der ER- und PR-Expression vor der Progestagen-Langzeitapplikation bei den beiden azyklischen Maultierstuten deutlich. Darüber hinaus erfolgt die Expression in allen endometrialen Strukturelementen ungleichmäßig. Die Ursache hierfür stellt zum einen wahrscheinlich die irreguläre endometriale Differenzierung dar, da auch HÄFNER et al. (2001) in den fehldifferenzierten Endometrien von Pferdestuten eine atypische Expression der ER nachweisen. Zum anderen könnte die Variabilität der Steroidhormonrezeptorexpression bei den zwei azyklischen Maultierstuten dieser Studie in der Besonderheit dieser Gattung begründet liegen, dass zahlreiche adulte weibliche Tiere zwar ein vollständig funktionsfähiges Genitale besitzen, jedoch aufgrund der ungeraden Chromosomenzahl von 2n = 63 zu keiner Jahreszeit eine zyklische Aktivität entwickeln (DAVIES et al. 1985, MÖLLMANN 1991). Bei den zwei azyklischen Maultierstuten dieser Studie erfolgt unter der Behandlung mit Regumate sowie post applicationem die Expression der Steroidhormonrezeptoren - im Gegensatz zu der bei Pferdestuten nachgewiesenen Downregulation unter der Progestagen-Langzeitapplikation (KLUG et al. 1997) - mit insgesamt deutlich gesteigerter Intensität, allerdings schwanken die IRS-Werte extrem, und der Nachweis der ER und PR innerhalb eines Drüsenquerschnitts erfolgt hochgradig ungleichmäßig. Die Interpretation dieser Ergebnisse erweist sich als äußerst schwierig, da bei den zwei Tieren schon vor Beginn der Behandlung eine endometriale Fehldifferenzierung mit ungleichmäßiger Expression der ER und PR sowohl innerhalb eines Drüsenquerschnitts als auch im umliegenden Endometrium bestand. Auch bei den Untersuchungen am Endometrium Progestagen-langzeitbehandelter Pferdestuten (KLUG et al. 1997) bestehen in Bezug auf diesen Punkt noch zahlreiche Unklarheiten. Ein Erklärungsansatz bei den zwei azyklischen Maultierstuten der vorliegenden Studie besteht möglicherweise im Zusammenhang mit der unter der Regumate -Gabe auftretenden hochgradig irregulär sekretorischen endometrialen Differenzierung, da auch HÄFNER (1999) in den Endometrien von Pferdestuten mit derartiger Fehldifferenzierung eine unverhältnismäßig starke glanduläre und stromale Expression der ER beobachtet. Die Autorin sieht ursächlich eine gestörte Signaltransduktion auf Rezeptorebene als wahrscheinlich an. Bei den zwei Maultierstuten der vorliegenden Studie ist es vorstellbar, dass auf Grund der Azyklie ein generalisierter endometrialer Defekt auf Rezeptor-Effektor-Ebene besteht, durch den die adäquaten Wirkungen von Progesteron bzw. Altrenogest in diesem Fall und Östradiol beeinträchtigt werden. Um eine derartige Vermutung zu bestätigen, sind jedoch molekularbiologische Untersuchungen erforderlich, die im Rahmen dieser Studie nicht duchgeführt wurden.

106 DISKUSSION 97 Entsprechend den Befunden einer atypischen Steroidhormonrezeptorexpression wird auch der Proliferationsmarker Ki-67 Antigen in den Endometrien der zwei azyklischen Maultierstuten deutlich uneinheitlich exprimiert. Übereinstimmend mit der sehr geringgradigen Proliferationsaktivität, die AUPPERLE et al. (2003) in den Endometrien von Pferdestuten während des Winteranöstrus beobachten, erfolgt sein Nachweis bei den zwei Maultierstuten der vorliegenden Studie vor der Progestagen-Langzeitapplikation in Übereinstimmung mit der klinisch dokumentierten Azyklie und einem inaktiven Endometrium ebenfalls nur vereinzelt positiv. Wie auch in den Endometrien der mit Progestagen langzeitbehandelten Pferdestuten, die KLUG et al. (1997) untersuchen, erfolgt - bis auf wenige Ausnahmen - auch bei den zwei azyklischen Maultierstuten dieser Studie unter der Regumate -Applikation eine überwiegend sehr geringgradige Expression von Ki-67 Antigen. Die vereinzelt auftretende gesteigerte Proliferationsaktivität der endometrialen Strukturelemente steht sehr wahrscheinlich im Zusammenhang mit der atypischen Steroidhormonrezeptorexpression, da auch HÄFNER (1999) in irregulär sekretorisch differenzierten Endometrien von Pferdestuten mit unverhältnismäßig gesteigerter ER-Expression eine überdeutliche mitotische Aktivität beobachtet, die - wie auch in den uterinen Drüsenepithelien und Stromazellen der zwei azyklischen Maultiere dieser Studie - zu Beginn der Behandlung auftritt. Die bei den zwei azyklischen Maultierstuten der vorliegenden Studie post applicationem dokumentierte ü- berwiegend vereinzelt auftretende Proliferationsaktivität steht den Ergebnissen von KLUG et al. (1997) entgegen, die bei Pferdestuten nach Absetzen des Medikaments zur Zeit des Ovulationstermins einen Peak der Ki-67 Antigen-Expression nachweisen. Bei diesen Pferdestuten erfolgt gemäß dem Wirkungsprinzip von Regumate (KROKER 2006) nach Absetzen des Medikaments ein Anstieg der Serumöstradiolkonzentration, der klinisch mit dem Auftreten von Rossesymptomen und Ovulationen verbunden ist. Obwohl bei den zwei Maultierstuten der vorliegenden Studie nach Beendigung der Progestagen- Langzeitbehandlung weder Veränderungen der Serumhormonkonzentrationen noch eine Rossesymptomatik festgestellt werden, besteht eine irregulär und ungleichmäßig proliferative endometriale Differenzierung, die gemäß den Untersuchungen von RAILA et al. (1997) sowie AUPPERLE et al. (2000) durch eine deutliche Expression von Ki-67 Antigen gekennzeichnet sein sollte. Da dies bei den zwei Maultierstuten nicht der Fall ist, liegt eine Erklärung für die nachgewiesene geringgradige endometriale Proliferationsaktivität post applicationem möglicherweise in der persistierenden Azyklie bei diesen zwei Tieren begründet Abschließende Betrachtung der zwei azyklischen Maultierstuten vor, unter und nach Regumate -Applikation Anhand des Vergleichs klinischer, endokrinologischer, histomorphologischer und immunhistologischer Ergebnisse zweier azyklischer Maultierstuten vor, unter und nach einer Progestagen-Langzeitapplikation konnte gezeigt werden, dass exogen über einen längeren Zeitraum zugeführte Progestagene bei Maultierstuten, wie bei Pferdestuten (KLUG et al. 1997), am Endometrium eine überdeutliche Sekretionsmorphologie mit ausgeprägter Irregularität bedingen. Bezüglich der endometrialen Funktionsmorphologie scheint es sich, ebenso wie bei Pferdestuten, um prinzipiell reversible Veränderungen zu handeln. Hinsichtlich der klinischen und endokrinologischen Befunde unterscheiden sich die Ergebnisse der vorliegenden Studie von den Befunden, die KLUG et al. (1997) bei zyklischen Pferdestuten gewinnen, da bei den zwei hier untersuchten Maultierstuten der klinische Zyklusstand der Azyklie in Verbindung mit relativ niedrigen Serumhormonkonzentrationen auch nach Absetzen des Medikaments persistiert. Mit den vorliegenden Untersuchungen vergleichbare Beobachtungen werden hingegen von SQUIRES et al. (1983) bei anöstrischen Pferdestuten und von DAVIES et al. (1985) bei azyklischen Maultierstuten gemacht, bei denen ebenfalls kein Östrus nach Regumate -Behandlung auftritt. Folglich muss in Anlehnung an die Beobachtungen

