5. Komponenten des Zellzykluskontrollsystems. Spezifische Zellzyklusereigneisse geschehen auf einem Hintergrund kontinuierlichen Wachstums.

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1 5. Komponenten des Zellzykluskontrollsystems Spezifische Zellzyklusereigneisse geschehen auf einem Hintergrund kontinuierlichen Wachstums. Proteingehalt -> steigt kontinuierlich durch ganzen cell cycle RNA Synthese -> auch kontinuirlich ausser M-Phase (Chromatinkondensation -> keine Transkription) DNA Synthese -> diskontinuierlich Proteine die für DNA Synthese wichtig auch diskontinuierlich (z.b. Enzyme für Nukleinsäureherstellung und Histone für DNA Verpackung. Wechslespiel zwischen verschiedenen Phasen muss kontrolliert sein. -> Zellzykluskontrollsystem -> initiiert essentielle Prozesse des Zellzyklus. Analogie Waschmaschiene (Wasser, waschen, spühlen, auswinden). -> Zentralkontroller wird an kritischen Punkten einen Feedback bekommen (z.b. Wasserstand) -> sonst waschen ohne Wasser -> fatal. Umgebung Zellwachstum Umgebung Zellwachstum Zellzykluskontrollsystem: Set von interagierenden Proteinen -> induzieren und koordinieren downstream Prozesse Downstream Prozesse -> Feedback auf Zellzyklus -> Checkpoints -> 3 Checkpoints -> 2 Umgebungssensitiv. 1

2 Das Zellzykluskontrollsystem basiert auf zyklisch aktivierten Proteinkinasen Zellzykluskontrollsystem basiert auf 2 Proteinfamilien: 1) cyclin-dependent protein kinasen (Cdk) -> phosphorylieren spezifische Proteine an Ser, Thr. sind konstant während Zellzyklus 2) cycline -> binden and Cdk -> kontrollieren dadurch die phosphorylierungsaktivität von Cdk werden in jeder Runde des Zyklus neu synthetisiert und degradiert -> daher Name. 4 Klassen von cyclinen: MPF G1/S cycline -> helfen über Start point zu gehen S-cycline -> initiation der DNA Replikation M-cycline -> binden an Cdk in G2 G1-cyclin -> binden an Cdk in G1 2

3 Vereinfachte Sicht der zentralen Zellzykluskontrolle = MPF Cdk assoziiert schrittweise mit verschiedenen cyclinen um verschiedene ereignisse des Zellzyklus zu triggern. Cdk Aktivität ist normalerweise beendet mit der Degradation von cyclin. Der Einfachheit halber sind nur die S- und M-cyclin Associationen gezeigt. Cyclin-Cdk Komplexe des Zellzykluskontrollsystems 3

4 Die strukturelle Basis für Cdk Aktivierung Aktiver Rest blockiert durch einen Teil des Proteins, den T-Loop (rot) Bindung von cyclin bewirkt dass der T-Loop aus der aktiven Tasche verdrängt wird -> partielle Aktivierung Cdk wird von CAK an einem Threonin Rest im T-Loop phosphoryliert was das Enzym weiter aktiviert durch die Strukturänderung im T-Loop Cdk-Aktivität kann durch inhibitorische Phosphorylierung oder inhibitorische Proteine unterdrückt werden 1) inhibitorsiche Phosphorylierung: Speziell für M-Cdk Aktivität wichtig 4

5 ) inhibitorisches Protein: z.b. p27 = CKI meistens in Kontrolle der G1 und S-Phase Das Zellzyklus-Kontrollsystem hängt von zyklischer Proteolyse ab Degradation durch Ubiquitinierung 5

6 Degradation von Cyclin nötig für Beenden der Mitose APC = anaphase promoting complex APC ändert M-cycline Securin Mutation der Signalsequenz im Cyclin -> keine Degradation mehr, bindet aber noch an Cdk -> MPF konstitutiv aktiv -> kein Beenden der Mitose G1-S transition z.b. p27 6

