Untersuchung und Optimierung des Biogasbildungspotentials der marinen Mikroalge Nannochloropsis salina

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1 Untersuchung und Optimierung des Biogasbildungspotentials der marinen Mikroalge Nannochloropsis salina Dissertation zur Erlangung des Grades Doktor-Ingenieur der Fakultät für Maschinenbau der Ruhr-Universität Bochum von Sebastian Schwede aus Witten Bochum 2013

2 Dissertation eingereicht am: Tag der mündlichen Prüfung: Erster Referent: Zweiter Referent: Prof. Dr.-Ing. R. Span Prof. Dr.-Ing. M. Wichern

3 DANKSAGUNG Die vorliegende Dissertation entstand in meiner Zeit als Wissenschaftlicher Mitarbeiter am Lehrstuhl für Thermodynamik der Ruhr-Universität Bochum unter Leitung von Prof. Dr.-Ing. Roland Span. Im Rahmen dieser Danksagung möchte ich mich ganz herzlich bei allen Personen bedanken, die mich in der Zeit meiner Promotion unterstützt haben. Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Prof. Dr.-Ing Roland Span, der es mir ermöglichte diese interdisziplinäre Arbeit unter seiner Betreuung durchführen zu können. Ich möchte mich für die vielen Ratschläge bedanken, die mich sowohl fachlich, als auch persönlich weitergebracht haben und wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Bei Prof. Dr.-Ing. Marc Wichern möchte ich mich für die Übernahme des Koreferats bedanken. Ich möchte mich bei meiner Familie für die andauernde moralische Unterstützung bedanken. Meiner Freundin Amal danke ich speziell für ihr Verständnis und die Geduld, die sie aufgebracht hat, um mich in schweren Stunden wieder aufzubauen. Frau Dr.-Ing. Mandy Gerber danke ich für die tolle Zusammenarbeit, die vielen fachlichen Diskussionen und auch die persönlichen Gespräche, die meine Perspektive stets erweitert haben. Auch bei der gesamten Biogasarbeitsgruppe möchte ich mich für die tatkräftige Unterstützung bei der Durchführung von Versuchen und Analysen bedanken. Dabei gilt mein besonderer Dank Frau Dr.-Ing. Alexandra Kowalczyk, Nico Schneider und Zia-Ur Rehman, sowie meinen studentischen Hilfskräften Eva Harnisch und Simon Czolkoss. Ein ganz besonderer Dank gilt meinem Bürokollegen Stefan Schimpf, der mit viel Geduld immer ein offenes Ohr für fachliche und vor allem auch persönliche Anliegen hatte und in dem ich in den letzten Jahren einen wichtigen Freund dazugewonnen habe. Ich danke aber auch allen Kollegen des gesamten Lehrstuhls für die freundliche und freundschaftliche Atmosphäre, in der auch immer ein Platz für Späße und bereichernde Diskussionen war. An dieser Stelle seien besonders Herr Dr.-Ing. Reiner Kleinrahm, Frau Birgit Esch, Andreas Jäger, Herr Dr.-Ing. Johannes Gernert, Herr Dr.-Ing. Markus Richter, Jan Wiedemann, Monika Thol, Michael Schäfer, Frau Dr.-Ing Judith Möller, Stefan Herrig und Rafael Lentner erwähnt. Zusätzlich möchte ich mich bei Frau Dr. rer. nat. Edith Nettmann, Frau PD Dr. Minou Nowrousian und Herrn PD Dr. Carsten Theiss für besondere fachliche Unterstützung, bei Herrn Dr. Sebastian Lippemeier, Peter-Josef Köpp und Friedrich Steinmann für die Bereitstellung der untersuchten Substrate, bei Herrn Dr. rer. nat. Ingo Bergmann für die Bereitstellung von Probenmaterial und bei den Mitarbeitern der Institutswerkstatt um den Leiter Christian Gramann und bei Volker Behrenbeck für die technische Unterstützung bedanken. Die vorliegende Dissertation wurde teilweise finanziell durch die RWE Power AG und die Forschungsschule für energieeffiziente Produktion und Logistik unterstützt.

4 Bochum im Dezember 2013 Sebastian Schwede

5 Inhaltsverzeichnis V INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis... V Abkürzungsverzeichnis... VII Formelzeichen und Symbole... VIII 1 Einleitung Theoretische Grundlagen Biogasbildungsprozess Biogaszusammensetzung Hydrolyse und Acidogenese Acetogenese Methanogenese Prozessparameter Temperatur ph-wert und Dissoziationsgleichgewicht Organische Fettsäuren Pufferkapazität Hemmstoffe Nährstoffe Durchmischung Kovergärung Genomanalysen Quantifizierung von Mikroorganismen in Umweltproben Mikroalgen Produktion von Mikroalgen Biotechnologische Verwendung Biogasproduktion aus Algen Konzentration der Algenbiomasse Zellwandaufbau Nannochloropsis salina Vorbehandlung Material und Methoden Analysen Bestimmung der Trockensubstanz und der organischen Trockensubstanz Bestimmung der Gasqualität Bestimmung des FOS/TAC-Verhältnisses Zusammensetzung der flüchtigen organischen Säuren... 27

6 VI Inhaltsverzeichnis Weenderanalyse Elementaranalysen Spurenelementanalysen Ammoniumgehalt Vorbehandlung der Algenbiomasse Methoden zur Vorbehandlung der Algenbiomasse Qualitative und quantitative Beurteilung des Aufschlusses Batchversuche Kontinuierliche Versuche Genomanalysen Probenahme und Vorbereitung der Proben Extraktion der DNS Standardreihen Messung der Fermenterproben Auswertung Zusammensetzung der verwendeten Substrate Organische Zusammensetzung Anorganische Zusammensetzung Batchversuche Einfluss des Salzgehaltes Einfluss physikalischer Vorbehandlung Kovergärung von Algenbiomasse Zusammenfassung der Ergebnisse der Batchversuche Kontinuierliche Versuche Monovergärung der Algenbiomasse Kovergärung von Maissilage und Algenbiomasse Genomanalysen Zusammenfassung der Ergebnisse der semi-kontinuierlichen Versuche Vergleich der Energieproduktion aus Algenbiomasse und Maissilage Zusammenfassung und Ausblick Literaturverzeichnis

7 Abkürzungsverzeichnis VII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS A ARC Biomasse der marinen Mikroalge Nannochloropsis salina Archaea A. dest. Aqua destilata, destilliertes Wasser Bp BAC CCM C/N C T DNS FM FOS GC LF mcra ME MS MSaet MSarc ots OD PCR q-pcr RB rrns SE TAC TEM TS Basenpaare Bacteria Corn-Cob-Mix Verhältnis von Kohlenstoff zu Stickstoff cycle threshold Desoxyribonukleinsäure Frischmasse flüchtige organische Säuren Gaschromatograph Leitfähigkeit Methyl-Coenzym M Reduktase Untereinheit A hydrogenotrophe Methanogene Maissilage Methanosaetaceae Methanosarcinaceae organische Trockensubstanz optische Dichte Polymerase-Ketten-Reaktion quantitative Real-time Polymerase-Ketten-Reaktion organische Faulraumbelastung ribosomale Ribonukleinsäure Spurenelemente gesamtes anorganisches Carbonat Transelektronenmikroskopie Trockensubstanz

8 VIII Formelzeichen und Symbole FORMELZEICHEN UND SYMBOLE Formelzeichen b [n.b.] Ordinatenabschnitt c [n.b.] Konzentration ΔG 0 [kj mol -1 ] Gibbs Energie unter Standardbedingungen g [m s -2 ] mittlere Erdbeschleunigung m [-] Steigung M [g mol -1 ] Molare Masse p [bar] Druck T [K] Temperatur t [n.b.] Zeit V [m 3 ] Volumen Y [m 3 kg ots -1 ] Ausbeute Symbole Volumenanteil ξ η Massenanteil Wirkungsgrad Indizes BG CH 4 el ots th TS Biogas Methan elektrisch organische Trockensubstanz thermisch Trockensubstanz n.b.: nach Bedarf

9 1 Einleitung 1 1 EINLEITUNG Mehr als 80% des heutigen Energiebedarfs wird aus fossilen Brennstoffen gedeckt (International Energy Agency, 2013). Die extensive Nutzung fossiler Brennstoffe führt aktuell zu einem globalen Klimawandel, zunehmender Umweltverschmutzung und Gesundheitsproblemen (International Energy Agency, 2013b). Der Energiebedarf und damit verbunden die Nutzung fossiler Brennstoffe wird zukünftig weiter ansteigen (International Energy Agency, 2013). Diese Entwicklung resultiert in einer Zunahme von Forschungsvorhaben und der Umsetzung von Projekten zur Bereitstellung von Energie aus regenerativen Quellen. Die Nutzung von Biomasse zur Produktion von Biogas bietet gegenüber anderen erneuerbaren Energieformen wie Photovoltaik oder Windenergie, mit denen Elektrizität produziert wird, wenn die jeweiligen Ressourcen vorhanden sind, den Vorteil einer grundlastfähigen Energieproduktion. Biogas kann neben der Bereitstellung von Elektrizität und Wärme durch Direktverstromung nach einer Aufbereitung im Erdgasnetz zwischengespeichert werden und bedarfsgerecht für die Produktion von Wärme oder durch die Verwendung von Prozessen mit Kraft-Wärme-Kopplung (KWK) zur Bereitstellung von Elektrizität und Wärme genutzt werden. Alternativ kann das aufgereinigte Biomethan als Kraftstoff zur Substituierung von Erdgas (komprimiertes (CNG = compressed natural gas) oder verflüssigtes (LNG = liquefied natural gas) Erdgas) verwendet werden. Durch die gezielte Förderung im Rahmen des Erneuerbaren-Energien-Gesetzes (EEG) seit dem Jahr 2000 wurde die Anzahl der bestehenden Biogasanlagen in Deutschland von mit einer Leistung von wenigen MW el auf Anlagen mit einer installierten Leistung von insgesamt MW el im Jahr 2012 erhöht (Fachverband Biogas e.v., 2012a). Im gleichen Zeitraum stieg die Anbaufläche für Energiepflanzen von ca ha im Jahr 2000 auf mehr als ha im Jahr 2012 (Fachagentur Nachwachsende Rohrstoffe e.v., 2013). Von den ca ha, die zur Produktion von Energiepflanzen als Einsatzstoffe für Biogasanlagen genutzt wurden, wurden ca. 75% der Flächen für den Anbau von Mais verwendet (Fachverband Biogas e.v., 2012b). Dies entspricht einem Anteil von ca. 8% des deutschen Ackerlandes (Deter, 2013). Im Zusammenhang mit der Zunahme der Maisanbauflächen für die Biogasproduktion werden die Konkurrenz zur Nutzung des Mais als Futtermittel und die Abnahme der biologischen Diversität durch die Vermaisung der Landschaft kritisch betrachtet (Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.v., 2009). Aus diesem Grund wurde im Zuge der aktuellen Novelle des EEG (2012) die Nutzung von Mais auf maximal 60% der Einsatzstoffe begrenzt, wodurch alternative Biomassequellen an Bedeutung gewinnen. Neben Kulturpflanzen wie Topinambur und Durchwachsene Silphie oder verschiedenen Wildpflanzen weisen Mikroalgen Vorteile als Biomassequelle für die Produktion von Biogas auf (Silbermann, 2012). Mikroalgen können unabhängig von landwirtschaftlichen Flächen produziert werden. Durch höhere Wachstumsraten von Mikroalgen werden in Deutschland bereits Biomasseausbeuten von ca. 100 Tonnen Trockenmasse pro Hektar und Jahr in geschlossenen Reaktorsystemen produziert (Schulze Steinmann, 2011). Im Vergleich zu Mais ist der Flächenertrag damit mehr als fünfmal so groß. Durch die Verwendung von geschlossenen Systemen kann eine gleichbleibende Qualität der Biomasse bei einer über das Jahr gesehen

10 2 1 Einleitung kontinuierlichen Produktion gewährleistet werden. Stoffströme wie Nährstoffe und Wasser können im Kreislauf verwendet werden, so dass der Bedarf geringer ist als bei konventionellen Energiepflanzen. (Schenk et al., 2008) In der vorliegenden Arbeit wurde das Biogasbildungspotential der marinen Mikroalge Nannochloropsis salina untersucht. Die verwendete Alge wurde im Rahmen des Forschungsprojektes Das RWE-Algenprojekt in Bergheim-Niederaußem, bei dem die Produktion von Mikroalgen unter Nutzung von Kraftwerksrauchgasen zur CO 2 -Einbindung untersucht wurde, mit Blick auf die hohen Wachstumsraten in gemäßigten Klimazonen ausgewählt. Die anaerobe Vergärung wurde als ein möglicher Konversionspfad der anfallenden Algenbiomasse untersucht. Im Rahmen der experimentellen Untersuchungen zur anaeroben Vergärung der Algenbiomasse wurden der Einfluss des Salzgehaltes, physikalische Vorbehandlungsmethoden und die Kovergärung der Algenbiomasse mit Mais in Batchversuchen und in einer semi-kontinuierlichen Langzeitstudie untersucht. Während der semi-kontinuierlichen Versuche wurde die mikrobielle Zusammensetzung hinsichtlich der Gesamtheit der Bacteria und Archaea zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht. der Auf Grundlage der experimentellen Daten wurde abschließend ein Vergleich des Biogasbildungspotentials der Algenbiomasse mit Maissilage hinsichtlich der Flächenproduktivität vorgenommen.

11 2 Theoretische Grundlagen 3 2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN Der theoretische Teil der vorliegenden Arbeit ist in drei Teile gegliedert. Zunächst werden die Grundlagen zum Verständnis der Bildung von Biogas und wichtige Einflussparameter dieses Prozesses beschrieben. Anschließend wird ein Überblick über die Verwendung der quantitativen Echtzeit-Polymerase-Ketten-Reaktion (qpcr) als Analysewerkzeug für die Bestimmung der mikrobiellen Zusammensetzung in Fermentern dargestellt. Abschießend wird ein Überblick über Mikroalgen und die Nutzung von Algen als Biomasse für die Bildung von Biogas, die einen wesentlichen Teil dieser Arbeit darstellt, gegeben und Möglichkeiten zur Vorbehandlung von Algenbiomasse vorgestellt. 2.1 Biogasbildungsprozess Biogas ist ein natürliches, brennbares Gas, das durch den anaeroben Abbau organischer Materialien durch verschiedene Gruppen von Mikroorganismen gebildet wird. Hierbei können im Wesentlichen zwei Prozessabfolgen unterschieden werden, die zu den unterschiedlichen Komponenten des Biogases führen: die Hydrolyse des organischen Materials und die Nutzung der durch die Hydrolyse verfügbaren organischen Bestandteile in Acidogenese, Acetogenese und Methanogenese. Der anaerobe Abbau organischer Materialien zu Biogas ist ein natürlicher Prozess, der in verschiedenen anaeroben Umgebungen wie Wasserläufen, Feuchtböden, Sedimenten oder im Verdauungstrakt von Wiederkäuern auftritt (Ward et al., 2008). Dieser Vorgang wird für den Abbau verschiedener Biomasseressourcen wie kommunale Abwässer, organische Reststoffe und Energiepflanzen nutzbar gemacht. Im folgenden Abschnitt sollen die einzelnen Stufen des Biogasbildungsprozesses und wichtige Einflussparameter dargestellt und erläutert werden. Ein vereinfachtes Schema über den Ablauf der einzelnen Prozessstufen ist in Abbildung 2.1 dargestellt. Die einzelnen Schritte des anaeroben Abbaus werden dabei von verschiedenen Konsortien an Mikroorganismen ausgeführt, die in teilweise syntrophischen Wechselwirkungen stehen und unterschiedliche Anforderungen an die Umgebung aufweisen (Angelidaki et al., 1993). Die Zusammensetzung der Biozönose ist dabei abhängig von den eingesetzten Substraten, vorliegenden Prozessparametern oder der Verweilzeit. Daraus resultiert eine große Heterogenität und Variabilität der Biozönose, wodurch besonders in der Hydrolyse und der Acidogenese viele verschiedene Abbauwege der Substrate vorkommen können (Briones und Raskin, 2003).

12 4 2 Theoretische Grundlagen Abbildung 2.1 Prozessmodel für den Ablauf der Biogaserzeugung nach (Weiland, 2010) Biogaszusammensetzung In der Praxis setzt sich Biogas aus ca % CH 4, 36-41% CO 2, bis zu 17% N 2, weniger als 1% O 2, ppm H 2 S, Wasserdampf und Spuren verschiedener anderer Gase zusammen (Rasi et al., 2007). Der Methangehalt im Biogas ist dabei abhängig vom Wassergehalt des Substrates, der Prozesstemperatur, der Verweilzeit und dem Grad des Substrataufschlusses (Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.v., 2009). Neben den genannten Prozessparametern wird die Methanausbeute maßgeblich durch die Zusammensetzung des eingesetzten Substrates beeinflusst. Unter der theoretischen Annahme, dass das eingesetzte Substrat vollständig zu Biogas umgesetzt wird, ergibt sich für Fette eine durchschnittliche Biogasausbeute von 1,39 m 3 kg ots -1 (m 3 im Normzustand) mit einem Methangehalt von 72 Vol.-% (Verein deutscher Ingenieure, 2006). Bei der Umsetzung von Proteinen und Kohlenhydraten sind geringere Methanausbeuten und Methangehalte zu erwarten. Die Biogasausbeuten bei Kohlenhydraten und Proteinen liegen bei 0,75 und 0,80 m 3 kg ots -1 und die Methangehalte bei 50 und 60 Vol.-%. Eine Einteilung der Biogasausbeute und des CH 4 - Gehaltes nach Substratbestandteilen ist der Tabelle 2.1 zu entnehmen.

13 2 Theoretische Grundlagen 5 Tabelle 2.1 Theoretische Biogasausbeute und theoretischer Methangehalt nach den verschiedenen Substratbestandteilen (Verein deutscher Ingenieure, 2006) Substrattyp Theoretische Biogasausbeute in m 3 kg ots -1 Theoretischer CH 4 -Gehalt in Vol.-% Kohlenhydrate 0,75 50 Fette 1,39 72 Proteine 0, Hydrolyse und Acidogenese Der anaerobe Abbau beginnt mit der Hydrolyse der komplexen Organik in einfache, lösliche Komponenten. Hydrolytische Bakterien scheiden hydrolytisch aktive Exoenzyme (z.b. Lipasen, Amylasen, Cellulasen, Proteasen) aus den Zellen in die Umgebung aus. Aus den komplexen Makromolekülen entstehen durch die enzymatische Hydrolyse kürzere Spaltprodukte wie Monosaccharide, Aminosäuren oder Fettsäuren (Schieder et al., 2010) Die prominentesten Vertreter hydtrolytisch aktiver Bakterien gehören zu den Gattungen Bacteroides, Clostridia und Bifidobacteria (Weiland, 2010). Nicht alle der Bakterien produzieren die gleichen Exoenzyme, die benötigt werden um ein komplexes Substrat abzubauen und jedes Exoenzym baut nur eine spezifische Substratgruppe ab (Gerardi, 2003). Dadurch bildet sich beim Abbau komplexer Substrate eine große, verschiedenartige Biozönose aus, die mehr als Zellen pro ml enthalten kann. Die Zusammensetzung der eingesetzten Substrate bestimmt, ob die Hydrolyse den geschwindigkeitslimitierenden Schritt des anaeroben Abbaus darstellt. Ungelöste Bestandteile wie Cellulose, Proteine oder Fette werden nur langsam hydrolysiert. Dieser Vorgang kann bis zu mehreren Tagen andauern (Weiland, 2010). In diesem Fall ist die Hydrolyse der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Die Hydrolyse von gelösten Kohlenhydraten kann dagegen in wenigen Stunden ablaufen, wodurch nachfolgende Prozessschritte geschwindigkeitslimitierend werden, da die entsprechenden Mikroorganismen geringere Wachstumsgeschwindigkeiten aufweisen als die hydrolytischen Bakterien (Bauer et al., 2009). Die chemische Definition der Hydrolyse deckt sich nicht vollständig mit der verfahrenstechnischen Begriffsverwendung der Hydrolyse bei der Biogasproduktion (Schieder et al., 2010). Bei der Hydrolyse werden chemische Bindungen in den Molekülen durch die Reaktion mit Wasser aufgespalten. Die verfahrenstechnische Hydrolyse umfasst zusätzlich Teilreaktionen der Acidogenese. In der sich an die Hydrolyse anschließenden Acidogenese werden die Spaltprodukte von den hydrolytischen Bakterien aufgenommen und über verschiedene Gärstoffwechsel zu organischen Säuren, Alkoholen, H 2 und CO 2 umgesetzt. Dabei bestimmt der Wasserstoffpartialdruck den vorliegenden Gärverlauf. Die Essigsäuregärung stellt den favorisierten Abbauweg dar, da die Essigsäure direkt zu Methan umgesetzt werden kann. Durch eine Zunahme des Wasserstoffpartialdrucks oder einer Absenkung des ph-wertes infolge einer Hemmung der nachfolgenden Stufen, in

14 6 2 Theoretische Grundlagen denen die Produkte der Acidogenese nicht weiter umgesetzt werden, kommt es vornehmlich zur Bildung langkettiger organischer Säuren (z.b. Propionsäure, Buttersäure) oder Milchsäure und Ethanol (Bauer et al., 2009; Schieder et al., 2010) Acetogenese In der Acetogenese werden die Produkte der acidogenen Phase in Essigsäure, CO 2 und H 2 umgesetzt. Die Bakterien dieser Stufe wachsen in syntrophischer Wechselwirkung mit den methanbildenden Mikroorganismen (Inter-Species-Elektronentransfer), da eine Akkumulation des in dieser Phase entstehenden H 2 eine Hemmung der Essigsäurebildung verursacht (Gerardi, 2003). Aufgrund dieser Wechselbeziehungen sind die syntrophen Bakterien schwer kultivierbar und wenig erforscht (Schieder et al., 2010). Syntrophe Bakterien sind ubiquitär und können resistente Überdauerungsformen bilden. Eine Aktivität der Bakterien liegt nur im anaeroben Milieu vor (Bauer et al., 2009). Die Elektronen aus der Oxidation der organischen Säuren zu Essigsäure müssen in Biogasanlagen über die Bildung von H 2 entsorgt werden, da unter anaeroben Bedingungen alternative Elektronenakzeptoren wie Sulfate oder Nitrate fehlen. Letztere sind bei der Produktion von Biogas aber unerwünscht, da diese über die Aufnahme der überschüssigen Elektronen die Methanogenese verhindern würden (Schieder et al., 2010). Die Änderung der Gibbs-Energie unter Standardbedingungen (ΔG 0 ) ist für die wesentlichen Reaktionen der Acetogenese positiv. Erst durch die Entfernung der Produkte dieser Reaktionen aus dem Reaktionsgleichgewicht und eine Erhöhung der Temperatur und des ph-wertes gegenüber den Standardbedingungen kann die Gibbs-Energie negativ werden, so dass ein Energiegewinn durch diese Reaktionen ermöglicht wird (Schink, 1997). Ein Energiegewinn über die Oxidation der organischen Säuren ist demnach nur bei einem niedrigen Wasserstoffpartialdruck möglich. Besonders kritisch ist der Abbau der Propionsäure, die nur bei einem Wasserstoffpartialdruck von 0,1-10,1 Pa (entspricht einer Konzentration von 1, , mg L -1 in der flüssigen Phase) umgesetzt werden kann (Kaspar und Wuhrmann, 1978). Die beteiligten Mikroorganismen leben daher am thermodynamischen Limit der Energiegewinnung, wodurch bei diesen Organismen lange Generationszeiten von typischerweise 3 Tagen auftreten (Gerardi, 2003). Der Abbau der Propionsäure ist exemplarisch für die Reaktionen der Acetogenese in Gleichung 2.1 dargestellt. CH CH COO H 2H O CH COO H CO 3H G 76,0 kj Mol Methanogenese Der letzte Schritt des Biogasprozesses ist die Bildung von CH 4 durch methanogene Archaeen (Methanogene). Alle bislang bekannten Methanogenen gehören in die Domäne der Archaea und zum Stamm der Euryarchaeota (Narihiro und Sekiguchi, 2011) und können in sechs Ordnungen

15 2 Theoretische Grundlagen 7 unterteilt werden: Methanosarcinales, Methanomicrobiales, Methanocellales, Methanococcales, Methanopyrales und Methanobacteriales. Methanogene sind ubiquitär und wurden in verschiedenen extremen Lebensräumen nachgewiesen. In Biogasanlagen weisen Methanogene ein ph-optimum von 6,8-7,5 auf, wobei der ph-wert einerseits durch die Verwertung der Essigsäure und andererseits durch die Freisetzung von CO 2 erhöht wird (Schieder et al., 2010). Methanogene sind strikt anaerob und können nur wenige Substrate wie CO 2 (hydrogenotroph), Essigsäure (acetoklastisch) und Methylgruppen-enthaltene Komponenten (methylotroph) wie Methanol für die Bildung von CH 4 verwenden (Liu und Whitman, 2008). Die Mehrheit der bekannten Methanogenen ist hydrogenotroph und reduziert CO 2 zu CH 4, wobei H 2 oder Formiat als Elektronendonor dienen. Die acetoklastischen Methanogenen oxidieren die Essigsäure aus der Acetogenese zu CH 4 und CO 2. Die Reaktionen der hydrogenotrophen und acetoklastischen Methanogenese sind in Gleichung 2.2 und 2.3 dargestellt. hydrogenotroph : CO 4H CH 2H O G 131,0 kj Mol acetoklastisch : CH COO H CH CO G 35,9 kj Mol Entgegen der Lehrbuchmeinung, bei der 70% des gebildeten CH 4 aus Essigsäure und 30% aus CO 2 und H 2 gebildet werden, deuten aktuelle Untersuchungen darauf hin, dass die Methanbildung in landwirtschaftlichen Biogasanlagen vornehmlich über die hydrogenotrophe Methanogenese gebildet wird (Bauer et al., 2008; Kaltschmitt, 2009). Die Essigsäure wird zunächst über syntrophe Acetat-Oxidation zu CO 2 und H 2 abgebaut, welche anschließend als Edukte für die Methanbildung dienen (Schnürer et al., 1999). Die acetoklastische Methanbildung wird hingegen nur bei geringer RB und niedrigen Essigsäurekonzentrationen beobachtet (Bauer et al., 2008). Die acetoklastische Methanbildung in Biogasfermentern wurde bislang nur in der Ordnung der Methanosarcinales innerhalb der Gattungen Methanosarcina und Methanosaeta beobachtet. Vertreter der Methanosaeta (früher Methanothrix) treten dabei aufgrund höherer Affinität zur Essigsäure bei geringerer organischer Faulraumbelastung (RB) und Methanosarcina bei höheren Essigsäurekonzentrationen auf (Jetten et al., 1992). 2.2 Prozessparameter Temperatur Der anaerobe Abbau zu Biogas erfolgt in zwei relevanten Temperaturbereichen unter mesophilen (35-42 C) und thermophilen (45-60 C) Bedingungen (Weiland, 2010), kann aber auch im psychrophilen Bereich unterhalb von 20 C ablaufen (Ward et al., 2008). In dem Bereich zwischen beiden relevanten Bedingungen kommt es aufgrund des Übergangs von mesophilen zu thermophilen Organismen zu Schwankungen in der Prozessstabilität (Gerardi, 2003). Im mesophilen Bereich betriebene Bioreaktoren weisen eine höhere Biodiversität auf als thermophil betriebene Systeme (Karakashev et al., 2005). Dadurch sind thermophile Prozesse anfälliger

16 8 2 Theoretische Grundlagen gegenüber Temperaturschwankungen als mesophile Systeme, bei denen Temperaturschwankungen von ±3 C toleriert werden (Weiland, 2010). Abbaugrad und Methanproduktion steigen proportional mit der Temperatur, so dass höhere Raten bei thermophilen Prozessen erreicht werden können (Gerardi, 2003). Der höhere Energieaufwand der thermophilen Vergärung muss dabei durch die höhere Methanproduktion ausgeglichen werden (Ward et al., 2008). Hydrolytische Bakterien weisen eine geringere Sensitivität gegenüber Temperaturschwankungen auf als acetogene und methanogene Mikroorganismen. Das Temperaturoptimum der Methanogenese muss nicht gleichzeitig auch das Optimum der übrigen Prozessstufen wie Hydrolyse und Acidogenese darstellen (Ward et al., 2008). Neben dem Einfluss der Temperatur auf die Aktivität der am anaeroben Abbau beteiligten Mikroorganismen, weist die Temperatur auch einen Einfluss auf physikochemische Prozessparameter auf. Durch eine Erhöhung der Temperatur verringert sich die Löslichkeit von Gasen im Fermenterinhalt, so dass das produzierte Biogas beispielsweise höhere Anteile an CO 2, H 2 O und NH 3 aufweist. Dadurch wird zum einen der Heizwert des Biogases vermindert und zum anderen die Prozessstabilität negativ beeinflusst, da NH 3 inhibierend auf die mikrobielle Biozönose wirken kann (Kaltschmitt, 2009) ph-wert und Dissoziationsgleichgewicht Der optimale ph-wert für die anaerobe Vergärung liegt in einem engen Bereich zwischen 6,8 und 7,2 (Ward et al., 2008). Dieser Bereich ergibt sich aus einem Kompromiss der Optima der beteiligten Mikroorganismen. Die Hydrolyse und Acidogenese weist einen Optimalbereich von 5,5-6,5 auf (Yu und Fang, 2002). Die Aktivität der hydrolytischen Bakterien ist bei höheren ph- Werten nur leicht gehemmt (Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.v., 2009). Die Aktivität der Methanogenen ist unterhalb von einem ph-wert von 6,6 deutlich vermindert (Mosey und Fernandes, 1989). Der ph-wert stellt sich durch die alkalischen und sauren Stoffwechselprodukte, die während des anaeroben Abbaus gebildet werden, automatisch ein (Kaltschmitt, 2009). Unter stabilen Abbaubedingungen sind die Produktion der organischen Säuren und die Umsetzung der Säuren zu Methan im Gleichgewicht, wodurch sich ein neutraler ph-wert einstellt (Weiland, 2010). Der ph- Wert ist als Überwachungsparameter für die Prozessstabilität wenig geeignet, da diverse Puffersysteme eine Verzögerung hinsichtlich der Veränderung des ph-wertes bewirken (Ward et al., 2008). Der ph-wert wirkt sich maßgeblich auf das Dissoziationsgleichgewicht und die Löslichkeit der im Fermenter befindlichen Substanzen und damit auf deren biologische Verfügbarkeit aus. Als elektrolytische Dissoziation wird der reversible Zerfall einer Verbindung in Anionen und Kationen in einem Lösungsmittel bezeichnet. In der undissoziierten Form liegen Verbindungen in für Mikroorganismen verfügbarer Form vor (Gerardi, 2003). Bei einem neutralen ph-wert von 7,0 liegen beispielsweise weniger als 1% der organischen Säuren in undissoziierter Form vor (Abbildung 2.2). Durch die Abnahme des ph-wertes, also einer Zunahme der Protonenkonzentration, nimmt der Anteil an undissoziierten Molekülen zu. Durch die