107 DISKUSSION 98 dieser Autoren sowie unter Berücksichtigung der vorliegenden Untersuchungsergebnisse die Verwendbarkeit von Regumate als Mittel der Wahl zur Ovulationsinduktion und -synchronisation (ANON. 2006) auch bei diesen azyklischen Maultieren als nicht effektiv angesehen werden. Im Gegensatz zu den immunhistologischen Untersuchungsergebnissen von ELLENBERGER et al. (2004) bei den Progestagen-langzeitbehandelten Pferdestuten steigert sich bei den beiden azyklischen Maultierstuten die vor der Behandlung beobachtete dezente Sekretion von UG, UK und UF unter der Medikation nur geringgradig, obwohl eine überdeutliche endometriale Sekretionsmorphologie vorliegt. Die Ursache für diese Ergebnisse konnte im Rahmen der durchgeführten Studie zwar nicht aufgedeckt werden; es liegt allerdings die Vermutung nahe, dass bei einer sowohl klinisch als auch histologisch dokumentierten Azyklie die endometrialen Synthesemechanismen für die untersuchten Proteine nicht in demselben Maß ausgebildet sind wie bei zyklischen Stuten. Um diese Annahme zu verifizieren sind jedoch molekularbiologische Untersuchungen notwendig, die im Zuge dieser Studie nicht durchgeführt wurden. Hinsichtlich der CAL-Expression stimmen die Ergebnisse bei den zwei azyklischen Maultierstuten weitgehend mit den Beobachtungen von ELLENBERGER et al. (2004) bei zwei Pferdestuten unter Regumate - Gabe überein, da sich die Sekretion des vor der Behandlung lediglich geringgradig intensiv exprimierten Proteins unter der Hormongabe hochgradig steigert. Post applicationem erfolgt der Nachweis wieder mit geringradigerer Intensität. Bis auf UK zeigen alle untersuchten Proteine ein atypisches Sekretionsmuster, was am ehesten im Zusammenhang mit der endometrialen Fehldifferenzierung zu interpretieren ist, die zwar vor der Medikation schon vorlag, sich im Verlauf der Regumate -Gabe jedoch deutlich intensiviert. Im Vergleich zu den Befunden vor der Behandlung steigert sich die Expression der ER und PR unter und nach der Behandlung deutlich, wobei auffällt, dass die Expression der Steroidhormonrezeptoren an zahlreichen Untersuchungsterminen unter der Behandlung und post applicationem synchron in Drüsen und Stroma verläuft, die Expression bezogen auf das gesamte Endometrium jedoch deutlich variabel ausgeprägt ist. Diese Ergebnisse unterscheiden sich grundlegend von den Beobachtungen von KLUG et al. (1997), die unter der Medikation eine Downregulation der ER und PR mit anschließendem Expressions-Peak nach Absetzten des Medikaments zum Zeitpunkt der Ovulation beobachten. Eine mögliche Erklärung für die Befunde in den Endometrien der zwei azyklischen Maultierstuten bietet die pathohistologisch nachgewiesene Fehldifferenzierung, da auch HÄFNER (1999) im fehldifferenzierten Endometrium von Pferdestuten eine atypische Steroidhormonrezeptorexpression beobachtet. Ursächlich vermutet die Autorin Störungen dieser zellulären Funktionselemente auf molekularer Ebene, was jedoch durch entsprechende Untersuchungen abzuklären bleibt. Die Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 Antigen erfolgt in den Endometrien der zwei azyklischen Maultieren dieser Studie überwiegend mit sehr geringgradiger Intensität. Die vereinzelt auftretende Intensivierung der Proliferationsaktivität korreliert mit keinem der parallel bestimmten Parameter und ist somit sehr wahrscheinlich ebenso wie die gestörte Expression der Steroidhormonrezeptoren - als Ausdruck der endometrialen Fehldifferenzierung zu werten. Wie schon durch zahlreiche Untersuchungen bei Pferdestuten bekannt (KENNEY u. DOIG 1986, SCHOON et al. 1995, RAILA 2000, HOFFMANN 2006, HOFFMANN et al. 2009), unterliegen auch bei den zwei azyklischen Maultieren dieser Studie die Uterindrüsen innerhalb fibrotischer Areale einer vom umliegenden Endometrium abweichenden Differenzierung. Wie in Drüsen mit periglandulärer Fibrose bei Pferdestuten (AUPPERLE et al. 2000, LEHMANN et al. 2008) erfolgt die Sekretion der untersuchten endometrialen Proteine, die Expression der ER, PR und von Ki-67 Antigen in diesen Drüsen bei den zwei azyklischen Maultierstuten mit abweichenden Mustern. Somit handelt es sich sehr wahrscheinlich auch bei diesen beiden Maultieren um eine degenerative endometriale Erkrankung, bei der die betroffenen Uterindrüsen der Diffe-

108 DISKUSSION 99 renzierungs- und Synthesedynamik des umliegenden Endometriums nicht mehr folgen, und auf die auch eine Progestagen-Langzeitapplikation keinen - mittels der durchgeführten Untersuchungen nachweisbaren - Einfluss zu nehmen scheint. DAVIES et al. (1985) betrachten azyklische Maultierstuten aufgrund der jahreszeitlichen Unabhängigkeit von einem Zyklusgeschehen als optimale Rezipientenstuten für den Embryonentransfer, da allein durch die Behandlung mit Progesteron sowie seinen synthetischen Analoga eine die uterinen Voraussetzungen für eine Implantation des Konzeptus geschaffen werden. Unter Berücksichtigung der Gesamtheit der Ergebnisse, die im Rahmen dieser Studie gewonnen wurden, darf jedoch bezweifelt werden, dass azyklische Maultierstuten in der Lage sind, die Versorgung des Embryos für die Dauer einer Gravidität adäquat zu gewährleisten.

109 ZUSAMMENFASSUNG ZUSAMMENFASSUNG Kathrin Jäger Morphologisch-funktionelle Untersuchungen am Endometrium von Maultierstuten während des Sexualzyklus und nach Progestagen-Langzeitapplikation Institut für Veterinär-Pathologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig Einsatz- und Ausbildungszentrum für das Gebirgstragtierwesen, Bad Reichenhall Eingereicht im Juni Seiten, 45 Abbildungen, 60 Tabellen, 168 Literaturangaben, 19 Seiten Anhang Schlüsselwörter: Maultier, Progestagen-Langzeitapplikation, Endometrium, Fehldifferenzierung Ziel dieser Studie ist die vergleichende immunhistologische Charakterisierung der uterinen Sekretionsprodukte Uteroglobin (UG), Uterokalin (UK), Uteroferrin (UF) und des kalziumbindenden Proteins Calbindin D9k (CAL) im Endometrium von klinisch zyklischen (n = 2) und azyklischen (n = 4) Maultierstuten unter Berücksichtigung der klinisch dokumentierten Befunde, der endometrialen Funktionsmorphologie und der endokrinologisch bestimmten Serumhormonwerte. Hierzu wurden die sechs Tiere von April bis August 2004, bzw. eine Stute bis November 2004, regelmäßig klinisch-gynäkologisch untersucht und Endometriumbioptate entnommen (zyklische Maultiere:n = 51 Bioptate, azyklische Maultiere: n = 46 Bioptate). Bei den zwei zyklischen Maultierstuten variiert entsprechend dem inkonstanten Zyklusgeschehen histomorphologisch die endometriale Funktionsmorphologie sehr stark, wobei jedoch keine Übereinstimmung zwischen dem klinisch dokumentierten Zyklusstand, den endokrinologischen Parametern oder dem endometrialen Funktionszustand hergestellt werden kann. Es findet sich eine endometriale Fehldifferenzierung, die als irreguläre glanduläre oder ungleichmäßige Differenzierung in Erscheinung tritt. Die Sekretion der endometrialen Proteine UG, UK, UF und CAL erfolgt äußerst variabel, und meistens ohne Korrelation zum klinisch dokumentierten Zyklusstand, den Serumhormonkonzentrationen oder der endometrialen Funktionsmorphologie. Die vier azyklischen Maultierstuten zeigen histomorphologisch über den gesamten Untersuchungszeitraum ein dem klinischen Zyklusstand entsprechend inaktives, allerdings irregulär differenziertes Endometrium. Die Sekretion der endometrialen Proteine wird überwiegend mit sehr geringgradiger Intensität nachgewiesen. In einem zweiten Schritt wurden zwei der azyklischen Maultierstuten über 50 Tage einer oralen Regumate - Applikation (Altrenogest 0,044 mg/kg KM) unterzogen, um den Einfluss einer Progestagen- Langzeitapplikation auf die endometriale Funktionsmorphologie zu überprüfen. Begleitend zur wöchentlichen Bioptatentnahme fanden klinisch-gynäkologische und endokrinologische Untersuchungen statt. Dieses Vorgehen wurde nach Absetzen des Medikaments über 27 Tage beibehalten, und 2 Jahre nach der Behandlung wurden beide Stuten erneut einmalig bioptiert. Die Ergebnisse vor Behandlungsbeginn wurden sowohl mit den Befunden während der Regumate -Applikation als auch mit jenen post applicationem verglichen. Für diese Untersuchungen standen insgesamt 28 Bioptate zur Verfügung, die (immun-)-histologisch (H.-E.- Färbung, UG, UK, UF, CAL, Östrogen- (ER) und Progesteronrezeptoren (PR), Ki-67 Antigen) untersucht wurden. Vor der Gabe von Regumate stellt sich das Endometrium der zwei azyklischen Maultierstuten irregulär inaktiv differenziert dar, mit Hilfe immunhistologischer Methoden kann eine äußerst geringgradige Sekretion aller untersuchten endometrialen Proteine dokumentiert werden. Unter der Progestagen-

