Bestimmung des Thiaminstatus von Frühgeborenen durch Messung von Thiamindiphosphat im Vollblut

Transkript

1 Aus dem Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin der Universität zu Köln Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendmedizin Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. J. Dötsch Bestimmung des Thiaminstatus von Frühgeborenen durch Messung von Thiamindiphosphat im Vollblut Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Robert Walter Körner aus Leverkusen promoviert am 07. August 2013

2 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln im Jahr 2013

3 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg 1. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. B. Roth 2. Berichterstatter: Privatdozent Dr. rer. nat. A. Klatt Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskripts habe ich Unterstützungsleistungen von Frau Dr. med. Anne Vierzig, Herrn Dr. med. Carsten Müller und Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Bernhard Roth erhalten. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin / eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, den Robert W. Körner

4 Die im Rahmen dieser Arbeit erfolgte Studie wurde in der Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendmedizin des Universitätsklinikum Köln unter der Anleitung und Unterstützung von Frau Dr. med. Anne Vierzig und Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Bernhard Roth von mir durchgeführt. Die der Studie zugrunde liegenden Messwerte wurden von mir im Institut für Pharmakologie des Universitätsklinikum Köln unter der Anleitung und Unterstützung von Herrn Dr. med. Carsten Müller erhoben.

5 Danksagungen Danksagungen Ich danke den ärztlichen Kollegen Frau Dr. med. Sarah Börner, Herrn Dr. med. Boris De Carolis, Frau Dr. med. Miriam Jackels, Frau Dr. med. Shino Junghänel, Frau Dr. med. Inga Gartz, Herrn Dr. med. Titus Keller, Frau Privatdozentin Dr. med. Angela Kribs, Herrn Kyriakos Martakis, Frau Dr. med. Andrea Mikolajczak, Herrn Dr. med. Guido Weißhaar, dem Pflegepersonal der Kinderklinik und den Eltern der Studienteilnehmer für Ihre Hilfe bei der Durchführung der klinischen Studie. Ich danke dem Kollegen Herrn Privatdozent Dr. med. Oliver Fricke für seine statistische Beratung. Frau Simone Gonschorek und Herrn Ahmad Arbab danke ich für ihre stets freundliche Hilfsbereitschaft im Labor. Ganz besonderer Dank gilt Frau Dr. med. Anne Vierzig für die Überlassung des Themas und ihre vielen konstruktiven Anregungen, Herrn Dr. med. Carsten Müller für die Bereitstellung des Laborplatzes und seine hervorragende wissenschaftliche Beratung und Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Bernhard Roth für seine stetige Unterstützung und Förderung.

6 Widmung Meinen Eltern Gabriela Körner und Dr. Walter Körner

7 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis..S Einleitung..S Von Beriberi zu Thiamin..S Chemie und Biochemie des Thiamins..S Bestimmung des Thiaminstatus..S Symptomatik des Thiaminmangels..S Thiaminmangel bei reifen Neugeborenen und Säuglingen..S Thiaminmangel bei Frühgeborenen..S Methodik und Ergebnisse..S Publikation.S Publikation.S Diskussion..S Zusammenfassung..S Literaturverzeichnis..S Lebenslauf..S

8 Abkürzungsverzeichnis Acetyl-CoA ACN ATDP ATTP CRIB CRP CV EDTA ETKA Hb HCl HPLC IUGR LLOQ LOD mrna NADPH NBRS PRISM III QC ROS SD SLC SSW TCA TDP TMP TPPE TTP Acetyl-Coenzym A Acetonitril Adenosin Thiamindiphosphat Adenosin Thiamintriphosphat Clinical Risk Index for Babies C-reaktives Protein Coefficient of variation (Variationskoeffizient) Ethylenediaminetetraacetic acid (Ethylendiamintetraessigsäure) Erythrocytäre Transketolaseaktivität Hämoglobin Salzsäure High Pressure Liquid Chromatography (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) Intrauterine growth retardation (Intrauterine Wachstumsretardierung) Lower limit of quantification (Untere Quantifizierungsgrenze) Limit of detection (Untere Nachweisgrenze) Messenger ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) Nicotinamidadenindinukleotidphosphat Nursery Neurobiologic Risk Score Pediatric Risk of Mortality III Quality control (Qualitätskontrolle) Reactive oxygen species (Reaktive Sauerstoffspezies) Standard deviation (Standardabweichung) Solute carrier Schwangerschaftswochen Trichloroacetic acid (Trichloressigsäure) Thiamindiphosphat Thiaminmonophosphat Thiamin Pyrophosphat - Effekt Thiamintriphosphat - 2 -

9 1. Einleitung 1.1. Von Beriberi zu Thiamin Die Entdeckung des Thiamin (Vitamin B 1 ) ist das Resultat langer Ursachenforschung der Erkrankung Beriberi und steht mit der Entdeckung der Vitamine im Allgemeinen in enger Verbindung. Beriberi ist eine Erkrankung, die bis zum 20. Jahrhundert auf der ganzen Welt häufig vorkam; besonders in Asien. Die älteste Beschreibung der Beriberi sei angeblich in einem von Chinas ältesten medizinischen Werken, dem Huáng Dì Nèi Jīng, zu finden und wird auf das Jahr 2697 v. Chr. geschätzt (95). Vor allem aus Japan liegen mehrere verlässliche Statistiken zur Prävalenz aus dem 19. Jahrhundert vor. Beispielsweise litten im Jahr % der Soldaten der japanischen Armee an Beriberi. Bei den Marinesoldaten der japanischen Armee waren es sogar 40% (95). Das Interesse an der Ursache dieser die Bevölkerung und Armee schwächenden Erkrankung war immens. Der niederländische Mediziner CHRISTIAAN EIJKMAN forschte von 1886 bis zum Ende des 19. Jahrhunderts in Indonesien an Beriberi, die dort endemischen war (14,77). Die Erkrankung trat zu dieser Zeit in zwei Formen auf: Einerseits mit Ödemen und Herzinsuffizienz und andererseits mit einer progressiven Lähmung der Beine. Beriberi ist singhalesisch und bedeutet "ich kann nicht, ich kann nicht" (68). Vermutlich spiegelt die Bezeichnung das Endstadium mit ausgeprägten Lähmungen wieder. Im 19. Jahrhundert existierten mehrere Theorien bezüglich der Ursache der Beriberi. Geprägt durch den medizinischen Einfluss von LOUIS PASTEUR wurde von den meisten Wissenschaftlern geglaubt, dass Beriberi eine Infektionskrankheit sei (14). EIJKMAN fand heraus, dass Hühner, die ausschließlich mit geschältem Reis gefüttert wurden, Zeichen von Beriberi entwickelten, während Hühner, die mit ungeschältem Reis ernährt wurden, gesund blieben. Der Grund hierfür war zunächst unklar. EIJKMAN spekulierte, dass die Stärke im geschälten Reis durch intestinale Mikroorganismen zu einem Neurotoxin umgewandelt würde. Erst später kam er zu der Annahme, dass sich in der Schale des Reis eine Substanz befinden mag, die das Auftreten von Beriberi verhindert (14). Es war eine neue, herausragende Entdeckung, dass der Mangel eines Nährstoffes eine Erkrankung auslösen konnte. EIJKMANS Arbeit wurde als Grundstein des Konzepts der Vitamine anerkannt. Ihm wurde hierfür 1929 der Nobelpreis verliehen (77)