17 2 Theoretische Grundlagen 9 Zunahme der Verfügbarkeit der Moleküle nimmt gleichermaßen auch die potentielle Hemmwirkung verschiedener Verbindungen zu (Weiland, 2010). Die Auswirkung des Dissoziationsverhaltens in Abhängigkeit vom ph-wert von Ammoniak (NH 3 ) verhält sich entgegengesetzt zu den organischen Säuren. Bei einem neutraten ph-wert von 7,0 liegt weniger als 1% undissoziiert und mehr als 99% dissoziiert als Ammonium (NH + 4 ) vor (Abbildung 2.2). Durch die Erhöhung des ph-wertes nimmt der Anteil an NH 3 zu. Abbildung 2.2 Dissoziationsgleichgewicht von Essigsäure, Propionsäure und Ammoniak in Abhängigkeit vom ph-wert nach (Weiland) Organische Fettsäuren Die organischen Fettsäuren entstehen im Prozessverlauf der anaeroben Vergärung in der acidogenen Phase (siehe Abschnitt 2.1.2) und stellen die Schlüsselintermediate des anaeroben Abbaus dar (Weiland, 2010). Die wichtigsten Säuren sind Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, iso-buttersäure, Valeriansäure, iso-valeriansäure und Capronsäure. Für gewöhnlich liegt die Essigsäure in höheren Konzentrationen vor als die übrigen Säuren (Wang et al., 1999). Eine Zunahme der Essigsäurekonzentration deutet auf eine Hemmung der methanbildenden Phase hin (Ohly, 2006), wogegen eine Zunahme von Propionsäure, (iso)-buttersäure und iso-valeriansäure auf eine Hemmung der Acetogenese hindeutet (Ahring et al., 1995; Kaltschmitt et al., 2009; Märkl und Friedmann, 2006). Dadurch ist eine Veränderung der Qualität und Quantität im Fettsäurespektrum ein wichtiger Parameter zur Überwachung der Prozessstabilität und ein Indikator für eine Überlastung des Prozesses (Ward et al., 2008). Kritische Konzentrationen an organischen Fettsäuren lassen sich aufgrund unterschiedlicher Prozessparameter, Substrate und der Adaptionsfähigkeit von Mikroorganismen nicht quantitativ auf andere Systeme übertragen (Ahring et al., 1995; Angelidaki und Ahring, 1993) Pufferkapazität Puffersysteme dienen der Stabilisierung des ph-wertes, indem bei vermehrter Säurebildung und Zunahme der Protonenkonzentration diese durch Reaktion mit pufferwirksamen Substanzen neutralisiert werden. Die Pufferkapazität kann daher als Menge an Säure oder Base beschrieben werden, die benötigt wird um den ph-wert einer Lösung um eine Einheit zu verändern. Die

18 10 2 Theoretische Grundlagen Stabilität der anaeroben Vergärung wird maßgeblich durch zwei verschiedene Puffersysteme beeinflusst. HCO - 3 /CO 2-3 -Puffersystem Das Hydrogencarbonat-/Carbonatpuffersystem stellt das Hauptpuffersystem bei der anaeroben Vergärung dar. Das Puffersystem läuft nach Gleichung 2.4 ab. In Abhängigkeit vom ph-wert, der Temperatur und der Löslichkeit unter den vorliegenden Prozessbedingungen löst sich CO 2 im Gärsubstrat und reagiert mit Wasser zu Kohlensäure. Diese dissoziiert gemäß des pk s -Wertes der Kohlensäure in Abhängigkeit vom ph-wert zu Hydrogencarbonat und weiter zu Carbonat. Der pk s -Wert des Hydrogencarbonats liegt bei 6,25, der des Carbonats bei 10,45. Im relevanten ph- Bereich um 7,5 liegen demnach 72,5-97,3% des Puffersystems als Hydrogencarbonat vor, so dass die Carbonatkonzentrationen vernachlässigt werden können (Rozzi et al., 1985). CO HO HCO HCO H CO 2H Eine Zunahme der organischen Fettsäuren im Verlauf der anaeroben Vergärung bewirkt eine Zunahme der Protonenkonzentration. Diese reagieren mit dem Hydrogencarbonat zu Kohlensäure, welche über die Bildung von CO 2 und Wasser nach Überschreitung der Löslichkeitsgrenze als CO 2 über die Gasphase austreten kann. Der ph-wert wird trotz Zunahme der Säurekonzentration so lange gepuffert bis der Anteil an Hydrogencarbonat im System verbraucht ist. Dieser Vorgang bewirkt eine Zunahme des CO 2 -Gehaltes im Biogas. (Gerardi, 2003) NH 4 + /NH 3 -Puffersystem Durch den Abbau von Proteinen bzw. von Aminosäuren als Bausteine der Proteine werden NH 3 und CO 2 freigesetzt. NH 3 und CO 2 lösen sich in Abhängigkeit vom ph-wert, der Temperatur und der Löslichkeit unter den vorliegenden Prozessbedingungen im Gärsubstrat durch die Reaktion mit Wasser und bilden Ammoniumhydrogencarbonat (Gleichung 2.5). Das Gleichgewicht zwischen NH + 4 und NH 3 ist ph-abhängig (pk s 9,25), wobei sich das das Gleichgewicht mit sinkendem ph- Wert in Richtung NH + 4 verschiebt. NH3 H 2O CO2 NH4HCO3 2.5 Ammoniumhydrogencarbonat reagiert wie Hydogencarbonat bei Säurezugabe mit der Bildung von CO 2 und Wasser (Gleichung 2.6), so dass die Gesamtpufferkapazität des Systems erhöht wird (Hecht, 2008).

19 2 Theoretische Grundlagen 11 NH HCO 2H NH CO H O Hemmstoffe Verschiedene Substanzen können zu einer Inhibierung des anaeroben Abbaus führen, wobei durch die enge Verknüpfung der Prozessstufen die Hemmung einer Stufe meist Auswirkungen auf die Stabilität der übrigen Prozessstufen hat. Inhibierende Substanzen können entweder über die Eingangsstoffe in den Prozess eingebracht oder als Intermediate in den Umsetzungsreaktionen der einzelnen Stufen entstehen und wirken sich negativ auf die Aktivität der Reaktorbiozönose aus. Eine Inhibierung des anaeroben Abbaus resultiert häufig in einer Akkumulierung der organischen Fettsäuren, da die acetogenen Bakterien und Methanogenen häufig sensitiver auf Veränderungen der Prozessführung reagieren und die Säuren aus der Acidogenese daraus resultierend in diesen Stufen akkumulieren (Gujer und Zehnder, 1983). Aufgrund der Vielfältigkeit der Substanzen mit möglichen inhibitorischen Eigenschaften sollen im Folgenden nur für diese Arbeit relevante Hemmstoffe besprochen werden. Die Schwellen, ab welchen Substanzen inhibitorische oder toxische Wirkungen auf die Aktivität und das Wachstum von Mikroorganismen aufweisen, können aufgrund von Synergismus, Antagonismus, Adaption oder Komplexbildung in verschiedenen Systemen deutlich abweichen (Chen et al., 2008). Aus diesem Grund werden in dieser Arbeit weitestgehend qualitative Vergleiche zu anderen Arbeiten vorgenommen. Ammonium NH 3 kann als NH + 4 über die Eingangsstoffe in den Prozess eingebracht oder durch den Abbau von Proteinen freigesetzt werden. Über das Dissoziationsgleichgewicht dissoziiert NH 3 zu NH + 4 (siehe Abschnitt 2.2.2). Die Gesamtheit von NH 3 und NH + 4 soll im Rahmen dieser Arbeit aufgrund der Analytik, bei der beide Formen in der Gesamtheit bestimmt werden, als Ammoniumgehalt zusammengefasst werden. Die Menge an NH 3 ergibt sich gemäß dem Dissoziationsgleichgewicht aus der vorliegenden Prozesstemperatur und dem ph-wert, wobei mit steigender Temperatur und zunehmendem ph-wert eine Verschiebung des Gleichgewichtes zu NH 3 und dadurch eine Zunahme der Hemmwirkung zu beobachten ist (Angelidaki und Ahring, 1994). Für eine Hemmung durch Ammonium ist das hydrophobe NH 3 verantwortlich, welches passiv in mikrobielle Zellen diffundieren kann und Auswirkungen auf den intrazellularen ph-wert, den Energiebedarf und die Aktivität spezifischer Enzymreaktionen aufweist (Wittmann et al., 1995). Unter den anaeroben Mikroorganismen zeigen die Methanogenen die geringste Toleranz gegenüber erhöhten Ammoniumkonzentrationen (Kayhanian, 1994). Hinsichtlich der Sensitivität acetoklastischer im Vergleich zu hydrogenotrophen Methanogenen liegen bislang widersprüchliche Ergebnisse vor (Chen et al., 2008). Hemmkonzentrationen von Ammonium reichen aufgrund von Unterschieden in Substrat, Inoculum, Prozessbedingungen und Adaptionsphasen von 1,7 bis 14 g L -1 (Chen et al., 2008).

20 12 2 Theoretische Grundlagen Salzgehalt Salze (Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+ ) können über die Eingangssubstrate in den anaeroben Abbauprozess eingebracht werden und verursachen in hohen Konzentrationen eine Dehydrierung der Zellen durch die Zunahme des osmotischen Drucks (Baere et al., 1984; Yerkes et al., 1997). Die Hemmwirkung geht dabei durch das negative Membranpotential der mikrobiellen Zellen vornehmlich von den Kationen aus (McCarty und McKinney, 1961). Methanogene weisen gegenüber den hydrolytischen und Essigsäure- und Propionsäure-verwertenden Bakterien eine höhere Sensitivität gegenüber erhöhten Na + -Konzentrationen auf (Liu und Boone, 1991). Organische Säuren Die organischen Fettsäuren als Hemmstoffe des anaeroben Abbaus wurden bereits im Abschnitt besprochen. Für die organischen Fettsäuren und NH 3 gilt, dass diese Substanzen nur in ihrer undissoziierten Form hemmend auf die Mikroorganismen des anaeroben Abbaus wirken (Ward et al., 2008). Dadurch nimmt die Hemmwirkung der organischen Fettsäuren mit ph-werten unter 7 und die Hemmwirkung von NH 3 mit ph-werten über 7 zu, wobei eine Zunahme der organischen Säuren in einer Abnahme und die Akkumulierung von Ammonium aus dem Proteinabbau in einer Zunahme des ph-wertes resultiert (Weiland, 2010). Bei der Akkumulierung von Ammonium kann die Zunahme der organischen Fettsäuren einer Erhöhung des ph-wertes entgegenwirken Nährstoffe Kohlenstoff, Stickstoff, Wasserstoff und Sauerstoff sind mit bis zu 99% die Hauptbestandteile organischer Biomasse (Schieder et al., 2010). Neben den Hauptbestandteilen enthält Biomasse Mineralstoffe, die gemäß ihrer Massenanteile in Makronährstoffe (>50 mg kg -1 ) und Spurenelemente (SE: <50 mg kg -1 ) eingeteilt werden können (Schieder et al., 2010). Zu den Makroelementen gehören Calcium, Magnesium, Phosphor, Natrium, Kalium, Chlor und Schwefel. Der Bedarf an Makronährstoffen für das Wachstum von anaeroben Mikroorganismen ist aufgrund des verminderten Biomasseaufbaus bei gleicher Substratmenge gegenüber Aerobiern gering (Gerardi, 2003). Natrium nimmt allerdings im Energiestoffwechsel vieler anaerober Mikroorganismen eine wichtige Rolle ein. Aufgrund des geringen Energiegewinns bei der Oxidation der im anaeroben Milieu vorliegenden Substrate werden über den Aufbau eines elektrochemischen Natrium-Gradienten energieabhängige Reaktionen angetrieben. Diese Tatsache bewirkt einen erhöhten Bedarf an Natrium für anaerobe Mikroorganismen, im speziellen für Methanogene, im Gegensatz zu aerob lebenden Organismen (Schink, 1997). Neben der Quantität der Nährstoffe spielt auch das Verhältnis der einzelnen Nährstoffe zueinander eine entscheidende Rolle für das Wachstum von Mikroorganismen. Für anaerobe Mikroorganismen wird ein C:N:P:S-Verhältnis von bis zu 600:15:5:1 postuliert, wobei das C/N-Verhältnis im eingebrachten Substrat ein Optimum von aufweist (Weiland, 2010). Bei zu hohen Kohlenstoffanteilen kann der Kohlenstoff von der Biozönose nicht effizient umgesetzt werden. Zu hohe Stickstoffanteile führen zur vermehrten Freisetzung von NH 3, welches zu einer Hemmung des anaeroben Abbaus führen kann.

21 2 Theoretische Grundlagen 13 Viele der essentiellen SE sind Metalle, die als Kofaktoren für die Aktivität von Metallo-Enzymen entscheidend sind. Alle dieser Metalle sind potentielle Schadstoffe, die in zu hohen Konzentrationen hemmend oder toxisch auf den Organismus wirken können, indem die Enzymaktivität oder -struktur durch Bindung an reaktive Gruppen von Proteinen oder durch Ersetzen des natürlichen Kofaktors zerstört wird (Chen et al., 2008). Metalle werden von Bakterien hauptsächlich als freie Metallionen über die Zellmembran aufgenommen und wirken auch nur in dieser Form toxisch auf die bakteriellen Zellen. Komplexe biochemische Prozesse im Fermenterinhalt wie Ausfällung oder Bildung von (an)organischen Komplexen (Sulfide S - 2, Sulfate SO 2-4, Phosphate PO 3-4, Carbonate CO 2-3 ) können die bioverfügbare, gelöste Konzentration der Metallionen bis zu geringen Werten reduzieren, obwohl im Gärrest hohe Mengen des Metalls vorliegen (Callander und Barford, 1983; Zandvoort et al., 2006). SE wie Eisen, Nickel, Kobalt, Selen, Wolfram und Molybdän spielen eine besondere Rolle bei der Aktivität und dem Wachstum von anaeroben Mikroorganismen und gelten als essentiell (Weiland, 2010). Nickel wird für die Methanogenese aus Acetat (Komponente des Schlüsselenzyms Kohlenmonoxid-Dehydrogenase) und aus CO 2 mit H 2 (Zentralatom des Kofaktors F 430 ) benötigt und ist für die meisten Bakterien nicht essentiell. Kobalt ist für die Methanbildung aus Acetat als Komponente der Kohlenmonoxid-Dehydrogenase und für die Methanbildung aus CO 2 mit H 2 als Bestandteil eines Transferproteins (5-Hydroxybenzimidazolyl-Cobamid) notwendig. Die Rolle von Molybdän, Selen und Wolfram ist nicht vollständig aufgeklärt, wobei nur einzelne Methanogene die Faktoren für das Wachstum benötigen (Weiland, 2010). Besonders bei der Vergärung von Energiepflanzen, insbesondere bei Mais, kann es zu einer Unterversorgung mit SE kommen, da der Bedarf der Mikroorganismen nicht aus dem Gehalt im Substrat gedeckt werden kann. Die Verfügbarkeit von Kobalt gilt dabei als am stärksten limitierender Faktor hinsichtlich der Versorgung der Biozönose mit SE (Lebuhn et al., 2008) Durchmischung Durch die Durchmischung des Fermenterinhalts sollen neue Angriffsflächen für die Hydrolyse des Substrates geschaffen und ein effizienter Transfer des organischen Materials zur aktiven mikrobiellen Biomasse gewährleistet werden (Ward et al., 2008). Allerdings kann zu schnelles Rühren zu einer Störung der Wechselbeziehungen der syntrophen Bakterien der Acetogense und der Methanogen führen. Aus diesem Grund sollte eine langsame Durchmischung in Anpassung an die Substratcharakteristik gewährleistet werden (Bauer et al., 2009). Kowalczyk et al. (2013) zeigten, dass Durchmischungsintervalle (z.b. 10 min Rühren und 230 min Pause) gegenüber der kontinuierlich durchmischten Referenz zunächst zu einer höheren Biogasproduktivität (+20%) führten und bis zu 29% der Energie für die Durchmischung eingespart werden konnte. Als Erklärung wurde die verbesserte Bildung von mikrobiellen Schichten (syntrophe Cluster) der einzelnen Prozessstufen genannt. Auf der anderen Seite resultierte zu geringe Durchmischung in Schaumbildung und Aufquellen des Fermenterinhalts (Kowalczyk et al., 2013).

22 14 2 Theoretische Grundlagen 2.3 Kovergärung Kovergärung zeichnet sich durch die gemeinsame Vergärung von mindestens zwei Substraten mit komplementären Eigenschaften aus, durch die ein positiver Einfluss auf die Biogasproduktion zu erwarten ist (Mata-Alvarez et al., 2011). Durch die Einstellung des optimalen Mischungsverhältnisses können Hemmungen, die bei der Vergärung der Einzelsubstrate auftreten können (z.b. Ammoniumhemmung bei proteinreichen Substraten), verhindert werden. Das Hauptziel geeigneter Kovergärungen liegt demnach in einer ausgeglichenen Einstellung verschiedener Prozessparameter wie C/N-Verhältnis, Makro- und Mikronährstoffe, ph-wert und Pufferkapazität, Hemmstoffe, abbaubare Organik und Trockensubstanzgehalt. In vielen Fällen übersteigt die Biogasproduktion der Mischung die Summe der Biogasproduktion der Einzelsubstrate. Tierische Reststoffe wie Gülle oder Mist, die häufig hohe N-Anteile und eine hohe Pufferkapazität aufweisen, eignen sich besonders für die Kovergärung mit landwirtschaftlichen Reststoffen oder Energiepflanzen, die durch eine geringere Pufferkapazität und ein hohes C/N- Verhältnis charakterisiert sind. 2.4 Genomanalysen Die mikrobielle Aktivität und Physiologie eines ökologischen Systems hängt von der Komposition und den Interaktionen der mikrobiellen Gemeinschaft des Systems ab. Mehr als 90% der Mikroorganismen eines solchen Systems können mit Standardmethoden nicht kultiviert werden, so dass sich Untersuchungen an komplexen mikrobiologischen Systemen als nicht trivial erweisen. Beim anaeroben Abbau von organischen Materialien zu Biogas liegt ein solches komplexes System vor. Die einzelnen Phasen des Abbaus können nur in der Gesamtheit und nicht separiert untersucht werden. Um dennoch Einflussfaktoren und Reaktionspfade identifizieren zu können, können die vorliegenden Systeme in ihrer Gesamtheit untersucht werden. Mit 16S rrns (ribosomale Ribonukleinsäure) Sequenzierung oder der Sequenzierung von funktionellen Genen lässt sich die mikrobielle Vielfalt und Zusammensetzung komplexer Systeme untersuchen. (Schneider und Riedel, 2010) 16S rrns sind Bestandteile der Ribosomen prokaryotischer Mikroorganismen, welche die Proteinbiosynthese katalysieren. Die Gene der 16S rrns enthalten sowohl variable, als auch konservierte Bereiche, so dass Unterschiede in den Sequenzen eine Klassifizierung von Organismen auf unterschiedlichen taxonomischen Ebenen zulassen (Zhang und Fang, 2006). Funktionelle Gene kodieren die genetische Information, die für die Expression verschiedener Enzyme in einzelnen Stoffwechselwegen benötigt werden. Funktionelle Gene werden daher von Organismen geteilt, die ähnliche physiologische Charakteristika aufweisen (Zhang und Fang, 2006). Quantifizierung von Mikroorganismen in Umweltproben Die quantitative Real-Time-Polymerase-Ketten-Reaktion (qpcr) bietet die Möglichkeit der Quantifizierung geringer Mengen von Mikroorganismen durch die Amplifizierung von

23 2 Theoretische Grundlagen 15 Nukleinsäuren in Echtzeit. Die Quantifizierung erfolgt mittels proportionaler Fluoreszenzzunahme markierter PCR-Produkte während der PCR-Zyklen. Die schematische Darstellung einer PCR ist in Abbildung 2.3 dargestellt. Die gewünschte DNS-Zielsequenz wird während der PCR durch zyklisch ablaufende Denaturierung des DNS-Doppelstranges, Anlagerung der Primer (Annealing) und Verlängerung der DNS-Sequenz (Extension), die bei unterschiedlichen Temperaturen ablaufen, vervielfältigt. Der Bereich der gewünschten DNS-Zielsequenz wird über spezifische DNS-Sequenzen (Oligonukleotide), sogenannte Primer, festgelegt. Für die Detektion der Fluoreszenz bestehen verschiedene Möglichkeiten. Abbildung 2.3 Schematische Darstellung des Ablaufs der Polymerase-Ketten-Reaktion (Holzapfel und Wickert, 2007) Bei TaqMan TM -Sonden handelt es sich um Oliginukleotide, die an den beiden Enden einen Reporter- und einen Quencher-Fluoereszenzfarbstoff tragen. Ein Signal durch den Fluoreszenzfarbstoff entsteht nur, wenn der Reporterfarbstoff durch die Taq-Polymerase freigesetzt wird.molecular Beacons sind Oligonukleotide, die an den Enden zusätzlich zu dem Reporter- und Quencher-Fluoereszenzfarbstoff kurze selbstkomplementäre Sequenzen enthalten. Dadurch bildet sich eine Haarnadelstruktur aus, die nicht fluoreszierend ist. Durch die Bindung der Primer an die Zielsequenz faltet sich diese Struktur auf und fluoresziert. Bei der Fluoereszence Resonance Energy Transfer (FRET) Detektion wird Energie von einem Donormolekül auf ein Akzeptormolekül übertragen, wenn diese nebeneinander an die Zielsequenz binden. Sind die Donor- und Akzeptormoleküle jeweils Primer spricht man von Hybridisierungssonden. Anders als bei den drei genannten Methoden zur Fluoreszenzdetektion, bei denen die Fluoreszenz durch die Bindung der Primer an die Zielsequenz ausgelöst wird, lagert sich der fluoreszierende Farbstoff SYBR Green I in doppelsträngige DNS ein, wodurch während der PCR eine Fluoreszenzzunahme bestimmt werden kann. Im Vergleich zu den Sondentechniken, die eine hohe Spezifität und geringe Sensitivität aufweisen, ist die SYBR Green-Methode durch die Fluoreszenz

24 16 2 Theoretische Grundlagen von Primerdimeren oder PCR-Beiprodukten, die unter ungünstigen Bedingungen entstehen können, weniger spezifisch, weist aber eine hohe Sensitivität auf. Die Spezifität des PCR-Produktes kann nach Durchführung der PCR durch eine Schmelzkurvenanalyse geprüft werden. Eine PCR lässt sich in drei Phasen unterteilen. In der Startphase liegen nur geringe DNS-Mengen in der Probe vor. Auf die Startphase folgt die exponentielle Phase, in der optimale Bedingungen für die Verdopplung der Zielsequenz vorliegen. Für die Quantifizierung wird der Anfangsbereich der exponentiellen Phase gewählt, in dem die Fluoreszenz des Zielfragments signifikant über die Hintergrundstrahlung ansteigt. Dieser Wert wird als C T - oder C P -Wert (cycle threshold bzw. crossing point) bezeichnet. Über die Erstellung einer Standardgerade, bei der die C T -Werte einer Verdünnungsreihe eines Referenzgens bestimmt werden, können Mikroorganismen in einer Umweltprobe quantifiziert werden. Dabei wird der in der Umweltprobe erhaltene C T -Wert über die lineare Regression der Standardreihe in die Anzahl der DNS-Kopien in der Referenzprobe umgerechnet. In der dritten Phase (Plateauphase) nimmt die PCR-Effizienz deutlich ab, da es vermehrt zur Hybridisierung von Produktfragmenten kommt. (Holzapfel und Wickert, 2007) Bislang liegt nur eine Studie zur Untersuchung der mikrobiellen Zusammensetzung des methanogenen Konsortiums eines mit Algen gefütterten anaeroben Fermentationssystems vor. Allerdings wurden die Versuche von Ellis et al. mit Abwasseralgen durchgeführt. Die Zusammensetzung der methanogenen Mikroorganismen wurde mittels 454-Pyrosequenzierung an dem Gen der α-untereinheit der Methyl-Coenzym M Reduktase (mcra), einem Schlüsselenzym aller Methanogenen, bestimmt. Arten aus der Gattung Methanosaeta wurden unter diesen Bedingungen als dominant vorherrschend identifiziert. Methanosaeta gehören zu der Ordnung Methanosarcinales und sind obligat acetoklastisch. (Ellis et al., 2012) Bei der Untersuchung der methanogenen Zusammensetzung eines mit Maissilage als Hauptsubstrat gefütterten Fermenters wurde hingegen die Ordnung Methanomicrobiales mit Methanoculleus bourgensis als dominant vorherrschender Spezies identifiziert (Kroeber et al., 2009). Vertreter der Methanomicrobiales sind obligat hydrogenotroph. 2.5 Mikroalgen Mikroskopische Algen und Cyanobakterien werden unter dem Begriff Mikroalgen zusammengefasst. Algen besiedeln die unterschiedlichsten ökologischen Nischen in marinen, lamnischen und terrestrischen Habitaten. Evolutionsbiologisch sind die Süßwasseralgen aus den marinen Formen hervorgegangen. Dieser Schritt hatte eine charakteristische Verminderung der Fettsäurebildung zur Folge, wodurch Süßwasseralgen geringere Konzentrationen ungesättigter Fettsäuren mit vier bis fünf Doppelbindungen aufweisen (Pohl et al., 1968). Schätzungen ergeben, dass zwischen und einigen Millionen Mikroalgenarten existieren (Norton et al., 1996), wobei nur 15 Arten aktuell biotechnologisch genutzt werden (Raja et al., 2008). Als Primärproduzenten sind Mikroalgen für 40-50% der globalen Fotosyntheseleistung verantwortlich (Metting, 1996). Generell können bei Mikroalgen vier verschiedene Metabolismen zur Energiegewinnung unterschieden werden: fotoautotroph, heterotroph, fotoheterotroph und mixotroph. Bei fotoautotrophem Wachstum werden die Energie aus Licht und der Kohlenstoff aus

25 2 Theoretische Grundlagen 17 anorganischen Quellen verwendet. Heterotrophes Wachstum zeichnet sich durch die Nutzung von organischen Ressourcen sowohl für die Energiegewinnung, als auch für die Kohlenstoffassimilation aus. Bei fotoheterotrophem Wachstum wird die Energie aus Licht gewonnen, der Kohlenstoff stammt aus organischen Quellen. Das mixotrophe Wachstum ist eine Mischform, bei der Licht und organische Materialien zur Energiegewinnung und organische und anorganische Kohlenstoffquellen genutzt werden. Innerhalb einiger Stämme können mehrere dieser Metabolismen beobachtet werden, die in Abhängigkeit zu den Umweltbedingungen angepasst werden. (Chojnacka und Marquez-Rocha, 2004) Die Wachstumsgeschwindigkeit ist abhängig von der jeweiligen Art, der Lichtintensität, der Kohlenstoffquelle (organisch oder anorganisch), der Biomassekonzentration und der Wachstumsphase, in der sich die Organismen befinden (Chojnacka und Marquez-Rocha, 2004; Sialve et al., 2009). Neben der quantitativen Entwicklung einer Algenkultur wird auch die qualitative Zusammensetzung der Algenzellen durch diese Faktoren beeinflusst (Brown et al., 1997). Besonders zwischen verschiedenen Arten unterliegen die Anteile an Proteinen (6-52% TS), Lipiden (7-23% TS) und Kohlenhydraten (5-23% TS) in den Algenzellen hohen Schwankungen. Neben dem hohen Proteingehalt verschiedener Arten können alle Aminosäuren von Algenzellen synthetisiert werden, insbesondere für andere Lebewesen essentielle Aminosäuren (Guil-Guerrero et al., 2004). Der Lipidgehalt der Algenzellen kann hohe Anteile an ω3- und ω6-fettsäuren enthalten und unter bestimmten Bedingungen wie N-Mangel bis zu 90% der Trockensubstanz betragen (Metting, 1996). Mikroalgen enthalten nahezu alle essentiellen Vitamine, viele Pigmente und Carotinoide (Spolaore et al., 2006) Produktion von Mikroalgen Mikroalgen weisen aufgrund höherer Wachstumsraten als terrestrische Pflanzen ein hohes Potential zur Produktion von Bioenergie auf (Day et al., 2012). Die Wachstumsbedingungen müssen bei der Produktion von Mikroalgen nicht mit dem terrestrischen Pflanzenwachstum konkurrieren. Dennoch wird derzeit der größte Anteil an Bioenergie trotz geringerer Fotosyntheseeffizienz, Ausbeuten und Wachstumsraten und einem größeren Bedarf an Anbauflächen aus terrestrischen Pflanzen gewonnen (Posten und Schaub, 2009; Schenk et al., 2008). Der aktuelle Fokus der fotoautotrophen Massenproduktion von Algen liegt aus ökonomischen Gründen bei der Produktion von Wertstoffen, da die Produktion von Mikroalgen generell teurer ist als die Produktion von terrestrischer Pflanzenbiomasse (Chisti, 2007). Hohe Mengen an Algenbiomasse können bei der Abwasserreinigung anfallen. Die verwendeten Mikroalgen fixieren dabei im Abwasser befindliche Nährstoffe und liefern den für die Oxidation von organischen Stoffen notwendigen Sauerstoff (Craggs et al., 1997). Neben der Biomasseproduktion von Mikroalgen im Rahmen der Reinigung von Abwässern können durch die Verwendung von marinen Algenarten im Überschuss vorhandenes Brackwasser oder Meerwasser, welche ein günstiges Anzuchtmedium darstellen (Li et al., 2008), verwendet werden (Day et al., 2012). Algenbiomasse kann neben der anfallenden Biomasse aus der Abwasserreinigung gezielt in offenen und geschlossenen Systemen produziert werden. In beiden Systemen werden für das