110 ZUSAMMENFASSUNG 101 Langzeitapplikation bildet sich eine hochgradig irregulär sekretorische Differenzierung aus, bei der partiell eine überdeutliche Sekretion von CAL auftritt, während jene der übrigen untersuchten Proteine kaum Veränderungen zeigt. Sowohl nach dem Absetzen von Regumate als auch zwei Jahre nach Beendigung der Studie stellen sich die Endometrien ähnlich irregulär inaktiv differenziert dar wie vor der Hormongabe. Die Sekretion der endometrialen Proteine entspricht weitgehend jener vor der Behandlung. Die Expression der Steroidhormonrezeptoren steigert sich im Verlauf der Regumate -Applikation insgesamt deutlich, obwohl klinisch kein Einfluss der hormonellen Intervention auf die Ovaraktivität festgestellt wird, und die Serumhormonwerte keinen nennenswerten Schwankungen unterliegen. Im Gegensatz zu dem vor der Behandlung dokumentierten asynchronen Expressionsmuster der ER und PR in Drüsen und Stroma erfolgt unter der Regumate -Gabe sowie post applicationem eine synchrone Expression der Hormonrezeptoren. Auf die endometriale Proliferationsaktivität zeigt die Behandlung keinen eindeutig erkennbaren Einfluss. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass exogen über einen längeren Zeitraum zugeführte Progestagene bei a- zyklischen Maultierstuten zu einer überdeutlichen endometrialen Sekretionsmorphologie führen, und ebenso deutlich erkennbare sowie wahrscheinlich reversible morphologisch-funktionelle endometriale Alterationen (Fehldifferenzierungen) verursachen wie bei Pferdestuten. Darüber hinaus scheinen auf die Expression der ausgewählten endometrialen Proteine, der Steroidhormonrezeptoren sowie von Ki-67 Antigen noch weitere Regulationsmechanismen Einfluss zu nehmen, die mittels der durchgeführten histologischen und immunhistologischen Untersuchungen nicht näher charakterisiert werden konnten. Die primäre Ursache der Infertilität bei Maultieren liegt ohne Zweifel in dem ungeraden Chromosomensatz (2n = 63) dieser Spezies begründet (WODSEDALEK 1916). Da jedoch Hormonrezeptordefekte sowie Beeinträchtigungen des uterinen Mikromilieus bei Pferden als fertilitätsrelevante Probleme bekannt sind (SCHOON et al. 1999, HÄFNER 1999, ELLENBERGER et al. 2004), ist es nicht auszuschließen, dass diese endometrialen Dysfunktionen, die auch bei den im Rahmen dieser Studie untersuchten Tieren nachgewiesen wurden, bei Maultierstuten ebenfalls zur Infertilität beitragen. Es ist allerdings zu beachten, dass die vorliegenden Erkenntnisse bei den sechs untersuchten Maultierstuten nicht ohne weiteres auf die Gesamtpopulation der Tiere übertragen werden können.

111 SUMMARY SUMMARY Kathrin Jäger Morpho-functional investigations in the endometria of mules during the sexual cycle and after progestin long-term administration Institute of Pathology of the Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Einsatz- und Ausbildungszentrum für das Gebirgstragtierwesen, Bad Reichenhall Submitted in June pages, 45 figures, 60 tables, 168 references, 19 pages appendices Key words: mule, progestin long-term administration, endometrium, maldifferentiation The aim of this study is a comparative immunohistochemical characterisation of the uterine secretory proteins uteroglobin (UG), uterocalin (UC), uteroferrin (UF) and of the calcium-binding protein calbindin (CAL) in the endometrium of clinically acyclic (n = 4) and cyclic mules (n = 2) considering clinicalgynaecological findings, endometrial functional morphology and blood serum concentrations of progesterone and estradiol. For this purpose a clinical-gynaecological examination was performed in five animals from April to August and in one mule until November Endometrial biopsies were taken concurrently (cyclic mules: n = 51 biopsies, acyclic mules: n = 46 biopsies). In the two cyclic mules, the endometrial functional morphology varies to a great extent, consistent with the clinically documented inconstant sexual cycle, without any relations to the stage of cycle or the serum hormone concentrations. Predominantly a distinct glandular irregular or unequal endometrial differenti-ation occurrs. The secretion of the endometrial proteins UG, UC, UF and CAL is highly variable and no correlation between the phases of the sexual cycle, the concentrations of the serum hormone values or the endometrial functional morphology can be detected. Over the whole examination period the four acyclic mules show histologically inactive irregularly differentiated endometria. According to these findings, the glandular expression of UG, UC, UF and CAL is detected with very slight intensitiy. In the second part of the study two of the acyclic mules received an oral dose of mg/kg body weight Regumate for 50 days in order to examine the influence of a long-term progestin administration on the endometrial functional morphology. During the treatment period until 27 days post administration the mules were biopsied weekly and examined both gynaecologically and endocrinologically. Two years after the treatment endometrial biopsies were collected once more. The results obtained prior to Regumate administration were compared with those during and after the treatment. On that account, 28 endometrial biopsies were examined histopathologically (H. E. staining) and imunohistologically (UG, UC, UF, CAL, estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), Ki-67 antigen). Prior to Regumate medication the endometria of the acyclic mule mares exhibit an irregular inactive differentiation with a very faint immunolabelling of all uterine proteins investigated. During the medication the endometria develop a highly irregular secretory differentiation associated with a distinctly increased secretion of CAL, while the secretion of the other investigated proteins remains low. After cessation of the Regumate administration as well as two years later the endometrium is found to be similarly irregular and inactive as before the treatment, and the secretion pattern of the endometrial proteins is comparable to that before medication.