10 Neben EIJKMAN forschten noch viele weitere Wissenschaftler an der Ursache der Beriberi. Besonders erwähnenswert ist der japanische Marinearzt KANEHIRO TAKAKI. Schon vor EIJKMANS Experimenten erkannte er, dass die Art der Ernährung das Auftreten von Beriberi beeinflusst. Er untersuchte 1883 die Zusammensetzung der Rationen von Kriegsschiffen und stellte fest, dass die Nahrung einen sehr hohen Anteil an Kohlenhydraten enthielt und gleichzeitig arm an Proteinen war. TAKAKI glaubte, dass jenes Verhältnis beider Anteile die Ursache der Beriberi war. Circa ein Jahr später setzte er durch, dass auf den Schiffen neue Rationen eingeführt wurden, deren Proteinanteil höher und Kohlenhydratanteil wesentlich niedriger war. Dadurch konnte die Inzidenz der Beriberi deutlich reduziert werden (78-80). Im Jahr 1911 begann der polnisch-amerikanische Biochemiker KAZIMIERZ FUNK seine Forschung an der Erkrankung Beriberi (65). Er führte Tierfütterversuche, vor allem mit Tauben, durch. Wie EIJKMAN und andere Wissenschaftler verwendete er Reis für seine Experimente, da mittlerweile klar war, dass die Manifestation von Beriberi durch den Konsum von poliertem Reis ausgelöst werden konnte. Dies erklärte die besonders hohe Prävalenz in Asien, wo Reis als Grundnahrungsmittel diente und der Konsum von poliertem Reis bevorzugt wurde. FUNK fraktionierte die Reisschale soweit, bis nur noch ein kleiner Teil der Schale übrig blieb, welcher in der Lage war, die Beriberi-artigen Symptome der Tauben zu heilen (30). Für diese Fraktion erfand er den Begriff "Vitamin". Dieser sollte Verbindungen beschreiben, die essentiell für das Leben (Vita) sind und in ihrer Struktur Stickstoffverbindungen (Amine) enthalten. Später stellte sich heraus, dass nicht alle Vitamine tatsächlich Amine sind. Das Vitamin, das bei seinem Fehlen Beriberi auslöst, nannte FUNK vorläufig "Beriberi-Vitamin". JACK DRUMMOND schlug 1920 die bis heute gültige Nomenklatur der Vitamine vor: "Vitamin A, B, C etc." (20). Es erfolgte die Benennung als "Vitamin B 1 ". Im Jahr 1926 gelang erstmalig die Isolation des Vitamin B 1 durch BAREND JANSEN und WILLEM DONATH (41). JANSEN schlug die Bezeichnung "Aneurin" vor, die auf die antineuritische Wirkung anspielt. Die bis heute allgemein gültige Bezeichnung "Thiamin" weist auf den Gehalt von Schwefel hin und wurde durch ROBERT WILLIAMS vorgeschlagen, der im Jahr 1936 erstmalig über die chemische Struktur und Synthese des Thiamins berichtete (93,94,96). Kurz darauf wurde ebenfalls erkannt, dass das zweifach phosphorylierte Thiamin (Thiamindiphosphat) als Koenzym im Kohlenhydratmetabolismus dient und dass das unphosphorylierte Thiamin diese Funktion nicht wahrnehmen kann (64,93). Seither wächst das Wissen um Thiamin stetig. Gleichzeitig hat die Inzidenz des Thiaminmangels in hohem Maße abgenommen

11 1.2. Chemie und Biochemie des Thiamins Thiamin ist ein wasserlösliches Vitamin. Es besteht aus einem Thiazol-Ring, der über eine Methylengruppe mit einem Pyrimidin-Ring verbunden ist (Summenformel Thiamin: C 12 H 17 N 4 OS, Strukturformel: s. Abbildung 1). Das Vitamin ist licht- und wärmeempfindlich. Thiamin ist in pflanzlichen und tierischen Lebensmitteln enthalten. Neben der freien Form kommt es in drei Phosphorylierungsstufen vor. Besonders reich an Thiamin sind Vollkornprodukte, Hülsenfrüchte, Nüsse und Schweinefleisch (3). Abbildung 1: Thiamin und seine Phosphatester Thiamin kann durch Pflanzen, Bakterien, Protozoen und Pilze gebildet werden (91). Hierbei werden stets der Thiazol-Ring und der Pyrimidin-Ring zuerst aufgebaut und schließlich durch die Thiaminphosphat-Synthase miteinander zu Thiaminmonophosphat (TMP) verbunden (5). Die Thiaminbildung wird durch einen Riboswitch reguliert (1). Riboswitches sind Bestandteile der mrna, welche die Genexpression dadurch kontrollieren, in dem sie ihre Struktur in Abhängigkeit von der Bindung eines speziellen Metaboliten verändern. In diesem Fall folgt eine Hemmung der Translation am Ribosom. Eine Thiaminsynthese im menschlichen Körper ist nicht möglich. TMP kann in der Folge durch die Thiaminmonophosphatase zu freiem Thiamin hydrolysiert werden. Das freie Thiamin kann durch die Thiamindiphosphokinase wiederum in Thiamindiphosphat (TDP) umgewandelt werden (5). TDP ist auch bekannt als "Thiaminpyrophosphat" und "Cocarboxylase". Es ist Koenzym verschiedener Enzyme bzw. Multienzymkomplexe und somit die stoffwechselaktive Form. Es wird allgemein davon ausgegangen, dass die Symptome des Thiaminmangels auf dem Mangel von TDP und den folglich gestörten Stoffwechselwegen beruhen, obwohl auch ein Mangel der anderen Thiaminformen potentiell pathologisch ist. Eine zentrale Stellung nimmt TDP im Kohlenhydratstoffwechsel ein, da es als Kofaktor dem Pyruvatdehydrogenase-Komplex - 5 -

12 dient, der die Umwandlung von Pyruvat zu Acetyl-CoA katalysiert. Der Pyruvatdehydrogenase-Komplex verbindet durch diese Reaktion die Glykolyse mit dem Citratzyklus. Bei einem TDP-Mangel entsteht eine Anhäufung von Pyruvat, das weiter zu Laktat umgewandelt wird. Die Folge ist eine Laktatazidose. Als Kofaktor im α- Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplex ist TDP auch direkter Bestandteil des Citratzyklus. TDP ist weiterhin Koenzym der Transketolase, die eine Verbindung zwischen Glykolyse und Pentosephosphatweg herstellt und somit wichtig für die Produktion von reduziertem Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH) ist (51). NADPH ist ein antioxidativer Metabolit, der zur Reduzierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), wie z.b. Wasserstoffperoxid, benötigt wird. Die intrazelluläre Thiaminkonzentration wird durch Transporterproteine der SLC19A-Genfamilie und durch Diffusion beeinflusst (31). Die Transporter werden ubiquitär exprimiert. Ein besonders starkes Vorkommen weisen Dünndarm, Nieren und Plazenta auf. Sowohl SLC19A2 (Thiamintransporter 1) als auch SLC19A3 (Thiamintransporter 2) transportieren spezifisch Thiamin. SLC19A1 (Folattransporter) transportiert hingegen Folat und kann zusätzlich TMP und TDP als Anion transportieren (99,100). Die genannten Transporter werden über den transmembranären ph-gradienten angetrieben. Es ist allerdings relativ wenig über die genaue Regulation der Thiaminkonzentrationen bekannt. Über die Funktion des TMP und des dreifach phosphorylierten Thiamin (Thiamintriphosphat, TTP) ist ebenso wenig bekannt. Wie bereits erwähnt, entsteht TMP als Zwischenprodukt in der Thiaminsynthese und auch im Abbau von TDP. Ob TMP eine physiologische Funktion hat, ist unklar. Bei Muttermilchanalysen fiel auf, dass TMP ca. 64% des gesamten Thiamins der Muttermilch ausmacht (75). Es hat also einen höheren Anteil am Gesamtthiamin als das freie Thiamin und ist somit für die Thiaminversorgung von Säuglingen bedeutsam. TTP wird oft eine neurophysiologische Rolle zugewiesen. Es wird vermutet, dass es bei der neuronalen Signalübertragung von Bedeutung ist (17). In einer experimentellen Arbeit am Rattenhirn, gab es Hinweise auf eine Funktion als Aktivator von Chloridkanälen (4). Im Jahr 2004 konnte gezeigt werden, dass das Bakterium E. coli vermehrt TTP produziert, wenn es einem Mangel an Aminosäuren ausgesetzt ist (47). Es wird behauptet, dass TTP deshalb bei Bakterien ein wichtiger Adaptationsfaktor des Stoffewechsels und folglich Wachstumsfaktor unter - 6 -