26 18 2 Theoretische Grundlagen fotosynthetische Wachstum Licht, CO 2, Wasser und anorganische Salze benötigt (Chisti, 2007). Der minimale Bedarf an Nährstoffen entspricht dabei der durchschnittlichen molekularen Zusammensetzung der Biomasse mit einem Verhältnis von CO 0,48 H 1,83 N 0,11 P 0,01 (Richmond, 2007). Algenbiomasse besteht durchschnittlich zu 50% aus Kohlenstoff (Sánchez Mirón et al., 2003), der typischerweise aus der Fixierung von CO 2 stammt. Der CO 2 -Bedarf liegt stöchiometrisch bei 1,7 kg CO 2 kg TS -1 (Posten und Schaub, 2009). Das CO 2 und frisches Anzuchtmedium werden während der Phasen, in denen eine ausreichende Menge an Lichtquanten vorliegt, kontinuierlich in das Anzuchtmedium eingebracht (Chisti, 2007). Damit CO 2 nicht limitierend auf das Wachstum wirkt, sollte die Luft mit mindestens 1 Vol.-% CO 2 angereichert sein (Posten und Schaub, 2009). Das CO 2 kann aus Biogas oder Verbrennungsprozessen stammen. Durch Respiration können in Abhängigkeit von der Temperatur bis zu 25% der bei Tageslicht produzierten Biomasse wieder abgebaut werden. Offene Systeme, sogenannte Raceway ponds, bestehen aus einem geschlossenen Kreislauf von bis zu 0,3 m tiefen Kanälen. Das Anzuchtmedium zirkuliert mittels eines Paddelrührwerks kontinuierlich durch die Kanäle. Nachteile dieser offenen Systeme sind die tageszeitlich und saisonabhängigen Temperaturschwankungen, eine hoher Wasserverlust durch Verdunstung und ein hohes Kontaminationsrisiko durch ungewünschte Algenarten oder Mikroorganismen. (Chisti, 2007) Im Gegensatz dazu kann in geschlossenen Fotobioreaktoren eine kontaminationsarme Produktion einzelner Algenarten mit höherer Biomasseproduktivität gewährleistet werden. Häufig werden Röhrenreaktoren verwendet, in denen eine kontrollierte und verlustarme Versorgung der Organismen mit Licht, Wasser und Nährstoffen ermöglicht werden kann. Diese sind parallel zueinander und flach auf dem Boden oder horizontal ausgerichtet und besitzen einen Durchmesser von höchstens 0,1 m, da das Licht in dicht gewachsenen Kulturen nicht weiter eindringen kann. Die Beleuchtung der Anlage kann künstlich oder mit natürlichem Tageslicht realisiert werden und ist abhängig von der Wertigkeit der produzierten Biomasse. Fotobioreaktoren werden aufgrund der hohen Investitionskosten fast ausschließlich in der Produktion einzelner Metaboliten mit hohem Wert eingesetzt (Metting, 1996). (Chisti, 2007) Trotz der hohen Wachstumsraten der Mikroalgen stellen Produktionskosten für das Wachstum, die Ernte, Nährstoffe und verschiedene Prozessschritte eine Limitierung für die großtechnische Verwendung von Algenbiomasse dar (Brennan und Owende, 2010). Aus diesem Grund müssen die Produktionsbedingungen an die Ausbeute und die Wertigkeit des gewünschten Endproduktes und die vielfältigen Verwendungsmöglichkeiten der Biomasse angepasst werden Biotechnologische Verwendung Biomasse von Mikroalgen weist ein breites Spektrum an Verwendungsmöglichkeiten auf. Diese können sich auf einzelne Inhaltstoffe der Biomasse oder auf die gesamte Biomasse beziehen. Die kommerzielle Nutzung von Mikroalgen für die Produktion einzelner Inhaltsstoffe begann in den 1970er Jahren mit der β-carotin Produktion in Dunaliella salina (Borowitzka, 1989), der Astaxanthin-Produktion in Haematococcus pulvialis (Lorenz und Cysewski, 2000) und der Produktion von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (polyunsaturated fatty acids, PUFA) in Crypthecodinium cohnii (Raja et al., 2008). Letztere sind von großer Bedeutung, da höheren

27 2 Theoretische Grundlagen 19 Pflanzen und Tieren Enzyme zur Synthese von PUFAs mit mehr als 18 C-Atomen fehlen. Alternativ werden PUFAs aus Fisch und Fischöl gewonnen (Certik und Shimizu, 1999; Gill und Valivety, 1997). Zu den wichtigsten PUFAs gehören γ-linolensäure (GLA), Arachidonsäure (AA), Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA) (Spolaore et al., 2006). Der größte Teil der produzierten Algenbiomasse mit Chlorella und Spirulina als dominierende Gattungen wird als Reformkost in Form von sonnen- oder sprühgetrockneten Tabletten oder Kapseln und als Zusatzstoffe in Nahrungsmitteln und kosmetischen Artikeln verwendet (Pulz und Gross, 2004; Raja et al., 2008). Vertreter der Gelbgrünen Algen (Xantophyceae) wie Olisthodiscus oder Nannochloropsis werden neben mehr als 40 anderen Arten häufig in der Aquakultur, andere Vertreter aber auch in der Fütterung von Haus- oder Nutztieren eingesetzt (Spolaore et al., 2006). Verschiedene Vertreter der Cyanobakterien wie Anabaena oder Nostoc gewinnen durch die Fähigkeit zur Fixierung von Luftstickstoff als Düngemittel in der Landwirtschaft an Bedeutung (Raja et al., 2008). Neben der verschiedenen Verwendungsmöglichkeiten von Algenbiomasse als Nahrungsmittel und Nahrungsergänzungsmittel oder in kosmetischen und pharmazeutischen Applikationen liegt aktuell ein besonderer Schwerpunkt auf der Verwendbarkeit von Algenbiomasse zur Erzeugung von Bioenergie, wobei die Biokraftstofferzeugung im Fokus steht. Kommerziell verfügbare Biokraftstoffe werden aktuell weitestgehend aus Zuckerrohr (Bioethanol) sowie Rapssamen und Sojabohnen (Biodiesel) gewonnen (Pittman et al., 2011). Für die Erzeugung von Bioenergie aus Algenbiomasse oder einzelner Komponenten der Biomasse liegen verschiedene Konversionspfade vor. Anders als bei der Verwendung von Energiepflanzen liegen bei der Verwendung von Algenbiomasse zur Bioenergieerzeugung keine Auswirkungen auf die Landwirtschaft vor. Getrocknete Algenbiomasse kann direkt mittels Verbrennung zur Energieerzeugung verwendet werden (Kadam, 2002). Thermochemische Konversion kann über Vergasung, Pyrolyse, Hydrierung und Verflüssigung der Algenbiomasse zur Herstellung gas- oder ölbasierter Biokraftstoffe oder Festbrennstoffe genutzt werden (McKendry, 2002a, 2002b). Die biochemische Umwandlung der Biomasse umfasst Fermentation oder anaerobe Vergärung zu Bioethanol oder Methan (McKendry, 2002a). Alternativ können einige Mikroalgen unter bestimmten Bedingungen über Biofotolyse Wasserstoff freisetzen (Melis, 2002). Neben den Verfahren, bei denen eine Umwandlung der gesamten Biomasse erfolgt, können auch einzelne Fraktionen der Biomasse zur Produktion von Biokraftstoffen genutzt werden. Nach der Extraktion von Lipiden können diese über Transesterifizierung zu Biodiesel oder extrahierte Kohlenhydrate über Fermentation zu Bioethanol umgesetzt werden (Chisti, 2007). In beiden Fällen bleibt ein großer Teil der Biomasse als Restmasse erhalten. Dieser kann alternativ über die genannten Verfahren weiter umgewandelt werden. Generell spielen bei der Auswahl eines geeigneten Verfahrens für die Umsetzung von Biomasse der Wassergehalt und die chemische Zusammensetzung eine entscheidende Rolle (Posten und Schaub, 2009). Die Biogasproduktion aus der anaeroben Vergärung von Algenbiomasse soll aufgrund der Relevanz für diese Arbeit im folgenden Abschnitt näher besprochen werden.

28 20 2 Theoretische Grundlagen Biogasproduktion aus Algen Die anaerobe Vergärung von Algenbiomasse ist der direkteste Weg zur Energieerzeugung, da die Biomasse ohne Trocknung mit dem Restwassergehalt nach der Ernte der Zellen durch Filtration oder Zentrifugation ohne weitere Vorbehandlung für die Vergärung verwendet werden kann (Posten und Schaub, 2009). Die Biomasse von Mikroalgen weist aufgrund hoher Anteile an Lipiden, Proteinen und Kohlenhydraten und der fehlenden Anteile an widerstandsfähigem Lignin ein hohes Potential für die Umwandlung zu Biogas in der anaeroben Vergärung auf (Posten und Schaub, 2009; Schenk et al., 2008). Die robusten Zellwände verschiedener Algenarten können dagegen zu einer Limitierung der anaeroben Abbaubarkeit führen (Chen und Oswald, 1998). Neben der hohen Resistenz von Algenzellen gegen enzymatische und chemische Hydrolyse können die Hemmung durch NH 3 durch den hohen Proteingehalt vieler Algenzellen und der Salzgehalt bei der Verwendung von marinen Mikroalgen zu einer Limitierung des anaeroben Abbaus von Algenbiomasse führen (Sialve et al., 2009). Die Methanausbeute liegt aus diesen Gründen häufig unter den theoretischen Ausbeuten von 0,47 bis 0,80 m 3 CH 4 kg ots -1 (Sialve et al., 2009). Die theoretischen Methanausbeuten werden dabei maßgeblich durch die chemische Zusammensetzung der Biomasse bestimmt. Durch die variable Zusammensetzung verschiedener Algenarten ist für die Bewertung des Potentials als Einsatzstoff für die anaerobe Vergärung eine Untersuchung jeder einzelnen Art notwendig (Mussgnug et al., 2010). Bei der Untersuchung der anaeroben Abbaubarkeit verschiedener Mikroalgen mit unterschiedlichem Zellwandaufbau wurden Biogasausbeuten zwischen 0,29 und 0,59 m 3 kg ots -1 ermittelt (Mussgnug et al., 2010). Die Anzahl der zerstörten Zellen variierte zwischen 0 und 100% (siehe Abschnitt 4.2.2). Die Nutzung von Mikroalgen zur Biogasproduktion ist keine neue Idee. Golueke et al. verwendeten hauptsächlich die Mikroalgen Chlorella und Scenedesmus aus der Abwasservorbehandlung, um die produzierte Biomasse wieder abzubauen (Golueke et al., 1957). Später wurde ein direktes Verfahren zur Umwandlung von Solarenergie in chemische Energie vorgestellt, bei dem die Produktion von Mikroalgen direkt an die Biogasproduktion gekoppelt wurde (Golueke und Oswald, 1959). Der Gärrest wurde zur Deckung des Nährstoffbedarfs in der Algenanzucht verwendet. Als limitierende Faktoren wurden Ammoniaktoxizität, Anstieg des ph- Wertes und Resistenz der Algenzellen aufgrund der biochemischen Zusammensetzung der Zellwände genannt (Golueke et al., 1957). Die geringe Effizienz der Umwandlung von Lichtenergie in die chemische Energie des Methans von 2% wurde von den Autoren durch die geringe RB erklärt. In nachfolgenden Studien konnte die Effizienz der Umwandlung von Algenbiomasse in Biogas gesteigert werden. Bei Verweilzeiten zwischen 10 (Yen und Brune, 2007) und 30 Tagen (Samson und LeDuy, 1982) wurden Methanausbeuten von 0,1-0,4 m 3 pro kg ots erreicht, wobei längere Verweilzeiten durch eine höhere Konzentrierung der Biomasse erreicht wurden. In einer aktuellen Studie von Ras et al. (2011) wurde die Realisierbarkeit der Kopplung von Algenproduktion (Chlorella vulgaris) und Vergärung untersucht. Bei einer geringen RB von 0,6 kg ots m -3 d -1 wurde die Methanproduktion bei verschiedenen Verweilzeiten bestimmt. Bei 28 Tagen

29 2 Theoretische Grundlagen 21 Verweilzeit wurde eine Methanproduktion von 0,24 m 3 pro kg ots bestimmt. Auch bei längeren Verweilzeiten wurden nicht mehr als 50% der Biomasse abgebaut. Als Grund wurde eine hohe Resistenz von C. vulgaris gegen den Abbau durch Mikroorganismen genannt. (Ras et al., 2011) Nach Chisti (2007) kann die Vergärung der Restalgenbiomasse aus Extraktionsprozessen wie der Lipidextraktion für die Biodieselherstellung einen Schlüsselprozess für die Wiederverwertung von Nährstoffen und Energierückgewinnung für die Produktion der Algenbiomasse darstellen Konzentration der Algenbiomasse Die Verminderung des Wassergehaltes von Algenkulturen gilt als ein wesentlicher Flaschenhals bei der großtechnischen Weiterverarbeitung von Algenbiomasse (Uduman et al., 2010). Für die gewünschte Konsistenz der Algenbiomasse als Einsatzstoff für die anaerobe Vergärung sind ein erster Ernteschritt und ein zweiter Schritt zur Verminderung des Wassergehaltes notwendig. Die zu verwendende Technik ist abhängig von den Eigenschaften (Zellgröße, Zellstabilität) der jeweiligen Algenart und der weiteren Verwendung der Biomasse. Als geeignetste Techniken gelten dabei Zentrifugation, Flockung, Filtration, gravimetrische Sedimentation, Flotation und Elektrophorese (Uduman et al., 2010). Zentrifugation ist die bevorzugte Technik hinsichtlich der Abtrennung und Erhaltung der einzelnen Zellen, weist allerdings einen hohen Energieverbrauch auf (Harun et al., 2010). Das Verhalten der kleinsten Partikel in der Suspension weist den größten Effekt auf die Trennung der Partikel vom Wasser auf (Shelef und Sukenik, 1984). Bei g konnte eine Abtrennung von mehr als 95% der Zellen erreicht werden. Diese Ausbeute sank mit abnehmender g-zahl (Heasman et al., 2000) Zellwandaufbau Die Zelloberfläche dient als Grenze zwischen dem Inneren einer Zelle und der Umgebung. Zu den Grundfunktionen gehören Aufnahme und Sekretion verschiedener Verbindungen, Schutz gegenüber Austrocknung und Pathogenen und Signalübertragung (Gualtieri und Barsanti, 2006). Zellwände von Mikroalgen weisen eine hohe Variabilität in der chemischen Zusammensetzung und der Morphologie auf (Rodríguez et al., 1999). Generell bestehen die Zellwände eukaryotischer Algenzellen aus einem mikrofibrillären Gerüst (Cellulose und Glykanen), welches in amorphes Material aus Polysacchariden, Lipiden und Proteinen eingelagert ist (Gualtieri und Barsanti, 2006). Einige Algen besitzen zusätzlich eine auf der Zellwand liegende Schicht, die aus Kieselerde, Calciumcarbonat oder Algaenan bestehen kann (Gualtieri und Barsanti, 2006). Algaenane sind unlösliche, aliphatische Biopolymere und weisen eine hohe Resistenz gegen enzymatische und chemische Hydrolyse auf und schützen die Zellen damit auch gegen mikrobiellen Abbau (Afi et al., 1996; Allard und Templier, 2000; Burczyk et al., 1999). Algaenan produzierende Organismen haben zusätzlich zu der klassischen Zellwand eine aufgelagerte äußere Zellwand mit einem trilaminaren Aufbau (trilaminar structure = TLS), wobei Algaenane in die äußerste Zellwandschicht eingelagert sind (Afi et al., 1996; Allard und Templier, 2001; Burczyk et al., 1999).

30 22 2 Theoretische Grundlagen Nannochloropsis salina Die Gattung Nannochloropsis gehöhrt in der Abteilung der Heterokontophyta zur Klasse der Eustigmatophyceae und ist die einzige marine Gattung innerhalb dieser Klasse. Es handelt sich bei Nannochloropsis um einzellige, unbewegliche Organismen, die sich über die Bildung von Autosporen vermehren, welche aus den Zellwänden abgegeben werden (Gualtieri und Barsanti, 2006). Dabei akkumulieren die Zellwände der Mutterzellen, die durch die Teilung und Größenzunahme der Autosporen aufgebrochen werden, im Medium (Burczyk et al., 1999). Die Zellen von Nannochloropsis weisen eine maximale Größe von 5 µm auf (Hibberd, 1981). Unter optimalen Wachstumsbedingungen weist N. salina, eine der fünf marinen Spezies dieser Gattung, eine Generationszeit von 23 Stunden auf (Boussiba et al., 1987). N. salina wird durch den hohen Gehalt an PUFAs, insbesondere EPA, häufig in der Fischzucht verwendet (Din Mohammady et al., 2005). In Zellen von N. salina konnten 1-2% der TS an Algaenanen nachgewiesen werden (Gelin und Boogers, 1996). Für die Kultivierung von Nannochloropsis werden generell geschlossene Systeme verwendet, die aus Polyethylenbeuteln bestehen und durch Besprudelung durchmischt werden. Die Zelldichte wird zur Vermeidung von Lichtlimitation zwischen 50 und 100 mg L -1 eingestellt. Die Produktivität liegt zwischen 25 und 125 mg L -1 in 24 h. In Flachbettreaktoren konnten im Labormaßstab bereits Zelldichten von mg L -1 bei Ausbeuten von mg L -1 in 24 h bzw mg L -1 und Ausbeuten von 800 bis mg L -1 in 24 h erreicht werden (Richmond, 2007). 2.6 Vorbehandlung Vorbehandlungsmethoden zur Desintegration von organischen Materialien sollen nicht-abbaubare intrazellulare organische Substanzen durch die Lyse von Zellen in eine lösliche Form überführen und die Zugänglichkeit der Substratbestandteile für die hydrolytischen Enzyme verbessern. (Alvira et al., 2010; Appels et al., 2010b). Dies kann insbesondere für partikelhaltige Materialien notwendig sein, für die die Hydrolyse der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist (Saifuddin und Fazlili, 2009). Auf diese Weise kann die Verweilzeit des Substrats im Fermenter verringert oder die RB und der Abbaugrad erhöht werden. Mögliche Vorbehandlungsmethoden umfassen physikalische, chemische und biologische Methoden. Ein Überblick über die Einteilung verschiedener Vorbehandlungsmethoden ist der Abbildung 2.4 zu entnehmen. Die meisten dieser Vorbehandlungsmethoden werden nur im Labormaßstab verwendet. Zellwandstrukturen vieler Mikroalgen stellen eine signifikante Barriere gegenüber der Extraktion von Zellbestandteilen aus den Zellen dar (Razon und Tan, 2011). Durch den Zellwandaufbau von N. salina mit einer trilaminaren Struktur und eingelagerten Algaenanen (siehe Abschnitt 2.5.6), die eine Resistenz gegenüber enzymatischer und chemischer Hydrolyse aufweisen, werden im Folgenden nur physikalische Methoden für den Zellaufschluss mit Relevanz für diese Arbeit behandelt.

31 2 Theoretische Grundlagen 23 Abbildung 2.4 Überblick über Methoden für den Zellaufschluss, verändert nach (Kampen, 2005) Thermische Vorbehandlung (Thermolyse) Häufig wird die thermische Vorbehandlung in Verbindung mit der anaeroben Vergärung von Belebtschlamm angewendet, um die geschwindigkeitsbestimmende Hydrolyse zu verbessern. Durch thermische Behandlung werden chemische Bindungen in den Zellwänden und Membranen aufgebrochen, wodurch Zellbestandteile in eine lösliche Form überführt werden können (Appels et al., 2008). Bezüglich der Verbesserung der Biogasproduktion wurden von Bougrier (2008) zwei thermische Bereiche unterschieden: Zwischen 70 und 121 C wurde eine Verbesserung um 20-30% und zwischen 160 und 180 C eine Zunahme um % der Biogasproduktion beobachtet (Bougrier et al., 2008). Die Solubilisierung der Organik folgt dabei einer linearen Abhängigkeit, wobei jene mit steigender Temperatur zunimmt (Carrère et al., 2008). Eine Abhängigkeit der Solubilisierung von der Behandlungsdauer konnte nur für den unteren Temperaturbereich beobachtet werden (González-Fernández et al., 2012). Der erhöhte Methanertrag von Klärschlamm kann mit der eingebrachten Energie für die Thermolyse im Gleichgewicht stehen und ist im industriellen Maßstab anwendbar (Kepp et al., 2000). Vorbehandlung bei höheren Temperaturen (>190 C) führen trotz der verbesserten Solubilisierung der Organik zu vermindertem Abbaugrad (Dwyer et al., 2008). Durch sogenannte Maillard Reaktionen werden Kohlenhydrate und Aminosäuren durch die Erhitzung zu Melaoidinen umgewandelt, die nur schwer oder nicht abbaubar sind (Bougrier et al., 2008). Mikrowellenstrahlung stellt eine Möglichkeit der schnellen Thermolyse dar (Priego-Capote und Luque Castro, 2007). Mikrowellenstrahlung erzeugt ein alternierendes elektrisches Feld, welches in polaren Lösungsmitteln eine schnelle Ausbildung und Auflösung von Dipolen erzeugt (Saifuddin und Fazlili, 2009). Dadurch entsteht auf molekularer Ebene Reibung, durch die die eingebrachte Leistung dissipiert wird. Die Behandlung von Abwasser einer Palmölfabrik mit Mikrowellenstrahlung (3 min, 2450 MHz, 700 W) resultierte in einer Erhöhung der Biogasausbeute von 57% gegenüber der unbehandelten Probe (Saifuddin und Fazlili, 2009)

32 24 2 Theoretische Grundlagen Einfrieren/Auftauen Durch das Einfrieren und Auftauen einer Probe werden die Zellen durch die Bildung von Eiskristallen und der daraus resultierenden Volumenzunahme des Wassers aufgeschlossen. Diese Methode gilt als schonend, aber ineffizient hinsichtlich des Aufschlusses der Probe (Kampen, 2005). Ultraschallhomogenisation Beim Einsatz von Ultraschall (Frequenzbereich >20 khz) auf wässrige Medien tritt der Effekt der Kavitation auf. Dabei entstehen kurzzeitig Wasserdampf- oder Gasblasen, bei deren Zerfall hohe Temperatur- und Druckspitzen auftreten (Priego-Capote und Luque Castro, 2007). Je nach Intensität des Ultraschalls und Dauer der Beschallung werden die Zellen durch das Platzen der Kavitationsblasen und die Entstehung von Radikalen zerstört (Priego-Capote und Luque Castro, 2007). Der Zellaufschluss liegt beim Einsatz von Ultraschall bei 100 %. Die hohen Temperaturund Druckspitzen, die durch den Zerfall der Kavitationsblasen entstehen, können Einfluss auf die chemische Beständigkeit der Inhaltsstoffe des verwendeten Materials nehmen. Hochdruckhomogenisation Hochdruckhomogenisatoren arbeiten nach dem Prinzip der Druckentspannung. Das aufzuschließende Material wird durch einen variablen Spalt (10-20 μm) gepresst und anschließend wieder auf Normaldruck entspannt. Mit Fließgeschwindigkeiten von 200 m s -1 trifft das Zellmaterial auf eine Prallplatte oder einen Prallring (Kampen, 2005). Die Zellen platzen aufgrund der wirkenden Scherkräfte und der entstehenden Kavitation. Für die Extraktion von Astaxanthin aus Haematococcus pulvialis konnten durch Hochdruckhomogenisation um den Faktor 4 höhere Ausbeuten erzielt werden als für die unbehandelte Probe (Molina Grima et al., 2003). Der Einsatz von Hochdruckhomogenisatoren ist sowohl im Technikums-, als auch im Produktionsmaßstab denkbar.

33 3 Material und Methoden 25 3 MATERIAL UND METHODEN Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten experimentellen Untersuchungen zur Vergärung von Algenbiomasse zu Biogas gliedern sich in zwei Teile: zum einen wurden Untersuchungen von Limitierungen im anaeroben Abbau der Algenbiomasse von N. salina in Batchversuchen durchgeführt. Zum anderen wurde die kontinuierliche Erzeugung von Biogas aus Algenbiomasse im Vergleich zu MS und in der Kovergärung der beiden Substrate untersucht. Diese Untersuchungen umfassen eine Analyse der mikrobiellen Zusammensetzung zu verschiedenen Zeitpunkten in den drei Fermentern. Zudem wurden umfassende Analysen zur Zusammensetzung der verwendeten Substrate durchgeführt. 3.1 Analysen Untersuchungen verschiedener Prozessparameter der Biogasbildung und Eigenschaften der verwendeten Substrate wurden sowohl im Biogaslabor des Lehrstuhls für Thermodynamik an der Ruhr-Universität Bochum, als auch von externen Laboren durchgeführt. Eine genaue Zuordnung und Beschreibung der einzelnen Parameter ist in den folgenden Abschnitten dargestellt Bestimmung der Trockensubstanz und der organischen Trockensubstanz Die Bestimmung der Trockensubstanz (TS) und der organischen Trockensubstanz (ots) dient der Beurteilung von Substraten, als spezifischer Bezugspunkt für die entstandene Biogasmenge einer definierten Substratmenge und zur Bestimmung des Abbaugrades des Substrats. Die Bestimmung der Trockensubsubstanz und der organischen Trockensubstanz wurden gemäß der Richtlinien DIN EN und DIN EN in Dreifachbestimmung durchgeführt (DIN Deutsches Institut für Normung e.v., 2001a; DIN Deutsches Institut für Normung e.v., 2001b). Dazu wurden Schmelztiegel bei 550 C ausgeglüht und nach dem Abkühlen und Wiegen der leeren Tiegel eine entsprechende Menge an Probe eingefüllt, so dass nach dem Verglühen noch mindestens 0,5 g an Rückstand zurück bleiben. Das Abkühlen der Tiegel erfolgte in jedem Schritt zur Vermeidung von Wasseradsorption in einem Exsikkatorschrank. Für die TS-Bestimmung wurde die Probe bei 105 C über Nacht in einem Trockenschrank (Function Line, Heraeus, Hanau) getrocknet und anschließend abgekühlt und gewogen. Der TS- Gehalt (angegeben als prozentualer Anteil der Frischmasse; % FM) errechnet sich aus der Differenz von getrockneter Probe und unbefülltem Tiegel geteilt durch die Differenz aus ungetrockneter Probe und unbefülltem Tiegel. Anschließend wurde die Probe im Muffelofen für 5 Stunden bei 550 C verglüht. Dabei bleibt, nach Verglühen aller organischen Bestandteile, die Rohasche zurück, die hauptsächlich aus Mineralstoffen und Silikaten besteht. Der ots-gehalt (angegeben als prozentualer Massenanteil der TS; % TS) kann analog zum TS-Gehalt berechnet werden. Der TS-Gehalt wird üblicherweise als Maß für die aktive Biomasse eines Belebtschlammes verwendet. Der TS-Gehalt wird im Rahmen dieser Arbeit analog zum Trockenrückstand (TR), also dem Rest nach völliger Austrocknung einer Probe, verwendet.

34 26 3 Material und Methoden Bestimmung der Gasqualität Im Rahmen der durchgeführten Versuche wurde eine gaschromatographische Analyse des Biogases durchgeführt. Bei Batchversuchen wurde das entstandene Biogas in Gasbeuteln (Ritter Apparatebau GmbH, Witten) gesammelt und nach der jeweiligen Versuchsreihe analysiert. Im Rahmen der semi-kontinuierlichen Versuchsreihen konnte eine Biogasprobe aus dem Kopfraum des Fermenters automatisch zum Gaschromatographen (GC; Focus GC, Thermo Fisher Scientific, USA) geleitet werden. Die Leitungen von den Fermentern zum GC wurden zur Vermeidung von Kondensatbildung durch ein Heizband auf 40 C temperiert. Eine Probenschleife mit einem Volumen von 0,5 ml, die in einem auf 110 C temperierten Ventilofen eingebracht war, wurde für eine Minute mit der jeweiligen Probe gespült. Anschließend wurde die Probe mit dem Trägergasstrom (Helium Typ 5.0, 20 ml min -1 ) auf die Trennsäule (mikrogepackte Säule Shin Carbon ST 100/120, Restek, USA) des GC geleitet. Die Detektion der aufgetrennten Probenbestandteile erfolgte mittels eines Wärmeleitfähigkeitsdetektors (WLD) gegen das Trägergas. Durch externe Kalibrierung des beschriebenen Systems zur Gasqualitätsanalytik konnte das in den Versuchen entstandene Biogas hinsichtlich der Bestandteile Methan (CH 4 ), Kohlendioxid (CO 2 ), Sauerstoff (O 2 ) und Stickstoff (N 2 ) untersucht werden. Die erweiterte Unsicherheit (U e ) des Messsystems und die jeweiligen Erweiterungsfaktoren (k) sind in Tabelle 3.1 dargestellt. Tabelle 3.1 Erweiterte Unsicherheit (Ue) mit Erweiterungsfaktoren (k) des gaschromatographischen Messsystems O 2 N 2 CH 4 CO 2 U e (x) mol-% ±0,0306 ±0,0498 ±1,5224 ±1,0714 k - 2,87 2,87 2,32 2,25 Biogas wird in der vorliegenden Arbeit als ideales Gas angenommen. Aus diesem Grund entspricht der Stoffmengenanteil (mol-%) dem Volumenanteil (Vol.-%) und wird synonym verwendet. Für die Berechnung des Methangehaltes einer Probe wurde eine Korrektur bezüglich der Anteile von Sauerstoff und Stickstoff vorgenommen. Sauerstoff kann im Gegensatz zu N 2 durch den anaeroben Abbau von organischen Materialien nicht gebildet und nur mit dem Substrat oder durch Undichtigkeiten in den Prozess eingebracht werden. Für den Fall, dass das N 2 /O 2 -Verhältniss der gemessenen Probe kleiner als das Verhältnis in Luft (3,7286) war, wurde der Anteil an O 2 und N 2 von der Gesamtsumme der Probenbestandteile subtrahiert. Bei einem größeren N 2 /O 2 -Verhältnis wurde der über das Luftverhältnis korrigierte Anteil an O 2 (O 2 +3,7286 O 2 ) von der Gesamtsumme der Probenbestandteile subtrahiert. Der Anteil an CH 4 und CO 2 der Probe wurde anschließend auf 100% bezogen, um den Anteil der Bestandteile im trockenen Biogas zu erhalten.