112 SUMMARY 103 In the course of the treatment an overall increased and highly variable expression of the steroid hormone receptors is noted, although no influence of the progestin long-term administration on the ovarian activitiy can be diagnosed clinically. The serum hormone concentrations do not show remarkable changes either. In contrast to the asynchronous expression of ER and PR in the uterine glands and in the stromal cells prior to the treatment, the steroid hormone receptors exhibit a synchronous expression pattern during the medication as well as post administration. The administration of Regumate does not show any significant influence on the endometrial proliferative activity. The results of this study clearly show that in mule mares an exogenous long-term administration of progestins causes an exceedingly pronounced secretory differentiation in the endometrium of acyclic mules, and beyond this generates distinctly visible and in principal reversible morphologic and functional alterations (maldifferentiations) as described in mares. However, it appears that the regulation of the uterine secretory proteins and the calcium-binding protein CAL, the endometrial expression of the steroid hormone receptors as well as the proliferation activity depends on further, more complex mech-anisms, which could not be revealed with the help of the accomplished histological and immunohistological investigations. Without a doubt, the main reason for infertility in mules is the uneven set of chromosomes with 2n = 63 (WODSEDALEK 1916). Aditionally, an atypical expression of the steroid hormone receptors and alterations of the uterine micromilieu found in the endometria of the mules investigated in this study might also contribute to infertility in this species, as these endometrial dysfunctions present known causes for fertility problems in mares (SCHOON et al. 1999, HÄFNER 1999, ELLENBERGER et al. 2004). Admittedly, the results of this study cannot be transferred without further ado to the total population of mules.

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124 LITERATURVERZEICHNIS 115 Volpe P, Russo M, Ianetti L, Izzo B. Endocrine and ultrasonographic aspects of the oestrous cycle of the mule. Vet Rec. 2005;157: von Gugelberg H, Bähler C. Alles über Maultiere. 1. Aufl. Cham: Müller Rüschlikon Verlags AG; Wasserman RH, Chandler JS, Meyer SA, Smith CA, Brindak ME, Fullmer CS et al. Intestinal calcium transport and calcium extrusion processes at the basolateral membrane. J Nutr. 1992;122: Wasserman RH, Corradino RA, Taylor AN. Vitamin D-dependent calcium-binding protein. Purification and some properties. J Biol Chem. 1968;243: Webel SK, Squires EL. Control of the oestrous cycle in mares with altrenogest. J Reprod Fertil Suppl. 1982;32: Wodsedalek JE. Causes of sterility in the mule. The Biological Bulletin. 1916;30:1-56. Wooding FBP, Morgan G, Care AD. Calcium transport and the localisation of calbindin-d9k in the ruminant placenta during the second half of pregnancy. Cell Tissue Res. 1996;285: Wooding FBP, Morgan G, Fowden AL, Allen WA. Separate sites and mechanisms for placental transport of calcium, iron and glucose in the equine placenta. Placenta. 2000;21: Zavy MT, Bazer FW, Sharp DC, Wilcox CJ. Uterine luminal proteins in the cycling mare. Biol Reprod. 1979a;20: Zavy MT, Mayer R, Vernon MW, Bazer FW, Sharp DC. An investigation of the uterine luminal environment of non-pregnant and pregnant pony mares. J Reprod Fertil. 1979b;27: Zavy MT, Sharp DC, Bazer FW, Fazleabas A, Sessions F, Roberts RM. Identification of stage-specific and hormonally induced polypeptides in the uterine protein secretions of the mare during the oestrous cycle and pregnancy. J Reprod Fertil. 1982;64:

125 ANHANG ANHANG 9.1 Übersicht über die Ergebnisse der klinisch-gynäkologischen und endokrinologischen Untersuchungen bei den zwei zyklischen Maultierstuten Tab. 9.1: Maultier 1 (13 Jahre), vollständiger Zyklus 1: Klinisch-gynäkologische, endokrino-logische und histomorphologische Befunde Zyklustag Zyklusphase Ovarien Endometriale Funktions- morphologie P [ng/ml] Ö [pg/ml] 1 AÖs keine FK inakt. 1,0 6,8 5 IÖs li C.l. inakt.; 1,2 7,1 12 IÖs li C.l. +(+) prolif.; 2,0 9,5 17 IÖs li C.l. +(+) prolif.; 3,0 4,0 21 IÖs li C.l. inakt.; 0,87 1,6 26 IÖs li C.l. uglm. inakt.; 0,75 6,1 32 IÖs li C.l. uglm. inakt.; +(+) irreg. 0,60 5,1 37 IÖs li C.l. + sekr.; + 0,55 1,7 43 IÖs li C.l. inakt.; 0,60 1,9 46 IÖs li C.l. inakt.; 0,48 5,2 50 IÖs li C.l. uglm. sekr.; +(+) irreg. 0,66 2,6 54 IÖs li C.l. inakt.; 0,23 Ø 59 IÖs li C.l. inakt.; 0,54 5,7 64 IÖs li C.l. inakt.; 0,65 Ø 68 IÖs li C.l. inakt.; 0,54 < 1,0 75 IÖs li C.l. inakt.; +(+) irreg. 0,68 4,6 79 IÖs li C.l. + sekr.; + 0,64 5,3 84 IÖs li C.l. + sekr.; + 0,58 8,0 90 IÖs li C.l. (+) sekr.; +(+) irreg. 0,59 5,8 94 IÖs li C.l. + sekr.; 0,65 4,7 97 IÖs li C.l. uglm. prolif.; +(+) irreg. 0,66 2,0 103 IÖs li C.l. + sekr.; + 0,65 8,0 109 PräÖs li C.l. + sekr.; +(+) irreg. 0,40 6,8 112 Ös re F +(+) sekr., 0,59 11,0 Legende zu Tab. 9.1: AÖs = Anöstrus, IÖs = Interöstrus, PräÖs = Präöstrus, Ös = Östrus, li = links, re = rechts, FK = Funktionskörper, C.l. = Corpus luteum, F = Follikel, inakt = inaktiv, uglm. = ungleichmäßig, irreg. = irregulär, prolif. = proliferativ, sekr. = sekretorisch, (+) = angedeutet, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++ = mittelgradig, P = Progesteron, Ö = Östradiol

126 ANHANG 117 Tab. 9.2: Maultier 1 (13 Jahre), vollständiger Zyklus 2: Klinisch-gynäkologische, endokrino-logische und histomorphologische Befunde Zyklustag Zyklusphase Ovarien Endometriale Funktionsmorphologie [ng/ml] [pg/ml] P Ö 0 Ös re F p.ov. + sekr.; +(+) irreg. 2,0 Ø 2 PÖs re Anbildungs-F +(+) sekr.; ++(+) irreg. 5,7 7,0 9 IÖs re C.l. +(+) sekr.; 9,8 7,8 16 IÖs re C.l. + prolif.; 0,65 Ø 23 IÖs re C.l. uglm. prolif.; 0,66 3,0 31 IÖs bds. C.l. uglm. prolif.; (+) irreg. 0,78 4,0 34 IÖs bds. C.l. uglm. prolif.; (+) irreg. 0,63 6,1 36 IÖs bds. C.l. inakt.; Ø Ø 38 IÖs bds. C.l. uglm. prolif.; 0,64 2,8 42 IÖs bds. C.l. uglm. prolif.; 0,74 7,0 52 IÖs bds. C.l. uglm. prolif.; 0,69 8,0 60 Ös li F + sekr.; 0,42 9,7 Legende zu Tab 9.2: Ös = Östrus, IÖs = Interöstrus, PÖs = Postöstrus, re = rechts, li = links, bds. = beidseits, C.l. = Corpus luteum, F = Follikel, p.ov. = post ovulationem, inakt. = inaktiv, prolif. = proliferativ, sekr. = sekretorisch, irreg. = irregulär, uglm. = ungleichmäßig, (+) = angedeutet, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++(+) = mittel- bis hochgradig, Ø = Untersuchungsbefund nicht verfügbar, P = Progesteron, Ö = Östradiol Tab. 9.3: Maultier 1 (13 Jahre), unvollständiger Zyklus 3 (Zur Untersuchung gelangten Bioptate der Zyklustage (ZT) 1, 3, 7 und 9. Nach der letzten Probenentnahme an Tag 9 wurden die Untersuchungen ohne Dokumentation des weiteren Zyklusverlaufs abgebrochen): Klinisch-gynäkologische, endokrino-logische und histomorphologische Befunde Zyklustag Zyklusphase Ovarien EndometrialeFunktionsmorphologie P [ng/ml] 1 PÖs li 1 F +(+) sekr.; 1,2 9,5 Ö [pg/ml] 3 IÖs li Anbildungs-C.l. + sekr.; +(+) irreg. 1,7 9,3 7 IÖs li C.l. +(+) sekr.; + 0,35 15,0 9 IÖs li C.l. +(+) sekr.; + 6,5 9,6 Legende zu Tab 9.3: IÖs = Interöstrus, PÖs = Postöstrus, li = links, C.l. = Corpus luteum, F = Follikel, sekr. = sekretorisch, irreg. = irregulär, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig, ++ = mittelgradig, P = Progesteron, Ö = Östradiol