13 dieser Stoffwechsellage sei. Laut den Autoren sei dies die bis dato erste bewiesene physiologische Rolle von TTP. Im Jahr 2007 wurde in der Arbeitsgruppe von LUCIEN BETTENDORFF mit Adenosin- Thiamintriphosphat (ATTP) eine weitere Thiaminverbindung entdeckt (6). Es wird in E. coli aus TDP und ATP oder ADP gebildet, vorausgesetzt das Bakterium ist neben einem Aminosäurenmangel auch einem Mangel an Kohlenstoff ausgesetzt (56). Über die Funktion in Eukaryoten gibt es bis jetzt keine Erkenntnisse. Im Jahr 2009 wurde eine weitere neue Verbindung mit unklarer Funktion gefunden, die bei der Synthese von ATTP anfällt: das Adenosin-Thiamindiphosphat (ATDP) (27). Bislang scheint es, als hätten TTP und ATTP beide eine Signalrolle und keine Rolle als Koenzym. Dies zeigt, dass sich hinter dem Thiaminmetabolismus eine Biochemie verbirgt, die komplexer ist, als ursprünglich angenommen Bestimmung des Thiaminstatus Eine immer noch weit verbreitete Bestimmungsmethode des Thiaminstatus ist die im Jahr 1960 durch MYRON BRIN eingeführte Messung der Aktivität der erythrozytären Transketolase (ETKA) (10,36,74,82). Bei einer reduzierten Aktivität ist davon auszugehen, dass zu wenig Koenzym (TDP) vorhanden ist. Diese Bestimmungsmethode erlaubt also eine indirekte Aussage zum Thiaminstatus. Liegt in Abwesenheit klinischer Symptome eine erniedrigte Aktivität vor, würde man von einem "biochemischen Thiaminmangel" sprechen. Die Bestimmungsmethode kann durch die Messung des "Thiaminpyrophosphat- Effekts" (TPPE) erweitert werden (2,36,74,81). Hierbei wird nach Messung der basalen ETKA das Enzym mittels Zugabe von TDP stimuliert. Im Falle eines Thiaminmangels steigt die Aktivität abnormal an. Es wird schließlich ein "Aktivierungs-Quotient" aus basaler und stimulierter Aktivität gebildet, der die Differenz prozentual ausdrückt (81) : Aktivierungs Quotient(%) = aktivierte ETKA basale ETKA basale ETKA 100 Je größer der Unterschied zwischen beiden Aktivitäten, desto größer der Thiaminmangel. Folgende Graduierung wurde vorgeschlagen: Bei einem Quotienten 25% gilt ein Thiaminmangel als gesichert, zwischen 15 und 25 % findet sich ein marginaler Mangel und bei < 15% ist ein Mangel praktisch ausgeschlossen (9). Die Grenzwerte werden in der Literatur jedoch unterschiedlich angegeben (85)

14 Die enzymatischen Methoden werden zwar oft verwendet, sind aber auch mit Nachteilen behaftet. Sie benötigen relativ viel Blut, sind aufwändig und nehmen viel Zeit in Anspruch. Es können außerdem nur eine normale Versorgung oder ein Mangelzustand erkannt werden. Eine übermäßige Versorgung wird nicht angezeigt. Schließlich ist die gemessene Enzymaktivität nicht nur von TDP abhängig, sondern wird auch durch andere Faktoren beeinflusst; beispielsweise durch die Existenz verschiedener Varianten der Transketolase, durch eine eventuell vorhandene Lebererkrankung, durch eine instabile Enzymaktivität bei jungen Säuglingen oder durch die Lagerungsdauer bis zur Analyse (24,42,63,67,69,74). Dies kann zu einer Fehlinterpretation der Enzymaktivität führen. Die Einführung der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC) in den 1960er Jahren war die Grundlage zur Entwicklung von Verfahren, die eine direkte und vor allem sensitive Konzentrationsbestimmung des Thiamins und seiner Phosphatverbindungen im Blut und anderen Matrices möglich machen. Die ersten dieser Methoden wurden 1979 durch CLARK GUBLER und BRUCE HEMMING sowie gleichzeitig durch KAZUHIKO ISHII et al. beschrieben (32,40). Durch die gleichzeitige Bestimmung aller Thiaminverbindungen, auch in geringsten Konzentrationen, ist die weitere Erforschung des Thiaminmetabolismus überhaupt erst möglich. Schließlich war die HPLC auch das Verfahren, mit dem die neuen Adenosin- Thiaminverbindungen entdeckt wurden (6). Der Thiaminstatus kann durch die isolierte Konzentrationsmessung des metabolisch aktiven TDP bestimmt werden (85). Die ersten Methoden bestimmten die TDP-Konzentrationen in den Erythrozyten. Der TDP-Gehalt der Erythrozyten nimmt im Falle eines Thiaminmangels in einer ähnlichen Geschwindigkeit wie der zelluläre TDP- Gehalt anderer Organe ab und ist deshalb ein guter Biomarker des Thiaminstatus (2,8). Es konnte später gezeigt werden, dass die weniger aufwändige Bestimmung im Vollblut ebenwertig ist, weil die TDP-Konzentrationen der Erythrozyten und des Vollbluts stark korrelieren (85). Studien, welche die Bestimmung von TDP mit der Messung der ETKA und des TPPE verglichen, konnten eine hohe Korrelation zwischen erythrozytärem TDP-Gehalt, ETKA und TPPE zeigen. Gegenüber der enzymatischen Methode fanden sich außerdem mehrere Vorteile der HPLC-Methode: Sie ist sensitiver, spezifischer, einfacher zu standardisieren, ist gegenüber kleinen Variationen der Testbedingungen unanfälliger und misst mit TDP einen stabileren Analyten (2,36,85). Des Weiteren kann ein - 8 -