7 Überblick über das Zellzyklus Kontrollsystem 7

8 Intrazelluläre Kontrolle von Zellzyklus Ereignissen S-Phase DNA wird pro Zyklus nur 1 mal repliziert. Wie geschieht es, dass DNA nur 1 mal repliziert wird? -> nach Transkription müsste DNA blockiert werden. Folgendes Experiment zeigt, dass ein solcher Block existiert: Fusionieren von 2 Säugerzellen die sich in verschiedenen Zellzyklusphasen befinden: Kontrolle der Chromosomenduplikation 8

9 Die Replikation der DNA einmal pro Zellzyklus phosphoryliert zum Teil auch Mcm Proteine -> export von Mcm aus Nukleus -> kein neuer pre-rc komplex kann gebildet werden. kein neuer pre-rc kann gebildet werden Ubiquitinierung durch SRC Komplex -> Degradation in Proteasom S-Cdk konzentration bleibt hoch in G2 -> keine Replikation nach S-Phase. Ende Mitose Cdk Aktivität ist reduziert auf 0 => neue Replikationsrunde möglich Cohesine helfen Schwesterchromatide zusammenzuhalten Ende der S-phase -> 2 Schwester Chromatide. Werden später spezifisch voneinander getrennt -> ver- Hindern von auseinanderdriften der Chromatidstränge durch Cohesine -> Mutationen in Cohesinen führt zu fehlern in Chromosomensegregation. Cohesin Komplexe über die ganze Länge der Schwesterchromatide verteilt. Komplex besteht aus Proteinen der SMC familie (Structural Maintenace of Chromosomes) und bilden Ringähnliche Struktur. 9

10 Mitose Mitose kann in 2 regulatorische Hauptphasen unterteilt werden: 1) Abrupte Erhöung der M-Cdk Aktivität am G2/Checkpoint 2) Zerstörung von Securin durch APC Komplex und Zerstörung von Cyclin Metahphase-Anaphase Transition. Aktivierung des M-Phase Cyclin-Cdk Komplexes (M-Cdk) ermöglicht den Eintritt in die Mitose Wichtig: positive und negative Feedback loops => doppel Feedback ermöglicht abrupte Aenderung in aktivem M-Cdk -> alles oder nichts Entscheidung möglich d.h. keine Zwischenstufen 10

11 Eintritt in Mitose ist blockiert durch inkomplete DNA Replikation: DNA Replikations-checkpoint Experiment: Säugerzellen mit Standardzellzyklus -> Zellen werden in S-Phase behandelt mit Inhibitoren der DNA-Synthese z.b. Aphidicolin (inhibiert DNA Polymerase) Hydroxyurea (blockiert Synthese von Desoxyribonucleotiden) Koffein harmlos Koffein kann Feedback inaktivieren embryonaler Zellzyklus -> keine Kontrolle -> Hydroxyurea kann Mitose nicht verhindern In adulten Zellen generiert beschädigte DNA ein Signal, das die Mitose verzögert. Wie funktioniert das? Antworten auf DNA Beschädigung studieren -> Experimentelle Induktion von DNA Läsionen -> x-rays Cerevisiae Hefe die Radiation sensitiv sind = rad Mutanten rad9 essentiell für feedback Kontrolle rad9 mutanten haben normale DNA repair Maschinerie aber G2-Phase wird nicht verlängert -> Mitose mit beschädigten Chromosomen -> sterben. Condensin hilft die Chromosomen für die Separation zu konfigurieren Am Ende der S-Phase ist die DNA ineinander verschlungen und Cateiniert -> Separation würde zu Strangbrüchen führen -> Reorganization der Schwesterchromatide. Geschieht in 2 Stufen: 1) Chromosomenkondensation -> kompakte DNA 2) Auflösen der Schwesterchromatide -> spezifische trennbare Strukturen werden gebildet. Durch decateniierung der DNA und teilweises entfernen der Cohesine entlang der Chromosomenarme. 11