127 ANHANG 118 Tab. 9.4: Maultier 2 (20 Jahre): Zur Untersuchung gelangten 11 Bioptate aus drei Zyklen, ohne de-tallierte Kenntnisse über deren Verlauf oder Länge. Ein vollständiger Zyklus mit einer Länge von 27 Tagen wurde aus den klinischen Daten ermittelt (Annahme des 1. ZT am sowie des letzten ZT am , Felder des entsprechenden Zeitraums in der Tabelle farbig hinterlegt). Die fettgedruckten Angaben bezeichnen die Entnahme von Uterusbioptaten, an denen eine Beurteilung des endometrialen Funktionszustandes möglich war. Darüber hinaus sind die klinisch-gynäkologischen und endokrino-logischen Befunde der entsprechenden Tage aufgeführt. Zyklustag Zyklusphase Ovarien Endometriale Funktionsmorphologie Uterus P [ng/ml] Ö [pg/ml] Zyklus bds. Anbildungs-F KI GI S IÖs + prolif.; ,3 14, GI S PräÖs li F Zervixbioptat 2004 KI 2,4 12, li F in Rückbildg. KI inakt.; GI S PräÖs ,86 4, li F in Rückbildg. KI Zervixbioptat GI S PräÖ ,6 13, Zervixbioptat GI S PräÖs re F 2004 KI 4,9 11, Zervixbioptat GI S 2. ZT li C.l KI 2,2 10, Zervixbioptat GI S IÖs li C.l KI 2,7 10,9 Zyklus prolif.; +(+) irreg. GI S IÖs keine FK 2004 KI 0,96 11,9 Zyklus prolif.; GI S PÖs li C.l KI 1,6 11, Zervixbioptat GI S IÖs li C.l KI 1,7 12, Zervixbioptat GI S IÖs re F 2004 KI 9,1 8,9 Legende zu Tab. 9.4: IÖs = Interöstrus, PräÖs = Präöstrus, PÖs = Postöstrus, ZT = Zyklustag, li = links, re = rechts, bds. = beidseits, FK = Funktionskörper, C.l. = Corpus luteum, F = Follikel, Rückbildg. = Rückbildung, inakt. = inaktiv, prolif. = proliferativ, irreg. = irregulär, + = geringgradig, +(+) = gering- bis mittelgradig,g = Größe, S = Symmetrie, K = Konsistenz und Kontraktilität, P = Progesteron, Ö = Ös-tradiol

128 ANHANG Pikrosiriusrot-Färbung nach CONSTANTINE (1969), modifiziert nach Grüninger (1998) Verwendete Färbelösungen 1% Siriusrot-Lösung: 1,25 g Siriusrot F3B 150 (Farbenabteilung der Bayer-AG, Leverkusen) in 100 ml Aqua dest. lösen 0,1% Pikrosiriusrot-Lösung: 10 ml 1% Siriusrot-Lösung mit 90 ml wässriger, kalt gesättigter Pikrinsäure-Lösung vermischen, einige Pikrinsäurekristalle hinzugeben, damit die Lösung ge-sättigt bleibt (sollte nach jeder Anwendung wiederholt werden); 24 Stunden reifen lassen Aldehydfuchsin-Lösung (GOMORI 1950): 2,5 g Pararosanilin in 500 ml 70% Ethanol vollständig lösen, anschließend mit 5 ml konzentrierter Salzsäure und 25 ml Paraaldehyd vermischen, mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur reifen lassen und anschließend kühl lagern Weigert-Eisen-Hämatoxylin-Lösung (PROPHET et al. 1992): Lösung A (1% alkoholische Hämatoxylin-Lösung) und Lösung B (4 ml wässrige 29% Eisen-III-Chlorid-Lösung, 95 ml Aqua dest., 1 ml konzentrierte, rauchende Salzsäure) kurz vor dem Gebrauch im Verhältnis 1 : 1 mischen 1% Alzianblau-Lösung, ph 2,5: 1 g Alzianblau 8 GX in 100 ml 3% Essigsäure lösen, ein Kristall Thymol zur Verbesserung der Haltbarkeit zugeben, 24 Stunden reifen lassen Färberezept 1. Entparaffinieren und Rehydrieren der Schnitte 2. Waschen in fließendem Leitungswasser (10 Minuten) 3. Kurzes Eintauchen der Schnitte in 3% Essigsäure (10 x) 4. Färben in 1% Alzianblau-Lösung (30 Minuten) 5. Waschen in fließendem Leitungswasser (3 Minuten) 6. Eintauchen in 70% Ethanol (10 x kurz) 7. Färben in Aldehyd-Fuchsin-Lösung (45 Minuten) 8. Kurzes Eintauchen in 70% Ethanol (je 3 x in 3 Portionen Ethanol) 9. Waschen in fließendem Leitungswasser (3 Minuten) 10. Färben in Weigert-Eisen-Hämatoxylin-Lösung (10 Minuten) 11. Waschen in fließendem Leitungswasser (3 Minuten) 12. Färben in 0,1% Pikrosiriusrot-Lösung (30 Minuten) 13. Waschen in 0,01% Salzsäure 14. Entwässern (je 2 Portionen 96% und 100% Ethanol und Xylol) und Eindecken der Objektträger

129 ANHANG Verfahrensschritte der immunhistologischen Untersuchungen Vorbehandlung Aufziehen von 3-4 µm dicken Schnitten auf Super-Frost Plus Objektträger (Fa. Menzel-Gläser), 30 min Trocknen bei Raumtemperatur vor einem Ventilator, anschließend Lagerung über Nacht im Wärmeschrank bei 37 C Entparaffinierung und Rehydrierung 10 min Xylol 2 x je 3 min Isopropanol 3 min 96% Alkohol Inaktivierung der endogenen Peroxidase 30 min in Methanol mit frisch zugesetztem 0,5% H 2 O 2 bei Raumtemperatur (Perhydrol 30% H 2 O 2 p.a., 7210, E. Merck, Darmstadt) Waschen in TBS Besondere Verfahren Vor dem Aufbringen der Objektträger auf die Coverplates wurde zunächst zum Nachweis der ER, PR sowie Ki-67 Antigen und Uterokalin eine Zitrat-Behandlung durchgeführt, während die Objektträger zum Nachweis von Uteroferrin mit Protease vorbehandelt wurden. Zitrat-Behandlung 1. 0,1 M Zitratpuffer ph 6,0 auf 96 C vorwärmen min Kochen der Schnitte in 96 C heißem Zitratpuffer min bei Zimmertemperatur abkühlen lassen 4. Spülen in TBS Protease-Behandlung 1. 5 min Spülen der Schnitte in PBS bei 37 C 2. 5 min Inkubieren der Schnitte in 0,05% Protease in PBS bei 37 C (bakterielle Protease Typ XXIV, P8038, Sigma Chemie, Deisenhofen) 3. 3 x 5 min Spülen der Schnitte in eiskaltem TBS Antigennachweis mittels monoklonaler Antikörper nach der PAP-Methode 1. Wechseln der Schnitte aus der Küvette in Coverplates ( Life Science Int. GmbH, Frankfurt/Main) 2. Einbringen von je 100 µl des in 1% BSA (Bovines Serumalbumin, 3895 Boehringer, Mannheim) in TBS verdünnten Primärantikörpers (bzw. des Kontrollserums) in die Coverplates 3. Inkubation über Nacht bei 4 C 4. Spülen durch Einbringen von 2 ml TBS je Coverplate 5. Einbringen von je 100 µl Ratte-anti-Maus IgG 1:100 in 1% BSA in TBS je Coverplate min Inkubation bei Raumtemperatur 7. Spülen durch Einbringen von 2 ml TBS je Coverplate

