Analytische Chemie II / Oberflächenanalytik mit Röntgenstrahlung
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- Oldwig Hase
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1 Analytische Chemie II / Oberflächenanalytik mit Röntgenstrahlung 4 Oberflächenanalytik mit Röntgenstrahlung 4.1 Prinzipien Bei der Absorption von Röntgenstrahlung wird ein Elektron aus dem Atom herausgeschlagen (photoelektrischer Effekt). Die kinetische Energie dieses Elektrons ist abhängig vom Element (der Bindungsenergie) und wird bei der XPS (X-Ray Photoelectron Spectroscopy) als analytisches Signal verwertet. Für Valenzelektronen kann auch mit UV-Strahlung gearbeitet werden (UPS, Ultraviolet Photoelectron Spectroscopy). Der Begriff ESCA (Electron Spectroscopy for Chemical Analysis) umfasst XPS und UPS. Seltener wird das Auger-Elektron ausgenützt (AES, Auger- Emissionsspektroskopie). Bei der Röngenfluoreszenz wird die entstehende sekundäre Röntgenstrahlung (Fluoreszenz) gemessen. 4.2 Instrumentelle Komponenten Röntgenröhren Röntgenstrahlung wird durch Abbremsen von schnellen Elektronen (Bremsstrahlung) erzeugt.
2 Analytische Chemie II / Oberflächenanalytik mit Röntgenstrahlung Elektronenspektrometer Elektronen mit unterschiedlicher kinetischer Energie werden durch Veränderung der an die Zylinder angelegten Spannung auf den Elektronenmultiplizierer fokussiert. Röntgenspektrometer Zwei Typen von Instrumenten sind gebräuchlich: wellenlängendispersive und engergiedispersive Röntgenfluoreszenzspektrometer. Bei wellenlängendispersiven Instrumenten wird ein Einkristall von beispielsweise LiF eingesetzt welcher als Reflektionsgitter für Röntgenstrahlung dient. Der Gasdurchflusszähler beruht auf der Detektion eines Stromflusses bedingt durch die Ionisation von Argon. Der Szintillationsdetektor beruht auf der Messung des in einem Szintillationskristall erzeugten Lichtes mittels einer PMT. Beim einfacheren energiedispersiven Instrument erfolgt die Messung mittels eines speziellen Halbleiterdetektors. In der Siliziumdiode werden Photoelektronen erzeugt,
3 Analytische Chemie II / Oberflächenanalytik mit Röntgenstrahlung dessen Energie zu Generierung einer Vielzahl von Elektronen/Löcher-Paaren führt welche extern als Ladung gemessen werden können. Die Grösse der so erzeugten Ladungspulse ist proportional zur Energie der einfallenden Röntgenstrahlung. Durch Zählung der Pulse nach Energie erhält man ein Spektrum. 4.3 XPS Analyse nur der obersten Schicht da Elektronen nur aus einer Tiefe bis etwa 1 nm entkommen können. Studium von Schichten durch Abtrag der Oberfläche durch Beschuss mit Ar +. Nachweisgrenze: ca. 0.1%. Chemische Verschiebung:
4 Analytische Chemie II / Oberflächenanalytik mit Röntgenstrahlung 4.3 Röntgenfluoreszenz (X-Ray Fluorescence) Die Röntgenfluoreszenz findet Anwendung für flüssige und feste Proben und benötigt in der Regel keine Probenvorbereitung. Beispiele: - Stahlindustrie zur schnellen (keine Probenaufbereitung) Ermittlung der Zusammensetzung von Stahlproben - Zementherstellung: Bestimmung der Haupt- und Nebenkomponenten von Rohstoffen und des fertigen Produktes - Erdölverarbeitung: Bestimmung von Katalysatorgiften (Ni, V, Fe) und Schmierölzusätzen, Schwefelgehalt - Umweltanalytik (z.b. Bleigehalt in Staubproben, Anstrichen) - Gesteinsproben in der Geologie