35 3 Material und Methoden Bestimmung des FOS/TAC-Verhältnisses Das FOS/TAC-Verhältnis ergibt sich aus der Summe der flüchtigen organischen Säuren (FOS) und dem totalen anorganischen Carbonat (TAC) und wurde im Rahmen der durchgeführten Versuche durch Titration (TitroLine 6000, SI Analytics, USA) der Fermenterproben in Dreifachbestimmung nach Nordmann bestimmt (Nordmann, 1977). Für die Bestimmung wurden 5 g Fermenterinhalt mit 45 ml Aqua destilata (A. dest.) verdünnt und von dem ph-wert der Probe ausgehend mit einer 0,1 M HCl-Lösung bis zu einem ph-wert von 5,0 für die TAC-Bestimmung und bis zu einem ph-wert von 4,4 für die FOS-Bestimmung titriert. FOS und TAC-Wert konnten mit Hilfe der Gleichungen 3.1 und 3.2 berechnet werden. Das FOS/TAC- Verhältnis wurde durch Division der FOS und TAC-Werte berechnet. 1 V1 TAC mg CaCO3 L 0,5 (VV chcl M CaCO ) V mit: V V = Verdünnung der Probe V 1 V Probe Probe = Verbrauch HCl bis ph 5,0 in ml = Volumen der Probe in ml c HCl = Konzentration HCl in mol L -1 M CaCO3 = Molekulargewicht von Calciumcarbonat in g mol -1 0,5 = Equivalent von HCl zu CaCO 3. (VV V2 1,66 0,15 ) c 1 HCl M CaCO3 FOS mg CH3COOH L 3.2 V mit: V 2 = Verbrauch HCl bis ph 4,4 in ml. Probe Zusammensetzung der flüchtigen organischen Säuren Die FOS setzen sich aus Essigsäure (ES), Propionsäure (PS), Buttersäure (BS), iso-buttersäure (i- BS), Valeriansäure (VS), iso-valeriansäure (i-vs) und Capronsäure (CS) zusammen. Die Bestimmung der Zusammensetzung der FOS wurde durch ein externes Labor (Wessling GmbH, Altenberge) durchgeführt. Durch das Unternehmen wurde ein Konservierungsmittel zur Verfügung gestellt, welches den weiteren Abbau der Proben während des Transportes verhindern soll. Das Konservierungsmittel wurde direkt nach der Probenahme in die Proben eingemischt. Die Bestimmung des Fettsäurespektrums erfolgte durch eine Hausmethode (WES 212) gaschromatographisch mit einem Flammenionisationsdetektor (FID). Eine Übersicht der erweiterten Messunsicherheiten laut Anbieter ist in Tabelle 3.2 dargestellt. Die Nachweisgrenzen aller Säuren sind mit 50 mg kg -1 angegeben.

36 28 3 Material und Methoden Tabelle 3.2 Erweiterte Messunsicherheit (U e ) für die Bestimmung der flüchtigen organischen Säuren ES PS BS i-bs VS i-vs CS U e (x) % 15,75 11,17 61,94* 45,86* k.a. 18,26 k.a. * Werte lagen im Ringversuch unterhalb der Nachweisgrenze (Mittelwert BS: 20,1 mg kg -1, i-bs: 28,8 mg kg -1 ). k.a. = keine Angabe Weenderanalyse Mittels der Weenderanalyse kann die chemische Zusammensetzung eines Substrates hinsichtlich des Rohprotein- (General priciples for analysts 4.0, Bestimmung des Kjedahl-Stickstoffs), Rohfett- (VDLUFA Band III 5.5.1), Rohasche- (DIN EN und 12880) und Rohfasergehaltes (VDLUFA Band III 6.1.1) analysiert werden. Die Differenz dieser Bestandteile zur Gesamttrockenmasse wird als stickstofffreie Extraktionsstoffe (NfE, z.b. lösliche Zucker oder Stärke) zusammengefasst. Die Weenderanalyse der Algenbiomasse und der Maissilage wurde durch ein externes Labor (Wessling GmbH, Altenberge) durchgeführt. Laut Anbieter beträgt die erweiterte Unsicherheit für die Bestimmung von Rohfett 25%, für Rohfaser 28% und für Rohprotein 7%. Bei der Bestimmung des Rohproteingehaltes wird der Gesamtstickstoffgehalt einer Probe bestimmt und mit einem durchschnittlichen Faktor für den N-Gehalt von Biomasse von 6,25 multipliziert. Für marine Algen liegt ein abweichender Faktor von 4,92 vor (Lourenço et al., 2002). Der Rohproteingehalt der Algenbiomasse wurde mit diesem Faktor korrigiert Elementaranalysen Zur Bestimmung des Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnisses (C/N-Verhältnis) der verwendeten Substrate und von Fermenterinhalt wurden Elementaranalysen am Lehrstuhl für Analytische Chemie der Ruhr-Universität Bochum durchgeführt. Ca. 5 g einer Probe wurden über Nacht bei 105 C getrocknet und anschließend in einem Mörser pulverisiert. Nach erneuter Trocknung bei 105 C wurde die elementare Zusammensetzung mit einem Elementaranalysator in Doppelbestimmung (vario EL, Elementar Analysesyteme GmbH, Hanau) auf die Bestandteile Kohlenstoff, Stickstoff, Wasserstoff und Schwefel ermittelt. Zur Bestimmung des C/N-Verhältnisses bezogen auf TS wurde der C-Anteil durch den N-Anteil dividiert. Zur Berechnung des C/N-Verhältnisses von Substratmischungen wurde Gleichung 3.3 verwendet.

37 3 Material und Methoden 29 (X C X C ) A A B B C/N (X A N A X B N B ) mit: C = Kohlenstoffanteil in % TS N = Stickstoffanteil in % TS A /B = Substrat A bzw. B X A/B = Anteil Substrat A bzw. Substrat B an der Substratmischung bezogen auf den TS-Anteil Spurenelementanalysen Spurenelementanalysen wurden sowohl für die verwendeten Substrate, als auch für Fermenterinhalt durch ein externes Labor (Wessling GmbH, Altenberge) durchgeführt. Die Analytik beschränkte sich auf die für die Biogasbildung relevantesten SE: Kobalt (Co), Molybdän (Mo), Nickel (Ni), Selen (Se), Mangan (Mn), Kupfer (Cu), Eisen (Fe) und Zink (Zn) sowie Natrium (Na). Die Anteile der einzelnen SE wurden nach einer Königswasserextraktion (ISO 11456) aus der Trockensubstanz durch optische Emissionsspektrometrie mittels induktiv gekoppelten Plasma (ICP-OES) bestimmt. Die erweiterte Messunsicherheit für die Spurenelementanalytik beträgt laut Anbieter 10% Ammoniumgehalt Der Ammoniumgehalt von Fermenterproben wurde durch ein externes Labor (Wessling GmbH, Altenberge) bestimmt. Die Bestimmung erfolgte photometrisch nach Calciumchlorid-Extraktion (CaCl 2 ) entsprechend DIN E5-1. Die erweiterte Messunsicherheit für die Bestimmung des Ammoniumgehaltes beträgt laut Anbieter 20%. 3.2 Vorbehandlung der Algenbiomasse Im Rahmen zur Untersuchung der Vergäbarkeit der Algenbiomasse wurde der Einfluss verschiedener physikalischer Vorbehandlungsmethoden auf die Abbaubarkeit der Algenbiomasse bestimmt. Diese Untersuchungen wurden in drei verschiedenen Versuchsreihen durchgeführt Methoden zur Vorbehandlung der Algenbiomasse In der ersten Versuchsreihe wurde der Einfluss von Einfrieren der Algenbiomasse, Ultraschall, Mikrowellen, Hochdruckhomogenisation und Thermolyse untersucht. Hierzu wurde die pastöse Algenbiomasse mit Leitungswasser auf eine Konzentration von 0,3 g FM ml -1 verdünnt. Die Verwendung von Leitungswasser verhinderte ein Aufplatzen der Zellen aufgrund osmotischer Effekte. Das Einfrieren erfolgte bei -15 C über Nacht in einem handelsüblichen Gefrierfach. Bis zum vollständigen Auftauen wurde die Probe anschließend bei Raumtemperatur gelagert.

38 30 3 Material und Methoden Für die Ultraschallbehandlung wurde die Algensuspension dreimal für 45 s bei einer abgegebenen Leistung von 200 W mit einer Frequenz von 30 khz vorbehandelt (Sonifier 250, Branson, USA). Die Erhitzung mittels Mikrowellen erfolgte in einer handelsüblichen Mikrowelle bei 600 W abgegebener Leistung und einer Frequenz von 2450 MHz. Die Probe wurde fünfmal zum Kochen gebracht. Die Probengefäße waren nicht verschlossen, so dass ein Druckausgleich mit der Umgebung gewährleistet war. Der Einfluss der Hochdruckhomogenisation wurde mittels einer French Press (French pressure cell press, Thermo Spectronic, USA) untersucht. Die Probe wurde zweimal bei 10 MPa vorbehandelt. Die Thermolyse wurde durch Erhitzen der Probe für 8 Stunden bei 100 C in einem Trockenschrank (Function Line, Heraeus, Hanau) untersucht. Die Probengefäße waren nicht verschlossen, so dass ein Druckausgleich mit der Umgebung gewährleistet war. In der zweiten Versuchsreihe wurde die Thermolyse in einem weiteren Temperaturbereich untersucht. Die Algenbiomasse wurde mit Leitungswasser auf eine Konzentration von 0,3 g FM ml -1 verdünnt. Die Vorbehandlung erfolgte bei 80 C für 4 Stunden, bei 100 C für 0,5, 2, 4, und 8 Stunden und bei 120 C für 4 Stunden in einem Trockenschrank (Function Line, Heraeus, Hanau). Die druckbeständigen Probengefäße wurden gasdicht verschlossen. In der dritten Versuchsreihe wurde die Algenbiomasse unverdünnt mit einem TS-Gehalt von 29% verwendet. Es wurden gasdicht verschlossene, druckbeständige Probengefäße verwendet. Die Vorbehandlung erfolgte bei 100 C und 120 C jeweils für 2 und 8 Stunden in einem Trockenschrank (Function Line, Heraeus, Hanau). Zusätzlich wurden Probengefäße bei Erreichen der jeweiligen Vorbehandlungstemperatur geöffnet, um über einen schlagartigen Druckausgleich mit der Umgebung ein Aufkochen der Proben auszulösen Qualitative und quantitative Beurteilung des Aufschlusses Im Rahmen der Vorbehandlung der Algenbiomasse wurden verschiedene Versuche zur Beurteilung des Aufschlusses durchgeführt. Für die erste Versuchsreihe zur Untersuchung des Einflusses verschiedener physikalischer Aufschlussmethoden wurde eine fotometrische Messung des Aufschlusses durchgeführt. Für die dritte Versuchsreihe zur Untersuchung der Thermolyse wurden zusätzlich lichtmikroskopische und transelektronenmikroskopische Messungen und der Nachweis von Membranlipiden durchgeführt. Fotometrie Für die Beurteilung des Aufschlusses wurden fotometrische Messungen vorgenommen. Dazu wurden die Proben je nach Konzentration 1:10-1:300 verdünnt. Feste Zellbestandteile wurden für 2 min bei x g mit einer Zentrifuge (Eppendorf Mini Spin plus, Eppendorf, Wesseling- Berzdorf) pelletiert. Der Überstand wurde in UV-beständige Küvetten überführt und die optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mit einem Fotometer (UV-2450, Shimadzu, Duisburg) bestimmt. Bei dieser Wellenlänge liegt ein Absoptionsmaximum der aromatischen

39 3 Material und Methoden 31 Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan vor, die als Bestandteile von Proteinen eine Zunahme der Zelldesintegration im Vergleich zur unbehandelten Algenbiomasse anzeigen sollten. Lichtmikroskopie Für die Bestimmung der Zellzahl wurden die Proben 1: verdünnt. 10 µl der Verdünnung wurden auf eine Zählkammer (Typ Thoma, Brand GmbH, Wertheim) gegeben. Die Anzahl der in der Probe befindlichen Zellen wurde bei 400-facher Vergrößerung unter dem Lichtmikroskop (Axiostar plus, Carl Zeiss AG, Oberkochen) ausgezählt. Transelektronenmikroskopie Zur qualitativen Beurteilung des Wirkmechanismus der thermischen Vorbehandlungen wurden transelektronenmikroskopische Aufnahmen der Algenbiomasse nach der Vorbehandlung bei 120 C für 2 Stunden und bei 120 C nach Druckausgleich der Proben im Vergleich zur unbehandelten Algenbiomasse durchgeführt. Die Präparation der Proben und die transelektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden an der medizinischen Fakultät in der Abteilung für Cytologie an der Ruhr- Universität durchgeführt. Proben für Transelektronenmikroskopie (TEM) wurden in 2,5% Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 2 Stunden fixiert, mit 4% (w/v) Agar gemischt, in Osmiumtetroxid (OsO 4 ) nachfixiert und in Epon dehydriert und eingebettet. Schnitte der präparierten Probe wurden auf Formvar-beschichteten Gittern gesammelt und mit Uranylacetat kontrastiert. Die Aufnahmen erfolgten mit einem Transelektronenmikroskop (EM 410, Philips, Holland) bei einer Vergrößerung zwischen und mit einer Spannung von 80 kv. Nachweis von Membranlipiden Für den Nachweis von Membranlipiden aus dem Überstand verdünnter Proben wurden feste Zellbestandteile mit einer Zentrifuge (Eppendorf Mini Spin plus, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf) für 2 min bei x g pelletiert. Die Lipidextraktion erfolgte nach der Methode von Bligh und Dyer (Bligh und Dyer, 1959). Zum Überstand wurden 375 µl Methanol-Chloroform-Lösung (2:1) gegeben und gevortext. Nach Zugabe von 100 µl A. dest. und 100 µl Chloroform wurde die Probe erneut gevortext und für 5 min bei x g zentrifugiert (Eppendorf Mini Spin plus, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf). Die organische Phase wurde in ein frisches Gefäß überführt und bei 50 C eingedampft. Das dabei erhaltene Pellet wurde in 15 µl Methanol-Chloroform-Lösung (1:1) aufgenommen und in 3µL Schritten auf eine Dünnschichtchromatographie-Kieselgelplatte (DC Kieselgel 60, Merck KGaA, Darmstadt) gegeben. Die Auftrennung der Proben erfolgte in einem Laufmittel aus Propionsäure-n-Propanol-Chloroform-A. dest. (3:2:2:1). Nach der Trennung wurde die Platte für 3 min getrocknet und durch kurzes Eintauchen in Kupfersulfatlösung (300 mm Kupfer(II)sulfat-pentahydrat in 8,5% (v/v) Phosphorsäure) gefärbt. Durch Verkohlen der Platte für 5 min bei 170 C wurden die Membranlipide sichtbar gemacht.

40 32 3 Material und Methoden 3.3 Batchversuche Alle dargestellten Batchversuche wurden im Biogaslabor des Lehrstuhls für Thermodynamik an der Ruhr-Universität Bochum gemäß der VDI-Richtlinie 4630 in Dreifachbestimmung unter mesophilen Bedingungen durchgeführt (Verein deutscher Ingenieure, 2006). Für Batchversuche steht im Biogaslabor ein temperierbarer Raum für 24 Batchansätze zur Verfügung. Ein Batchansatz besteht aus einem Gärgefäß (0,5 L Schott-Flasche), einem Eudiometer mit 400 ml Volumen, einem Ausgleichsgefäß (1 L Schott-Flasche) und einem Gasbeutel mit 5 L Volumen (Ritter Aparatebau GmbH, Witten). Das Eudiometer und das Ausgleichsgefäß wurden mit einer Mindestmenge von 0,8 L Sperrflüssigkeit (55,2 g L -1 Schwefelsäure; 200 g L -1 Natriumsulfat-decahydrat) befüllt. Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 3.1 dargestellt. Abbildung 3.1 Versuchsaufbau der Batchversuche Vor jeder Versuchsreihe wurde das verwendete Inoculum für einen Zeitraum von Tage bei 38 C ohne weitere Beschickung mit frischem Substrat gelagert, um das Eigengaspotential des Inoculums zu minimieren. Gemäß der VDI-Richtlinie wurde ein Gäransatz mit 400 g FM befüllt, wobei das ots-verhältnis von Substrat zu Inoculum 0,5 betrug. Dadurch wurden 7 g ots aus dem Inoculum und 3,5 g ots aus dem Substrat zu den Ansätzen gegeben. Durch unterschiedliche TS/oTS-Konzentrationen verschiedener Inocula und Substrate wurde die Differenz zu 400 g mit lauwarmem Leitungswasser

41 3 Material und Methoden 33 ausgeglichen. Bei jeder Versuchsreihe wurde eine Nullprobe erstellt, bei der das Eigengaspotential des Inoculums erfasst wurde. Nach Aufbau der Ansätze wurde das Gärgefäß mit dem Eudiometer verbunden und der Kopfraum des Gärgefäßes und das Eudiometer für 1 min mit Helium (Typ 4.6) gespült, um anaerobe Bedingungen im Reaktionsraum zu schaffen. Die produzierte Biogasmenge wurde täglich zusammen mit der aktuellen Temperatur und dem aktuellen Druck abgelesen, indem die Füllstände der Sperrflüssigkeit im Ausgleichsgefäß und im Eudiometer auf ein Niveau gebracht wurden. Für den Fall, dass das Eudiometer ausreichend mit Biogas gefüllt war, wurde das Gas aus dem Eudiometer in den Gasbeutel abgelassen. Die jeweilige Versuchsreihe wurde abgebrochen, wenn alle Ansätze eine Sättigung der akkumulierten Biogasmenge aufwiesen. Im Anschluss an die Versuchsreihe wurde von jedem Ansatz eine TS/oTS-Bestimmung in Dreifachbestimmung und eine Analyse der Zusammensetzung des Biogases aus dem Gasbeutel vorgenommen. Die täglich bestimmten Biogasvolumina wurden über Gleichung 3.4 auf das trockene Normvolumen bei 273,15 K und 1013,25 hpa umgerechnet. Alle in der Arbeit dargestellten Biogasmengen, -ausbeuten und -erträge sind im Normzustand angegeben. V (p p )T B w N N VB 3.4 pn TB mit: V N = Volumen des trockenen Gases im Normzustand in ml V B p B p w T N p N = abgelesenes Gasvolumen in ml = Druck zum Zeitpunkt des Ablesens in hpa = Dampfdruck des Wassers bei T B in hpa = Normtemperatur 273,15 K = Normdruck 1013,25 hpa T B = Temperatur zum Zeitpunkt des Ablesens in K. Der Dampfdruck des Wassers p w wurde mittels einer erweiterten Antoine-Gleichung (Gleichung 3.5) berechnet ((Gerber, 2009): C p 10 exp( C C ln T / K C (T / K ) 3.5 C5 2 2 w 1 3 B 4 B T B / K mit: C 1 = 73,6490 C 2 = -7258,2000 C 3 = -7,3037 C 4 = 4, C 5 = 2,0000 T B = Temperatur zum Zeitpunkt des Ablesens in K. Die einzelnen Ansätze einer Dreifachbestimmung wurden mit Gleichung 3.6 in einer Regression zusammengefasst, wobei Ausreißer eliminiert und nicht in weitere Berechnungen einbezogen

42 34 3 Material und Methoden wurden. Die Parameter a bis g der Regression wurden soweit angepasst, dass die Standardabweichung der Regression minimal wurde und der Verlauf der entstandenen Biogasmenge der Dreifachbestimmung bestmöglich wiedergegeben wurde. e b VN t a tanh c t d 1 (tanh f t g 1) mit: V N (t) = Volumen des trockenen Gases im Normzustand zum Zeitpunkt t in ml a-g = anpassbare Parameter zur Beschreibung des Regression. Für die Darstellung des Biogasverlaufes der einzelnen Proben konnte die durch die Regression berechnete tägliche Biogasmenge der Nullprobe (Inoculum) von der Biogasmenge der Gesamtprobe subtrahiert werden. Über die TS/oTS-Bestimmung der eingesetzten Substrate vor jeder Versuchsreihe und der Bestimmung des gesamten Gäransatzes nach der Versuchsreihe konnte für jede Probe eine Biogasausbeute und ein ots-abbaugrad des Substrates berechnet werden. Für die Biogasausbeute wurde das Biogasvolumen der Nullprobe von dem Gesamtbiogasvolumen der Probe subtrahiert und durch die eingesetzte Organik des Substrates dividiert. Der Abbaugrad des Substrates wurde mit Gleichung 3.7 berechnet. Für den ots-gehalt des Substrats nach der Vergärung wurde vom Gesamt-oTS-Gehalt der Probe der ots-gehalt des Inoculums nach der Vergärung subtrahiert. (ots ots ) ots in, Sub out,probe out, IS ots Abbaugrad /% mit: ots out,probe = ots-menge der Gesamtprobe nach der Vergärung in g ots out,is = ots-menge der Nullprobe nach der Vergärung in g ots in,sub = ots-menge des Substrats im Ansatz vor der Vergärung in g. 3.7 Spezifikationen der Batchansätze und eine Kennzeichnung der verwendeten Substrate und Inocula werden bei der Auswertung der einzelnen Versuchsreihen beschrieben. 3.4 Kontinuierliche Versuche Die semi-kontinuierlichen Versuche zur Monovergärung der Algenbiomasse (A) und von Maissilage (MS) und zur Kovergärung der Algenbiomasse mit Maissilage (1A/6MS) wurden im Biogaslabor des Lehrstuhls für Thermodynamik an der Ruhr-Universität Bochum in drei baugleichen Fermentern mit einem Volumen von 22 L unter mesophilen Bedingungen (38 C) durchgeführt. Der Aufbau der Versuchsanlagen ist in Abbildung 3.2 und Abbildung 3.3 dargestellt.

43 3 Material und Methoden 35 Abbildung 3.2 Schematischer Aufbau der Versuchsfermenter für die semi-kontinuierlichen Versuche Abbildung 3.3 Schematische Darstellung der Anschlüsse am Deckel der Versuchsfermenter für die semikontinuierlichen Versuche

44 36 3 Material und Methoden Der Fermenter besteht aus einem doppelwandigen Borsilicatglasbehälter, der mittels Zirkulation von Wasser im äußeren Mantel über einen Umlaufthermostaten (CC2-202C, Huber, Offenburg) beheizt werden kann. Auf dem Deckel des Behälters befindet sich ein Kugellager (SUCTF205, Bearing Service Wälzlager-Vertriebs GmbH, Düsseldorf), durch das die Edelstahlwelle des Rührwerks (Turbo Misch- und Verfahrenstechnik Industrierührwerke GmbH, Nienhagen bei Celle) geführt ist. An der Rührwerkswelle befinden sich drei Edelstahlrührorgane. Zur Abdichtung des Fermenterinhalts gegenüber der Umwelt sitzt im Deckel unterhalb des Kugellagers ein Simmerring (25x52x7 Baum IV, Hengstenberg, Essen) und in einer Nut am Flansch des Fermenters ein O-Ring. Am Deckel befinden sich des Weiteren ein Beschickungsstutzen mit Kugelventil, ein Anschluss für eine Gasleitung zur Überdrucksicherung, ein PT-100 (1/3 DIN B) und eine Edelstahlleitung zum GC. Am unteren Teil des Fermenters befindet sich ein Flansch, an dem ein Kugelventil zum Ablass von Fermenterinhalt angebracht wurde. Von der Gasleitung zur Überdrucksicherung geht eine weitere Gasleitung zu jeweils einem Gasbeutel mit 5 L Volumen (Ritter Apparatebau GmbH, Witten) ab. Der Gasbeutel dient als Gasspeicher, damit beim Ablassen von Fermenterinhalt über das untere Ablassventil kein Unterdruck in der Anlage entsteht. Von den Gasbeuteln geht die Gasleitung weiter zu jeweils einem Trommelgaszähler (Typ TG05/2, Ritter Apparatebau GmbH, Witten), welche mit dem Weißöl Autin B als Sperrflüssigkeit gefüllt sind. Zur Berechnung des Normvolumenstroms werden die Temperatur (PT-100, 1/3 DIN B) und der Druck (HPSA- KDVAA-002-A, Althen GmbH Meß- und Sensortechnik, Kelkheim) in der Gasphase der Trommelgaszähler kontinuierlich erfasst. Zu Beginn der Versuchsreihe wurden alle drei Anlagen bis zu einem Füllstand von 20 L mit demselben Inoclum befüllt. Dieses stammte aus der landwirtschaftlichen Biogasanlage Steinmann (Bottrop-Kirchhellen), die mit MS und Rindergülle als Hauptsubstraten betrieben wird. Die Beschickung der drei Fermenter erfolgte ein Mal täglich. Dazu wurden 1-1,5 L Fermenterinhalt über den Kugelhahn am unteren Flansch der Anlagen abgelassen und mit dem frischen Substrat vermischt. Für die Beschickung wurde das Substratgemisch in einen Trichter, der auf den Befüllungsstutzen aufgesetzt wurde, gefüllt und mit einem gasdicht abschließenden Stopfen langsam in die Anlage gedrückt. Die MS, die während der semi-kontinuierlichen Versuche verwendet wurde, stammte aus dem gleichen Betrieb wie das Inoculum. Die Algenbiomasse wurde durch die Firma BlueBiotech GmbH (Büsum) zur Verfügung gestellt. Während der Versuchsreihe wies der Mais einen TS-Gehalt zwischen 26,6 und 31,1% FM und die Algenbiomasse einen TS- Gehalt zwischen 16,2 und 29,6% FM auf. Die Lagerung der Substrate erfolgte in einem handelsüblichen Kühlschrank bei 4 C. Der zum Anmaischen verwendete Fermenterinhalt aus den Anlagen wurde zusätzlich zur Analytik verwendet. Der ph-wert (Orion 3-Star, Thermo Scientific, USA) und die elektrische Leitfähigkeit (EC Testr. 11, Eutech Instruments, Holland) des Fermenterinhalts wurden täglich gemessen. Die Bestimmung des TS- und ots-gehaltes und des FOS/TAC-Verhältnisses erfolgte im wöchentlichen und die Bestimmung des Fettsäurespektrums und des Ammoniumgehaltes im monatlichen Rhythmus. Die Elementaranalytik und die Bestimmung der Spurenelementzusammensetzung erfolgten vor jeder Veränderung der Beschickung hinsichtlich der Veränderung der RB oder der Veränderung der eingesetzten Substrate (vorbehandelte Algenbiomasse).

45 3 Material und Methoden 37 Die Zusammensetzung des Biogases wurde einmal täglich vor jedem Fütterungszyklus bestimmt. Das Biogasvolumen wurde zusammen mit der Temperatur und dem Gasdruck im Gaszähler kontinuierlich gemessen und über eine Messsoftware gemäß der Gleichungen 3.4 und 3.5 als trockenes Normvolumen ausgegeben. Der Abbaugrad des Substrates und die Biogasausbeute wurden mit der Gleichung 3.7 und analog zu den Batchversuchen berechnet. Zusätzlich wurde der tägliche Biogasertrag berechnet, indem das täglich entstandene Biogasvolumen durch das jeweilige Fermentervolumen geteilt wurde. Zur Darstellung einzelner Parameter in definierten Versuchszeiträumen wurde die Streuung der Messwerte um das arithmetische Mittel als Standardabweichung (s) angegeben. Die Standardabweichung wurde nach Gleichung 3.8 berechnet. 1 s (x x ) n n 2 i i Genomanalysen Im Rahmen der semi-kontinuierlichen Langzeitversuche wurde die Entwicklung der Zusammensetzung der Biozönose der einzelnen Versuchsanlagen untersucht. Die Untersuchungen teilen sich einerseits in die Bestimmung der Mikroorganismen auf Ebene der Domänen Bacteria und Archaea und andererseits in eine weitere Unterteilung aller hydrogenotrophen Methanogenen und der Familien Methanosarcinaceae und Methanosaetaceae, die zu den acetoklastischen Methanogenen zuzuordnen sind. Die genomischen Analysen beinhalten die Probenahme und Vorbereitung der Proben, die Extraktion der DNS, die Aufnahme von Standardreihen für die quantitative Bestimmung und die Messungen der einzelnen Fermenterproben Probenahme und Vorbereitung der Proben Während der semi-kontinuierlichen Versuche wurden jeweils Proben nach Veränderungen der Betriebsweise genommen. Die erste Probe bezieht sich auf das in allen drei Versuchsanlagen verwendete Inoculum zu Beginn der Versuchsreihe. Für die Monovergärung der Algenbiomasse (A) wurden weitere Proben nach 88, 164, 188 und 227 Tagen genommen. Zu diesen Proben kamen für die Monovergärung von MS und die Kovergärung von MS und A (1A/6MS) zusätzlich Proben nach 245 Versuchstagen hinzu. Für die Probenahme wurden ca. 0,5 L Fermenterinhalt bis zur weiteren Verwendung der Proben in einem handelsüblichen Gefrierschrank bei -15 C weggefroren. Nach vollständigem Auftauen der Proben bei 4 C wurden die Proben 5mal für jeweils 30 s mit einem Zerkleinerer (La Moulinette, Moulinex, Offenbach/Main) zerkleinert und homogenisiert. Die Vorbehandlung führt größtenteils zu Partikeln <0,5 mm mit einzelnen Partikeln mir einer Maximalgröße von 1,4 mm.

46 38 3 Material und Methoden Extraktion der DNS Die Extraktion der DNS aus den Fermenterproben erfolgte mittels eines Kits zur Extraktion von DNS aus Umweltproben (PowerSoil DNA Isolation Kit, Mo Bio Laboratories, USA) nach Anweisung des Herstellers. Von jeder Fermenterprobe wurden ca. 250 mg für die Extraktion eingesetzt. Der Zellaufschluss erfolgt mechanisch durch die Zerreibung des Zellmaterials zwischen Glasperlen. Die DNS bindet anschließend an einen Silica Filter und wird nach verschiedenen Waschschritten mit 65 µl 10 mm Tris Puffer eluiert. Die DNS-Extraktion wurde in Dreifachbestimmung durchgeführt. Nach der Extraktion wurden die Konzentration und Reinheit der DNS-Proben spektralphotometrisch (Nandodrop ND-1000, Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) bestimmt. Dabei wird angenommen, dass eine OD 260 von 1,0 einer DNS-Konzentration von 50 µg ml -1 entspricht. Die Reinheit der DNS kann über die Verhältnisse OD 260/280 und OD 260/230 bewertet werden. Ausreißer der Dreifachbestimmung wurden anschließend verworfen, alle anderen Ansätze einer Probe wurden vereint. DNS-Konzentration und Reinheit der Proben wurden anschließend erneut bestimmt Standardreihen Die Standardreihen dienen der Quantifizierung der Mikroorganismen gemäß der durch die Primersequenzen festgelegten Organismengruppen. Tabelle 3.3 zeigt einen Überblick über die verwendeten Primersequenzen und die wichtigsten Eigenschaften der Primer. Das BAC-Set dient dem Nachweis aller Vertreter der Domäne Bacteria und das ARC-Set dem Nachweis aller Archaea. Beide Primerpaare haben als Zielsequenz einen konservierten Abschnitt in der 16S rrns. Für den Nachweis aller hydrogenotropher Methanogenen wurde das ME-Set verwendet. Organismen der Familen Methanosarcinaceae und Methanosaetaceae wurden über die MSarc- und MSaet-Sets nachgewiesen. Die Primerpaare zum Nachweis der Methanogenen weisen als Zielsequenz jeweils konservierte Bereiche im mcra-gen auf. Die jeweiligen Zielgenfragmente für die Primer lagen kloniert im pgem-t Vektor (Plasmidlänge Bp) vor und wurden durch Dr. rer. nat. Ingo Bergmann (Leibniz-Institut für Agrartechnik Potsdam-Bornim e.v.) zur Verfügung gestellt. Für den Nachweis der Bacteria wurde ein Genfragment (1.579 Bp) von Pectobacterium carotovorum ssp. carotovorum DSM verwendet. Das Genfragment von Methanosarcina barkeri DSM 800 zum Nachweis der Archaea hatte eine Länge von Bp. Für das ME-Set wurde eine Sequenz von Methanothermobacter thermautotrophicus DSM 1053 (1.537 Bp) verwendet. Eine Bp lange Sequenz aus Methanosarcina bakeri DSM 800 wurde für den Nachweis der Methanosarcinaceae und eine 468 bp lange Sequenz aus Methanosaeta concilii DSM 2139 zum Nachweis der Methanosaetaceae verwendet. Für die Erstellung der Standardreihen wurden die Plasmide jeweils mit dem Restriktionsenzym ScaI (20 Units in 1x ScaI Puffer: 10 mm Bis-Tris Propan-HCl, 10 mm MgCl 2, 100 mm KCl, 0,1 mg L -1 BSA, Thermo Scientific, USA) für 2 Stunden bei 37 C linearisiert. Die Inaktivierung des Enzyms erfolgte für 20 min bei 80 C. Die DNS-Konzentration wurde anschließend spektralfotometrisch (Nandodrop ND-1000, Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) bestimmt.