130 ANHANG Einbringen von je 100 µl Maus-PAP 1:500 in 1% BSA in TBS je Coverplate min Inkubation bei Raumtemperatur 10. Spülen durch Einbringen von je 2 ml TBS je Coverplate und weiter mit Abschnitt Antigennachweis mittels polyklonaler Antikörper nach der PAP-Methode 1. Wechseln der Schnitte aus der Küvette in Coverplates ( Life Science Int. GmbH, Frankfurt/Main) 2. Blocken der unspezifischen Bindungen mit 1:2 Schweineserum in TBS min Inkubation bei Raumtemperatur 4. Einbringen von je 100 µl des in 20% Schweineserum in TBS verdünnten Primärantikörpers in die Coverplates 5. Inkubation über Nacht bei 4 C 6. Spülen durch Einbringen von 2 ml TBS je Coverplate 7. Einbringen von je 100 µl Schwein anti-kaninchen IgG 1:100 in 20% Schweineserum in TBS je Coverplate min Inkubation bei Raumtemperatur 9. Spülen durch Einbringen von 2 ml TBS je Coverplate 10. Einbringen von je 100 µl Kaninchen-PAP 1:100 in 20% Schweinserum in TBS je Coverplate min Inkubation bei Raumtemperatur 12. Spülen durch Einbringen von je 2 ml TBS je Coverplate 13. weiter mit Abschnitt Standard zur Nachbehandlung 1. Wechseln der Schnitte aus den Coverplates in eine Küvette min Inkubation der Schnitte unter ständigem Rühren (Magnetrührer) in 3,3`Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB, Fluka, Feinchemikalien GmbH, Neu Ulm) mit 0,01% H 2 O 2 (30%) 0,1 M Imidazolpuffer (ph 7,1) bei Raumtemperatur 3. 3 x 5 min Waschen in TBS bei Raumtemperatur 4. 5 min Waschen in Aqua dest. bei Raumtemperatur sec Gegenfärbung mit PAPANICOLAOUs Lösung und 10 min Bläuen in Leitungswasser 6. Je 3 min Entwässern in der aufsteigenden Alkoholreihe min Xylol 8. Eindecken der Objektträger

131 ANHANG Verwendete Antikörper und Seren Die in der Studie verwendeten Primär- und Sekundärantikörper, ihre Bezugsquellen sowie die verwendeten Verdünnungen sind in Tab. 9.5 aufgeführt. Tab. 9.5: In dieser Studie verwandte Antikörper, ihre Verdünnungen und ihre Bezugsquellen Antikörper mak/pak Verdünnung Bezugsquelle Maus anti-human Östrogenrezeptor Clone 6F11 mak 1:20 Maus anti-human Progesteronrezeptor Clone PR4-12 mak 1:100 Maus anti-human Ki-67 Clone MM1 mak 1:10 Kaninchen anti-uteroglobin pak 1:600 Kaninchen anti-uterokalin pak 1:150 Kaninchen anti-uteroferrin pak 1:25 Kaninchen anti-calbindin D9k pak 1:500 NCL-ER-6F11 Medac GmbH, Wedel NCL-PGR-AB Medac GmbH, Wedel NCL-Ki-67-MM1 Medac GmbH, Wedel Dr. Klug Justus-Liebig- Universität, Gießen Prof. Dr. Allen Equine Fertility Unit, Newmarket, England Prof. Dr. Bazer Texas A&M University, USA CB9 Swant Bellinzona, Schweiz Legende zu Tab. 9.5: mak = monoklonaler Antikörper; pak = polyklonaler Antikörper; BSA = bovines Serumalbumin; TBS = tris-buffered saline Schweineserum Das von Schlachtschweinen stammende Serum wurde sterilfiltriert, zur Konservierung mit 0,05% Merthiolat versetzt und bis zur Verwendung bei -20 C gelagert. Sekundäre Antikörper Als Sekundärantikörper für monoklonale Primärantikörper nach der PAP-Methode wurde 1:100 in 1% BSA in TBS verdünntes Ratte anti-maus IgG (H&L, Code-Nr.: , Dianova GmbH) eingesetzt. Als Sekundärantikörper für polyklonale Primärantikörper nach der PAP-Methode wurde 1:100 in 20% Schweineserum in TBS verdünntes Schweine anti-kaninchen IgG (DAKO ZO196) verwendet. Peroxidase anti-peroxidase Komplex Als PAP-Komplex für die monoklonalen Primärantikörper diente eine 1:500 in 1% BSA in TBS verdünnte Maus-PAP (Code NR , Dianova Diagnostika GmbH Hamburg). Als PAP-Komplex für die polyklonalen Primärantikörper diente eine 1:100 in 20% Schweineserum in TBS verdünnte Kaninchen-PAP (Code-Nr. ZO113, Fa. DAKO, Hamburg). Kontrollseren

132 ANHANG 123 Als Kontrollseren (Negativkontrolle) für die monoklonalen Antikörper aus der Maus wurde ein monoklonaler Antikörper gegen das Oberflächenantigen von Hühner-Bursa-Lymphozyten (T1; HIRSCHBERGER 1987) verwendet. Als Negativkontrolle für die polyklonalen Antikörper aus dem Kaninchen wurden die Schnitte jeweils parallel mit normalem Kaninchenserum (DAKO X0902) inkubiert Lösungen und Puffer Tris-buffered saline (TBS, ph 7,6) Stammlösung: 60,57 g Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Roth, 48552) 610 ml Aqua dest. 390 ml HCl 1N (Merck, ) Gebrauchslösung: 100 ml Stammlösung 900 ml 0,8% NaCl (Merck, ) in Aqua dest. Phosphate-buffered saline (PBS, ph 7,2, 300 mosm) Stammlösung: 42 g NaCl krist. (Merck, ) 9,26 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O p.a. (Merck, ) 2,15 g KH 2 PO 4 (Merck, ) Aqua bidest. ad 100 ml Gebrauchslösung: Verdünnung der Stammlösung 1:5 in Aqua bidest. Zitratpuffer (10 mm, ph 6,0) Stammlösung A: 0,1 M Zitronensäure (Merck, ) (21,01 g C 6 H 8 O 7 x H 2 O in 1000 ml Aqua dest.) Stammlösung B: 0,1 M Natriumcitrat (Merck, ) (29,41 g C 6 H 5 O 7 Na 3 x H 2 O in 1000 ml Aqua dest.) Gebrauchslösung: 9 ml Stammlösung A und 41 ml Stammlösung B mit 450 ml Aqua dest. auf 500 ml auffüllen und mischen. Imidazol/HCl-Puffer 0,1 M (ph 7,1) 6,81 g Imidazol (Merck, ) Aqua dest. ad 1000 ml Zugabe von 500 ml 0,1 M HCl