15 Thiaminmangelzustand mit TDP früher erkannt werden: Im Tierversuch fällt der TDP- Spiegel beim absoluten Thiaminmangel unmittelbar ab und erreicht nach 10 Tagen ein Minimum. Die ETKA fällt hingegen erst nach diesen 10 Tagen drastisch ab (90). Bislang wurden mehrere HPLC-Methoden zur Bestimmung von Thiamin und seinen Phosphatverbindungen entwickelt (25,54,55,84,85). Die meisten benötigen hierfür ein Probenvolumen von µl Vollblut. Ein Problem, das alle genannten Messmethoden gemeinsam haben ist, dass sie meist bei Erwachsenen eingesetzt werden und die ermittelten Grenzwerte, die einen Thiaminmangel anzeigen, nicht einfach für Kinder übernommen werden können. Außerdem werden die TDP-Normbereichsgrenzen in den Studien unterschiedlich angegeben. Die Ursache wird in regionalen Schwankungen der Thiaminversorgung gesehen. Es wird außerdem diskutiert, ob die im Vollblut gemessenen TDP- Konzentrationen mittels der Hämoglobin-Konzentration oder dem Hämatokrit korrigiert werden müssen, da ca. 80 % des Thiamins in den Erythrozyten vorkommt (83,85,97). Neben den genannten Messmethoden wurden weitere Methoden zur Bestimmung des Thiaminstatus entwickelt; beispielsweise mikrobiologische Tests, die anhand von Bakterienkulturen kolorimetrisch auf den Thiamingehalt schließen oder die Bestimmung der Thiaminausscheidung im Urin (34,58,72). Diese Methoden erwiesen sich als nicht spezifisch und sensitiv genug. Methoden, die den Gesamtthiaminspiegel nach Dephosphorylierung im Serum oder Vollblut messen, sind ebenfalls für die Bestimmung des Thiaminstatus ungeeignet, da der Messwert das freie Serum-Thiamin enthält. Dieses spiegelt die aktuelle Thiaminaufnahme wieder, unterliegt darum großen Schwankungen und repräsentiert nicht den zellulären Thiamingehalt (71). Wie bereits erwähnt, kommt es bei einem Thiaminmangel zu einer Anhäufung von Pyruvat und in der Folge auch Laktat, so dass diese Laborwerte einen indirekten Hinweis auf einen Thiaminmangel bieten

16 1.4. Symptomatik des Thiaminmangels Beriberi war die erste Erkrankung, die als "Mangelerkrankung" bezeichnet wurde (52). Die Symptomatik des Thiaminmangels ist komplex und zeigt eine große individuelle Variation. Wie anfangs erwähnt, wird Beriberi als trockene und feuchte Form eingeteilt. Eine klare Abgrenzung zwischen beiden Formen ist jedoch teilweise nicht möglich. Symptome aus beiden Formen können gleichzeitig auftreten oder nacheinander hinzukommen (95). Grund der unterschiedlichen Symptomatik scheint das Ausmaß und die Dauer des Thiaminmangels zu sein. Die trockene Beriberi tritt eher bei älteren Menschen auf, die an einem chronischen Thiaminmangel leiden. Leitsymptome sind Paresen und Hypästhesien durch periphere Neuritis, Muskelatrophien und eine allgemeine Schwäche. Zuerst sind meist die Beine betroffen. Es kommt zu Muskelkrämpfen, Schmerzen der Wadenmuskulatur und Schmerzen beim Gehen. Außerdem kann Heiserkeit auftreten, die durch eine Rekurrensparese bedingt ist (53). Leitsymptom der feuchten Beriberi sind Ödeme, die vor allem durch eine Rechtsherzinsuffizienz bedingt sind. Es tritt eine Kardiomegalie auf. Im akuten Stadium der Erkrankung kommt es zu Dyspnoe, Palpitationen, starken präkordialen oder epigastrischen Schmerzen, Erbrechen, Unruhe, Angst und Zyanose. Das Versterben tritt meist plötzlich ein (19). Thiaminmangel wirkt sich neben dem peripheren auch auf das zentrale Nervensystem aus. Charakteristisch sind Nystagmus, Ophthalmoplegie mit Diplopie, Gang- und Standunsicherheit sowie mentale Veränderungen. Histologisch findet sich unter anderem eine Einblutung der Mammillarkörper. CARL WERNICKE beschrieb die Erkrankung erstmals 1881 als "Akute haemorrhagische polioencephalitis superior" (92). In Anerkennung seiner wissenschaftlichen Leistung wird heutzutage die Bezeichnung "Wernicke-Enzephalopathie" verwendet. Dass Thiaminmangel der Auslöser dieser Enzephalopathie ist, wurde erst in den 1940er Jahren erkannt (13). Die Wernicke- Enzephalopathie ist zur Zeit die häufigste Ausprägung des Thiaminmangels in entwickelten Ländern und tritt hier vor allem bei Alkoholikern bedingt durch einseitige Ernährung auf (33). Von den Erkrankten entwickeln circa 80% das Korsakow- Syndrom (88). Hierbei kommt es vor allem zu retrograden und anterograden Amnesien sowie zu Konfabulationen (44). In Kombination ist die Erkrankung als "Wernicke- Korsakow-Syndrom" bekannt

17 1.5. Thiaminmangel bei reifen Neugeborenen und Säuglingen Eine erste systematische Beschreibung der infantilen Beriberi erfolgte durch den Japaner HIROTA im Jahr 1888 (37,38). Er beschrieb insgesamt 52 Fälle von Säuglingen stillender Mütter. Fast alle Mütter der Säuglinge litten an Beriberi. HIROTA konnte in vielen Fällen eine drastische Besserung der Symptome durch Umstellung auf Flaschennahrung erreichen. Er glaubte, dass in der Muttermilch ein Toxin vorhanden war, das die Symptome auslöste. Diese bestanden vor allem aus Ödemen, Dyspnoe, Verdauungsproblemen, kardialen Symptomen, Oligurie und Aphonie. In vielen asiatischen Ländern war die infantile Beriberi ein großes Problem. Es wird geschätzt, dass noch während der ersten Dekade des 20. Jahrhunderts in Manila rund 40% der Säuglinge an Beriberi verstarben (95). Im Jahr 1912 wurde eine Methode beschrieben, infantile Beriberi mit einem Reishüllen-Extrakt zu heilen (15). Den Müttern war es hiermit möglich, weiter zu stillen. Diese effektive Methode sorgte für einen wesentlichen Rückgang der Erkrankung und war ein weiterer Hinweis darauf, dass es sich bei Beriberi um eine Mangelerkrankung handelt und nicht, wie geglaubt, um den Effekt eines Toxins (95). In entwickelten Ländern, in denen kein Thiaminmangel stillender Mütter besteht, kommt die infantile Beriberi heutzutage praktisch nicht vor. Thiamin ist zudem obligater Bestandteil kommerzieller Säuglingsnahrung, so dass ein Thiaminmangel auch bei nicht gestillten Kindern nicht zu erwarten ist. Wird die Zugabe des Vitamins jedoch vergessen, treten Fälle von infantiler Beriberi auf, wie es ein Bericht aus Israel aus dem Jahr 2003 zeigt (23) : Irrtümlicherweise wurde einer sojabasierten Flaschennahrung kein Thiamin zugefügt. Bei 20 Säuglingen, die mit dieser Nahrung ernährt wurden, wurde Beriberi diagnostiziert und teilweise mittels Bestimmung des TPPE bewiesen. Zwei der Säuglinge starben an einer Kardiomyopathie. Der zitierte Bericht beschreibt die Verläufe von 9 Säuglingen. Symptome der infantilen Beriberi waren Erbrechen, Lethargie, Irritabilität, abdominale Distension, Diarrhoe sowie Entwicklungs- und Wachstumsrückstand. Zudem lag in allen Fällen eine Infektion vor. Drei der Kinder zeigten eine Ophthalmoplegie, eine bilaterale Abduzensparese mit oder ohne Upbeat- Nystagmus; Symptome, die auf eine Wernicke-Enzephalopathie hinweisen. Diese Säuglinge hatten zudem eine Laktatazidose, die für einen ausgeprägten Thiaminmangel typisch ist. Bei einem der Patienten konnte die Wernicke- Enzephalopathie in der Magnetresonanztomographie bestätigt werden. Hierbei fanden sich charakteristische Signalanhebungen im Bereich der Basalganglien, der