47 3 Material und Methoden 39 Für die Standardreihen wurden jeweils fünf verschiedene Verdünnungen (10 9, 10 7, 10 5,10 3 und 10 1 DNS-Kopien pro PCR-Ansatz) erstellt. Die Anzahl der DNS-Kopien wurde aus den DNS- Konzentrationen gemäß Gleichung 3.9 bestimmt. 1 N c N (L M ) 3.9 DNS DNS A Plasmid Bp mit: N DNS = Anzahl der DNS-Kopien c DNS = DNS-Konzentration in g µl -1 N A = Avogadrozahl 6, mol -1 L Plasmid = Länge des Plasmid in Bp M Bp = durchschnittliche molare Masse eines Bp (660 g mol -1 ). Nach Erstellung der Verdünnungsreihen wurden qpcrs (StepOne TM Real Time PCR System, Applied Biosystems, USA) mit den einzelnen Verdünnungen in Doppelbestimmung am Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik an der Ruhr-Universität Bochum durchgeführt. 12,5 µl SYBR Green qpcr MasterMix (2x, Fermentas GmbH, St. Leon-Rot), 5 µl Plasmid-DNS mit der gewünschten Anzahl DNS-Kopien, 1 µl forward (F) Primer (400 nm), 1 µl reverse Primer (400 nm) und 5,5 µl A. dest. wurden jeweils in ein Well der q-pcr-platten (96-well Fast Thermal Cycling Plates, Life Technologies GmbH, Darmstadt) gefüllt. Die Wells wurden anschließend mit Caps und Stripes (FG Optical Cap, Life Technologies GmbH, Darmstadt) verschlossen. Folgende qpcr-bedingungen wurden verwendet: anfänglicher Denaturierungsschritt bei 95 C für 10 min und 45 Zyklen von Denaturierung bei 95 C für 15 s, Annealing bei 53 C (ME) oder 55 C (Msaet, MSarc) oder 57 C (BAC, ARC) und Extension bei 72 C für 1 min. Für jede Messreihe wurde eine Referenzprobe ohne Zielfragment erstellt. Im Anschluss an jede Messung wurde automatisch eine Schmelzpunktanalyse durchgeführt, um zu prüfen, ob im Verlauf der PCR unspezifische Bindungen oder die Bildung von Primer-Dimeren zu beobachten waren. Dazu wurde die Temperatur kontinuierlich erhöht. Im Idealfall kann nur ein Fluoreszenzpeak beobachtet werden, wobei weitere Peaks bei geringerer Schmelztemperatur als das Zielfragment auf unspezifische Bindungen hindeuten (Holzapfel und Wickert, 2007). Die Auswertung der Fluoreszenzentwicklung während der q-pcr wurde mit der Analysesoftware LineRegPCR (11.x) durchgeführt. Dabei wurde durch das Programm die Hintergrundfluoreszenz bestimmt und von der Gesamtfluoreszenz der Proben subtrahiert. Durch die Software konnte anschließend eine Effizienz und ein C T -Wert für die jeweilige Probe berechnet werden. Zur Erstellung der Standardgeraden wurden die erhaltenen C T -Werte gegen die Anzahl der Kopien in den Ansätzen aufgetragen. Die erhaltenen Standardgeraden sind in Abbildung 3.4 dargestellt. Für die absolute Quantifizierung benötigte Standardkurven weisen eine Steigung zwischen -3,9 und -3,0, eine Effizienz zwischen 80 und 115% (1,8-2,15) und einen Korrelationskoeffizienten >0,95 auf (Zhang und Fang, 2006). Für die Standardkurven erhaltene Werte sind Tabelle 3.4 zu entnehmen. Der Ordinatenabschnitt der Standardgeraden gibt den CT-Wert an, bei dem genau eine DNS-Kopie im Reaktionsansatz enthalten ist.

48 Tabelle 3.3 Primersets für den Nachweis verschiedener Mikroorganismen mittels q-pcr Set Primer Funktion Sequenz 5 3 Amplikongröße Bp T S C % GC Zielgruppe Referenz BAC Bacfw Bacrev F primer R primer ACTCC TACG GAGGC AG GACTA CCAGG GTATC TAATC C ,4 60,7 64,7 47,6 Bacteria Yu et al Yu et al ARC Archfw Archrev F primer R primer ATTAG ATACC CSBGT AGTCC GCCAT GCACC WCCTC T ,0 62,3 40,0 62,5 Archaea Yu et al Yu et al ME ME1 ME2 F primer R primer GCMAT GCARA THGGW ATGTC TCATK GCRTA GTTDG GRTAG T ,9 55,6 46,7 42,0 Methanogene (ohne Metanosaetaceae) Hales et al Hales et al MSaet SaetfwV1 SaetrevV1 F primer R primer AGCTA CATGT CCGGN GGNGT GAGAA GTCNT CCAGG ACNTC GTT 77 61,4 62,4 60,0 52,2 Methanosaetaceae Bergmann 2011 Bergmann 2011 MSarc MBARKFW MBARKREV F primer R primer CTACC AGGGC GACGA AGGT CTGGT GACCR ACGTT CATTG C 79 61,0 60,8 63,2 54,8 Methanosarcinaceae Bergmann 2011 Bergmann 2011 F primer = forward primer, R primer = reverse primer, T S = Schmelztemperatur, GC = Guanin- und Cytosingehalt der Primer, Bp = Anzahl Basenpaare Material und Methoden

49 3 Material und Methoden 41 Die aus den Standardkurven resultierende Bestimmungs- und Nachweisgrenzen (bezogen auf den C T -Wert bzw. die Anzahl der DNS-Kopien pro Reaktionsansatz) wurden nach Gleichung 3.10 bzw berechnet. Die Effizienz der PCR wurde nach Gleichung 3.12 bestimmt. Für ME wurde kein Fluoreszenzsignal für 10 1 DNS-Kopien im Reaktionsansatz bestimmt. Daraus resultierend sind die Bestimmungs- und Nachweisgrenzen entsprechend dem Messwert bei 10 3 DNS Kopien pro Reaktionsansatz (C T -Wert von ca. 39). Für MSaet wurden keine Fluoreszenzsignale bei 10 1 und 10 3 DNS-Kopien pro Reaktionsansatz bestimmt. Daraus resultieren eine Bestimmungs- und Nachweisgrenze bei einem C T -Wert von ca. 25 (10 5 DNS-Kopien pro Reaktionsansatz). Bestimmungsgrenze b 3 S ( m ) mit: b = Ordinatenabschnitt S y m 1 y 3.10 = Reststandardabweichung des Ordinatenabschnitts = Steigung. Nachweisgrenze b 10 S ( m ) 1 y 3.11 ( 1/m) PCR Effizienz Abbildung 3.4 Standardgeraden für die Primersets BAC, ARC, ME, MSarc und MSaet

50 42 3 Material und Methoden Tabelle 3.4 Charakteristika der Standardgeraden für die verwendeten Primersets BAC ARC ME MSarc MSaet Steigung -3,42-3,85-5,38-3,32-4,495 Korrelationskoeffizient 0,993 0,999 1,000 0,998 0,994 PCR-Effizienz 1,96 1,82 1,53 2,00 1,67 Ordinatenabschnitt 35,44 39,59 55,30 33,39 47,82 Bestimmungsgrenze (C T ) 34,54 39,25 39,08 32,95 24,71 Bestimmungsgrenze (Kopien) 1,82 1, , Nachweisgrenze (C T ) 32,47 38,48 39,08 31,94 24,71 Nachweisgrenze (Kopien) 7,38 1, , Messung der Fermenterproben Die Messung der Fermenterproben erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie die jeweiligen Messungen der Standardreihen. Die 15 verschiedenen Proben (1mal Inoculum, 4mal A, 5mal MS, 5mal 1A/6MS) wurden mit allen fünf verschiedenen Primerpaaren in Doppelbestimmung gemessen. Es wurde jeweils 1 ng der aus den Fermenterproben extrahierten DNS eingesetzt. Diese wurde in einem Gesamtvolumen von 25 µl mit A. dest. auf eine Konzentration von 1 ng µl -1 verdünnt, so dass 1 µl jeweils für die PCR eingesetzt werden konnte. Nach Auswertung der erhaltenen Fluoreszenzdaten konnte über die lineare Regressionsgleichungen der Standardreihen der C T -Wert der Proben in die Anzahl der DNS-Kopien pro ng eingesetzter DNS berechnet werden. Die Anzahl der DNS-Kopien wurde auf die Menge an eingesetzter Fermenterprobe in g FM -1 bezogen, indem die Einwaage für die DNS-Extraktion in mg FM durch das Elutionsvolumen (65 µl) der DNS-Extraktion dividiert und anschließend durch die DNS- Konzentration (ng µl -1 ) der extrahierten Proben geteilt wurde. Der dabei erhaltene Wert wurde durch die DNS-Kopien pro ng DNS dividiert.

51 4 Auswertung 43 4 AUSWERTUNG 4.1 Zusammensetzung der verwendeten Substrate Als Substrate für die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche wurden Mais als Ganzpflanzensilage und als Corn-Cob-Mix, und Algenbiomasse von der marinen Mikroalge N. salina verwendet. Im Folgenden werden die Unterschiede dieser Substrate hinsichtlich der organischen und anorganischen Zusammensetzung dargestellt Organische Zusammensetzung Wesentliche Parameter, die der Beurteilung von Energiepflanzen als Substrat für die Biogaserzeugung dienen, sind TS/oTS-Gehalt, die Nährstoffzusammensetzung und das C/N- Verhältnis. Diese Parameter variieren sowohl zwischen verschiedenen Substraten, als auch innerhalb einer Substratgruppe, da die verwendete Sorte, Standort, Klima, Erntezeitpunkt, Konservierungsmethoden und Vorbehandlung maßgeblichen Einfluss auf die organische Zusammensetzung des Substrates nehmen (Amon et al., 2007). Mais sollte aufgrund von Sickersaftbildung bei der Konservierung mindestens einen TS-Gehalt von 28% aufweisen und 35% nicht überschreiten, da Silierfähigkeit und Verdichtung des Substrats beeinträchtigt werden können (Eder und Eder, 2009). Für Mikroalgen konnten ähnliche Zusammenhänge beobachtet werden (siehe Abschnitt 2.5). Zum Vergleich von Mais und Algenbiomasse wurde die Analytik für Energiepflanzen für die Algenbiomasse übernommen. Neben dem hohen Salzgehalt einer marinen Mikroalgenkultur, der bei der Vergärung zu Hemmungen führen kann, war die bessere Vergleichbarkeit mit Mais ein Grund für die Verwendung von aufkonzentrierter Algenbiomasse. Bis zu einem TS-Gehalt von 30% war die Algenbiomasse pumpfähig. Höhere TS-Gehalte führten zur Bildung einer pastösen Masse, die nur mit höherem mechanischem Aufwand resuspendiert werden konnte. Tabelle 4.1 zeigt die typische Nährstoffzusammensetzung der verwendeten Substrate. Für die Algenbiomasse (N. salina A und B) und für MS (MS A und B) sind zwei Analysen dargestellt, da diese Substrate von zwei verschiedenen Produzenten bezogen wurden. Bei der Algenbiomasse sind durch die unterschiedliche Produktion leichte Unterschiede im Rohfettgehalt, Rohaschegehalt und NfE-Gehalt erkennbar. Bei Probe A ist der Rohfettgehalt um 6 Prozentpunkte höher, Rohascheund NfE-Gehalt um 4 und 5 Prozentpunkte geringer als bei Probe B. Für Probe A konnte, im Gegensatz zu Probe B, ein geringer Faseranteil (2 Prozentpunkte) bestimmt werden. Die abweichende Nährstoffzusammensetzung beeinflusst das C/N-Verhältnis in den Proben. Für Probe A liegt das Verhältnis bei 6,5, für Probe B bei 12,2. Bei MS liegt der Fettgehalt in Probe B um 6 Prozentpunkte höher als in Probe A. Der NfE-Gehalt, der aus der Differenz aller bestimmten Parameter zusammengesetzt ist, liegt dementsprechend bei Probe A höher. Auch bei MS beeinflusst die Nährstoffzusammensetzung das C/N-Verhältnis. Bei Probe A ist das C/N-Verhältnis (32,6) deutlich geringer als bei Probe B (44,5).

52 44 4 Auswertung MS und CCM zeigen im Vergleich untereinander signifikante Unterschiede. Der TS-Gehalt von CCM ist ungefähr doppelt so hoch wie bei MS. CCM weist nur einen geringen Anteil an Fasern (4% TS) und Rohasche (2 % TS) auf. Diese liegen bei MS deutlich höher (21-22 % TS Fasern und 4% TS Rohasche). Durch die fehlenden Anteile von Blättern und Stängeln ergibt sich für CCM ein deutlich höherer Anteil an NfE (81% TS), wobei Stärke aus den Maiskörnern den größten Anteil ausmacht. Der Proteingehalt liegt bei CCM mit 10% leicht höher als bei MS (7-9%), wodurch das C/N-Verhältnis geringer ist (26,2) als bei MS. Das durchschnittliche C/N-Verhältnis für marine Mikroalgen liegt bei ungefähr 7,0 (Geider R. und La Roche J., 2002). Landpflanzen weisen hingegen ein durchschnittliches C/N-Verhältnis von 36 auf (Elser et al., 2000). Das optimale C/N-Verhältnis von Substraten beim anaeroben Abbau zu Biogas liegt in einem Bereich zwischen 15 und 30 (Weiland, 2010). Geringe C/N-Verhältnisse können zur erhöhten Freisetzung von Ammoniumstickstoff aus dem Proteinabbau führen (Yen und Brune, 2007). In Abhängigkeit von Temperatur und ph-wert dissoziiert das Ammonium zu Ammoniak. Letzteres kann zu Hemmungen der Biozönose führen. Andererseits verhindern auch zu hohe C/N-Verhältnisse einen optimalen Abbau des Substrats. Hinsichtlich des C/N-Verhältnisses sind weder die verwendete Algenbiomasse von N. salina, noch MS als optimal anzusehen. In diesem Fall kann die Kovergärung von mindestens zwei Substraten mit unterschiedlichen Eigenschaften zu einer Ausbalancierung des C/N-Verhältnisses und der Nährstoffzusammensetzung führen (Mata-Alvarez et al., 2011). Tabelle 4.1 Nährstoffzusammensetzung der verwendeten Substrate N. salina A N. salina B MS A MS B CCM TS % FM 31,8 26,5 34,5 30,7 64,2 ots % TS 92,0 90,2 95,7 95,8 98,3 Rohfett % TS 42,2 36,1 1,7 7,4 4,1 Rohprotein % TS 21,0 20,8 6,7 8,8 10,0 Rohfaser % TS 2,0 0,0 21,2 22,4 3,6 Rohasche % TS 6,0 9,8 4,4 4,2 1,7 NfE % TS 28,8 33,3 66,0 57,2 80,6 C/N Verhältnis - 6,5 12,2 32,6 44,5 26,2 Theoretische Biogasausbeute m 3 kg ots -1 0,97 0,92 0,57 0,60 0,74 CH 4 -Gehalt Vol.% 65,03 63,84 51,85 54,93 52,77 Theoretische CH 4 - Ausbeute m 3 kg ots -1 0,63 0,59 0,30 0,33 0,39 N. salina A. Nannochloropsis salina (Phytolutions), N.salina B. Nannochloropsis salina (BlueBiotech), MS A. Maissilage (Neurath), MS B. Maissilage (Bottrop) CCM. Corn-Cob-Mix (Neurath).

53 4 Auswertung 45 Im Vergleich zu den beiden Maissubstraten weisen die Proben der Algenbiomasse signifikante Unterschiede in der Nährstoffzusammensetzung auf. Der Rohascheanteil liegt aufgrund des hohen Salzgehaltes mit ca. 10% TS deutlich höher als beim Mais. Rohfasern konnten in der Algenbiomasse nicht, bzw. nur in geringen Anteilen, nachgewiesen werden. Lipid- und Proteingehalt sind in den Algenzellen deutlich höher konzentriert, wohingegen die NfE im Vergleich zum Mais eine untergeordnete Rolle spielen. Aus der Nährstoffzusammensetzung einzelner Substrate lässt sich die theoretische Biogasausbeute und Biogaszusammensetzung (siehe Tabelle 4.1) des jeweiligen Substrates berechnen (Verein deutscher Ingenieure, 2004). Hierzu dienen durchschnittliche Biogasausbeuten und Methangehalte der einzelnen Substratbestandteile (siehe Abschnitt 2.1.1) unter der Annahme, dass diese vollständig und ohne Verluste durch den Aufbau von Biomasse zu Biogas umgesetzt werden. Von den untersuchten Substraten zeigt die Algenbiomasse das größte Biogasbildungspotential (0,92-0,97 m 3 kg ots -1 ) mit dem höchsten Methananteil im Biogas (64-65 Vol.%). Für MS und CCM liegen die theoretische Biogasausbeute (0,6 und 0,7 m 3 kg ots -1 ) und der Methangehalt (52-55 und 53 Vol.%) deutlich unter den Werten der Algenbiomasse. Daraus ergibt sich für die Algenbiomasse eine um den Faktor 2 und Faktor 1,6 größere theoretische Methanausbeute als für MS und CCM. Diese resultiert aus dem höheren Methanbildungspotential von Proteinen und Lipiden, die die Hauptbestandteile der Algenbiomasse darstellen. Das reelle Methanbildungspotential von Energiepflanzen ist durch den Aufbau der pflanzlichen Zellwände limitiert. Die Einlagerung von Lignin in das Gerüst aus kristalliner Cellulose und Hemicellulose stellt eine physikalische Barriere für die enzymatische Hydrolyse dar (Chang und Holtzapple, 2000). Aus diesem Grund wird Cellulose in Biogasanlagen nur zu 80% abgebaut (Ress et al., 1998). Für die Algenbiomasse liegt analog zur Lignifizierung bei terrestrischen Pflanzen eine schwer abbaubare Fraktion vor. Bei der Teilung der Zellen werden die Autosporen aus den Zellwänden der Mutterzellen abgegeben (Burczyk et al., 1999). Dadurch kommt es zu einer Akkumulation von Mutterzellwänden im Medium, die auch als rigide Zellwände bezeichnet werden (Burczyk et al., 1999). Diese Algaenan enthaltenen Strukturen gelten als Hauptbestandteile von Kerogen, welches als global größte unlösliche Kohlenstoffquelle gilt (Gelin et al., 1997) Anorganische Zusammensetzung Neben abweichenden Mengen an anorganischen Bestandteilen, konnten auch qualitative Unterschiede im Vergleich von Algenbiomasse und Mais beobachtet werden. Tabelle 4.2 zeigt die Konzentrationen der für die Biogasbildung relevanten SE (siehe Abschnitt 2.2.6) in zwei verschiedenen Proben der Algenbiomasse (N. salina A und B), zwei verschiedenen Proben von MS (MS A und B) und CCM (vgl. Abschnitt 4.1.1). Die beiden Proben der Algenbiomasse weisen deutliche Unterschiede in der anorganischen Zusammensetzung auf. Probe A (Phytolutions) enthält höhere Mengen aller relevanten SE. Molybdän und Selen liegen in beiden Proben unterhalb der Nachweisgrenze. Probe B (BlueBiotech) enthält kein oder nur geringe Mengen an Nickel.

54 46 4 Auswertung Die Unterschiede zwischen den beiden Maisilageproben sind deutlich geringer als zwischen den Proben der Algenbiomasse. Probe A (Neurath) enthält weniger Natrium und Zink und kein Molybdän und Nickel. In Probe B (Bottrop) konnten geringe Mengen an Nickel und Molybdän nachgewiesen werden. Selen und Kobalt ist in beiden Proben nicht enthalten. CCM weist von allen untersuchten Proben die geringsten Spurenelementkonzentrationen auf. Kobalt, Molybdän und Nickel konnten zudem nicht nachgewiesen werden. Mais gilt hinsichtlich der Aufnahme von SE und Natrium als sogenannter Exkluder (Bergmann et al., 2006; Drew und Läuchli, 1985). Dies bedeutet, dass der Gehalt an Schwermetallen in der Pflanze durch verschiedene Mechanismen geringer gehalten wird als die Konzentration im Boden. Dennoch scheint auch der Standort und die dort vorliegenden Gehalte an Schwermetallen im Boden die Aufnahme von Schwermetallen und Natrium zu beeinflussen. Dadurch konnten in Probe B (Bottrop) Molybdän und Nickel nachgewiesen werden. Neben Kobalt, welches als das limitierenste SE in der Monovergärung von MS gilt, sind Molydbän und Nickel essentiell für den anaeroben Abbau der Methanbildung (Lebuhn et al., 2008). Kobalt konnte allerdings in keiner der Maisproben nachgewiesen werden. Tabelle 4.2 Konzentrationen relevanter Spurenelemente (in mg kg TS -1 ) in den verwendeten Substraten N. salina A N. salina B MS A MS B CCM Na , ,87 60,00 289,58 50,00 Co 4,07 0,98 n.n. n.n. n.n. Cu 277,38 2,34 4,13 2,90 2,60 Fe ,02 224,11 147,00 111,40 46,00 Mn 672,13 49,06 20,90 25,70 6,11 Mo n.n. n.n. n.n. 0,33 n.n. Ni 8,59 n.n. n.n. 0,36 n.n. Se n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. Zn 452,46 34,11 16,40 40,39 16,10 n.n. (nicht nachweisbar) = unter der Nachweisgrenze. N. salina A. Nannochloropsis salina (Phytolutions), N.salina B. Nannochloropsis salina (BlueBiotech), MS A. Maissilage (Neurath), MS B. Maissilage (Bottrop) CCM. Corn-Cob-Mix (Neurath).

55 4 Auswertung 47 Im Vergleich zu MS und CCM enthalten beide Proben der Algenbiomasse höhere Mengen an SE. Besonders der Natriumgehalt ist mehr als hundertfach höher, da N. salina in einem marinen Nährsalzmedium produziert wird. Mikroalgen können hohe Mengen an Schwermetallen aufnehmen und in den Zellen akkumulieren (Ajayan et al., 2011). Die Konzentration der Schwermetalle in den Algenzellen ist demnach stärker abhängig von der Zusammensetzung des Nährmediums. Tabelle 4.3 zeigt, dass höhere Anteile der SE nach der Ernte durch Zentrifugation in der Algenbiomasse als im Zentrifugat vorliegen. Eine Ausnahme bildet Molybdän, welches im Zentrifugat nachgewiesen werden konnte, aber in der Biomasse nicht vorliegt. Die Mengen, die durch das frische Medium in die Algenproduktion eingebracht werden, sind deutlich höher als die Mengen, die nach der Ernte im Zentrifugat und in der Biomasse bestimmt werden konnten. Durch die semi-kontinuierliche Betriebsweise in der Algenproduktion wird immer nur ein Teil der Algensuspension der Ernte zugeführt und die entfernte Menge durch frisches Medium ausgeglichen. Dadurch werden die hoch konzentrierten Mengen an SE im frischen Medium in dem Gesamtvolumen der Algensuspension verdünnt. Tabelle 4.3 Vergleich der Spurenelementkonzentrationen (in mg kg TS -1 ) von frischem Medium und den Trennphasen nach der Ernte (Zentrifugat und N. salina Biomasse) Medium frisch Zentrifugat N. salina Na ,83 345, ,48 Co 28,29 0,60 0,75 Cu 29,52 0,56 12,21 Fe 7.134,07 51,59 408,96 Mn 688,81 2,98 121,49 Mo 29,52 1,23 n.n. Ni 1,48 n.n. n.n. Se n.n. n.n. n.n. Zn 578,11 2,14 163,88 n.n. (nicht nachweisbar) = unter der Nachweisgrenze.

56 48 4 Auswertung Abbildung 4.1 Lineare Korrelation von Trockensubstanzgehalt und Leitfähigkeit und Trockensubstanzgehalt und organischem Trockensubstanzgehalt. Dennoch sind die Mengen an SE und Natrium in der Algenbiomasse sehr variabel (vgl. Tabelle 4.2 N. salina A und B) und hängen vom TS-Gehalt bzw. Wassergehalt, auf den die Algenbiomasse konzentriert wird, ab. In Abbildung 4.1 sind Korrelationen von TS-Gehalt und Leitfähigkeit sowie TS-Gehalt und ots-gehalt dargestellt. Mit zunehmendem TS-Gehalt nimmt die Leitfähigkeit, die größtenteils durch den Natriumgehalt bestimmt wird, deutlich ab. Gleichermaßen nimmt der ots- Gehalt mit steigendem TS-Gehalt der Algenbiomasse zu, so dass weniger SE und Natrium in höher konzentrierten Proben vorliegen. Die Untersuchungen der SE in der Algenbiomasse zeigen, dass die Algenbiomasse potentiell durch die gezielte Zugabe von SE bei der Produktion und die geeignete Einstellung des TS-Gehalts bei der Ernte dem Bedarf an SE bei der anaeroben Vergärung angepasst werden könnte. Hierzu sind aber weitere Untersuchungen hinsichtlich der optimalen Zugabemengen und Wiederfindungsraten in der Biomasse notwendig. 4.2 Batchversuche Batchversuche dienen der Untersuchung eines Substrates oder Substratgemisches hinsichtlich des zu erwartenden Biogasertrags und der Abbaubarkeit. Batchversuche lassen qualitative Aussagen

57 4 Auswertung 49 über die Abbaugeschwindigkeit und potentielle Hemmwirkungen des zu untersuchenden Substrates zu (Verein deutscher Ingenieure, 2006). Im Folgenden werden Untersuchungen aus Batchversuchen dargestellt, die der Beurteilung von Biomasse der marinen Mikroalge N. salina dienen. Neben einer Beurteilung des experimentellen Biogasertrages im Vergleich zum bereits dargestellten theoretischen Biogasertrag des Substrats, dienen die Untersuchungen auch der Beurteilung von aus der Literatur bekannten Limitierungsfaktoren, die die anaerobe Vergärung von Mikroalgen beeinflussen können. Diese sind der hohe Salzgehalt bei der Verwendung von marinen Algen, erhöhte Ammoniumfreisetzung aus dem Proteinabbau und die Limitierung der Hydrolyse aufgrund eines robusten Zellwandaufbaus der Mikroalgen (Sialve et al., 2009) Einfluss des Salzgehaltes Bei der Produktion von Mikroalgen liegen die Algenzellen in einer Suspension mit dem verwendeten Nährsalzmedium vor. Um allen Zellen eine gleichmäßige Versorgung mit Lichtquanten zur Durchführung von Fotosynthesereaktionen zu ermöglichen, werden die Zellen bei einer Konzentration von 2-3 g Zellen L -1 geerntet. Dies entspricht in Abhängigkeit der Konzentrationen an Nährsalzen und SE im Nährsalzmedium einem TS-Gehalt von 4% mit einem ots-gehalt von 12% TS. Zum einen ist die organische Fracht dieser Suspension bei der Verwendung als Substrat für die Biogasproduktion sehr gering und zum anderen kann der hohe Salzgehalt in der Suspension zu Hemmungen der anaeroben Biozönose führen. Im Rahmen dieser Versuchsreihe wurden die Algen vom Produzenten (Phytolutions) mit einer Zentrifuge auf einen TS-Gehalt von 29,1% mit einem ots-gehalt von 92,3% TS konzentriert. Die Abscheidung des Nährsalzmediums gilt aufgrund des hohen Energieverbrauchs als einer der größten Engpässe bei der industriellen Verwendung von Mikroalgen (Uduman et al., 2010). Demnach muss ein Kompromiss aus Erhöhung des Energiegehaltes der Biomasse und Energieeintrag durch die Abscheidung des Nährsalzmediums eingestellt werden. In der vorliegenden Versuchsreihe wurde die aufkonzentrierte Algenbiomasse mit dem bei der Ernte erhaltenen Zentrifugat stufenweise verdünnt, um den TS-Gehalt der Algensuspension zu bestimmen, bei dem eine Hemmung der Biogasproduktion zu erwarten ist. Ausgehend von der aufkonzentrierten Algenbiomasse mit einem TS-Gehalt von 29,15% FM (Ansatz 1), die noch eine pumpfähige Konsistenz aufwies, wurden sechs Verdünnungen der Algenbiomasse (Ansätze 2-7) bis zu einem geringen TS-Gehalt von ca. 1% FM untersucht. Die Referenzprobe (IS) enthielt kein Substrat. Als Parameter für die Bestimmung des Salzgehaltes in den Ansätzen wurde die Leitfähigkeit untersucht. Die TS-Gehalte der Algensuspension und die Leitfähigkeit der untersuchten Ansätze sind in Tabelle 4.4 dargestellt. Als Inoculum wurde in dieser Versuchsreihe Fermenterinhalt aus der landwirtschaftlichen Biogasanlage Neurath (Grevenbroich) verwendet, der für 14 Tage bei 38 C preinkubiert wurde. Die durchschnittliche Versuchstemperatur über den gesamten Versuchszeitraum betrug 37,7±2,5 C.