12 Trennen der Schwesterchromatide hängt von Condensinen ab (siehe unten) Condesine sind verwandt mit Cohesinen (smc1 und 3). Unter ATP verbrauch können die Condensine das coiling und somit die Topologie der DNA verändern. Phosphorylierung der Condensin Untereinhieten durch M-Cdk stimuliert diese Aktivität. Dies ist wahrscheinlich der Grund warum M-Cdk Chromosomen-restrukturierung in der frühen Mitose induziert. Die mitotische Spindel ist eine auf Mikrotubuli basierende Maschine Verankerung in Zellkortex 12

13 Das Centrosom Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Säugerzelle Besteht aus einer Wolke von amorphem Material (pericentriole Matrix) Die Matrix beinhaltet microtubuli abhängige Motorproteine und Coiled coil Proteine welche die Motoren mit dem Centrosom und Komponenten des Zellzyklus verbinden. Um Mikrotubuli einzuschliessen gibt es gamma-tubulin Ring Komplexe Tochtercentriole Mikrotubuli-abhängige Motorproteine bestimmen den Spindelaufbau und Funktion 2 Hauptproteinklassen: Kinesine (bewegen meist zu +) Dyneine (bewegen zu -) Kinesin-5: 2 Motordomänen -> wandern zu + der Microtubuli -> Pole werden auseinandergedrückt Kinesin-14: 1 Motordomäne die gegen wandert -> Pole werden gegeneinander gezogen. Kinesin-4,10: chromokinesine, interagieren mit Chromosomen, wandern zu + -> Chromosom wird vom Pol weggedrückt. Dyneine: - end orientierte Motoren, verbinden + Ende von astralen Mikrotubuli mit Komponenten des Cytoskelets des Zellcortex. -> ziehen Spindelpole zum Zellcortex und voneinander weg. 13

14 Zwei Mechanismen wirken zusammen um die bipolare mitotische Spindel aufzubauen. Aufgabe der Mitotischen Spindel: Trennen von Schwesterchromatiden zu gegenseitigen Enden in der Zelle. 2 Mechanismen welche die Bipolarität der Spindel sicherstellen: Mechanismus 1: hängt von der Fähigkeit der mitotischen Chromosomen ab, Mikrotubuli zu machen und zu stabilisieren (siehe vorangehendes Slide). Mechanismus 2: hängt von der Fähigkeit der Centrosomen ab, Spindelpole zu bilden. Eine Tierzelle tritt in Mitose mit einem Paar von Centrosomen, welche einen radialen array von Mikrotubuli machen. Die Centrosomen vereinfachen die Ausbildung einer bipolaren Spindel, indem ein Paar von spindel poolen schon vorfabriziert ist. Wie setzt sich Spindel selber zusammen? Wie funktioniert die Selbstorganization? Centrosomenverdoppelung geschieht früh im Zellzyklus Zelle hat 1 Centrosom mit 2 Centriolen -> G1/S Cdk -> initiiert Centrosom Duplikation, die beiden Centriolen werden separiert und dupliziert. Parallelen zwischen Chromosomen und Centrosomenduplikation: Beide durch semi-konservativen Mechanismus In normalen Zellzyklus nur einmalige Duplikation geregelt durch DNA Synthese (blockieren stoppt auch Centrosomenduplikation) Ausnahme: Embryonaler Zellzyklus Centrosome Centriolen 14

15 M-Cdk iniziiert Spindelzusammensetzung in der Prophase M-Cdk steigt schlagartig zu Beginn der Mitose. Centrosomen generieren neue Microtubules = Centrosome Maturation. Verschiedene Motorproteine (siehe Vorher) ziehen in verschiedene Richtungen M-Cdk phosphoryliert Kinesin-5 ->stimuliert Centrosom Separation Hefezelle -> Nukleus bleibt Intakt aber nicht in Säuger- Zellen. Grün= Spindel Rote Pfeile = Befestigung der Spindelpole Der Einfluss von gegensätzlichen Motorproteinen auf die Spindellänge in S. cerevisiae (Kinesin-14) Presst Pole zusammen (Kinesin-5) Stösst Pole auseinander Wie die Zelle die Balance zwischen den gegensätzlichen Kräften reguliert ist unbekannt 15