133 ANHANG 124 Diaminobenzidintetrahydrochlorid-Lösung (DAB) 100 mg DAB (Fluka, 32750) in 200 ml 0,1 M Imidazol/HCl-Puffer (ph 7,1) lösen und mischen (Magnetrührer). Filtrieren und unmittelbar vor Gebrauch 70 µl H 2 O 2 (30%) (Merck, ) zugeben. PAPANICOLAOUs Lösung PAPANICOLAOUs Lösung (Merck, ) und Aqua dest. im Verhältnis 1:20 mischen und filtrieren. Merthiolat-Gebrauchslösung 10 g Ethylenmercurithiosalicylat-Natrium (Merthiolat) (Sigma, T 5125) 100 ml 0,8% NaCl (Merck, ) 9.4 Für die Immunhistologie verwendete Positivkontrollen und Primärantikörper Tab. 9.6: Als Positivkontrolle mitgeführte Gewebe des Pferdes der immunhistologisch eingesetzten Marker Antigen UG, UK, UF, CAL Hormonrezeptoren (ER, PR) Ki-67 Antigen Positivkontrolle Uterus (Interöstrus) Tab. 9.7: Übersicht über die verwendeten Primärantikörper und ihre Reaktionsmuster innerhalb der untersuchten Zellpopulationen im Endometrium ER, PR Ki-67 Antigen Uteroglobin Uterokalin Uteroferrin Calbindin D9k Primärantikörper Steroidhormonrezeptoren Proliferationsmarker endometriales Protein endometriales Protein endometriales Protein kalziumbindendes Protein Legende zu Tab. 9.7: ER: Östrogenrezeptor untersuchte Zellpopulationen endometriale Epithelien, Stromazellen endometriale Epithelien, Stromazellen luminale und glanduläre Epithelien luminale und glanduläre Epithelien luminale und glanduläre Epithelien luminale und glanduläre Epithelien PR: Progesteronrezeptor Reaktionsmuster intranukleär intranukleär intrazytoplasmatisch, Drüsenlumina intrazytoplasmatisch, Drüsenlumina intrazytoplasmatisch, Drüsenlumina intrazytoplasmatisch, intranukleär, Drüsenlumina

134 ANHANG 125 Tab. 9.8: Anteil der positiv mit immunhistologischen Markern reagierenden Zellen innerhalb einer Zellpopulation (+) vereinzelt positive Zellen, maximal 5-10% der Gesamtzellzahl + einzelne positive Zellen, maximal 20% der Gesamtzellzahl +(+) mehrere positive Zellen, maximal 40% der Gesamtzellzahl ++ viele positive Zellen, maximal 60% der Gesamtzellzahl ++(+) sehr viele positive Zellen, maximal 80% der Gesamtzellzahl +++ (fast) alle Zellen positiv, % der Gesamtzellzahl Legende zu Tab. 9.8: (+) schwach ++ mittelgradig + geringgradig ++(+) mittel- bis hochgradig +(+) gering- bis mittelgradig +++ hochgradig

135 ANHANG 126

136 ANHANG Bilddokumentation Histologische Befunde der zwei zyklischen Maultierstuten Abb. 9.1: Endometrium Maultierstute 1 (13 Jahre; 50. Zyklustag (ZT), Zyklus 1): Ungleichmäßig sekretorische endometriale Differenzierung. Gleichzeitiges Vorliegen von sekretorisch aktiven Uterindüsen (Ds) mit weiten Lumina ( ), hochprismatischem Epithel und hypochromatischen Zellkernen neben teils prolifertiv aktiven (Dp) Uterindrüsen mit kleinen Lumina (Stern), kubischem glandulären Epithel, hyperchromatischen, runden bis ovalen Zellkernen und wenig Zytoplasma; (S) Stromazellen. H.-E.-Färbung Abb. 9.2: Endometrium Maultierstute 1 (13 Jahre; 79. ZT, Zyklus 1): Irregulär sekretorische endometriale Differenzierung. Uterindrüsen (D) mit weiten Lumina und hochprismatischen Epithelien sowie zahlreichen schlanken, stiftförmigen, hyperchromatischen Zellkernen (schwarze Pfeilspitze); multifokal Abgabe von Sekretbestandteilen in die Drüsenlumina (Stern); (S) Stromazellen. H.-E.-Färbung Abb. 9.3: Endometrium Maultierstute 2 (20 Jahre; Zyklus 1): Geringgradige Fibroelastose der T. media und T. adventitia eines venösen Gefäßes (V). Kollagene Fasern: rot (schwarze Pfeilspitze); elastische Fasern violett: (Pfeil); Uterindrüsen (D) des umliegenden Endometriums mit irregulärer proliferativer Differenzierung; (S) Stromazellen. Pikrosiriusrotfärbung Histologische Befunde der vier azyklischen Maultierstuten Abb. 9.4: Endometrium Maultierstute 4 (21 Jahre; Untersuchungszeitpunkt (US-Zeitpunkt) 7): Irregulär inaktive endometriale Differenzierung. Uterindrüsen (D) mit engen Lumina, kubischen Epithelien sowie kleinen, hyperchromatischen, geringgradig polymorphen Zellkernen (Pfeile); Stromazellen (S) mäßig dicht gelagert, geringgradiges stromales Ödem. H.-E.-Färbung Abb. 9.5: Endometrium Maultierstute 6 (23 Jahre; US-Zeitpunkt 1): Mittelgradige gemischte, teils destruierende Endometrose. Die durch eine periglanduläre Fibrose nestartig aggregierten Drüsen (De) sind teils deformiert und weisen multifokal deutliche Degenerationserscheinungen des glandulären Epithels auf (Pfeilspitze); (S) Stromazellen des umliegenden Endometriums. H.-E.-Färbung Abb. 9.6: Endometrium Maultierstute 3 (22 Jahre; US-Zeitpunkt 3): Mittelgradige Fibroelastose der T. media und T. adventitia eines größeren venösen Gefäßes (V). Kollagene Fasern: rot; elastische Fasern: violett (Pfeilspitzen); (S) Stromazellen. Pikrosiriusrotfärbung

137 ANHANG 128 D Dp Ds * S S µm 9.4 * S D De 9.2 S 50 µm µm D S V 9.3 S D V 50 µm µm

138 ANHANG Immunhistologische Befunde der zwei zyklischen und der vier azyklischen Maultierstuten Nachweis von Uteroglobin Abb. 9.7: Endometrium Maultierstute 1 (13 Jahre; 112. ZT, Zyklus 1): Geringgradige Sekretion von UG in dem irregulär sekretorisch differenzierten Endometrium. Die Sekretion bezogen auf die Gesamtheit der Uterindrüsen (D) erfolgt mit uneinheitlicher Intensität; (S) Stromazellen; (Stern) positiv reagierendes Sekret innerhalb eines Drüsenlumens. Immunhistologie, Uteroglobin, Nomarski-Interferenzkontrast Abb. 9.8: Endometrium Maultierstute 2 (20 Jahre; Zyklus 2): Deutlich verminderte Sekretion von UG in den endometrotisch veränderten Drüsen (De) im Vergleich zum umliegenden, nicht degenerativ geschädigten Endometrium. (D) unveränderte Drüsen; (Pfeilspitzen) Stromazellen in der Endometrose; (S) Stromazellen des umliegenden Endometriums. Immunhistologie, Uteroglobin, Nomarski-Interferenzkontrast Abb. 9.9: Endometrium Maultierstute 5 (19 Jahre; US-Zeitpunkt 11): Geringgradige Sekretion von UG in dem irregulär inaktiv differenzierten Endometrium. Ungleichmäßige Sekretion sowohl innerhalb eines Drüsenquerschnittts (D) als auch bezogen auf die Gesamtheit der Uterindrüsen; (S) Stromazellen. Immunhistologie, Uteroglobin, Nomarski-Interferenzkontrast Nachweis von Uterokalin Abb. 9.10: Endometrium Maultierstute 2 (20 Jahre; Zyklus 2): Geringgradige Sekretion von UK in dem irregulär proliferativ differenzierten Endometrium. Gleichmäßige Reaktion innerhalb eines Drüsenquerschnitts (Pfeilspitze) und zwischen den Uterindrüsen (D); (S) Stroma; (Stern) positiv reagierendes Sekret innerhalb eines Drüsenlumens. Immunhistologie, Uterokalin, Nomarski-Interferenzkontrast Abb. 9.11: Endometrium Maultierstute 6 (23 Jahre; US-Zeitpunkt 11): Dezente Sekretion von UK in dem irregulär inaktiv differenzierten Endometrium. Die Reaktion erfolg sowohl innerhalb eines Drüsenquerschnitts (D) als auch zwischen den Uterindrüsen gleichmäßig (Pfeilspitze); (S) Stromazellen; (Stern) positiv reagierendes Sekret innerhalb eines Drüsenlumens. Immunhistologie, Uterokalin, Nomarski-Interferenzkontrast Abb. 9.12: Endometrium Maultierstute 6 (23 Jahre; US-Zeitpunkt 7): Deutlich intensivere Sekretion von UK in einer Drüse mit periglandulärer Fibrose (De, Pfeil) als in den nicht von der Endometrose betroffenen Drüsen. (Pfeilspitzen) Stromazellen in der Endometrose, (S) Stromazellen des umliegenden Endometriums; (Stern) positiv reagierendes Sekret innerhalb eines Drüsenlumens. Immunhistologie, Uterokalin, Nomarski-Interferenzkontrast