58 50 4 Auswertung Tabelle 4.4 TS-Gehalt des Substrats, Leitfähigkeit und Biogasausbeute der Ansätze zur Untersuchung des Salzgehalteinflusses IS TS % FM 0,00 29,15 24,76 16,77 7,64 4,21 2,26 1,17 Zentrifugat g 0,00 0,00 1,91 7,90 30,01 63,34 127,00 254,02 LF ms cm -1 8,50 9,00 9,03 9,60 11,03 14,40 19,07 39,60 Biogasausbeute m 3 kg ots -1 0,17 0,38 0,35 0,39 0,41 0,33 0,32 0,12 Stabw m 3 kg ots -1 ±0,01 ±0,03 ±0,01 ±0,01 ±0,00 ±0,01 ±0,02 ±0,01 Stabw = Standardabweichung, IS = Impfschlamm Die Leitfähigkeit der Mischung bis zu einem TS-Gehalt im Substrat von 7,64% verändert sich nur geringfügig von 9,00 auf 11,03 ms cm -1. Mit sinkenden TS-Gehalten im Substrat erhöht sich die Leitfähigkeit deutlich bis auf 39,60 ms cm -1 bei einem TS-Gehalt von 1,17%. Dieser Effekt ergibt sich teils aus der Abhängigkeit der Leitfähigkeit vom TS-Gehalt der Algenbiomasse (siehe Abbildung 4.1) und aus der signifikant steigenden Menge an Zentrifugat zur Verdünnung der Algenbiomasse (siehe Tabelle 4.4). In Abbildung 4.2 ist der Verlauf der entstandenen Biogasmenge der Ansätze zur Untersuchung des Salzgehalteinflusses dargestellt. Aus der Dreifachbestimmung der Batchansätze wurde gemäß Gleichung 3.6 die entstandene Biogasmenge aus dem Substrat berechnet, indem das produzierte Biogasvolumen aus der Referenzprobe (nur das Inoculum) subtrahiert wurde. Ansatz 1 (Algenbiomasse ohne weitere Verdünnung mit Zentrifugat) zeigte über den Versuchszeitraum von 44 Tagen einen ungehemmten Verlauf der Biogasproduktion mit linearem Anstieg in den ersten fünf Versuchstagen und dem Erreichen einer Sättigung im weiteren Versuchsverlauf. Die Proben 2 (TS 24,76%), 3 (TS 16,77%) und 4 (TS 7,64%) wiesen einen ähnlichen Verlauf auf wie Probe 1. Bei Probe 4 hielt die lineare Zunahme der Biogasproduktion in der Anfangsphase am längsten an. Zum Ende der Versuchsreihe konnte ein weiterer leichter Anstieg des Biogasvolumens beobachtet werden. Die Proben 5 (TS 4,21%) und 6 (TS 2,26%) wiesen nach dem linearen Anstieg der Biogasproduktion eine leichte Verzögerung in der Zunahme des entstandenen Biogasvolumens auf, wodurch das entstandene Biogasvolumen insgesamt geringer ausfiel als das Biogasvolumen der ersten vier Proben. Verzögerte Kurvenverläufe können auf eine leichte Hemmung der Biogasbildung hindeuten (Verein deutscher Ingenieure, 2006).

59 4 Auswertung 51 Abbildung 4.2 Verlauf der Biogasproduktion aus dem Substrat zur Untersuchung des Salzgehalteinflusses auf die anaerobe Vergärung Eine deutlich Hemmung der Biogasproduktion konnte bei Probe 7 (TS 1,17%) beobachtet werden. Der lineare Anstieg der Biogasproduktion fiel deutlich geringer aus als bei den übrigen Proben. Nach acht Tagen nahm das entstandene Biogasvolumen aus dem Substrat ab. Diese Abnahme wird durch die Darstellungsweise, in der die ungehemmte Biogasproduktion aus dem Inoculum von der Gesamtmenge an entstandenem Biogas subtrahiert wurde, ermöglicht. In diesem Ansatz konnte ein signifikanter Einfluss des Salzgehaltes auf die Biogasproduktion nachgewiesen werden. Die zu Beginn produzierte Biogasmenge stammt aus der anfänglichen Hydrolyse des Substrates, bei der unter anderem CO 2, NH 3 und H 2 S aus dem Substrat freigesetzt werden. Generell sind die Bakterien der Hydrolyse- und Acidogenesestufe weniger anfällig für veränderte Prozessbedingungen als die Mikroorganismen der nachfolgenden Stufen (Weiland, 2010). Dadurch akkumulieren die FOS und resultieren in einer zunehmenden Hemmung der Acetogenese und Methanbildung. In den einzelnen Ansätzen der Batchversuche können die Substratmengen leicht variieren. Um diesen Einfluss beim Vergleich der entstandenen Biogasmengen zu eliminieren, wurde das entstandene Biogasvolumen durch die eingesetzte Menge an Organik dividiert. Die dadurch erhaltenen Biogasausbeuten sind der Tabelle 4.4 zu entnehmen. Bis zu einer Leitfähigkeit von 11 ms cm -1 (Ansatz 4) in den Ansätzen konnte ein positiver Einfluss durch den höheren Salzgehalt auf die anaerobe Vergärung beobachtet werden. Das Optimum, welches in dieser Versuchsreihe bestimmt wurde, lag bei 0,41 m 3 kg ots -1. Mit steigender Leitfähigkeit in den Ansätzen konnte ein negativer Trend hinsichtlich der Biogasausbeute beobachtet werden. Dies bedeutet, dass unter

60 52 4 Auswertung Batchbedingungen die Algenbiomasse von N. salina mindestens einen TS-Gehalt von 7% aufweisen sollte, um Hemmungen durch in die Vergärung eingebrachte Salze zu verhindern. Unkonzentrierte Algenbiomasse mit Erntekonzentrationen zwischen 2-3 g Zellen L -1 können auf Basis dieser Daten nicht verwendet werden, da Hemmungen der Biogasbildung zu erwarten sind. Die in dieser Versuchsreihe erhaltenen Grenzen der Substratkonzentration können nicht ohne weiteres auf kontinuierliche Bedingungen übertragen werden. Unter diesen Bedingungen wird ein potentieller Hemmstoff kontinuierlich in den Prozess eingebracht. Durch den Abbau der organischen Bestandteile im Substrat werden anorganische Bestandteile im Fermenter aufkonzentriert und akkumulieren. Dies kann zu anderen Grenzwerten führen, die unter kontinuierlichen Bedingungen untersucht werden müssen. Andererseits kann auch eine Adaption der Biozönose an hohe Salzkonzentrationen oder antagonistische und synergistische Effekte von verschiedenen Ionen die tatsächlichen Hemmkonzentrationen beeinflussen. In einem Review von Chen et al. (2008) werden beispielsweise von Nartiumkonzentrationen zwischen 5,6 und 53,0 g L -1 berichtet, die eine 50%ige Hemmwirkung auf die Aktivität der Biozönose ausüben können. Im vorliegenden Versuch lag die höchste Natriumkonzentration im Ansatz 7 bei 93,8 g kg FM -1 (unter der Annahme, dass die Dichte von Fermenterinhalt ca. 1 kg L -1 beträgt, entspricht die Bezugsgröße kg FM einem Liter). In Ansatz 6 lag die Natriumkonzentration bei 63,4 g kg FM -1. Allerdings konnte in diesem Ansatz nur eine leichte Hemmung beobachtet werden, so dass der absolute Vergleich von Hemmkonzentrationen aus anderen Forschungsarbeiten aufgrund der oben genannten Effekte mit Vorsicht zu betrachten ist. Im Vergleich zur theoretischen Biogasausbeute von 0,97 m 3 kg ots -1, die aus der chemischen Zusammensetzung von N. salina Biomasse (Phytolutions) berechnet wurde (vgl. Abschnitt 4.1.1), beträgt die experimentell bestimmte Biogasausbeute der Referenzprobe (0,38 m 3 kg ots -1 ) nur 39% der theoretischen Biogasausbeute. Der Verlauf der Biogasproduktion der Referenzprobe zeigte, wie auch in den Proben bis zu einer Leitfähigkeit von 11 ms cm -1, keine Hemmung der Biogasproduktion. Es ist aus diesem Grund ein Einfluss chemischer Parameter der Algenbiomasse auf den Prozessverlauf auszuschließen. In den Zellwänden von N. salina konnten 1-2% Algaenane (resistente Biomakromoleküle) nachgewiesen werden (Gelin et al., 1997). Diese Moleküle erschweren die enzymatische und chemische Hydrolyse der Algenzellen. Folglich scheint bei der anaeroben Vergärung von N. salina Biomasse bereits die Hydrolyse als geschwindigkeitslimitierende Prozessstufe vorzuliegen Einfluss physikalischer Vorbehandlung Bei den Untersuchungen zum Einfluss des Salzgehaltes auf die Vergärbarkeit von N. salina Biomasse wurde in der Monovergärung der Biomasse eine Biogasausbeute bestimmt, die nur 39% der theoretischen Biogasausbeute ausmachte. Es konnte im Versuchsverlauf keine Hemmung der Biogasproduktion beobachtet werden. Die Hydrolyse wurde daraus resultierend durch das Vorhandensein resistenter Biomakromoleküle (Algaenan) in den Algenzellwänden als geschwindigkeitslimitierender Schritt beim anaeroben Abbau der Biomasse identifiziert. Zur Überprüfung dieser These wurde in einer weiteren Versuchsreihe der Einfluss einer physikalischen Vorbehandlung der Algenbiomasse auf die Vergärbarkeit untersucht.

61 4 Auswertung 53 Einfluss verschiedener physikalischer Vorbehandlungsmethoden Aufgrund der Resistenz von Algaenanen gegen enzymatische und chemische Hydrolyse wurden verschiedene physikalische Vorbehandlungsmethoden hinsichtlich der Effektivität zur Zerstörung der Algenzellen durchgeführt. Im Rahmen der Vorbehandlung wurde der Einfluss von Einfrieren/Auftauen (TL), Ultraschall (US), Mikrowellen (MW), Thermolyse (TH) und Hochdruckhomogenisation mittels French Press (FP) durchgeführt. Diese Versuchsreihe wurde mit Algenbiomasse von Phytolutions GmbH (Bremen) durchgeführt, die einen TS-Gehalt von 34,9% FM und einen ots-gehalt von 94,5% TS aufwies. Das Inoculum stammte aus der landwirtschaftlichen Biogasanlage Neurath (Grevenbroich) und wurde vor der Versuchsreihe für 23 Tage bei 38 C gelagert. Die durchschnittliche Temperatur, bei der die Versuche durchgeführt wurden, lag bei 38,4±0,8 C Zur Überprüfung des Zellaufschlusses wurde nach der Vorbehandlung von jedem Ansatz eine verdünnte Probe mittels Zentrifugation pelletiert und die optische Dichte des Überstandes bei 280 nm bestimmt. Bei dieser Wellenlänge weisen die drei aromatischen Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin als Bestandteile von Proteinen ein Extinktionsmaximum auf. Die Vorbehandlung der Zellsuspension sollte zu einer Zerstörung der Zellen führen, wodurch lösliche organische Bestandteile (Proteine) aus den Zellen für eine Extinktionszunahme im Überstand der Proben sorgen. Die Extinktionswerte der einzelnen Proben sind in Abbildung 4.3 dargestellt. Bei der unbehandelten Probe (A) blieben die Zellen intakt, so dass gegenüber dem Blindwert (Leitungswasser) keine Extinktionszunahme zu beobachten war. In allen vorbehandelten Proben wurde eine Zunahme der Extinktion in der Reihenfolge TL<US<MW<TH<FP bestimmt. Im Anschluss an die Vorbehandlung wurden die aufgeschlossenen Proben im Vergleich zur unbehandelten Referenzprobe hinsichtlich des Biogasbildungspotentials untersucht. Abbildung 4.4 zeigt die Entwicklung der Biogasproduktion der verschiedenen Ansätze. Die Referenzprobe wies in dieser Versuchsreihe einen zweistufigen Abbau auf. Zwischen Tag 5 und 15 konnte eine leichte Verzögerung der Biogasbildung beobachtet werden, die vermutlich auf einen Substratwechsel zurückzuführen ist. Von der Referenzprobe wurde täglich die Gasqualität bestimmt (Daten nicht gezeigt). Am 9. Versuchstag wies der Schwefelwasserstoffanteil im Biogas der Referenzprode das Maximum dieser Versuchsreihe auf. Bei der Hydrolyse von Proteinen wird die Sulfidgruppe aus den schwefelhaltigen Aminosäuren Cystein und Methioin als Schwefelwasserstoff freigesetzt. Im weiteren Verlauf wurden vermehrt andere Substratbestandteile, vermutlich Lipide, die auch in hohen Mengen in den Algen vorliegen und häufig geringere Hydrolysekonstanten aufweisen als Proteine, abgebaut.

62 54 4 Auswertung Abbildung 4.3 Messung der optischen Dichte vorbehandelter Algenbiomasse bei 280 nm Abbildung 4.4 Verlauf der Biogasproduktion aus physikalisch vorbehandelter Algenbiomasse

63 4 Auswertung 55 Die vorbehandelten Proben TL und US zeigten einen der Referenzprobe ähnlichen Verlauf der Biogasentwicklung. Die Gasproduktion aus dem vorbehandelten Substrat war in diesen Ansätzen jedoch geringer als in der Referenzprobe. Die vorbehandelten Proben FP, MW und TH zeigten deutlich abweichende Verläufe. Neben einem fast verdoppelten Biogasvolumen in den Ansätzen konnte keine Verzögerung der Biogasproduktion beobachtet werden. MW und TH wiesen Sättigungskurven mit einem zunächst linearen Anstieg der Biogasbildung in den ersten 7 Tagen und das höchste Biogasvolumen dieser Versuchsreihe auf. Die vorbehandelte Probe FP zeigte den größten Anstieg des entstandenen Biogasvolumens in der Anfangsphase. Nach 10 Tagen konnte bis zum Ende der Versuchsreihe im weiteren Verlauf ein geringer, kontinuierlicher Anstieg beobachtet werden. Abbildung 4.5 Biogasausbeute und ots-abbaugrad nach physikalischer Vorbehandlung der Algenbiomasse Die Biogasausbeute der verschiedenen Ansätze ist in Abbildung 4.5 dargestellt. Wie bei der Darstellung des Verlaufs der entstandenen Biogasmenge ist die Reihenfolge der Ansätze TL (0,24 m 3 kg ots -1 ), US (0,28 m 3 kg ots -1 ), A (0,34 m 3 kg ots -1 ), FP (0,49 m 3 kg ots -1 ), MW (0,50 m 3 kg ots -1 ) und TH (0,56 m 3 kg ots -1 ). Durch die physikalische Vorbehandlung konnte die Biogasausbeute der Algenbiomasse im Vergleich zur unbehandelten Probe um maximal 64% gesteigert werden. Allerdings korreliert der Abbaugrad einzelner Ansätze nicht mit der

64 56 4 Auswertung Biogasausbeute. Die vorbehandelten Proben FP und MW wiesen einen höheren Abbaugrad, jedoch eine geringere Biogasausbeute auf als TH. Gleichermaßen waren Abbaugrad und Zellaufschluss bei den vorbehandelten Proben TL und US höher als bei der unbehandelten Referenzprobe. Diese wies aber eine höhere Biogasausbeute auf als die beiden vorbehandelten Proben. Nach der Vorbehandlung wurde keine erneute Bestimmung des ots-gehaltes vorgenommen. Die fehlenden Korrelationen zwischen Zellaufschluss, Abbaugrad und Biogasausbeute deuten auf einen Verlust von organischen Bestandteilen durch die Vorbehandlung hin. Die Vorbehandlung wurde in nicht gasdicht verschlossenen Probegefäßen durchgeführt. Durch thermische Vorbehandlung werden Lipide abgebaut, wobei aus langkettigen Fettsäuren flüchtige kurzkettige Fettsäuren entstehen können (Appels et al., 2010a; Saifuddin und Fazlili, 2009). Flüchtige Fettsäuren können durch thermische Vorbehandlung auch aus dem Abbau von Proteinen gebildet werden (Bougrier et al., 2008). Lipide und Proteine wurden als Hauptbestandteile der Algenzellen identifiziert. Insbesondere bei der Vorbehandlung durch Ultraschall und Hochdruckhomogenisation, aber auch beim Einfrieren können durch die Bildung und das Platzen von Kavitationsblasen lokal hohe Temperaturen (bis 5000 K) und Drücke (bis 500 bar) entstehen, die in einer Verflüchtigung von organischen Bestandteilen resultieren können (Kampen, 2005; Priego-Capote und Luque Castro, 2007). Bei der vorbehandelten Probe TH (100 C für 8 h) lag eine lineare Korrelation von Biogasausbeute und Abbaugrad vor. Der Abbaugrad nach der anaeroben Vergärung betrug 54%. Auch der in der Versuchsreihe bestimmte Biogasertrag lag deutlich unter dem theoretischen Biogasertrag (58%). Aus diesem Grund wurde in einer weiteren Versuchsreihe die Thermolyse hinsichtlich der optimalen Vorbehandlungsdauer und Vorbehandlungstemperatur untersucht. Einfluss der Thermolyse ( C) Anders als in der vorhergegangenen Versuchsreihe wurde der Aufschluss in gasdichten und druckbeständigen Gefäßen durchgeführt. Die Bestimmung des ots-gehalts der Proben wurde zusätzlich nach der Vorbehandlung durchgeführt, um potentielle Verluste an Organik durch die Vorbehandlung bestimmen zu können. Es wurde ein Temperaturbereich zwischen 80 C und 120 C gewählt. Temperaturen von über 140 C führten zu kritischen Drücken in den Probegefäßen. Für die Versuche wurde Algenbiomasse der Firma Phytolutions (Bremen) mit einem TS-Gehalt von 27,3% FM und einem ots-gehalt von 91,1% TS verwendet. Das Inoculum aus der landwirtschaftlichen Biogasanlage Neurath (Grevenbroich) wurde vor der Versuchsreihe für 17 Tage bei 38 C gelagert. Die durchschnittliche Versuchstemperatur lag bei 40,4±0,6 C. Die Biogasausbeuten und Abbaugrade der Ansätze dieser Versuchsreihe sind in Abbildung 4.6 dargestellt.

65 4 Auswertung 57 Abbildung 4.6 Biogasausbeute und ots-abbaugrad nach thermischer Vorbehandlung der Algenbiomasse Abweichend von der Versuchsreihe mit den verschiedenen physikalischen Vorbehandlungsmethoden wurde Fermenterinhalt vor der Nutzung als Inoculum gesiebt. Dies führte zusammen mit dem Substrat zu einer homogenen Mischung, zu der kein Leitungswasser zugefügt werden musste. Allerdings lag das Substrat/Inoculum-Verhältnis dadurch bei 0,16 statt bei 0,5 wie in der vorangegangenen Messreihe. Daraus resultierte ein verkürzter Versuchszeitraum von 33 statt 43 Tagen. Die Biogasausbeute in der unbehandelten Referenzprobe war geringer als in der vorangegangenen Versuchsreihe (0,30 statt 0,34 m 3 kg ots -1 ). Die Vorbehandlung bei 80 C für 4 Stunden hatte einen negativen Einfluss auf die anaerobe Abbaubarkeit des Substrats. Sowohl Biogasausbeute (-59%), als auch der Abbaugrad des Substrats (-26%) waren gegenüber der unbehandelten Referenzprobe reduziert. Die Vorbehandlung bei 100 C für 0,5 Stunden hatte nur einen geringen Einfluss auf Biogasausbeute (+4%) und Abbaugrad (+18%). Mit zunehmender Vorbehandlungsdauer bei 100 C stieg der Einfluss auf die anaerobe Abbaubarkeit des Substrats: bei 4 Stunden +30% bei der Biogasausbeute und +27% beim Abbaugrad und bei 8 Stunden +37% bei der Biogasausbeute und +41% beim Abbaugrad. Die Vorbehandlungsdauer von 2 Stunden bei 100 C zeigte abweichende Resultate bei der Abhängigkeit von der Vorbehandlungsdauer und der Biogasausbeute. In diesem Ansatz wurde ein größerer positiver Einfluss der Vorbehandlung auf die Biogasausbeute (+56%) und den Abbaugrad (+72%) bestimmt als in den übrigen Proben bei 100 C. Während der Vorbehandlung hat sich durch den steigenden Druck in den Probegefäßen der Deckel gelöst. Dies führte zu einer schlagartigen Entspannung des Drucks gegenüber der Umgebung und resultierte in einem Aufkochen der Probe. Der Ansatz mit Vorbehandlung für 4 Stunden bei 120 C zeigte im Rahmen dieser Versuchsreihe die höchste Biogasausbeute von 0,49 m 3 kg ots -1 (+65%). Die Dreifachbestimmung der Probe

66 58 4 Auswertung wies die größte Standardabweichung der Versuchsreihe auf. Die höheren Werte der Dreifachbestimmung sind dabei realistischer einzuschätzen, da geringere Werte durch Undichtigkeiten erklärt werden können. Die Probe mit der höchsten Biogasausbeute und dem höchsten Abbaugrad wies eine Verbesserung von 85%, bzw. 93% gegenüber der unbehandelten Referenzprobe auf. Basierend auf den dargestellten Daten liegt das Optimum hinsichtlich der Vorbehandlungstemperatur bei 120 C. Höhere Temperaturen führten zu einer Verklumpung der Algenzellen und Zelltrümmer. Die Bildung von Agglomeraten kann einen nachteiligen Effekt auf die Zugänglichkeit der organischen Bestandteile bei der Hydrolyse haben. Zudem bedeutet eine weitere Temperaturerhöhung auch einen höheren Energieverbrauch für die Vorbehandlung. Geringere Temperaturen als 100 C zeigten einen negativen Effekt auf die Abbaubarkeit des Substrats. Hinsichtlich der Vorbehandlungsdauer liegt das Optimum zwischen 2 und 4 Stunden. Eine weitere Erhöhung der Vorbehandlungsdauer zeigte keine signifikante Steigerung der Abbaubarkeit. Einfluss von Thermolyse und Druckausgleich Im Rahmen der vorangegangenen Versuchsreihe konnte ein positiver Einfluss auf die Abbaubarkeit durch schlagartiges Entspannen der Probe (Druckausgleich) beobachtet werden. Dieser Effekt wurde im Rahmen einer weiteren Versuchsreihe untersucht. In diesem Zusammenhang wurden verschiedene Methoden zur Überprüfung des Zellaufschlusses durchgeführt. Die Deckel der Probengefäße für die Vorbehandlung wurden durch gasdichte und passgenauer sitzende Deckel ersetzt, um ein unkontrolliertes Öffnen der Flaschen zu verhindern. Neben dem Einfluss des Druckausgleichs bei 100 und 120 C wurden zum Vergleich Ansätze bei 100 und 120 C mit einer Vorbehandlungsdauer von 2 und 8 Stunden untersucht. Aufgrund eines größeren Probenvolumens für die Vorbehandlung wurde die Vorbehandlungszeit um eine Aufheizzeit von 2 Stunden für 100 C und 2 Stunden und 20 Minuten für 120 C ergänzt. Bei mit Druckausgleich vorbehandelten Proben wurde nach Ablauf der jeweiligen Aufheizzeit ein Aufkochen durch schnelles Öffnen der Probengefäße ermöglicht. Die Versuchsreihe wurde mit Algenbiomasse der Firma BlueBioTech GmbH (Büsum), die einen TS-Gehalt von 29,3% FM und einen ots-gehalt von 89,8% TS aufwies, durchgeführt. Als Inoculum wurde Fermenterinhalt der zu dieser Versuchsreihe parallel laufenden semi-kontinuierlichen Monovergärung der Algenbiomasse verwendet. Das Inoculum wurde vor der Versuchsreihe für 11 Tage bei 38 C gelagert. Die durchschnittliche Versuchstemperatur betrug bei dieser Versuchsreihe 40,1±0,6 C. Abbildung 4.7 zeigt die Überprüfung des Zellaufschlusses hinsichtlich der Zellzahl und der OD bei 280 nm der Algensuspension nach der Vorbehandlung. Um einen Verlust an Organik durch die Vorbehandlung ausschließen zu können, wurde nach der Vorbehandlung eine TS und ots- Bestimmung der Proben durchgeführt. Zwischen den einzelnen Proben, im speziellen bei den Druckausgleichproben (DA), die durch Öffnen der Flaschen zum Überkochen gebracht wurden, konnten keine signifikanten Unterschiede beobachtet werden (Standardabweichung ±0,0024 g ots g FM -1 ). Bei der Darstellung der Zellzahl wurde dennoch die Anzahl der Zellen in

67 4 Auswertung 59 der Probe auf den TS-Gehalt bezogen, um die geringen Schwankungen im TS-Gehalt zu eliminieren. Grundsätzlich konnte sowohl ein Einfluss der Temperatur, als auch ein Einfluss der Vorbehandlungsdauer auf die Zellzahl in den vorbehandelten Proben nachgewiesen werden. Die Zellzahl verringerte sich in der bei 100 C für 2 Stunden vorbehandelten Probe im Vergleich zur unbehandelten Referenzprobe um 22%. Eine Erhöhung der Vorbehandlungsdauer bei gleicher Temperatur bewirkte eine Abnahme der Zellzahl um 38%. Für eine Vorbehandlungstemperatur von 120 C nahm die Zellzahl bei 2 Stunden Vorbehandlungsdauer um 33% und bei 8 Stunden um 60% ab. Bei den Proben, die mittels Druckausgleich vorbehandelt wurden, konnte keine Abnahme der Zellzahl beobachtet werden. Bei 100 C wurde eine Zunahme von 4% im Vergleich zur unbehandelten Referenzprobe bestimmt. Diese lag allerdings innerhalb der Standardabweichung der Dreifachbestimmung von der Referenzprobe. Bei 120 C wurde eine Zunahme von 33% bestimmt. Diese Probe wies gegenüber allen anderen Proben eine hohe Stanbdardabweichung auf. Eine Zunahme der Zellzahl durch die Vorbehandlung ist nicht möglich, so dass hier von einer Überschätzung der tatsächlichen Zellzahl ausgegangen wird. Die Zellen erschienen bei der lichtmikroskopischen Betrachtung kleiner als die unbehandelten Zellen. Daraus resultierend war wie bei der 100 C-Probe kein Einfluss der Vorbehandlung auf die Zellzahl zu beobachten. Abbildung 4.7 Zellzahl und optische Dichte (280 nm) der Algenbiomasse nach thermischer Vorbehandlung mit und ohne Druckausgleich (DA) Für die Bestimmung der OD bei 280 nm wurde eine verdünnte Probe nach der Vorbehandlung durch Zentrifugation pelletiert und der Überstand fotometrisch bei 280 nm gemessen. Anders als bei der Bestimmung der Zellzahl konnte in allen Proben ein signifikanter Einfluss der Vorbehandlung auf die Freisetzung von Substanzen aus den Zellen beobachtet werden. Die OD 280 nahm in allen Proben gegenüber der unbehandelten Referenzprobe um mehr als das 10-Fache zu.

68 60 4 Auswertung Die größte Zunahme der OD konnte für die Druckausgleichprobe bei 120 C (16-fache Zunahme) bestimmt werden. Unabhängig vom Zerstörungsgrad der Zellen wurden Bestandteile der Zellen durch die Vorbehandlung freigesetzt. Ähnliche Beobachtungen wurden durch González-Fernández et al. (2012) gezeigt. Die Thermolyse von Scenedesmus Biomasse bei 70 und 90 C wiesen gleiche Mengen freigesetzter Organik und Ammonium auf, obwohl im Gegensatz zur Vorbehandlung bei 90 C keine Zerstörung der Zellwände bei 70 C beobachtet werden konnte. Die freigesetzte Organik wurde durch Exopolymere erklärt, die durch die Vorbehandlung aus der Zellwand herausgelöst wurden. Die Ammoniumfreisetzung wurde durch den Abbau von Zellwandproteinen verursacht. Die geringen Vorbehandlungstemperaturen können bereits schwache Wasserstoffbrücken zwischen Cellulose und Hemicellulose gelöst haben und die Zellen dadurch durchlässiger gemacht haben (Laureano- Perez et al., 2005). Für die Bindungsstärke in den Zellstrukturen scheinen bestimmte Schwellenwerte hinsichtlich der Temperaturstabilität vorzuliegen (Kita et al., 2010). Analoge Beobachtungen wurden auch von Appels et al. (2010) beschrieben. Bei der thermischen Vorbehandlung von Belebtschlamm zwischen 70 und 90 C wurden freigesetzte organische Bestandteile (lösliche Kohlenhydrate und Proteine) durch die Zerstörung von chemischen Bindungen in den Zellwänden und Membranen erklärt. Die Solubilisierung der Kohlenhydrate wurde auf den Abbau der Zellwände und die Solubilisierung der Proteine auf die Freisetzung aus den Zellen zurückgeführt (Appels et al., 2010a). Für die Proben, die durch Druckausgleich aufgeschlossen wurden, bedeutet dies, dass durch das Herauslösen von Zellwandbestandteilen aus der resistenten Matrix intrazellulare Bestandteile freigesetzt wurden. Die Gesamtstruktur des Zellwandapparates blieb insgesamt aber intakt. Aus diesem Grund erschienen die Zellen bei lichtmikroskopischer Betrachtung weniger voluminös als die Zellen der Referenzprobe. Die Beobachtungen bei der Bestimmung der Zellzahl und der OD 280 Messung konnten durch die qualitative Bestimmung von Phospholipiden (Membranlipide) aus dem Überstand abzentrifugierter Proben bestätigt werden. Die Membranlipide wurden aus dem Überstand extrahiert und mittels Dünnschichtchromatographie aufgetrennt. Abbildung 4.8 zeigt die Dünnschichtchromatographie- Platte nach der Färbung mit CuSO 4. In der unbehandelten Referenzprobe und in der 100 C Druckausgleichs-Probe konnten keine Phospholipide nachgewiesen werden. Dies bestätigt, dass die Zellen in diesen Proben intakt sind. Die geringsten Mengen an Phospholipiden wurden in der 120 C Druckausgleichprobe bestimmt. Bei den übrigen Proben nimmt wie bei der Bestimmung der Zellzahl mit steigender Vorbehandlungstemperatur und dauer die Menge an freigesetzten Phospholipiden, erkannbar an der Zunahme der drei Phospholipidspots, zu. Diese Beobachtungen bestätigen die Ergebnisse aus der Bestimmung der Zellzahl. Durch die Zerstörung der Zellen werden sowohl die Zellwand, als auch die darunter liegende Zellmembran zerstört. Dadurch konnte mit steigendem Zellaufschluss auch eine Zunahme der Membranlipide beobachtet werden.