18 Mamillarkörper und des periaquäduktalen Grau. Durch die Gabe von Thiamin besserte sich zwar der Zustand des Patienten, jedoch verblieben neurologische Schäden. Bei den Kindern, die keine neurologischen Symptome zeigten, kam es durch Thiamingabe innerhalb von 2 bis 3 Wochen zu vollständiger Genesung. Dieser Bericht zeigt, dass es auch noch in der heutigen Zeit in entwickelten Ländern zu Thiaminmangel bei Säuglingen kommen kann Thiaminmangel bei Frühgeborenen Über die Thiaminversorgung von frühgeborenen Säuglingen ist wenig bekannt. Allerdings stellen sie aus verschiedenen Gründen eine potentielle Risikogruppe für Thiaminmangel dar. Aufgrund ihres niedrigen Körpergewichts haben sie generell wenig Reserven und sind von der regelmäßigen Nahrungszufuhr abhängig. Eine optimale Ernährung wird dabei benötigt, um ein optimales Wachstum zu ermöglichen. Die Ernährung muss so zusammengesetzt sein, dass keine Mangelerkrankungen auftreten. Viele Frühgeborene benötigen in den ersten Lebenstagen eine ergänzende parenterale Ernährung oder sind von parenteraler Ernährung abhängig, um ihren Ernährungsbedarf zu decken. Die Zufuhr von zu wenig oder keinem Thiamin kann schwere Folgen haben, wie ein Bericht aus dem Jahr 2011 zeigt (61). Hier wurde ein 35 Schwangerschaftswochen (SSW) altes Frühgeborenes eine Woche lang parenteral ernährt, ohne der Nahrung Thiamin oder andere Vitamine zuzufügen, weil diese zur Zeit nicht verfügbar waren. Es entwickelte sich eine schwere Laktatazidose, die sich auch durch hohe Gaben von Natriumhydrogencarbonat nicht besserte. Dies ist typisch für einen absoluten Thiaminmangel. Genauso typisch war die rasche Besserung der Laktatazidose innerhalb von 3 Stunden nach der Verabreichung von Thiamin. Zusätzlich zu der Laktatazidose entwickelte das Frühgeborene Zeichen einer Sepsis. In der Literatur finden sich zahlreiche ähnliche Fälle von Kindern und Säuglingen, die total parenteral ernährt wurden und bei denen die Thiamingabe schlichtweg vergessen wurde oder aufgrund einer fehlenden Verfügbarkeit nicht erfolgte (16,48,86). Dass Frühgeborene eine potentielle Risikogruppe für einen Thiaminmangel sind, ist auch in ihrer intensivmedizinischen Behandlung begründet. In einer Untersuchung von 80 intensivmedizinisch behandelten Kindern, konnte bei 12,5% der Kinder ein Thiaminmangel festgestellt werden (73)

19 Das Wachstum ist ein zentrales Therapieziel in der Neonatologie. "Ein wachsendes Kind ist ein gesundes Kind", heißt es. Bereits in den 1930er Jahren war durch Tierversuche bekannt, dass Thiamin sehr wichtig für das Wachstum ist (93). Insbesondere Frühgeborene benötigen eine hohe Zufuhr von Kohlenhydraten für eine adäquate Gewichtszunahme. Es ist bekannt, dass mit steigender Kohlenhydratzufuhr auch der Thiaminbedarf steigt (71). Kann der Thiaminbedarf bei einer hohen Kohlenhydratzufuhr nicht gedeckt werden, kommt es zu einem "relativen Thiaminmangel", also dem Auftreten von Mangelerscheinungen trotz Thiaminzufuhr. Im Tierversuch führte Thiaminmangel auch zu einer intrauterinen Wachstumsretardierung (IUGR) (11). Beim Menschen wird es ebenfalls als Risikofaktor für IUGR gesehen (35). Weiterhin ist Thiamin wichtig für die Gehirnentwicklung von Neugeborenen und Säuglingen (12). Thiaminmangel kann Hirnstammfunktionen beeinträchtigen und wurde mit dem Sudden Infant Death Syndrom in Verbindung gebracht (52). Kinder, die als Säugling an einem Thiaminmangel litten, haben später ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Epilepsie und für das Auftreten einer Sprachentwicklungsverzögerung (21,22). Dies zeigt, dass Thiaminmangel vielfältige Auswirkungen haben kann, die sich nicht nur in einem akuten Verlauf zeigen. Da bislang kaum Studien zum Thiaminstatus bei Frühgeborenen durchgeführt wurden, soll der Thiaminstatus nun erstmalig an einem größeren Kollektiv Frühgeborener durch Bestimmung der TDP-Konzentration im Vollblut untersucht werden. Um diese Studie zu ermöglichen, wird zunächst eine validierte Bestimmungsmethode mit einem sehr geringem Probenvolumen benötigt. Bei der Studie soll der TDP-Spiegel zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt werden, um seinen Verlauf während der Behandlung beurteilen zu können. Wichtige Ziele sind die Etablierung von Normbereichen und die Identifizierung von Risikofaktoren für niedrige TDP-Spiegel. Zu diesem Zweck sollen neben dem TDP-Spiegel weitere medizinische Parameter erfasst werden. Bei der Studie sollen möglichst viele Frühgeborene jeden Gestationsalters eingeschlossen werden

20 2. Methodik und Ergebnisse Es wurde eine neue HPLC-Methode entwickelt, welche die Bestimmung von TDP in 100µl Vollblut ermöglicht. Die neue Methode wurde publiziert (46). Sie war Grundlage für eine epidemiologische Studie zum Thiaminstatus Frühgeborener, die an der Kinderklinik der Universitätsklinik Köln durchgeführt wurde. Die Ergebnisse der Studie wurden ebenfalls publiziert (45). Beide Publikationen werden im Folgenden aufgeführt

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34 3. Diskussion In der hier durchgeführten Studie wurden zum ersten mal TDP-Spiegel bei Frühgeborenen systematisch untersucht. Dabei wurden Längsschnittdaten erhoben, um eine eventuell vorhandene Dynamik erkennen zu können. Das wesentliche Ergebnis der Studie ist eine große Streubreite der TDP-Spiegel bei Geburt und ein altersabhängiger Abfall. In der Literatur finden sich einzelne Studien, die den Thiaminstatus Frühgeborener auf eine andere Weise untersucht haben. In einer Studie wurde der Gesamtthiaminspiegel zusammen mit anderen Vitaminen im Vollblut bei 32 Neugeborenen mit niedrigem Geburtsgewicht (< 2500 g) bestimmt (60). Davon waren 22 Kinder Frühgeborene. Als Messmethode wurde ein mikrobiologischer Test verwendet. Die Bestimmungen erfolgten am 5. Lebenstag sowie bei Geburt aus Nabelschnurblut und dem Blut der Mutter. Sie wurden mit den Spiegeln eutropher Reifgeborener verglichen. Hierbei war der mittlere Gesamtthiaminspiegel am 5. Lebenstag in der Kontrollgruppe etwas höher. Der Unterschied war jedoch nicht signifikant. Bei dem untersuchten Kollektiv fiel auf, dass der mittlere Gesamtthiaminspiegel im Nabelschnurblut höher war als am 5. Lebenstag (Nabelschnurblut: 324 ± 78 nmol/l, Mittelwert ± SD; Vollblut Tag 5: 269 ± 42 nmol/l, Mittelwert ± SD). Zudem zeigten die Nabelschnurwerte eine größere Streubreite. Es zeigt sich also eine gewisse Ähnlichkeit zu unserer Studie. Da der Gesamtthiaminspiegel als Biomarker für den Thiaminstatus nicht geeignet ist, ist die Aussagekraft dieser Studie allerdings sehr limitiert. Weitere Studien, die den Thiaminstatus Frühgeborener untersucht haben, wendeten mit der Bestimmung des TPPE einen funktionellen Test an (28,29,49,59). Wie bereits erwähnt, wird das Ergebnis dieses Tests nicht nur von der TDP-Konzentration, sondern auch durch andere Faktoren beeinflusst. Zudem ist er mit einer Reihe von weiteren Nachteilen verbunden. Auf die Ergebnisse dieser Studien wird im Folgenden eingegangen. MOORE et al. untersuchten in den 1980er Jahren die Versorgung mit Thiamin und anderen Vitaminen bei Neugeborenen, die für zwei bis vier Wochen ausschließlich parenteral ernährt wurden (59). Darunter befanden sich 18 Frühgeborene. Die tägliche Thiaminzufuhr war mit 780 µg/kg viel höher als die Thiaminzufuhr in unserer Studie (s. 2. Publikation, Tabelle 3). Die TPPE-Messungen fanden bei Geburt und an den Tagen

