Global Analysis of the Yeast Protein Kinase - Substrate Network by Quantitative Phosphoproteomics Technology

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1 Diss. ETH No Global Analysis of the Yeast Protein Kinase - Substrate Network by Quantitative Phosphoproteomics Technology A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH for the degree of Doctor of Sciences presented by Bernd Bodenmiller Diplom Naturwissenschafter, ETH Zurich born on June 15th, 1979 citizen of Germany accepted on the recommendation of Prof. Dr. Ruedi Aebersold, examiner Prof. Dr. Ernst Hafen, co-examiner Dr. Paul Jenö, co-examiner 2008

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3 ABSTRACT New directions in science are launched by new tools much more often than by new concepts" and "The effect of a tool-driven revolution is to discover new things that have to be explained" are two quotes from Freeman J. Dyson that acutely apply to the current status of systems biology. Some of the concepts of systems biology have been discussed for years by people such as Ludwig von Bertalanffy or William Ashby, yet they could not be rigorously tested due to a lack of tools to generate the required data. Systems biology at the molecular level is concerned with networks of interacting molecules, their structure, and dynamic response to perturbations that give rise to systems properties that determine measurable, macroscopic phenotypes. At any time, in any cell, multiple types of molecular networks are concurrently active. One of the most important known regulatory systems in eukaryotic cells is reversible protein phosphorylation catalyzed by protein kinases and phosphatases, respectively. While thousands of published research reports have studied the properties of specific kinases/phosphatases or phosphoproteins and their involvement in every kind of process, neither a conceptual framework nor a suitable technology to study this essential regulatory system as a whole exists. As the understanding of the wiring of any phosphorylation network is one of the most promising approaches to develop therapeutic interventions the lack of an analyzed kinome remains a stumbling block in developing therapeutics. Therefore, it is essential to understand and eventually model the protein phosphorylation mediated informational fluxes in cells from sensors and signaling systems to effector molecules, to comprehensively analysis the dynamic system of kinases/phosphatases and their substrates and to determine the basic rules of information processing in cells. I

4 In this thesis, first, I developed and applied the technology necessary to comprehensively and quantitatively measure the phosphorylation-modulated informational networks in cells. The technology pipeline relies on the selective, quantitative isolation of phosphopeptides generated by the tryptic digestion of complex protein mixtures and their subsequent mass spectrometric and computational analysis. Then second, I applied this technology, to map the phosphoproteomes of the model organisms D. melanogaster, S. cerevisiae and C. elegans, producing the first large scale phosphorylation maps in fly and worm as well as the most comprehensive analysis of any phosphoproteome to date. Third, I used the technology to study time resolved signaling events in insulin stimulated D. melanogaster cells and forth, applied the technology to determine the substrates of 120 kinases and phosphatases in the yeast S. cerevisiae. This dataset allowed us for the first time to generate a global phosphorylation network comprising most yeast kinases and phosphatases in any cell. All technological developments, the mass spectrometric assays and the software tools to measure phosphorylation-mediated informational fluxes in cells as well as all phosphorylation sites are freely accessible to the scientific community via the database PhosphoPep which we developed for this task ( It can be expected that the developed general technology for quantitative phosphoproteome analysis as well as the over 20,000 novel described phosphorylation sites from yeast, worm and fly will broadly impact biological research. Finally, the first global phosphorylation network in yeast will help understanding the informational fluxes in cells, to learn the general concepts which govern phosphorylation networks and thereby will be the fundament for the understanding and analysis of the human kinome, ultimately impacting medical research. II