5 Analytische Chemie II / Radiochemie 5. Radiochemische Methoden der Analytik ca unstabile, d.h,. radioaktive Isotope der Elemente Radioaktiver Zerfall unter Abgabe 3er Arten von Strahlung: α-strahlung: positiv geladene Heliumkerne ( 4 He 2+ ) β-strahlung: Elektronen (β - ) oder Positronen (β + ) γ-strahlung: elektromagnetische Strahlung kleiner Wellenlänge! Die Zerfallsrate ist abhängig vom Isotop und direkt proportional zur Zahl der vorhandenen radioaktiven Atome. " dn dt = #n 2 wobei λ die stoffabhängige Zerfallskonstante ist, und n die Zahl der Isotope! Durch Integration erhält man: n = n 0 e "#t oder: A = Aktivität A = A 0 e "#t! d.h. es ergibt sich eine exponentielle! Abnahme der Radioaktivität:
6 Analytische Chemie II / Radiochemie Die Halbwertszeit ist die Zeit, nach der die Hälfte der vorhanden Isotope zerfallen sind, und charakteristisch für jedes Isotop: 1 2 = e"#t 1/2 t 1/ 2 = ln2 " = 0.693! "! Dosimetrie: Die Radioaktivität (oder einfach Aktivität) wird in Becquerel (Bq) angebeben. 1 Becquerel ist definiert als 1 radioaktiver Zerfall pro Sekunde, bzw. entspricht der Stoffmenge welche diese Zerfallrate ergibt (ältere Einheit: Curie, Ci). Radioaktive Strahlung lässt sich anhand der Energie charakterisieren und ist verknüpft mit der Geschwindigkeit der Teilchen rsp. der Wellenlänge der Strahlung. Die übliche Einheit ist das Elektronenvolt (ev). Die absorbierte Menge Strahlung (Abhängig vom Material und der Art der Strahlung) wird als Dosis bezeichnte: Gray (Gy), entspricht der Absorption von einem J von Strahlungsenergie durch 1 kg Materie. (Alte Einheit: Rad (rd)). Die Äquivalentdosis (Sievert, Sv; alte Einheit: Rem) berücksichtigt unterschiedliche physiologische Wirkungen der Dosis.
7 Analytische Chemie II / Radiochemie Messung der Radioaktivität: Gasionisation Ionisationskammer: Betrieb im ersten Plateau, relativ unempfindlich, spricht bevorzugt auf α-partikel an, weniger auf β-strahlung Proportionalzähler: Betrieb im zweiten Anstiegsbereich, empfindlicher, α-und β- Srahlung Geiger-Müller-Zähler: Betrieb im zweiten Sättigungsbereich, höchstempfindich, α-und β- und γ-strahlung (für letztere etwas weniger empfindlich)
8 Analytische Chemie II / Radiochemie Szintillationsdetektoren: Hier werden Substanzen eingesetzt welche durch radioaktive Strahlung zur Fluoreszenz von Licht angeregt werden. Für α-, β- und γ-strahlung. Halbleiterdetektoren: Funktionsprinzip wie p,n-photodiode. β- und γ-strahlung. Anwendungen: - Neutronenaktivierungsanalyse (die Probe wird im Kernreaktor durch Neutronenbestrahlung radioaktiv gemacht) - Markierung von chemischen Verbindungen in Metabolismusstudien - Nachweis, Identitäts- und Reinheitsbestimmung von Radiopharmaka (Behandlung von Tumoren etc.) - Isotopenverdünnungsanalyse (interne Standardadditionsmethode etwa zur Korrektur von nicht 100%er Extraktion) - Radioimmunoassay (Nachweis von Pharmaka und anderen Substanzen welche eine Immunreaktion hervorrufen, radioaktiv markierte Standardsubstanz wird der Probe beigemischt, Antikörper ist immobilisiert und bindet Analyt plus Anteil radioaktiv markierter Standard) (Nobelpreis Medizin 1977) C-Methode zur Altersbestimmung von Artefakten (Nobelpreis Chemie 1960). Radiochemische Methoden sind sehr empfindlich, besitzen aber den Nachteil, dass mit radioaktiven Substanzen gearbeitet werden muss, bzw. diese dabei produziert werden.