35 4, 7, 14, 21 und 28 statt. Ein Thiaminmangel wurde nicht angezeigt. Ferner gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Messwerten von Frühgeborenen unter und über 1000 g Geburtsgewicht. In dieser Studie fiel auf, dass im Vergleich zu Reifgeborenen bei Frühgeborenen die Folsäure- und Vitamin B 12 -Spiegel deutlich erhöht waren. Die Folsäure-Spiegel zeigten zudem einen altersabhängigen Abfall. Diese interessante Analogie zum Thiamin wurde auch in einer anderen Studie ersichtlich, bei welcher der Folsäure-Spiegel von 20 Frühgeborenen gemessen wurde (87). Eine Erklärung für die hohen Spiegel bei Geburt wurde hier nicht genannt. Als Grund für den Konzentrationsabfall wird eine zu geringe Folsäure-Aufnahme angegeben. Möglicherweise besteht ein Zusammenhang über den Folattransporter, der sowohl Folsäure als auch TMP und TDP transportiert. Die im Jahr 1992 durch LEVY et al. publizierte Studie diente dem Vergleich zwischen zwei verschieden Dosierungen einer Multivitaminzubereitung für die parenterale Ernährung (49). Dabei wurden der TPPE und die Thiaminausscheidung im 24-Stunden-Sammelurin bei 48 Frühgeborenen mit einem Geburtsgewicht 1750 g bestimmt. 30 Frühgeborene wurden parenteral ernährt. Die eine Hälfte der Kinder erhielt täglich µg/kg Thiamin und die andere Hälfte µg/kg Thiamin. 18 Frühgeborene dienten als enteral ernährte Kontrollgruppe und erhielten im Mittel 260 µg/kg Thiamin. Die Bestimmungen des Thiaminstatus erfolgten bei Geburt und an den Tagen 7, 14 und 21. Kein Frühgeborenes hatte zu keinem Zeitpunkt einen abnormalen TPPE. Somit führte auch die niedrige enterale Thiaminzufuhr nicht zu einem Thiaminmangel. Die tägliche Thiaminausscheidung im Sammelurin betrug % der Thiaminzufuhr und war immer geringer als die Zufuhr, so dass stets eine positive Bilanz vorlag. FRIEL et al. publizierten 1996 eine Studie, in der sie den Status von Thiamin und anderen Vitaminen bei 18 Frühgeborenen mit einem mittleren Gestationsalter von 29 SSW untersuchten (28). Diese wurden im Gegensatz zu der vorherigen Studie zum Untersuchungszeitpunkt enteral ernährt, wobei teilweise eine ergänzende parenterale Ernährung erfolgte. Die Thiaminzufuhr kann nicht verglichen werden, da sie nicht auf das Körpergewicht, sondern auf die Energiezufuhr bezogen wurde. Der TPPE und die Thiaminausscheidung im 24-Stunden-Sammelurin wurden bei 14 Frühgeborenen an Tag 14 und 21 gemessen. Bei 4 Frühgeborenen fand die Messung nur an Tag 21 statt. Auch in dieser Studie lagen die gemessenen Werte stets im Normalbereich. In der 2001 durch FRIEL et al. publizierten Studie wurde die Versorgung mit Thiamin und anderen Vitaminen bei 14 Frühgeborenen mit einem mittleren

36 Gestationsalter von 30 SSW untersucht (29). Der TPPE wurde vor Beginn der Ernährung (Tag 2 ± 1, Mittelwert ± SD), bei ergänzender parenteraler Ernährung (Tag 16 ± 10, Mittelwert ± SD) und bei ausschließlich enteraler Ernährung (Tag 32 ± 15, Mittelwert±SD) bestimmt. Unter der ergänzenden parenteralen Ernährung lag die mittlere tägliche Thiaminzufuhr bei 510 µg/kg und unter ausschließlich enteraler Ernährung bei 254 µg/kg. Der TPPE zeigte bei 2 Kindern bei Geburt einen grenzwertigen Thiaminmangel an und wies auf einen biochemischen Thiaminmangel bei einem Frühgeborenen hin; zu einem Zeitpunkt als es ausschließlich enteral ernährt wurde. Hier lag der Aktivierungs-Quotient über 25 %. Laut den Autoren normalisierten sich die Werte in einer Kontrolluntersuchung. Abschließend kann also festgehalten werden, dass die bisher an Frühgeborenen durchgeführten Studien keine Mangelzustände in den untersuchten Kohorten zeigten. Bis auf wenige Ausnahmen befand sich der TPPE im Normbereich. Auf der zuletzt genannten Studie basiert die Empfehlung der EUROPEAN SOCIETY OF PAEDIATRIC GASTROENTEROLOGY, HEPATOLOGY AND NUTRITION (ESPGHAN) zur Thiaminzufuhr bei Frühgeborenen, die ausschließlich parenteral ernährt werden (43). Sie beträgt µg/kg pro Tag. Die Empfehlungen variieren allerdings je nach Literaturstelle. Wenn man die Mengen an zugeführtem Thiamin der oben zitierten Studien vergleicht, erkennt man, dass starke Schwankungen vorliegen. Klarheit über die tatsächlich benötigte Menge besteht nicht. Auch in unserer Studie gab es starke Schwankungen je nach Ernährungsart. Im Vergleich zu den anderen Studien erhielten die Frühgeborenen relativ niedrige Mengen an Thiamin. Die meisten der Kinder erhielten nicht mehr als 20 µg/kg pro Tag (s. 2. Publikation, Tabelle 3). Diese Kinder wurden praktisch alle enteral ernährt. Sie entwickelten ebenfalls keine Zeichen eines Thiaminmangels und keine verminderten TDP-Spiegel. Verglichen mit den vorherigen Studien, konnte in unserer Studie durch die direkte Messung des TDP die Versorgungslage direkt abgebildet werden. Die große Streubreite der TDP-Spiegel in den ersten Lebenstagen und ihr Abfall mit dem Alter waren zuvor nicht bekannt. Die neue Erkenntnis wirft viele Fragen zum Thiaminmetabolismus auf. Wie werden Thiamintransporter und Enzymaktivitäten reguliert? Was führt dazu, dass das eine Frühgeborene in den ersten Lebenstagen einen hohen TDP-Spiegel hat und das andere nicht? Warum nehmen die TDP-Spiegel