16 Die Komplettierung der Spindelzusammensetzung in Tierzellen benötigt eine Auflösung des Zellkerns M-Cdk bereitet die Separation der Chromosomen vor MPF phosphoryliert targets direkt oder indirekt. -> Lamine (mutierte nicht phosphor) -> Histon H1, condensine -> Chromosomen Kondensation -> Microtubules -> phosphorylierung von Microtub. assoz. Proteinen -> zusammensetzen der Mitot. Spindel Instabilität von Mikrotubuli steigt in der Mitose In der interphasen Zelle immer Mikrotubuli die wachsen bzw. sich verkürzen -> wachsen und schrumpfen Wechselt sich ab. Wechsel von Wachstum zu Schrumpfen wird als Katastrophe bezeichnet. Wechsel von Schrumpfen zu Wachsen als Rettung. Neue Mikrotubuli werden auch kontinuierlich gebildet für die welche verschwinden. Eintritt in Mitose -> abrupter Wechsel in Mikrotubuli. Die wenigen langen Mikrotubuli werden in mehrere Aber kürzere dynamischere verwandelt -> Halbwertszeit eines Mikrotubulus wird kleiner in the Promethaphase und Methaphase. Gleichzeitig können aber Centrosomen mehr Mikrotubuli generieren. -> dichtes dynamisches Mikrotubuli Netzwerk welches Schwesterchromatide einfangen kann. M-Cdk iniziiert diesen Wechsel im Mikrotubuli verhalten zumindest teilweise durch phosphorylieren von 2 verschiedenen Proteinklassen welche Mikrotubulidynamik regulieren. 1) Mikrotubuli abhängige Motorproteine 2) Mikrotubuli assoziiierte Proteine (MAPs) = Rettungsfaktoren Katastrophen Faktoren destabilisieren Mikrotubuli Wechsel in MAPs und Katastrophenfaktoren machen Mikrotubuli dynamisch. 16

17 Experimentelle Evidenz dass die Balance zwischen Katastrophenfaktoren und MAPs die Frequenz von Mikrotubuli Verkürzung und Verlängerung reguliert Mitotische Chromosomen fördern die bipolare Spindelbildung Chromosomen nicht nur passive Passagiere. Bilden eine lokal Bedingungen günstig für die Nukleation und Stabilisierung von Mikrotubuli -> spielen also einen aktiven Part in der Spindelbildung. Wenn Chromosom aus der Aufreihung rausgezogen wird -> an neuer Position schnell neue Mikrotubuli Und die an der alten Stelle degradieren schnell. Diese Neuiniziierung zur Mikrotubulibildung abhängig von guanine-nucleotide exchange factor (GEF) Dieser Faktor ist and Chromatin gebunden. GEF stimuliert eine GTPase genannt Ran. Ran-GTP induziert die Entlassung von Mikrotubuli-stabilisiernden Proteinen aus Protein-Komplexen im Cytosol was zu einer lokalen Nukleation der Mikrotubuli um Chromosomen führt. Diese Fähigkeit von Chromosomen Mikrotubuli zu stabilisieren und zu organisieren ist der Grund warum Bipolare Spindeln auch in Abwesenheit von Centrosomen gemacht werden können. 17

18 Spindelselbstorganisation durch Motorproteine Zellen die normalerweise keine Zentrosomen haben wie höhere Pflanzen und viele tierische Oozyten Nutzen diesen Chromosomen basierenden Selbstorganisierungsprozess Spindeln zu formen. Auch in parthenogenetischer Zellteilung da das Centrosom des Spermiums fehlt -> keine funktionelle Spindelpole. Mit Centrosomen Ohne Centrosomen Insect Sciana 18

19 Kinetochoren befestigen Schwesterchromatide and die Spindel Der 2. wichtige Schritt in der Spindelbildung ist das befestigen der Schwesterchromatide an Die Spindel. An Kinetochoren = grosse Proteinstruktur am heterochromatin welches die Centromer Region bildet. 19

20 Mikrotubulus Befestigungsstelle an einem Kinetochor Kragen Polymerisierung und Depolymerisierung kann immer noch stattfinden. Such und Fang Mechanismus für Chromosomenbefestigung an Spindel 20