5 ZUSAMMENFASSUNG Neue Richtungen werden in der Wissenschaft häufiger durch neue Technologien als durch neue Konzepte angestossen und Der Effekt von technologiegetriebenen Revolutionen ist, dass Neues entdeckt wird, das erst noch erkärt werden muss. Diese zwei Aussagen von Freeman J. Dyson beschreiben sehr passend den gegenwärtigen Zustand der Systembiologie. Einige der Konzepte, die heute in der Systembiologie angewendet werden, wurden schon vor Jahren unter anderem von Ludwig von Bertalanffy und Wiliam Ashby diskutiert. Jedoch war es zu dem Zeitpunkt noch nicht möglich, diese Konzepte zu untersuchen, da die Methoden zur Erzeugung von geeigneten Daten gefehlt haben. Systembiolgie beschäftigt sich auf der molekularen Ebene mit Netzwerken interagierender Moleküle, deren Strukturen und ihrer Antwort auf Veränderungen in den Netzwerken und der resultierenden Systemeigenschaften, die messbare, makroskopische Phenotypen bestimmen. Zu jedem Zeitpunkt sind in sämtlichen Zellen eine Vielzahl von molekularen Netzwerken parallel aktiv. Eines der wichtigsten regulatorischen Systeme in eukaryotischen Zellen ist die reversible Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Proteinen durch Enzyme, die Kinasen und Phosphatasen genannt werden. Obwohl Tausende von wissenschaftlichen Publikationen sich mit den Eigenschaften sowohl einzelner Kinasen/Phosphatasen als auch ihrer phosphorylierten Proteine und deren Rollen in diversen Prozessen beschäftigt haben, gibt es weder geeignete Technologien noch einen konzeptionellen Rahmen, um dieses essentielle regulatorische System auf einer systemweiten Ebene zu untersuchen. Die Aufklärung der Zusammenhänge eines Phosphorylierungsnetzwerks ist einer der erfolgsversprechendsten Ansätze für die Entwicklung neuer medikamentöser Therapien. Aus diesem Grund ist es essentiell, die Informationsflüsse in zellulären Systemen von den Sensoren zu Effektoren, wie beispielsweise im dynamischen System von III

6 Kinasen/Phosphatasen und ihrer Substrate, zu modellieren, um die Regeln der Informationsverarbeitung zu verstehen. Ich habe deshalb in meiner Doktorarbeit als erstes Projekt eine Methode entwickelt, die eine umfassende und quantitative Analyse von phosphorylierungsabhängigen Netzwerken in Zellen ermöglicht. Diese Methode beruht auf der selektiven, quantitativen Isolation von Phosphopeptiden aus einem komplexen Peptidgemisch, das durch einen tryptischen Verdau eines Proteoms entstanden ist, der massenspektrometrischen Analyse dieser Phosphopeptide und der nachfolgenden Datenanalyse mit Hilfe von speziell entwickelten Computerprogrammen. Als Zweites habe ich diese Methode auf die Modellorganismen Fruchtfliege (D. melanogaster), Bäckerhefe (S. cerevisiae) und Fadenwurm (C. elegans) angewandt, um deren Phosphoproteome zu kartieren. Dies lieferte die bisher genausten Phosphorylierungskarten eines Organismuses. Als weitere Anwedungen der Methode habe ich in der Fruchtfliege speziell die zeitaufgelöste insulinabhängige Signaltransduktion mit der entwickelten Technologie untersucht. Als letztes Projekt habe ich für 120 Kinasen und Phosphatasen der Hefe die Substrate bestimmt. Mit diesem Datensatz konnte das erste globale Phosphorylierungsnetzwerk erstellt werden. Alle entwickelten Technologien inklusive der massenspektrometrischen Methoden, der Computerprogramme für die Datenanalyse der Phosphorylierungsnetzwerke und alle identifizierten Phosphorylierungsstellen sind durch die Entwicklung der PhosphoPep Datenbank ( frei zugänglich. Es kann angenommen werden, dass unsere generelle Methode für quantitative, phosphoproteomische Analysen zusammen mit den über 20,000 identifizierten Phosphorylierungsstellen in Hefe, Fadenwurm und der Fruchfliege einen grossen Einfluss auf die biologische Forschung haben wird. Des Weiteren wird es das erste umfassende Phosphorylierungsnetzwerk in Hefe erlauben, die Informationsflüsse in Zellen und deren Regeln zu verstehen. Dadurch ist das Fundament gelegt, um das menschliche Kinom zu verstehen, was wiederum einen grossen Einfluss auf die medizinische Forschung verspricht. IV