139 ANHANG 130 S * D D S * De D S D S * * D S 9.9 D S 9.12 De

140 ANHANG Nachweis von Uteroferrin Abb. 9.13: Endometrium Maultierstute 2 (20 Jahre; Zyklus 2): Dezente bis geringgradige Sekretion von UF in dem irregulär proliferativ differenzierten Endometrium. Die Sekretion innerhalb einer Drüse (D) erfolgt gleichmäßig, zwischen den Uterindrüsen ist sie jedoch uneinheitlich intensiv ausgeprägt (1* und 2*); (S) Stromazellen. Immunhistologie, Uteroferrin, Nomarski-Interferenzkontrast Abb. 9.14: Endometrium Maultierstute 2 (20 Jahre; Zyklus 2): Verminderte Sekretion von UF in Drüsen mit periglandulärer Fibrose. Im Vergleich zu den nicht endometrotisch veränderten Drüsen des umliegenden Endometriums (D; Pfeil) sezernieren die Drüsen in der Endometrose (De) das Protein mit geringgradigerer Intensität; (schwarze Pfeilspitzen) periglanduläre Fibrose; (S) Stromazellen des umliegenden Endometriums. Immunhistologie, Uteroferrin, Nomarski-Interferenzkontrast Abb. 9.15: Endometrium Maultierstute 6 (23 Jahre; US-Zeitpunkt 11): Dezente Sekretion von UF in dem irregulär inaktiv differenzierten Endometrium. Diffus intrazytoplasmatische und gleichmäßige Reaktion innerhalb eines Drüsenquerschnitts (D), uneinheitliche Sekretion zwischen den Uterindrüsen (1* und 2*); (S) Stromazellen. Immunhistologie, Uteroferrin, Nomarski-Interferenzkontrast Nachweis von Calbindin Abb. 9.16: Endometrium Maultierstute 1 (13 Jahre; 1. ZT, Zyklus 3): Mittelgradige Expression von CAL. Nachweis des Proteins in den irregulär sekretorisch differenzierten Uterindrüsen (D). Vereinzelte Drüsenepithelzellen reagieren deutlich intensiver (Pfeil), woraus ein mosaikartiges Reaktionsmuster innerhalb eines Drüsenquerschnitts resultiert; (S) Stromazellen; (Stern) positiv reagierendes Sekret innerhalb eines Drüsenlumens. Immunhistologie, Calbindin D9k, Nomarski-Interferenzkontrast Abb. 9.17: Endometrium Maultierstute 1 (13 Jahre; 50. ZT, Zyklus 1): Deutlich abweichendes Expressionsmuster von CAL in fibrotischen Arealen. In Drüsen mit periglandulärer Fibrose (De) überwiegend verminderte (Pfeilspitze), vereinzelt jedoch auch gesteigerte (Pfeile) Reaktionsintensität; (D) unveränderte Drüsen des umliegenden Endometriums; (S) Stromazellen. Immunhistologie, Calbindin D9k, Nomarski-Interferenzkontrast Abb. 9.18: Endometrium Maultierstute 6 (23 Jahre; US-Zeitpunkt 10): Geringgradige Expression von CAL. Intrazytoplasmatischer (weiße Pfeilspitze) und intranukleärer (schwarze Pfeilspitze) Nachweis des Proteins in den irregulär inaktiv differenzierten Uterindrüsen (D); mosaikartiges Erscheinungsbild des glandulären Epithels aufgrund unterschiedlich intensiver Reaktion innerhalb eines Drüsenquerschnitts; (S) Stromazellen. Immunhistologie, Calbindin D9k, Nomarski-Interferenzkontrast

141 ANHANG 132 D S 1* * D 2* S D De S 9.14 D De * D S 2* S 9.15 S De 9.18 D

142 ANHANG Histologische Befunde vor, unter und nach Regumate -Applikation bei zwei Maultierstuten aus der azyklischen Gruppe Abb. 9.19: Endometrium Maultierstute 5 (19 Jahre), US-Zeitpunkt 7 vor Regumate -Applikation: Irregulär inaktiv differenziertes Endometrium. Uterindrüsen (D) mit kleinen Lumina und kubischen Epithelien sowie kleinen, hyperchromatischen, geringgradig polymorphen Zellkernen (Pfeilspitzen); Stromazellen (S) aktiv differenziert und dicht gelagert. H.-E.-Färbung Abb. 9.20: Endometrium Maultierstute 5 (19 Jahre), Tag 15 unter Regumate -Applikation: Irregulär sekretorische glanduläre Differenzierung. Deutlich geschlängelte Drüsen (D) mit weiten Lumina und hochprismatischem Epithel sowie hochgradiger Kernpolymorphie; in den Drüsenlumina befinden sich Sekretbestandteile (Stern); (S) Stromazellen. H.-E.-Färbung Abb. 9.21: Endometrium Maultierstute 5 (19 Jahre), 2 Jahre post applicationem: Irregulär inaktiv differenziertes Endometrium. Drüsen (D) mit kleinen Lumina und Epithelzellen mit kleinen, hyperchromatischen, geringgradig polymorphen Zellkernen (Pfeilspitzen); Stromazellen (S) aktiv differenziert und dicht gelagert. H.-E.-Färbung Immunhistologische Befunde vor, unter und nach Regumate -Applikation bei zwei Maultierstuten aus der azyklischen Gruppe Nachweis von Uterokalin Abb. 9.22: Endometrium Maultierstute 4 (21 Jahre), US-Zeitpunkt 2 vor Regumate -Applikation: Dezente Sekretion von UK in dem irregulär inaktiv differenzierten Endometrium. Das Protein liegt diffus verteilt in den glandulären Epithelien vor (Pfeilspitzen) und ist im gesamten Endometrium mit gleichmäßiger Intensität nachweisbar; (D) Uterindrüsen; (S) Stroma. Immunhistologie, Uterokalin, Nomarski-Interferenzkontrast Abb. 9.23: Endometrium Maultierstute 5 (19 Jahre), Tag 29 unter Regumate -Applikation: Geringgradige Sekretion von UK in dem irregulär sekretorisch differenzierten Endometrium. Die Sekretion innerhalb eines Drüsenquerschnitts und zwischen den Uterindrüsen (D) erfolgt gleichmäßg (Pfeilspitzen); (S) Stromazellen. Immunhistologie, Uterokalin, Nomarski-Interferenzkontrast Abb. 9.24: Endometrium Maultierstute 5 (19 Jahre), 27 Tage post applicationem: Dezente Sekretion von UK in den irregulär inaktiv differenzierten Uterindrüsen (D). Die Sekretion innerhalb einer Drüse (Pfeilspitzen) sowie bezogen auf das gesamte Endometrium erfolgt mit gleichmäßiger Intensität; (S) Stromazellen. Immunhistologie, Uterokalin, Nomarski-Interferenzkontrast

143 ANHANG 134 D D S S µm 9.22 S D * D S S D S D