21 Bi-Orientierung der Spindeln wird durch Trial and Error erreicht Wie wird die bidirektionale Orientierung der Befestigung der Spindeln am Kinetochor erreicht? 1) Kinetochoren sind normalerweise so konstruiert dass sie voneinander wegschauen -> Wahrscheinlichkeit, dass zwei unkorrekte Befestigungen vorkommen reduziert. 2) Korrekte Befestigung wird durch Spannung (Zug) stabilisiert. Kinetochor sendet bei Befestigung der Mikrotubuli an gleichem Kinetochor ein inhibitorisches Signal aus -> Befestigung löst sich auf. Dieses Signal stammt von einer protein kinase aurora-b im Kinetochor. Wenn kein Zug -> aurora-b phsophoryliert Komponenten der Mikrotubuli -> Reduktion der Affinität zum Kinetochor. Verschiedene Kräfte bewegen Chromosomen and der Spindel 1) Depolimerisierung am Kinetochor Depolimerisierung am plus Ende der Mikrotubuli generiert eine Kraft zum Pol hin. 21

22 2) Mikrotubuli Flux Die Mikrotubuli selber wandern zum Pol. Am minus Ende werden sie abgebaut. Bis zum Start der Anaphase werden am plus Ende neue Tubuline angefügt um Länge der Mikrotubuli konstant zu halten. -> Sichtbar durch wanderndes fluoreszeierendes Tubulin. Modell: 22

23 3) Polare Abstossungskraft Zum plus Ende gerichtete Kinesine 4 und 10 Motoren interagieren mit interpolaren Mikrotubuli und transportieren die Chromosomen weg von den Spindelpolen. -> wichtig in prometaphaseund metaphase um die bi-orientierung der Schwesterchromatide sicherzustellen. Evidenz für polare Abstossungkräfte 23

24 APC/C iniziiert Schwesterchromatidseparation und die Komplettierung der Mitose Metaphase Anaphase M-Cdk startet die komplexen Rearrangierungen die im Metaphase-Anaphase Uebergang geschehen. APC/C legt den Schalter um welcher zur plötzlichen Separation der Schwesterchromatide führt. -> Cohesine müssen zerstört werden Chromatidseparation wird durch Proteolyse initiiert Proteindegradation ist nötig um Mitose zu verlassen 24

25 APC initiiert Chromatidseparation Cdh-1 Unbefestigte Chromosomen blockieren Chromatid-Strang Separation: Spindle Attachement Checkpoint Zustand der Kinetochoren wird überprüft -> wenn nicht alle Kinetochoren an Spindel befestigt sind -> negatives Signal das Cdc20-APC Aktivierung blockiert Mechanismus unklar: Mad2 Protein scheint involviert zu sein Mad2 Protein an unbefestigten Kinetochoren Die Fluoreszenzaufnahme zeigt eine Säugerzelle in Prometaphase. Mitotic Spindle Sister chromatide Dieses Chromosom hat sich gerade an der Spindel befestigt und weniger Mad2 ist sichtbar am Kinetochor Ein Sister-Chromatid ist noch nicht an der Spindel festgemacht -> die Präsenz von Mad2 Protein ist visualisiert mit anti-mad2 Antikörper. 25

26 Chromosomen segregieren in Anaphase A und B Bewegen der Chromosomen zum Pol durch Verkürzung der Kinetochormikrotubuli. 26

27 Sliding Mechanismus an interpolaren Mikrotubuli -> Abstossen Dynein Mechanismus an astralen Mikrotubuli -> Zug Seggregierte Chromosomen werden in der Telophase in Tochterkerne verpackt 27

28 Meiose ist eine spezielle From der Zellteilungfür die sexuelle Reproduktion beide Schwesterkinetochore sind am gleichen Spindelpol befestigt in Meisose 1! In Meiose 2 aber wieder bi-orientierung wie in mitose. Crossover hält Chromosomen zusammen. In Meiose 1 bleiben die Cohesine am Centromer ungespalten. Block für Cohesinspaltung in Meiose 2 aufgehoben. 28