37 mit der Zeit tendenziell ab? Solch eine Tendenz konnte bei Erwachsenen nicht beobachtet werden (s. 1. Publikation, Abbildung 3). In einer Studie von WYATT et al. wurden die Spiegel von phosphoryliertem Thiamin im Vollblut bei reifen Neugeborenen, Säuglingen und älteren Kindern untersucht (97). Hier konnte ebenfalls ein altersabhängiger Abfall der Konzentrationen festgestellt werden. Da TDP ca. 93% des phosphorylierten Thiamins im Vollblut ausmacht, sind die Ergebnisse vergleichbar (83). Der Konzentrationsabfall bei reifgeborenen Kindern vollzieht sich im Vergleich zu Frühgeborenen langsamer. Es kommt erst nach 3 Monaten zu einem deutlichen Abfall. Der Abfall hält zwischen 3 und 12 Monaten weiter an. Erst danach stabilisieren sich die Spiegel. In dieser Studie wurde diskutiert, ob der Abfall durch eine Konzentrationsabnahme des Hämoglobins bedingt ist. Gleichzeitig analysierte Liquor-Proben zeigten jedoch ebenso einen Abfall der TDP-Spiegel, so dass der Abfall im Vollblut als physiologisch gewertet wurde. Auf eine Hämoglobinbezogene Korrektur der Thiamin-Spiegel wurde verzichtet, da sie den physiologischen Abfall verzerren würde. Es wurde angenommen, dass die hohen Liquorspiegel bei Geburt durch die höheren Energiebedürfnisse des schnell wachsenden Gehirns bedingt sind. Der Abfall sei bedingt durch die anschließende "neurologische und metabolische Reifung". Es gibt Hinweise darauf, dass während der Schwangerschaft ein aktiver Transport von Thiamin über die Plazenta präferenziell an den Feten erfolgt (18,98). Durch diesen Transport lassen sich im fetalen Blut prinzipiell viel höhere Thiamin-Spiegel erreichen als im maternalen Blut. Möglicherweise sind die hohen TDP-Spiegel bei Geburt dadurch bedingt. In unserer Studie konnte gezeigt werden, dass die TDP-Spiegel von jungen und sehr jungen Frühgeborenen niedriger als die von älteren Frühgeborenen sind (s. 2. Publikation, Tabelle 1). Vielleicht bedeutet dies, dass im Fetus während der Schwangerschaft ein gewisser Vorrat an TDP aufgebaut wird. Der Abfall der TDP- Spiegel könnte durch eine geringere postpartale Thiaminzufuhr oder durch eine postpartale Zunahme der renalen Exkretion verursacht sein. Auch metabolische Veränderungen mit z.b. postpartal erhöhter Thiamindiphosphatase-Aktivität erscheinen möglich. Letztendlich sind viele Ursachen denkbar. Bis weitere Studien durchgeführt werden, bleiben sie Hypothesen. Es besteht Unklarheit darüber, ob im Vollblut gemessene TDP-Spiegel an hämatologische Parameter angepasst werden müssen. Wie oben erwähnt, wird eine Korrektur teilweise abgelehnt (97). Hingegen empfehlen andere Autoren die Korrektur in

38 Bezug auf den Hämatokrit oder die Hämoglobinkonzentration (25,85). Vor kurzem wurde untersucht, ob die Hämoglobinkonzentration oder die Erythrozytenzahl der bessere Korrekturfaktor ist (39). Hierbei wurde festgestellt, dass der TDP-Spiegel im Vollblut von 131 Erwachsenen stärker mit der Erythrozytenzahl als mit der Hämoglobinkonzentration korreliert. Die Autoren empfehlen schließlich, die Erythrozytenzahl als Korrekturfaktor einzusetzen. Im Rahmen der Validierung unserer Messmethode konnte bei 30 Proben erwachsener Personen keine Korrelation zwischen Hämoglobinkonzetration, Hämatokrit, Erythrozytenzahl oder mittlerem korpuskulärem Volumen festgestellt werden (46). Bei den TDP-Spiegeln der Frühgeborenen fiel jedoch eine leichte Korrelation zur Hämoglobinkonzentration auf. Bei Frühgeborenen kommt es in der Regel durch verschiedene Faktoren zu einer Frühgeborenenanämie. Es wurde deshalb überprüft, ob der Abfall der Hämoglobinkonzentration als Parameter des Erythrozyten-Kompartments mit dem Abfall der TDP-Spiegel ursächlich in Verbindung steht. Allerdings fiel die mittlere Hämoglobinkonzentration gleichmäßig und langsam ab und zeigte keine drastische Abnahme nach dem 20. Lebenstag wie die mittleren TDP-Spiegel. Aufgrund der unterschiedlichen Dynamik und der nur leichten Korrelation scheint der Abfall der Hämoglobinkonzentration eher nicht der Auslöser für die abnehmenden TDP-Spiegel zu sein. Dennoch sollte der Zusammenhang zu hämatologischen Parametern nicht außer Acht gelassen werden. Im Falle einer Anämie scheint es möglich, einen niedrigen TDP-Spiegel als Thiaminmangel zu interpretieren, obwohl dieser nicht vorliegt. Der mittlere TDP-Spiegel unterschied sich je nach Thiaminzufuhr und Nahrungsart (s. 2. Publikation, Tabelle 3). Jedoch waren Thiaminzufuhr und Nahrungsart wiederum vom postnatalen Alter abhängig, so dass die Zusammenhänge vor dem Hintergrund des altersabhängingen Abfalls der TDP-Spiegel gesehen werden sollten. Beispielsweise waren Kinder, die fortifizierte Milch erhalten haben, im Durchschnitt älter als Kinder, die mit reiner Muttermilch ernährt wurden. Darum war ihr mittlerer TDP-Spiegel niedriger, obwohl die enterale Thiaminzufuhr höher war. Dies scheint paradox, könnte aber für die Hypothese der fetalen TDP-Akkumulation während der Schwangerschaft sprechen. Für Säuglinge, die von Müttern mit Thiaminmangel gestillt werden, besteht ein hohes Risiko ebenfalls einen Thiaminmangel zu entwickeln (57,62). In unserer Studie waren die TDP-Spiegel der ausschließlich gestillten Frühgeborenen nicht niedriger als

39 die TDP-Spiegel der Frühgeborenen, die andersartig ernährt wurden. Allerdings kann angenommen werden, dass die Wahrscheinlichkeit eines mütterlichen Thiaminmangels aufgrund von Unter- oder Fehlernährung in dieser Studie äußerst gering ist. Ein weiterer Faktor ist, dass die Ernährung mit reiner Muttermilch während der ersten Lebenstage stattfand und zu dieser Zeit die TDP-Spiegel generell höher waren. Abschließend ist festzustellen, dass weder in einer speziellen Nahrungsart noch in einer niedrigen Thiaminzufuhr Risikofaktoren für niedrige TDP-Spiegel identifiziert werden konnten. Ein Nachteil unserer Studie ist, dass die Thiaminzufuhr geschätzt und nicht bestimmt wurde. Es ist bekannt, dass Thiamin aufgrund seiner Licht- und Wärmeempfindlichkeit über die Zeit zerfällt, besonders wenn es als parenterale Infusion appliziert wird (70). Besonders problematisch ist jedoch die Schätzung von Thiamin in Muttermilch. Die WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO) empfiehlt einen Thiamingehalt von ng/ml anzunehmen (89). Diese Empfehlung beruht auf Durchschnittskonzentrationen, die von diversen Bevölkerungsgruppen ermittelt wurden. Allerdings konnte festgestellt werden, dass es einerseits interindividuelle Unterschiede gibt und andererseits der Thiamingehalt mit der Dauer des Stillens zunimmt (26). In einer Studie aus England wurde die Milch von 26 Müttern frühgeborener Kinder untersucht (26). Sie enthielt im Mittel 24 ng/ml Thiamin im Kolostrum, 54 ng/ml in der Übergangsmilch und 89 ng/ml in reifer Muttermilch. Bei der Untersuchung fielen ebenfalls große interindividuelle Deviationen auf; beispielsweise war der niedrigste Thiamingehalt reifer Muttermilch 35 ng/ml und der höchste 156 ng/ml. Der in unserer Studie verwendete Wert von 100 ng/ml war schließlich ein angenommener Durchschnittswert. Aufgrund der zentralen Rolle im Kohlenhydratmetabolismus wurde untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen TDP-Spiegel und Kohlenhydratzufuhr, Energiezufuhr und Blutzucker besteht. Eine Korrelation bestand jedoch in keinem der Fälle. In der Literatur finden sich auch keine Hinweise darauf, dass sich der TDP-Spiegel beispielsweise durch eine erhöhte Energie- oder Kohlenhydratzufuhr erniedrigen oder steigern lässt. Es fand sich weiterhin keine Korrelation zur Wachstumsrate. Wie in der Einleitung erwähnt, ist Thiamin für das Wachstum wichtig und ein Mangel kann zu Wachstumsstörungen führen. Bei Frühgeborenen gingen hohe TDP-Spiegel aber nicht mit einer höheren Wachstumsrate einher. Andererseits führten niedrige TDP-Spiegel