69 4 Auswertung 61 Abbildung 4.8 Nachweis von Phospholipiden der Algenbiomasse nach thermischer Vorbehandlung Zur visuellen Beurteilung des Einflusses der Thermolyse auf die Zellen von N. salina wurden transemissionsmikroskopische Aufnahmen von der unbehandelten Referenzprobe, der Druckausgleichsprobe bei 120 C und der für 2 Stunden bei 120 C vorbehandelten Probe durchgeführt. Diese sind in Abbildung 4.9 dargestellt. Abbildung 4.9 Transelektronenmikroskopische Aufnahmen jeweils einer Zelle von Nannochloropsis salina nach Druckausgleich bei 120 C (B) und thermischer Vorbehandlung für 2 Stunden bei 120 C (C) im Vergleich zur unbehandelten Referenzprobe (A). Ch = Chloroplast. N = Nukleus Unbehandelte Zellen wiesen einen Durchmesser von 3-4 µm auf. Chloroplast und Nukleus als Hauptbestandteile der Zellen und der trilaminare Zellwandaufbau konnten eindeutig identifiziert werden. Nach der Vorbehandlung mittels Druckausgleich waren die Zellen kleiner im Durchmesser. Alle Zellstrukturen waren desintegriert und nicht definierbar voneinander zu

70 62 4 Auswertung unterscheiden. Die Zellwand schien die Zellen weiterhin als intakte Barriere zu umgeben. Der Mechanismus der Vorbehandlung ist aus den Aufnahmen nicht klar zu erkennen. Es ist anzunehmen, dass durch das schlagartige Verdampfen von Wasser Zellbestandteile aus den Zellen gepresst werden. Die Zellstrukturen werden dabei aufgelöst, wobei die Zellwand weitestgehend intakt bleibt. Die geringen Mengen an freigesetzten Membranlipiden (vgl. Abbildung 4.8) zeigen, dass die Zellmembran beginnt sich aufzulösen, wodurch Bestandteile aus den Zellen in die Umgebung gelangen können. Bei der für 2 Stunden bei 120 C vorbehandelten Probe konnten signifikante Unterschiede zu der unbehandelten Referenzprobe und der Druckausgleich-Probe beobachtet werden. Alle Zellstrukturen waren aufgelöst, wodurch eine Zunahme des Zellumpfangs und eine Abnahme der Plastizität der Zellen ausgelöst wurden. Der Aufbau der Zellwand war ebenfalls deutlich verändert. Mikroalgen mit Algaenan-Einlagerungen in der Zellwand weisen einen membranähnlichen trilaminaren Zellwandaufbau auf (Allard und Templier, 2000). Mindestens zwei dieser Schichten waren zerstört und ohne Barrierefunktion gegen die Umwelt. Die exemplarisch dargestellte Zelle zeigt das letzte Stadium bevor die Zellwand vollständig aufbricht und der gesamte Zellinhalt freigesetzt wird. Dies konnte durch die TEM-Aufnahmen aufgrund der Präparation der Zellen nicht dargestellt werden. Durch die verschiedenen Methoden zur Überprüfung des Einflusses der Vorbehandlung konnten bereits signifikante Unterschiede zwischen den unterschiedlich vorbehandelten Proben untereinander und der Referenzprobe nachgewiesen werden. Im Anschluss an die Vorbehandlung wurde das Biogasbildungspotential der Proben im Vergleich zur unbehandelten Probe untersucht, um nachzuweisen, dass eine verbesserte Freisetzung der Zellbestandteile auch einen positiven Einfluss auf die anaerobe Abbaubarkeit der Biomasse aufweist. Die Versuchsreihe wurde über einen Zeitraum von 49 Tagen durchgeführt. In Abbildung 4.10 ist die Entwicklung der täglich entstandenen Biogasmenge über den Versuchszeitraum abgebildet. Die unbehandelte Referenzprobe wies den Verlauf einer Sättigungskurve auf, wobei mehr als 75% des entstandenen Biogases in den ersten 10 Tagen gebildet wurde. Die beiden Proben, die mittels Druckausgleich vorbehandelt wurden, verliefen parallel zueinander und wiesen einen zweistufigen Prozessverlauf auf. Nach einer Lag-Phase in den ersten zwei Versuchstagen, folgte eine lineare Zunahme des Biogasvolumens bis zum 10. Versuchstag. Zwischen dem 10. und dem 20. Versuchstag wurde kein Biogas aus dem Substrat gebildet. Ab dem 25. bis zum 40. Versuchstag folgte eine weitere weniger steile lineare Zunahme des Biogasvolumens in den Ansätzen, bis nach 49 Versuchstagen eine Sättigung erreicht wurde. Die bei 100 C für 2 Stunden vorbehandelte Probe wies einen ähnlichen Verlauf mit Lag-Phase zu Beginn und zweistufigem Prozessverlauf auf wie die Druckausgleichproben. Dabei war allerdings der Sattelpunkt weniger stark ausgeprägt und das insgesamt entstandene Biogasvolumen geringer. Die Proben 100 C 8 Stunden und 120 C 2 Stunden verliefen parallel, wobei die 120 C Probe bis zum Versuchsende leicht oberhalb der 100 C Probe lag. Beide Proben begannen mit einem linearen Anstieg des Biogasvolumens bis zum 10. Versuchstag. Bis zum 22. Versuchstag konnte eine leichte Verzögerung der Biogasbildung beobachtet werden, die allerdings geringer ausfiel als bei der für 2 Stunden bei 100 C vorbehandelten Probe.

71 4 Auswertung 63 Abbildung 4.10 Verlauf der Biogasproduktion aus Algenbiomasse nach thermischer Vorbehandlung mit und ohne Druckausgleich Anders als die übrigen vorbehandelten Proben wies die für 8 Stunden bei 120 C vorbehandelte Probe keine Verzögerung der Biogasbildung auf. Die Probe verzeichnete den schnellsten, steilsten und am längsten andauernden linearen Anstieg des entstandenen Biogasvolumens. Die in dieser Versuchsreihe beobachteten Verläufe der Biogasproduktion scheinen mit der Menge an zerstörten Zellen zu korrelieren. Je mehr Zellen durch die Vorbehandlung zerstört wurden, desto geringer bildete sich die Verzögerung der Biogasbildung in dem zweistufigen Prozessverlauf aus. Bei der für 8 Stunden bei 120 C vorbehandelten Probe, bei der im Vergleich zur unbehandelten Probe 60% der Zellen zerstört wurden, war keine Verzögerung zu beobachten. Bei den Druckausgleichproben, bei denen gegenüber der Referenzprobe keine Zellabnahme beobachtet werden konnte, war der zweistufige Prozessverlauf besonders ausgeprägt. Die zwei Stufen, die in den vorbehandelten Proben vorliegen, scheinen sich auf unterschiedliche Fraktionen der Biomasse zurückführen zu lassen. Die abbaubare Biomasse in der unbehandelten Probe ist zu 75% nach 10 Tagen abgebaut. In allen vorbehandelten Proben wird dieser abbaubare Anteil durch die Vorbehandlung erhöht, da der Anstieg länger andauert. Im weiteren Verlauf des Versuchs findet in der Referenzprobe fast kein anaerober Abbau mehr statt. Aus diesen Beobachtungen lässt sich die Hypothese ableiten, dass intakte Zellen von N. salina, die in den Biogasprozess eingebracht werden, nicht bzw. sehr langsam von den hydrolytischen Enzymen abgebaut werden. Es werden lediglich beschädigte Zellen, organische Bestandteile aus dem Anzuchtmedium und Bestandteile der Zellwände abgebaut.

72 64 4 Auswertung Durch den Druckausgleich als Vorbehandlung werden zusätzlich zu der verfügbaren Organik, die auch in der Referenzprobe abgebaut wird, weitere abbaubare Bestandteile von oder aus den Zellen verfügbar gemacht. Zusätzlich werden die Zellen dadurch beschädigt, so dass der Zellabbau durch die hydrolytischen Enzyme stattfinden kann. Diese Hydrolyse ist aufgrund des komplexen Zellwandaufbaus und den daraus resultierenden wenigen Angriffspunkten langwierig und bedingt eine deutliche Verzögerung der Biogasbildung, nachdem die zunächst verfügbareren Bestandteile abgebaut sind. Bei der Vorbehandlung, bei der zusätzlich zerstörte Zellen hinzukommen, liegt mehr schneller hydrolysierbare Organik vor, so dass die Verzögerungen durch den Substratwechsel und die Hydrolyse mit Zunahme der zerstörten Zellen abnehmen. Zudem kommt in der Gesamtprobe der Abbau von organischen Bestandteilen aus dem Inoculum hinzu. In der Darstellungsweise der Entwicklung der Biogasbildung über den Versuchszeitraum ist die Biogasbildung des Inoculums von der gesamten entstandenen Biogasmenge subtrahiert. Aufgrund des geringen Energiegewinns unter anaeroben Bedingungen wird von den Mikroorganismen zunächst der Abbau von leichter hydrolysierbaren Substanzen bevorzugt. Im Vergleich zum aeroben Abbau von organischen Bestandteilen kann unter anaeroben Bedingungen durchschnittlich nur 15% der Energie gewonnen werden (Schink, 1997). Im Falle der Druckausgleichproben scheinen nach 10 Tagen größere Mengen an abbaubaren Bestandteilen im Inoculum vorzuliegen, die mit größerem Energiegewinn abgebaut werden können als durch das Substrat. Dadurch ist die Verzögerung der entstandenen Biogasmenge durch das Substrat größer als in den Proben, in denen eine größere Menge an aufgeschlossenen Zellen und dadurch größere Mengen leichter abbaubarer Organik vorliegen. Abbildung 4.11 Biogasausbeute nach 21 und 49 Tagen und ots-abbaugrad thermisch vorbehandelter Algenbiomasse mit oder ohne Druckausgleich.

73 4 Auswertung 65 Ein ähnlicher Verlauf wie bei der Entwicklung der Biogasproduktion konnte auch bei der Biogasausbeute beobachtet werden. Die Biogasbeute nach 21 und nach 49 Tagen und der Abbaugrad des Substrates sind in Abbildung 4.11 dargestellt. In der unbehandelten Probe waren nach 21 Tagen 84% der gesamten Biogasausbeute von 0,26 m 3 kg ots -1 erreicht. Das Inoculum wies nur eine geringe Biogasausbeute (0,11 m 3 kg ots -1 ) auf, wobei das Biogasvolumen über den gesamten Versuchszeitraum gleichmäßig zunahm und zum Ende der Versuchsreihe abflachte. Bei den vorbehandelten Proben konnte nach 21 Tagen eine Abhängigkeit von Vorbehandlungstemperatur und Vorbehandlungsdauer beobachtet werden. Mit steigender Temperatur und Vorbehandlungsdauer wurde eine Zunahme der Biogasausbeute bestimmt. Nach 2 Stunden Vorbehandlung bei 100 C waren 57% und nach 8 Stunden 64% der gesamten Biogasausbeute von 0,68 und 0,72 m 3 kg ots -1 erreicht. Für 120 C wurden nach 21 Tagen bei 2 Stunden Vorbehandlung 69% und bei 8 Stunden 86% der gesamten Biogasausbeute von 0,73 und 0,74 m 3 kg ots -1 bestimmt. Bei den Druckausgleichsproben waren nach 21 Tagen bei 100 C 60% und bei 120 C 57% der gesamten Biogasausbeute von 0,76 und 0,72 m 3 kg ots -1 erreicht. Die Unterschiede bei diesen Proben lagen im Rahmen der Standardabweichung. Zwischen der Biogasausbeute des Substrats und dem ots-abbau (nach 49 Tagen) konnte eine lineare Korrelation (R 2 = 0,96, Daten nicht gezeigt) festgestellt werden. Der Abbaugrad des Substrats lag zwischen 58 und 70%. Im Vergleich zur theoretischen Biogasausbeute der Algenbiomasse von 0,92 m 3 kg ots -1 wurden im Rahmen dieser Versuchsreihe zwischen 74 und 83% der theoretischen Biogasausbeute erreicht. Diese Werte korrelieren unter Einbeziehung der Biomassezunahme und einem Verbrauch von durchschnittlich 7% der Organik für die Biomassezunahme mit dem Abbaugrad des Substrats (Verein deutscher Ingenieure, 2004). Beim Methangehalt nach der Vergärung konnten keine signifikanten Unterschiede oder Abhängigkeiten von der Vorbehandlung beobachtet werden. Der Methangehalt lag zwischen 74 und 78 Vol.% (Daten nicht gezeigt). Hinsichtlich des theoretischen Methangehalts der Algenbiomasse von 64 Vol.% konnte eine deutliche Abweichung nach oben beobachtet werden. Diese Abweichung lässt sich darauf zurückführen, dass die Proben nach dem Versuch nicht angesäuert wurden, um das gelöste Kohlendioxid aus den Ansätzen auszutreiben. Bei hohen ph- Werten, die nach der Vergärung im Batch-Betrieb vorliegen können, verbleibt ein hoher Anteil an CO 2 im Gärrest gelöst (Verein deutscher Ingenieure, 2006). Fernandez-Gonzalez et al. (2012) untersuchten die anaerobe Abbaubarkeit und den Einfluss von thermischer Vorbehandlung bei der Mikroalge Scenedesmus sp.. Für diese Mikroalge konnte analog zu N. salina ein robuster Zellwandaufbau nachgewiesen werden (González-Fernández et al., 2012). Für die unbehandelte Probe wurde nach 33 Tagen ein Abbaugrad von 22% bei einer Methanausbeute von 0,12 m 3 CH 4 kg ots -1 bestimmt. Durch die Vorbehandlung bei 70 C wurde die Methanausbeute nur geringfügig auf 0,13 m 3 CH 4 kg ots -1 verbessert, obwohl durch die Vorbehandlung bei 70 C vergleichbare organische Anteile wie bei der Vorbehandlung bei 90 C solubilisiert wurden. Die Zellwand blieb dennoch als Barriere für den Abbau der intrazellulären Bestandteile bestehen. Durch die Vorbehandlung bei 90 C wurden die Methanausbeute auf 0,27 m 3 CH 4 kg ots -1 und der Abbaugrad auf 48% verdoppelt, da eine Zerstörung der Zellwände

74 66 4 Auswertung beobachtet werden konnte und auch intrazelluläre Bestandteile für den anaeroben Abbau verfügbar waren. Die Methanausbeute von Scenedesmus sp. (0,12 m 3 CH 4 kg ots -1 ) ist in den unbehandelten Proben im Vergleich zu N. salina (0,20 m 3 CH 4 kg ots -1 ) deutlich geringer. Scenedesmus Biomasse weist im Gegensatz zum Lipidanteil höhere Mengen an Kohlenhydraten und Proteinen auf (Richmond, 2007) S Die Methanausbeuten der aufgeschlossenen Proben sind schlecht vergleichbar, da die höheren Vorbehandlungstemperaturen von 100 und 120 C einen größeren Einfluss auf den Aufschlussgrad aufweisen. Für N. salina liegen die Methanausbeuten mit 0,51 bis 0,57 m 3 CH 4 kg ots -1 deutlich über der Methanausbeute von Scenedesmus. Keymer et al. (2013) untersuchten ebenfalls den Einfluss einer thermischen Vorbehandlung auf die Vergärbarkeit von Scenedesmus Biomasse. Die Zellen wurden mittels Hochdruck-Thermolyse bei 170 C und 800 kpa vorbehandelt. Gegenüber den Versuchen von Fernandez-Gonzalez et al. (2012) konnte die Methanausbeute auf 0,33 m 3 CH 4 kg ots -1 erhöht werden (Keymer et al., 2013). Trotz der hohen Vorbehandlungstemperatur lag die Methanausbeute deutlich geringer als für die vorbehandelte Biomasse von N. salina. Die Resistenz der Zellwand gegen die enzymatische Hydrolyse von N. salina wurde im Rahmen dieser Versuchsreihe als limitierender Faktor bei der anaeroben Vergärung identifiziert. Durch thermische Vorbehandlung konnte die Biogasausbeute im Vergleich zur unbehandelten Probe um das Dreifache gesteigert werden. Generell war dabei die Gesamtbiogasausbeute ab einer Vorbehandlungstemperatur von 100 C unabhängig von der Vorbehandlungsdauer und der Anzahl der zerstörten Zellen. Anders als die Biogasausbeute zeigte die Kinetik der Biogasproduktion signifikante Unterschiede in den einzelnen Proben. Mit steigender Behandlungstemperatur und - dauer und zunehmender Zellaufschlusseffizienz verlief der anaerobe Abbau schneller. Daraus folgt, dass die Temperaturen ab 100 C bei einer Mindestvorbehandlungszeit von 2 Stunden zwar nicht ausreichen, um alle Zellen der Probe zu zerstören, aber die Vorbehandlung durch das Herauslösen von organischen Bestandteilen aus den Zellwänden Angriffsflächen für die hydrolytischen Enzyme schaffen. Je höher der Zellaufschluss, desto schneller läuft die Hydrolyse der Algenzellen ab. Über die Erhöhung der Verweilzeit lässt sich aber auch bei geringerem Zellaufschluss ein gleichwertiger Abbaugrad erreichen. Im Vergleich zu anderen Studien, bei denen die Biogasausbeute von Mikroalgen nach physikalischer Vorbehandlung untersucht wurde, weist N. salina ein hohes Potential als Substrat für die Biogasproduktion auf. Die Methanausbeute liegt durch den höheren Lipidanteil in der Biomasse durchschnittlich fast doppelt so hoch wie beispielsweise Scenedesmus. Trotz der durch die Vorbehandlung hohen Biogasausbeute der Algenbiomasse wird im Vergleich zur theoretischen Biogasausbeute und bei Betrachtung des Abbaugrades nicht die gesamte Biomasse zu Biogas umgesetzt. Aus diesem Grund soll in einer abschließenden Batchversuchsreihe der Einfluss des unbalancierten Nährstoffverhältnisses durch den hohen Proteingehalt in den Algenzellen untersucht werden.

75 4 Auswertung Kovergärung von Algenbiomasse Die Kovergärung von mindestens zwei verschiedenen Substraten dient der Anpassung einer ausgeglichenen Nährstoffzusammensetzung, insbesondere dem C/N-Verhältnis, und der Einstellung eines stabilen ph-bereichs (Mata-Alvarez, 2003). Dabei verbessern ausgewogene Mengen an Kohlenhydraten, Fetten und Proteinen den anaeroben Abbau zu Biogas (Nges et al., 2012). Hinsichtlich der chemischen Zusammensetzung der Algenbiomasse von N. salina konnte bereits gezeigt werden, dass der Protein- und Fettanteil der Algen sehr hoch und das C/N- Verhältnis in der Biomasse dadurch sehr gering sind (siehe Abschnitt 4.1.1). Andererseits konnten für Mais geringe Anteile an Proteinen und Fetten, aber sehr hohe Anteile an Kohlenhydraten bestimmt werden. Neben den komplementären Unterschieden in der organischen Zusammensetzung wurden auch deutlich abweichende qualitative und quantitative Unterschiede in der anorganischen Zusammensetzung beobachtet. Aufgrund der Einhaltung der oben genannten Kriterien für beiderseitige Vorteile in der Kovergärung wurden Kovergärungsversuche mit Algenbiomasse und Mais durchgeführt, um etwaige positive Effekte auf den anaeroben Abbau der Substrate in der Kovergärung nachzuweisen. Neben der Algenbiomasse wurden zwei verschiedene Maissilagen untersucht. Die im Folgenden verwendete Bezeichnung Maissilage (MS) bezieht sich auf eine Silage der ganzen Maispflanze. Der Corn-Cob-Mix (CCM) ist eine Silage, für die nur der Kolbenanteil der Maispflanze verwendet wird. Letztere Silage zeichnet sich im Vergleich zur Ganzpflanzensilage durch einen hohen Anteil an Kohlenhydraten (vornehmlich Stärke) aus den Maiskörnern und einen um den Faktor 2 höheren TS-Gehalt aus. Neben der Monovergärung der einzelnen Substrate, die als Referenz dienen, wurden vier verschiedene Mischungen der Algenbiomasse mit den Maissubstraten untersucht (2A/1MS, 1A/2MS, 1A/6MS, 1A/3CCM)). Die Bezeichnungen beziehen sich dabei auf die Mischung der Frischmasseanteile. Als Inoculum wurde bei dieser Versuchsreihe Fermenterinhalt aus der landwirtschaftlichen Biogasanlage Neurath (Grevenbroich) verwendet, der 7 Tage bei 38 C gelagert wurde. Die Algenbiomasse wurde durch die Firma Phytolutions GmbH (Bremen) mit einem TS-Gehalt von 31,85% FM und einem ots-gehalt von 92,0% TS zur Verfügung gestellt. MS (TS: 37,6% FM; ots: 96,3% TS) und CCM (TS: 62,4% FM; ots: 98,4% TS) stammten von der Biogasanlage Neurath. Die Versuchstemperatur lag durchschnittlich bei 38,2±1,1 C. Die Verläufe der Biogasproduktion (ohne Gasproduktion aus dem Inoculum) der einzelnen Proben über den Versuchszeitraum von 37 Tagen sind in Abbildung 4.12 dargestellt. Die Monovergärung der Algenbiomasse und alle untersuchten Mischungen wiesen einen typischen Verlauf mit einer Sättigungskurve auf. Das entstandene Biogasvolumen lag dabei in allen Mischungen mindestens doppelt so hoch wie in der Monovergärung der Algenbiomasse.

76 68 4 Auswertung Abbildung 4.12 Biogasverlauf der Mischungen von Algenbiomasse mit Maissilage oder Corn- Cob-Mix im Vergleich zu den einzelnen Monovergärungen Bei den Monovergärungen von MS und CCM konnte ab dem dritten bis zum achten Versuchstag eine Verzögerung der Biogasbildung beobachtet werden. Verzögerte Verläufe können auf eine leichte Hemmung der Biogasbildung zurückgeführt werden (Verein deutscher Ingenieure, 2006). Im weiteren Versuchsverlauf erreichten die beiden Proben eine mit den Verläufen der anderen Proben vergleichbare Sättigung. Abbildung 4.13 zeigt zusätzlich zur Biogasausbeute, dem Methangehalt und dem Abbaugrad des Substrats eine Kalkulation der Biogasausbeute, die aus den Beträgen der Monovergärungen bezogen auf den ots-anteil in der Probe berechnet wurde. Wie in den vorangegangenen Studien wies die Monovergärung der unbehandelten Algenbiomasse eine geringe Biogasausbeute (0,28 m 3 kg ots -1 ), einen geringen Abbaugrad (37%) und einen hohen Methangehalt (78 Vol.%) auf. Bei den Monovergärungen von MS und CCM wurden die höchsten Abbaugrade dieser Versuchsreihe bestimmt. Bei MS wurden 82% und bei CCM 87% des Substrats umgesetzt. Anders als beim Methangehalt (MS: 63 Vol.%; CCM: 67 Vol.%) lag die Biogasausbeute bei MS (0,60 m 3 kg ots -1 ) höher als bei CCM (0,56 m 3 kg ots -1 ).

77 4 Auswertung 69 Abbildung 4.13 Biogasausbeute, kalkulierte Biogasausbeute, Abbaugrad und Methangehalt der Mischungen von Algenbiomasse mit Maissilage oder Corn-Cob-Mix im Vergleich zu den einzelnen Monovergärungen Für die Mischungen mit MS konnte aufgrund der geringen Biogasausbeute und dem geringen Abbaugrad der Alge eine Zunahme der Biogasausbeute und des Abbaugrads mit sinkendem Anteil der Algenbiomasse beobachtet werden: 2A/1MS (0,44 m 3 kg ots -1 ; 55%), 1A/2MS (0,57 m 3 kg ots -1 ; 69%) und 1A/6MS (0,66 m 3 kg ots -1 ; 77%). Analog dazu nahm der Methangehalt in den Proben mit sinkendem Anteil an Algenbiomasse in den Proben ab (2A/1MS: 70 Vol.%; 1A/2MS: 66 Vol.%; 1A/6MS: 62 Vol.%). Die Mischung der Algenbiomasse mit CCM wies im Vergleich zur Mischung mit MS wie in der Monovergärung aufgrund des höheren Protein- und Stärkegehaltes eine geringere Biogasausbeute (0,61 m 3 kg ots -1 ), aber einen höheren Abbaugrad (83%) und Methangehalt (63 Vol.%) auf. Die Mischungen 1A/6MS und 1A/3CCM wiesen in dieser Versuchsreihe, trotz der geringen Biogasausbeute der Algenbiomasse in der Monovergärung eine höhere Biogasausbeute auf als die Monovergärungen der Maissilagen (1A/6MS: +9% gegenüber MS; 1A/3CCM: +7% gegenüber CCM). Zur Darstellung dieses Effektes der Kovergärung wurde die aus den Monovergärungen in den Mischungen zu erwartende Biogasausbeute anhand der Anteile des jeweiligen Substrats (auf ots-basis) in der Mischung berechnet. In allen Mischungen wurde die experimentell bestimmte Biogasausbeute durch diese Berechnung unterschätzt, wobei die Abweichung analog zur Biogasausbeute mit sinkendem Anteil der Alge zunimmt (2A/1MS: 9%; 1A/2MS: 11%; 1A/3CCM: 14%; 1A/6MS: 15%). Die Unterschiede in den chemischen Zusammensetzungen der verwendeten Substrate resultierten in deutlich abweichenden C/N-Verhältnissen. Die Algenbiomasse wies durch den erhöhten

78 70 4 Auswertung Proteingehalt im Vergleich zu MS (32,6) und CCM (26,2) ein geringes C/N-Verhältnis auf (6,5). Geringe C/N-Verhältnisse verhindern eine effiziente Umsetzung des Substrats und können durch die Freisetzung von Ammonium aus dem Proteinabbau zu einer Hemmung der Biogasbildung führen (Yen und Brune, 2007). Andererseits kann durch die Ammoniumfreisetzung die Pufferkapazität des Biogasprozesses verbessert und der ph stabilisiert werden (Gerardi, 2003). Hohe C/N-Verhältnisse können aufgrund eines Stickstoffmangels die effiziente Umsetzung des Substrats behindern (Nges et al., 2012). Für eine optimale Biogasproduktion wird ein C/N- Verhältnis im Substrat zwischen 15 und 30 postuliert (Weiland, 2010). Die in dieser Versuchsreihe verwendeten Mischungen von Mais und Algenbiomasse führten zu C/N-Verhältnissen, die sowohl innerhalb, als auch außerhalb des Optimalbereiches lagen: 2A/1MS (C/N: 9,1), 1A/2MS (C/N: 14,4), 1A/3CCM (C/N: 17,6) und 1A6MS (C/N: 21,2). In Abbildung 4.14 wurden die Biogasausbeute und der Abbaugrad gegen das C/N-Verhältnis in den Proben aufgetragen. Daraus wird ersichtlich, dass bezüglich der Biogasausbeute das Optimum bei einem C/N-Verhältnis um 21 und hinsichtlich des Abbaugrades um 26 liegt. Diese Ergebnisse decken sich mit Untersuchungen von Yen und Brune (2007), die die Kovergärung von Algenbiomasse mit geringem C/N-Verhältnis (5,3) mit Papierabfällen mit hohem C/N-Verhältnis (2.000) untersuchten. Hierbei wurde ein Optimalbereich für das C/N-Verhältnis zwischen 20 und 25 bestimmt (Yen und Brune, 2007). Bei der Kovergärung von Cyanobakterienbiomasse mit geringem C/N-Verhältnis (6) mit Maisstroh mit hohem C/N-Verhältnis (71) wurde ein optimales C/N-Verhältnis von 20 bestimmt (Zhong et al., 2012). Abbildung 4.14 Korrelation des C/N-Verhältnisses mit der Biogasausbeute und dem Abbaugrad der Mischungen von Algenbiomasse mit Maissilage oder Corn-Cob-Mix und den einzelnen Monovergärungen

79 4 Auswertung 71 Aus den Beobachtungen der vorliegenden Versuchsreihe kann der Schluss gezogen werden, dass die Kovergärung der Algenbiomasse mit MS einen positiven Einfluss auf die Prozessstabilität, Abbaubarkeit, Biogasausbeute und den Methangehalt aufweist. Für diese positiven Effekte kommen verschiedene Mechanismen und Wirkungsweisen in Frage. Die Verbesserung der Prozessstabilität in den Mischungen kann aus der Erhöhung der Pufferkapazität durch die Freisetzung von Ammonium stammen. Über die Bildung von Ammoniumbicarbonat wird die Löslichkeit von Kohlendioxid erhöht, welches flüchtige Fettsäuren neutralisieren kann und dadurch die Pufferkapazität verbessert (Gerardi, 2003). Aus Untersuchungen der Monovergärung von Mais ist bekannt, dass Hemmungen durch Spurenelementmangel auftreten können (Lebuhn et al., 2008). Insbesondere die Verfügbarkeit von Kobalt kann dabei als limitierender Faktor agieren. Kobalt wurde im Gegensatz zur Algenbiomasse in keinem der beiden Maissubstrate nachgewiesen, so dass die Verfügbarkeit von Kobalt in den Mischungen mit Algenbiomasse die Prozessstabilität positiv beeinflussen kann. Zudem kommt es durch die Kovergärung von Mais und Algenbiomasse zu einer Verbesserung der Nährstoffverteilung. In den Maissubstraten überwiegen die Anteile an Kohlenhydraten, wo hingegen in der Algenbiomasse hohe Lipid- und Proteinanteile vorliegen. Durch die Kovergärung werden die Anteile der einzelnen Substratbestandteile ausgeglichen, so dass diese effizienter umgesetzt werden. Welcher dieser Mechanismen oder ob ein Zusammenspiel dieser Faktoren für die positiven Effekte verantwortlich ist, konnte im Rahmen dieser Untersuchungen nicht geklärt werden. Allerdings verbessert und stabilisiert die Zugabe der Algenbiomasse den Abbau der Maissubstrate. Neben dieser Beobachtung scheint auch die Abbaubarkeit der Algenbiomasse durch die Kovergärung positiv beeinflusst zu werden. Im Rahmen dieser Versuchsreihe wurde der NH 4 -N-Gehalt von jeweils einer Probe der Dreifachbestimmung nach der anaeroben Batchvergärung bestimmt. Der NH 4 -N-Gehalt wurde in Abbildung 4.15 über dem C/N-Verhältnis in der Probe aufgetragen. Der Anteil an Ammonium aus der Inoculum-Referenzprobe wurde jeweils vom Gesamtgehalt subtrahiert. Aus dieser Abbildung ist eine Tendenz des Ammoniumgehalts in den Proben erkennbar. Mit steigendem C/N-Verhältnis in den Proben nimmt der Ammoniumgehalt konstant ab. Zusätzlich zu der experimentell bestimmten Freisetzung von Ammonium in den Mischungen wurde bezüglich des ots-anteils der einzelnen Substrate die zu erwartende Ammoniumfreisetzung aus den Monovergärungen berechnet. In allen Proben, inbesondere in den Mischungen 2A/1MS und 1A/6MS, wurde die Ammoniumfreisetzung durch diese Berechnung unterschätzt. Dies bedeutet, dass in den Mischungen mehr Proteine abgebaut werden als in den Monovergärungen. Durch die Erhöhung des C/N-Verhältnisses in der Kovergärung kann eine höhere Menge an Proteinen aus den Algen abgebaut werden als dies in der Algenmonovergäung der Fall ist.