9 Analytische Chemie II / Bioanalytik 6. Biochemische Assays Bei diesen Methoden wird die Selektivität biochemischer Reaktionen für analytische Anwendungen ausgenützt. Vielseitig: von Umweltanalytik für Pestizide zu Nachweis von Viren wie etwa SARS Aufwendig in der Entwicklung, dann aber recht einfach, relativ schnell und billig 6.1 Enzym-Assays Meist Substrat als Analyt, manchmal auch Cofaktoren oder Enzyme selbst (klinische Analytik). Selektiv für Naturstoffe in komplexen Proben die sonst nur mit aufwendigen Trennmethoden (HPLC) zu bestimmen wären. Enantioselektivität Selektivität bedeutet, dass nur geringe Probenaufarbeitung zur Unterdrückung von Matrixeffekten notwendig ist. Die meisten der eingesetzten Verfahren beruhen auf redoxaktiven Enzymen mit Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) als Coenzym, welches direkt anhand der UV- Absorption nachgewiesen werden kann, oder auf Reaktionen welche H 2 O 2 als Nebenprodukt aufweisen, welches dann in einer nachfolgenden Sekundärreaktion zur Bildung eines farbigen Produktes führt.
10 Analytische Chemie II / Bioanalytik Bei relativ langsamer Reaktion wird der vollständige Umsatz des Analyten nicht abgewartet sondern die Reaktionskinetik gemessen und aus der Reaktionsrate die Konzentration abgeleitet. Die Enzymreaktionen sind immer ph-wert empfindlich und die höchste Umsatzrate wird in der Regel um den physiologischen ph-wert von 7.4 erreicht. Anwendungen liegen im Bereich der Biochemie, Lebensmittelanalytik, Pharmazie und klinische Chemie (da man auf Enzyme und damit auf natürlich vorkommende Analyte angewiesen ist). Beispiele: Ethanolbestimmung mit Alkoholdehydrogenase: CH 3 CH 2 OH + NAD + -> CH 3 CHO + NADH + H + Glukosebestimmung mit Hexokinase und Adenosin-5'-triphosphat als Coenzym gefolgt von einer Indikatorreaktion des Produktes in einer mit NAD gekoppelten weiteren Enzymreaktion: Glukose + ATP -> ADP + Glukose-6-Phosphat Glukose-6-Phosphat + NAD + -> 6-Phosphoglukonolacton + NADH + H + (oder mit Glukoseoxidase via Peroxid) Cholesterin mit Cholesterinoxidase (via Peroxid) Harnsäure mit Uricase (via Peroxid)
11 Analytische Chemie II / Bioanalytik Harnstoff mit Urease und Nachweis des gebildeten NH 4 + photometrisch (via Berthelotreaktion) Kreatin mit Creatinase und Nachweis des gebildeten Sarcosin mit Sarcosinoxidase (via Peroxid) Laktat mit Laktatdehydrogenase (via NAD) 6.2 Immuno-Assays Erkennung von Analyten (Antigene) mittels einer immunologischen Abwehrreaktion; Antikörper-Antigen. Spezifische Antikörper (Immunoglobuline) werden durch Inkubation von Lebewesen (Mäusen) erzeugt. Es kommen entweder Gemische von Antikörpern (polyklonal, aus dem Blutserum) oder sogenannte monoklonale Antikörper zum Einsatz. Kleine Analytmoleküle (< 1000 g/mol) (Haptene) müssen vor der Inkubation kovalent an Trägerproteine gebunden werden da sonst keine Antikörper gebildet werden. In den meisten Verfahren werden die Antikörper an eine Oberfläche gebunden und dann erfolgt der Nachweis der Antigene mittels kompetitiver Absorption von markierten Analytderivaten. Die Markierung erfolgt entweder mit radioaktiven (RIA) oder fluoreszierenden (FIA) Substanzen oder mit Enzymen (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay) die eine farbgebende Reaktion katalysieren (siehe 6.1).
12 Analytische Chemie II / Bioanalytik Für den Routineeinsatz werden Einwegtestkits für einzelne Nachweise eingesesetzt (Umweltanalytik zur Kontaminationskontrolle etwa auf Erdöl, Schwangerschaftstests). Wo hohe Probenzahlen anfallen (klinische Analytik) kommen standardisierte sogenannte Mikrotiterplatten, mit 96 Vertiefungen als Gefässe, in Robotern zum Einsatz die mit Vielfachmikropipetten und CCD-Kameras ausgestattet sind.
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