40 zu keiner Abnahme der Wachstumsrate, was gegen das Vorliegen eines manifesten Thiaminmangels in der untersuchten Kohorte spricht. Da Thiaminmangel bei schwer kranken Kindern vermehrt auftreten kann, wurden der Clinical Risk Index for Babies (CRIB) und der Pediatric Risk of Mortality III - Score (PRISM III) in die Analyse eingeschlossen (66,76). Doch weder CRIB noch PRISM III konnten niedrige TDP-Spiegel vorhersagen. In einer Studie, die den Thiaminstatus kritisch kranker Kinder untersuchte, waren hohe Konzentrationen des C-reaktiven Proteins (CRP) mit niedrigen TDP- Konzentrationen im Vollblut verbunden (50). Bei dieser Studie wurde der TDP-Spiegel von 202 Kindern mit einem mittleren Alter von 1,7 Jahren bei Aufnahme auf die Intensivstation untersucht. Frühgeborene wurden jedoch ausgeschlossen. Die mittlere TDP-Konzentration bei Aufnahme lag bei 25,8 ng/ml (Interquartilabstand: 15,2-31,6 ng/ml). Sie ist vergleichbar mit der mittleren TDP-Konzentration für Frühgeborene zwischen dem 21. und 103. Lebenstag (Mittel: 33,6 ng /ml, Interquartilabstand: 13,0-37,9 ng/ml). In der zitierten Studie wurde ein Thiaminmangel als TDP-Spiegel < 16 ng/ml definiert. Hiernach lag bei 57 (28 %) der Kinder ein Thiaminmangel vor. Nur eins der Kinder hatte jedoch Symptome eines Thiaminmangels in Form einer Wernicke- Enzephalopathie. Die Autoren schlagen deshalb vor, eher von "niedrigen TDP- Spiegeln" zu sprechen. Es wurde festgestellt, dass Kinder, die eine CRP-Konzentration > 200 mg/l hatten, ein 2,3fach erhöhtes Risiko eines niedrigen TDP-Spiegels hatten. Die niedrigen TDP-Spiegel hatten in dieser Studie jedoch keinen Einfluss auf das klinische Outcome. In unserer Studie wurde ebenfalls die CRP-Konzentrationen untersucht. Eine ähnlicher Zusammenhang konnte nicht festgestellt werden. Der Grund hierfür ist wahrscheinlich, dass die untersuchte Kohorte im Allgemeinen eher gesund war und CRP-Erhöhungen nur selten vorkamen und leicht waren. In unserer Studie wurden nur 6 Messungen während einer Infektion und 10 Messungen während einer schweren Erkrankung durchgeführt. Unter beiden Umständen waren die TDP-Spiegel nicht auffallend niedrig, was aber aufgrund der kleinen Fallzahl nicht generalisiert werden darf. Aufgrund der Wichtigkeit von Thiamin für das zentrale Nervensystem wurde der Nursery Neurobiologic Risk Score (NBRS) erfasst (7). Dieser Score zeigt mit einer hohen Spezifität und Sensitivität ein abnormales neurologisches Outcome an, wenn sein Wert

41 im Alter von zwei Wochen 5 oder bei Entlassung 6 beträgt. Er wird durch das Vorliegen von periventrikulärer Leukomalazie, intraventrikulärer Hämorrhagie, Krampfanfällen, Infektionen, Hypoglykämie, Azidose und Notwendigkeit von Beatmung beeinflusst. Der Score korrelierte nicht mit niedrigen TDP-Spiegeln. Allerdings war die untersuchte Kohorte neurologisch überwiegend gesund. Der mittlere NBRS bei 2 Wochen lag schließlich bei 1 und erreichte bis auf eine Ausnahme als höchsten Wert 4. Nur ein Frühgeborenes der 24. SSW hatte einen NBRS von 10. Der TDP-Spiegel lag hier am 18. Lebenstag unter der 25. Perzentile. Die folgenden Werte waren nicht besonders niedrig und der hohe NBRS war nicht durch einen Thiaminmangel bedingt. Ein möglicher Effekt niedriger postpartaler TDP-Spiegel auf die neurologische Entwicklung, kann letztendlich nur durch eine neurologische Nachuntersuchung der Kinder eruiert werden. Nach der Durchführung unserer Studie stellt sich die Frage: wie definiert man einen Thiaminmangel bei Frühgeborenen? Es wurden teilweise sehr niedrige TDP-Spiegel gemessen. Dennoch wiesen diese Frühgeborenen keine klinischen Zeichen eines Thiaminmangels auf. Einen weiteren Hinweis, dass es in dieser Kohorte zu keinem manifesten Thiaminmangel kam, bieten die ph- und Laktatwerte, welche keine schwere Laktatazidose zeigten, wie sie bei einem Thiaminmangel vorkommen würde. Andererseits helfen diese Werte zur Erkennung eines marginalen Thiaminmangels nicht weiter. Angenommen, in dieser Kohorte waren Frühgeborene mit einem marginalen Thiaminmangel, welche Auswirkungen hat dieser auf Frühgeborene? Das Studiendesign war vermutlich zu breit, um diese Auswirkungen erfassen zu können. Vielleicht hat ein marginaler Mangel auch nur in bestimmten Situationen Auswirkungen. Solch eine Situation könnte beispielsweise eine Infektion sein, ein Umstand, der in der untersuchten Kohorte kaum vorkam. Es ist letzen Endes unklar, ab welchem TDP-Spiegel bei Frühgeborenen mit einem Thiaminmangel zu rechnen ist. Außerdem ist unklar, wie lange dieser Grenzwert unterschritten sein muss, damit sich der Thiaminmangel klinisch manifestiert. In einem Bericht entwickelten elf Neugeborene Symptome eines Thiaminmangels, nachdem sie Tage ausschließlich parenteral ohne Thiaminsubstitution ernährt wurden (86). Es ist denkbar, dass bei den niedrigen TDP-Spiegeln in unserer Studie einige davon zu einem manifesten Thiaminmangel geführt hätten, wenn sie mehrere Tage auf diesem niedrigen Niveau geblieben wären. Da kein Thiaminmangel beobachtet wurde, konnte schließlich kein definitiver Grenzwert, der einen Mangel anzeigt, eruiert werden. Als