80 72 4 Auswertung Abbildung 4.15 Korrelation des C/N-Verhältnisses mit dem Ammoniumgehalt der Mischungen von Algenbiomasse mit Maissilage oder Corn-Cob-Mix und den einzelnen Monovergärungen nach der Vergärung Durch die Kovergärung von Algenbiomasse und zwei verschiedenen Maissubstraten konnten im Rahmen dieser Versuchsreihe synergistische Effekte beobachtet werden. Die Prozessstabilität des Maisabbaus wurde durch die Alge signifikant verbessert. Gegenüber den Monovergärungen der Substrate wurde die Biogasausbeute in den Mischungen gesteigert. Hierbei konnte auch ein positiver Einfluss auf den Abbau der Algenbiomasse beobachtet werden. Dieser Einfluss wurde in einer weiteren Batchversuchreihe untersucht, bei der die Verhältnisse von Algenbiomasse zu MS verkleinert wurden (1A/6MS, 1A/10MS, 1A/20MS, 1A/50MS und 1A/100MS). Bei dieser Versuchsreihe wurde Fermenterinhalt der landwirtschaftlichen Biogasanlage Neurath (Grevenbroich) als Inoculum verwendet. Dieser wurde vor der Versuchsreihe für 14 Tage bei 38 C preinkubiert. Für die Versuchsreihe verwendete MS (TS: 37,8% FM; ots: 96,5% TS) stammte von der gleichen Biogasanlage wie das Inoculum. Die Algenbiomasse wurde durch die Firma Phytolutions GmbH (Bremen) mit einem TS-Gehalt von 33,2% FM und einem ots-gehalt von 89,9% TS zur Verfügung gestellt. Die durchschnittliche Versuchstemperatur betrug über die Versuchsdauer von 32 Tagen 39,0±1,2 C. Abbildung 4.16 zeigt die Biogasausbeute dieser Kovergärungsansätze im Vergleich zur Monovergärung der Algenbiomasse und MS.

81 4 Auswertung 73 Abbildung 4.16 Biogasausbeute und kalkulierte Biogasausbeute der Mischungen von Algenbiomasse und Maissilage und von den Monovergärungen der Substrate Anders als in der vorangegangenen Versuchsreihe konnte bei der Monovergärung von MS keine Verzögerung in der Biogasbildung beobachtet werden. Alle Verläufe wiesen einen normalen, ungehemmten Verlauf aus. Dementsprechend wiesen die Kovergärungsansätze im Vergleich zur Monovergärung der Maissilage keinerlei Unterschiede auf. Die Biogasausbeute lag zwischen 0,69 und 0,71 m 3 kg ots -1 mit Unterschieden die innerhalb der Standardabweichung der Ansätze lagen. Zusätzlich zur experimentell bestimmten Biogasausbeute wurde die aus den Monovergärungsansätzen zu erwartende Biogasausbeute auf Basis des ots-verhältnisses der Substrate kalkuliert. Auch hier wird deutlich, dass die kalkulierte Biogasausbeute in allen Ansätzen unterschätz wird. Mit sinkendem Anteil an Algenbiomasse in den Ansätzen sinkt auch die Unterschätzung der Biogasausbeute. Die höchste Abweichung wurde bei der Kovergärung 1A/6MS mit 6% bestimmt. Eine Reproduzierung der synergistischen Effekte durch die Kovergärung von Algenbiomasse und MS war im Rahmen von weiteren Batchversuchen nicht möglich, da die Beschaffenheit des Inoculums bei diesem Versuchsaufbau einen entscheidenden Einfluss auf die Kinetik der Biogasbildung nimmt. Allerdings konnte ein prozessstabilisierender Wirkmechanismus der Ammoniumfreisetzung aus dem Proteinabau durch die Verwendung eines Proteinstandards (BSA = bovine serum albumin) nachgewiesen werden. Als Inoculum wurde für diese Versuchsreihe eine Mischung des Fermenterinhalts der semi-kontinuierlichen Monovergärung von MS und der Kovergärung von Algenbiomasse und MS ohne Preinkubation verwendet. MS (TS: 28,2% FM; ots: 95,8% TS) stammte von der landwirtschaftlichen Biogasanlage Steinmann (Bottrop- Kirchhellen). Die Algenbiomasse wurde durch die Firma BlueBioTech (Büsum) mit einem TS- Gehalt von 23,8% FM und einem ots-gehalt von 85,5% TS bereit gestellt. Die durchschnittliche Versuchstemperatur über den Versuchszeitraum von 39 Tagen betrug 40,3±0,8 C. Abbildung 4.17 zeigt die Biogasausbeute dieser Versuchsreihe, bei der Inocumlum mit erhöhten Säurekonzentrationen verwendet wurde. Dieser Impfschlamm wies einen FOS/TAC-Wert von 1,41

82 74 4 Auswertung und einen ph von 6,76 auf. In der Darstellungsweise wurde das Biogasvolumen aus der Referenzprobe (nur Inoculum) vom Gesamtvolumen des entstandenen Biogases subtrahiert. Abbildung 4.17 Biogasausbeute der Mischungen von Algenbiomasse, einem Proteinstandard, Ammoniumchlorid oder einer Spurenelementmischung mit Maissilage Neben der Kovergärung von thermisch vorbehandelter Algenbiomasse mit MS (1A/6MS: Verhältnis 1/6 auf ots-basis), der Kovergärung von BSA mit MS (1BSA/6MS: Verhältnis 1/6 auf ots-basis), der Kovergärung von Ammoniumchlorid mit MS (MS/NH 4 Cl) und einer Spurenelementlösung (MS/SE) mit MS wurden thermisch vorbehandelte Algenbiomasse (A), MS und BSA in der Monovergärung untersucht. Alle Proben, in denen MS verwendet wurde, weisen eine negative Biogasausbeute auf. Durch die Hydrolyse und Säurebildung der leicht abbaubaren Organik in MS, die durch den niedrigen ph-wert im Inoculum im Gegensatz zur Acetogenese und Methanbildung begünstigt wurde, fand in diesen Proben durch die Hemmung der methanbildenden Stufe keine Methanbildung statt. Die negative Biogasausbeute kam dadurch zustande, dass die vorhandene Organik im Inoculum abgebaut werden konnte, da die methanbildende Biozönose ohne die zusätzliche Organik aus MS nicht gehemmt wurde. In den Kovergärungen von MS mit Algenbiomasse und BSA sind die Biogasausbeuten geringfügig höher als in den Proben mit NH 4 Cl und der SE-Lösung. In die Monovergärungen von Algenbiomasse und BSA konnte trotz der zusätzlichen Organik durch die Substrate eine stabile Biogasproduktion mit hoher Biogasausbeute (A: 0,66 m 3 kg ots -1 ; BSA: 0,60 m 3 kg ots -1 ) beobachtet werden. Dies deutet zum einen darauf hin, dass in diesen Substraten weniger schnell hydrolysierbare Organik vorliegt, die in einer raschen zusätzlichen Säurebildung resultiert, und dass die Abbauprodukte dieser Organik eine prozessstabilisierende Wirkung auf den Gesamtprozess ausüben. Im Falle von BSA wurde bewusst ein Substrat verwendet, dass ausschließlich aus einem einzelnen Protein besteht. Durch den Abbau von Proteinen, die im

83 4 Auswertung 75 Vergleich zu löslichen Kohlenhydraten langsame Hydrolyseraten aufweisen, wird Ammonium freigesetzt, welches einen positiven Einfluss auf die Pufferkapazität des Prozesses bewirkt (Gerardi, 2003; Pavlostathis und Giraldo Gomez, 1991). Dieser Mechanismus konnte durch die vorliegende Versuchsreihe für die Kovergärung von Algenbiomasse und MS nachgewiesen werden. Ob dies der alleinige Einflussparameter für die synergistischen Effekte ist oder zusätzlich auch essentielle SE eine Rolle spielen, konnte im Rahmen der Batchversuche nicht nachgewiesen werden. Die angesprochenen Einflussparameter sollen daher im Rahmen von semi-kontinuierlichen Langzeitversuchen aufgrund des geringeren Einflusses des Inoculums und besserer Analysemöglichkeiten näher untersucht werden Zusammenfassung der Ergebnisse der Batchversuche Im Rahmen von Batchversuchen wurde das Biogasbildungspotential der marinen Mikroalge N. salina untersucht. In jeder dieser Versuchsreihen wurde die Monovergärung der unbehandelten Algenbiomasse als Referenz mit untersucht. Im Mittel ergab sich bei diesen Studien eine Biogasausbeute von 0,31±0,05 m 3 kg ots -1, ein Methangehalt von 77,3±2,7 Vol.% und ein Abbaugrad von 32,6±4,5%. Im Vergleich zur theoretischen Biogasausbeute (0,92-0,97 m 3 kg ots - 1 ) wurden experimentell mit diesen Proben nur 32-34% des theoretischen Maximums erreicht. Dies korreliert mit dem experimentell bestimmten Abbaugrad, der ebenfalls in diesem Bereich lag. Der experimentell bestimmte Methangehalt lag im Vergleich zum theoretischen Methangehalt (63,8-65,0 Vol.%) deutlich höher. Die Proben wurden nach der Vergärung nicht angesäuert, so dass bei den Batchversuchen eine höhere Kohlendioxidlöslichkeit vorlag. Im Vergleich zu anderen unvorbehandelten Mikroalgen (0,29-0,59 m 3 kg ots -1 ) liegt die Biogasausbeute von N. salina im unteren Bereich (Mussgnug et al., 2010). Für jede Algenart besteht aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften wie Zellwandaufbau oder chemische Zusammensetzung die Notwendigkeit zur experimentellen Untersuchung des Biogasbildungspotentials und der Einflussfaktoren auf den anaeroben Abbau. Neben der prinzipiellen anaeroben Abbaubarkeit wurden wesentliche limitierende Faktoren des anaeroben Abbaus von Mikroalgen, die in der Literatur beschrieben wurden, bei N. salina untersucht. Im Rahmen der Batchversuche wurden der Einfluss des Salzgehaltes der marinen Alge, der Einfluss von physikalischen Vorbehandlungsmethoden auf den robusten Zellwandaufbau und die Kovergärung zur Angleichung der unausgewogenen Nährstoffzusammensetzung auf die anaerobe Abbaubarkeit untersucht. Hinsichtlich des Salzgehaltes konnte nachgewiesen werden, dass die Algenbiomasse in aufkonzentrierter Form in einem TS-Gehalt-Bereich von 8-30% verwendet werden sollte. Geringere TS-Konzentrationen der Algenbiomasse führen zu einem zu hohen Anteil an Salzen, die zu einer Hemmung des anaeroben Abbaus führen. Höhere TS-Gehalte führen zur Bildung einer pastösen Masse, die prozesstechnisch schlecht zu verwenden ist. Die geringe Abbaubarkeit der Alge wurde maßgeblich durch den robusten Zellwandaufbau und die daraus resultierende Resistenz gegen enzymatische und chemische Hydrolyse bestimmt. Durch

84 76 4 Auswertung verschiedene physikalische Vorbehandlungsmethoden konnte die Abbaubarkeit und Biogasausbeute der Algenbiomasse signifikant gesteigert werden. Besonders effizient war hierbei die thermische Vorbehandlung des Substrats. Die Biogasausbeute konnte gegenüber der unbehandelten Algenbiomasse maximal um ca. 200% (100 C DA und 120 C 8 h) gesteigert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Desintegration der Algenzellen bei Temperaturen höher als 80 C mit zunehmender Temperatur und Vorbehandlungsdauer zunimmt. Temperaturen höher als 120 C führen zu einer Verklumpung der zerstörten Zellen und Zellbestandteile. Der Einfluss dieser Agglomerate auf die anaerobe Abbaubarkeit wurde nicht weiter untersucht. Es konnte allerdings die Wirkweise des Abbaus der Algenbiomasse nachgewiesen werden. Im Gegensatz zur unbehandelten Algenbiomasse, bei der nur beschädigte Zellen und verfügbare organische Bestandteile aus der Algensuspension abgebaut werden, wurden durch die thermische Vorbehandlung Bestandteile aus den Zellwänden herausgelöst und mit steigender Temperatur und Vorbehandlungsdauer Zellen zerstört. Durch das Herauslösen von Zellwandbestandteilen wurden Angriffspunkte für die hydrolytischen Enzyme geschaffen, so dass die Biogasausbeute und der Abbaugrad vergleichbar mit den Proben war, bei denen ein großer Anteil der Zellen zerstört wurde. Bei letzteren Proben konnte allerdings ein deutlicher Einfluss auf die Kinetik der Biogasbildung beobachtet werden, die in diesen Proben deutlich schneller ablief. In der Kovergärung mit MS konnten synergistische Effekte auf den anaeroben Abbau der Substrate beobachtet werden. Die Algenbiomasse zeigte eine prozessstabilisierende Wirkung auf den Abbau von MS. Hierbei konnte die Freisetzung von Ammonium aus dem Proteinabbau als einer der wirkenden Faktoren nachgewiesen werden. Durch ein ausgeglichenes Nährstoffverhältnis in der Kovergärung mit Mais konnte auch eine Verbesserung des Abbaus der Algenbiomasse beobachtet werden. Die in diesen Versuchsreihen nachgewiesenen Einflussfaktoren auf den anaeroben Abbau der Algenbiomasse müssen weiterführend in kontinuierlichen Versuchen untersucht werden. Die kontinuierliche Zufuhr an Substrat kann zu einer Akkumulation von Substratbestandteilen oder Zwischenprodukten des anaeroben Abbaus führen. Andererseits kann es unter diesen Bedingungen mit höheren Verweilzeiten zu einer Adaption der Biozönose an verschiedene Prozessgrößen kommen, wodurch die in Batchversuchen identifizierten Grenzen der Einflussparameter eine größere oder geringere Bedeutung aufweisen können. 4.3 Kontinuierliche Versuche Kontinuierliche Versuche dienen der Bestimmung verlässlicher Langzeitdaten hinsichtlich der Biogasausbeute, der Biogaszusammensetzung und des Gärverlaufs durch Identifizierung von Prozessstörungen und den Belastungsgrenzen unter Praxisbedingungen (Verein deutscher Ingenieure, 2006). Im Rahmen der hier beschriebenen semi-kontinuierlichen Versuche wurde die Monovergärung von N. salina Biomasse, die Monovergärung von MS und die Kovergärung der beiden Substrate (Verhältnis 1A/6MS auf ots-basis) in drei baugleichen Biogasfermentern mit 20 L Volumen durchgeführt. Aufgrund größerer Substratmengen, die über einen Zeitraum von fast 250 Tagen benötigt wurden, wurden die Lieferanten der Substrate gewechselt. Die Algenbiomasse

85 4 Auswertung 77 wurde durch die Firma BlueBioTech und MS sowie das Inoculum durch den Landwirt Friedrich Steinmann (Bottrop) zur Verfügung gestellt. Im Folgenden werden die semi-kontinuierlichen Versuche zur Monovergärung der Algenbiomasse alleine, und die Monovergärung von MS und die Kovergärung der Algenbiomasse mit MS zusammen betrachtet. Durch den höheren Abbaugrad von MS unter geringer RB konnte in den Anlagen mit Monomaisvergärung und Kovergärung von Algenbiomasse und MS eine Abnahme des Volumens beobachtet werden. Dies resultierte im Vergleich zur Monovergärung der Algenbiomasse bei gleichbleibender Substratzufuhr in einer Zunahme der RB, wodurch die Monovergärung der Algenbiomasse nur qualitativ mit den beiden anderen Vergärungen vergleichbar ist. Zudem handelt es sich bei der hier beschriebenen Monovergärung der Algenbiomasse um die erste Studie zur Vergärbarkeit von N. salina unter semi-kontinuierlichen Bedingungen Monovergärung der Algenbiomasse Die semi-kontinuierlichen Monovergärungsversuche mit Algenbiomasse von N. salina wurden insgesamt über einen Zeitraum von 225 Tagen mit täglicher Beschickung von frischem Substrat durchgeführt. Nach 88 Versuchstagen wurde bei 100 C für 2 Stunden thermisch vorbehandelte Algenbiomasse verwendet. Nach 124 Tagen wurde die Algenbiomasse für 2 Stunden bei 120 C vorbehandelt. Die durchschnittliche Verweilzeit des Substrats im Fermenter betrug 117±17 Tage bei einer durchschnittlichen RB von 1,98±0,11 kg ots m -3 d -1. Abbildung 4.18 zeigt die Entwicklung der Biogasproduktion und des Methangehaltes im Biogas über den Versuchszeitraum. Zur besseren Vergleichbarkeit wurde die Biogasproduktion zum einen auf die eingesetzte Menge an Organik (Biogasausbeute) und zum anderen auf das jeweilige Fermentervolumen (Biogasrate) bezogen. Beide Darstellungsweisen der Biogasproduktion verlaufen parallel zueinander. Tendenziell weist das entstandene Biogasvolumen in der Anfangsphase von 25 Tagen eine Abnahme und im weiteren Verlauf eine deutliche Zunahme auf. Das verwendete Inoculum stammte aus einer landwirtschaftlichen Biogasanlage, die mit MS als Hauptsubstrat gefüttert wurde. Der Versuch wurde mit der Fütterung der Algenbiomasse einen Tag nach der Entnahme des Inoculums aus der großtechnischen Anlage und Befüllung in die Laboranlagen gestartet. Aus diesem Grund kam es neben der Biogasproduktion aus der Algenbiomasse, an die durch die veränderten Substrateigenschaften eine Adaption der Biozönose notwendig war, zusätzlich zum Abbau der Organik aus dem Inoculum. Nach 25 Tagen ist diese Phase abgeschlossen und die Biogasproduktion steigt das erste Mal durch den Abbau der Algenbiomasse an.

86 78 4 Auswertung Abbildung 4.18 Spezifische Biogasrate, Biogasausbeute und Methangehalt der semikontinuierlichen Monovergärung der Algenbiomasse Im weiteren Verlauf schwankt die Biogasproduktion, wobei diese Schwankungen auf den TS- Gehalt der verschiedenen Chargen an Algenbiomasse (zwischen 16 und 29% FM) zurückgeführt werden konnten (siehe Abbildung 4.19). Dabei ist eine höhere Biogasproduktion bei niedrigerem TS-Gehalt zu beobachten. Zwischen dem 25. und dem 88. Versuchstag lag die durchschnittliche Biogasausbeute bei 0,22±0,04 m 3 kg ots -1 mit einem Maximalwert von 0,30 m 3 kg ots -1 und einem Minimalwert von 0,17 m 3 kg ots -1. Bezogen auf das Fermentervolumen ergab sich in diesem Zeitraum ein durchschnittlicher Biogasertrag von 0,42±0,07 m 3 m -3 d -1 mit einem Maximalwert von 0,53 m 3 m -3 d -1 und einem Minimalwert von 0,32 m 3 m -3 d -1. Die in diesem Versuchszeitraum erhaltene Biogasausbeute entspricht annähernd der Biogasausbeute, die für die unbehandelte Algenbiomasse in den Batchversuchen bestimmt wurde. Aus diesem Grund wurde nach 88 Tagen bei 100 C für 2 Stunden thermisch vorbehandelte Algenbiomasse verwendet. Nach 124 Versuchstagen wurde die Vorbehandlungstemperatur bei gleicher Vorbehandlungsdauer auf 120 C erhöht. Durch die Vorbehandlung der Algenbiomasse kam es bis zum 162. Versuchstag zu einer stetigen Zunahme der Biogasproduktion. Die Biogasausbeute und der Biogasertrag betrugen an diesem ersten Maximum 0,44 m 3 kg ots -1 und 0,94 m 3 m -3 d -1 (wird im Folgenden diskutiert). Im weiteren Verlauf fiel die Biogasproduktion zunächst deutlich gegen Null gehend ab. Ab dem 173. Versuchstag konnte eine weitere stetige Zunahme der Biogasproduktion bis zum absoluten Maximum der Versuchsreihe am 195. Versuchstag beobachtet werden. Die Biogasausbeute und der Biogasertrag betrugen am absoluten Maximum 0,62 m 3 kg ots -1 und 1,23 m 3 m -3 d -1. Nach dem Maximum sank die Biogasproduktion erneut deutlich ab, stabilisierte sich aber zum Ende der Versuchsreihe ab dem 217. Versuchstag um 0,50 m 3 kg ots -1 und 1,00 m 3 m -3 d -1.

87 4 Auswertung 79 Für den Methangehalt des Biogases konnte mit einer Ausnahme eine ansteigende Tendenz beobachtet werden. Der Methangehalt nahm von 53,5 Vol.% in der Adaptionsphase zu Beginn auf 62,6 Vol.% am Ende der Versuchsreihe zu. Nach 145 Versuchstagen sank der Methangehalt bis auf das absolute Minimum der Versuchsreihe von 48,5 Vol.% am 164. Versuchstag. Im weiteren Verlauf konnte eine Zunahme des Methangehalts auf über 62 Vol.% beobachtet werden. Anhand der Methankonzentration im Biogas konnten während der Versuchsreihe zwei Undichtigkeiten in der Anlage identifiziert werden. Bei Prozessstörungen geht anders als bei Undichtigkeiten die Verminderung der Biogasproduktion auch mit einer Verminderung des Methangehaltes einher. Der Methangehalt nahm nach dem Minimum am 164. Versuchstag wieder zu, wogegen die Biogasproduktion noch bis zum 178. Versuchstag gegen Null tendierte. Bei der Abnahme der Biogasproduktion nach dem 203. Versuchstag konnte keine Veränderung des Methangehaltes beobachtet werden. In beiden Fällen lagen Undichtigkeiten in den Anlagen vor, die durch Austausch des Simmerringes im Anlagendeckel wieder hergestellt wurden. Bei den absoluten Minima der Versuchsreihe handelt es sich demnach um Artefakte, die für die weitere Auswertung des Versuchs keine Rolle spielen. Im Vergleich zu den Batchversuchen, bei denen der experimentell bestimmte Methangehalt im Biogas gegenüber dem theoretischen Methangehalt (63,8 Vol.%) deutlich höher lag, konnte im Rahmen der semi-kontinuierlichen Versuche der theoretische Methangehalt auch experimentell nachgewiesen werden. Die Biogasausbeute der unbehandelten Algenbiomasse aus den Batchversuchen konnte ebenfalls anhand der semi-kontinuierlichen Versuche reproduziert werden. Die Biogasausbeute von bei 120 C für 2 Stunden thermisch vorbehandelter Algenbiomasse wies im semi-kontinuierlichen Versuch ein Maximum von 0,66 m 3 kg ots -1. Die Abweichung zur Biogasausbeute zu den Batchversuchen lag damit bei unter 10%. Bei der Batchversuchsreihe hatte das Substrat im Vergleich zum kontinuierlichen Versuch, bei dem täglich frisches Substrat zugefügt wurde, eine höhere Verweilzeit, so dass auch schwerer hydrolysierbare Bestandteile abgebaut werden konnten. Allerdings konnte im Rahmen der semi-kontinuierlichen Versuche keine gleichbleibend kontinuierliche Biogasproduktion in der Monovergärung der Algenbiomasse beobachtet werden. Dies deutet auf Prozessstörungen im Verlauf der einzelnen anaeroben Abbaustufen hin. Zur Identifizierung maßgeblicher Einflussgrößen auf die Biogasbildung sollen im Folgenden Entwicklungen verschiedener chemischer Parameter betrachtet werden. Abbildung 4.19 zeigt die Entwicklung des TS- und ots-gehalts und des ots-abbaugrades über den Versuchszeitraum. Bei der Entwicklung des TS-Gehaltes im Fermenter konnte bis zum 155. Versuchstag eine kontinuierliche Zunahme von 8,6% auf 16,4% beobachtet werden. Zum Ende der Versuchsreihe nahm der TS-Gehalt auf 14,8% ab. Die Zunahme der TS kann zum einen durch die geringe Abbaubarkeit der Alge und zum anderen durch den hohen Anteil an anorganischen Bestandteilen, die in Abbhängigkeit vom TS-Gehalt zwischen 9,6% und 12,3% der TS ausmachten, erklärt werden. Der anorganische Anteil im Substrat nahm dabei mit steigendem TS-Gehalt der Algensuspension ab (siehe Abschnitt 4.1.2). Durch den Abbau der organischen Bestandteile des Substrates reicherten sich anorganische Bestandteile im Fermenter an.

88 80 4 Auswertung Abbildung 4.19 Verlauf des Trockensubstanzgehaltes, organischen Trockensubstanzgehaltes und Abbaugrades des Substrats und des Fermenterinhalts Der ots-gehalt im Fermenter zeigte ähnlich wie der TS-Gehalt eine steigende Tendenz bis zum 148. Versuchstag (von 78,2 auf 85,1% der TS). Die Entwicklung weist anders als die TS- Entwicklung in diesem Bereich geringe Schwankungen auf, die wie bei der Entwicklung der Biogasproduktion eine Abhängigkeit zum TS-Gehalt des Substrats zeigen. Zum Ende der Versuchsreihe sinkt der ots-gehalt im Fermenter auf 82,2% der TS. Der ots-abbaugrad des Substrats weist bis zum 150. Versuchstag eine negative Tendenz von 75,4% zu Beginn der Versuchsreihe auf 40,3% auf. Zum Ende der Versuchsreihe konnte eine Zunahme des Abbaugrades auf 49,4% beobachtet werden. Der Verlauf des Abbaugrades zeigt wie der ots-gehalt im Fermenter und die Biogasproduktion eine Abhängigkeit zum TS-Gehalt des Substrats, wodurch einzelne Messwerte deutlich von dem Kurvenverlauf der Entwicklung des Abbaugrades abweichen. Der TS-Gehalt des Fermenters fließt in die Berechnung des Abbaugrades ein. Durch die kontinuierliche Zunahme der TS bis zur Anpassung der Bedingungen im Fermenter an das veränderte Substrat nach einer Verweilzeit, wird der Abbaugrad des Substrats in dieser Phase überschätzt und liefert keine verlässlichen Daten. Zum Ende der Versuchsreihe konnte, auch durch eine konstante TS-Konzentration des Substrats, gezeigt werden, dass der Abbaugrad für die thermisch vorbehandelte Algenbiomasse bei ca. 50% liegt. In den Batchversuchen konnte durch die gleiche Vorbehandlung ein Abbaugrad von über 70% bestimmt werden. Der Aufbau der Algenzellwand ist in den kontinuierlichen Versuchen demnach nicht der einzige limitierende Faktor, der die Abbaubarkeit der Algenbiomasse bestimmt. Das Verhältnis von flüchtigen organischen Säuren (FOS) zum anorganisch gebundenen Kohlenstoff (TAC) gilt als wichtiger Indikator für die Prozessstabilität bei der anaeroben

89 4 Auswertung 81 Vergärung zu Biogas. Ein FOS/TAC-Verhältnis unter 0,4 ist typisch für Systeme, bei denen eine ausgeglichene Säure- und Methanbildung vorliegt (Gomez et al., 2011). Bei erhöhten FOS/TAC- Verhältnissen übersteigt die Säureproduktion die Methanbildung. Dies kann zur Hemmung des anaeroben Abbaus führen. Abbildung 4.20 zeigt die Entwicklung des FOS- und TAC-Wertes und des FOS/TAC-Verhältnisses. Ausgehend vom Zustand des Inoculum zu Beginn der Versuchsreihe konnte aufgrund der geringen RB zunächst eine Abnahme des FOS/TAC-Verhältnisses von 0,35 auf 0,22 beobachtet werden. Ab dem 120. Versuchstag nahm das Verhältnis bis zum 155. Versuchstag erst leicht auf 0,35 und im weiteren Verlauf bis zum absoluten Maximum von 1,14 am 204. Versuchstag deutlich zu. Abbildung 4.20 Entwicklung der flüchtigen organischen Säuren, des anorganisch gebundenen Carbonats und des FOS/TAC-Verhältnisses in der semi-kontinuierlichen Monovergärung der Algenbiomasse Die anfängliche Abnahme des FOS/TAC-Verhältnisses (bis Versuchstag 50 von 0,35 auf 0,18) kann neben der Abnahme des FOS-Wertes durch die verminderte RB auch auf eine kontinuierliche Zunahme des TAC-Wertes zurückgeführt werden. Dieser verzeichnete von Versuchsbeginn bis zum 155. Versuchstag eine Zunahme von auf mg L -1. Aus diesem Grund konnte bis zum 120. Versuchstag kein Anstieg des FOS/TAC-Verhältnisses beobachtet werden, obwohl der FOS-Wert bereits ab dem 99. Versuchstag eine ansteigende Tendenz aufwies. Die Abnahme des TAC-Wertes nach dem 155. Versuchstag korreliert mit dem raschen Anstieg des FOS-Wertes und dem Einbruch im Methangehalt des Biogases. Durch die zunehmende Säurebildung wurde Pufferkapazität des Systems verbraucht, woraus eine Ausgasung des anorganisch gebundenen Kohlenstoffs als Kohlendioxid und eine Reduzierung des Methangehalts resultierte. Trotz weiter steigender Säurewerte bis zum absoluten Maximum von mg L -1 am 218. Versuchstag

90 82 4 Auswertung konnte der Biogasbildungsprozess durch eine erneute Zunahme des TAC-Wertes stabilisiert werden, wodurch auch der Methangehalt im Biogas wieder zunahm. Zum Ende der Versuchsreihe konnte eine Abnahme des FOS-Wertes und durch die weitere Zunahme des TAC-Wertes eine Abnahme des FOS/TAC-Verhältnisses beobachtet werden (wird im Folgenden diskutiert). Abbildung 4.21 Entwicklung der Zusammensetzung der flüchtigen organischen Säuren in der semi-kontinuierlichen Monovergärung der Algenbiomasse Neben dem Gesamtwert der FOS wurde auch die qualitative Zusammensetzung der einzelnen Säuren untersucht. Abbildung 4.21 zeigt die Entwicklung der relevanten FOS Essigsäure (ES), Propionsäure (PS), Buttersäure (BS), iso-buttersäure (i-bs), Valeriansäure (VS), iso-valeriansäure (i-vs) und Capronsäure (CS). Analog zum FOS-Wert konnte ein Anstieg der Säuren, beginnend mit Essigsäure, ab dem 100. Versuchstag beobachtet werden. Nach 150 Versuchstagen nahmen die ES-Konzentration und die Konzentrationen der übrigen Säuren in der Reihenfolge CS, PS, BS, i- VS, i-bs und VS deutlich zu. Am Maximum der ES-Konzentration am 211. Versuchstag konnte eine bereits Abnahme der CS, bei gleichzeitiger Zunahme von i-vs, VS und i-bs und eine Abnahme der BS bei gleichzeitiger Zunahme der PS beobachtet werden. Die Zunahme der ES deutet auf eine Prozessstörung der methanogenen und die Zunahme von PS, BS, i-bs und i-vs auf eine Hemmung der acetogenen Phase hin (siehe Abschnitt 2.2.3). Zum Ende der Versuchsreihe nahmen die ES, CS, und BS-Konzentrationen deutlich ab. Für PS, i-bs, VS und i-vs konnten leichte Zunahmen bestimmt werden. Die Akkumulierung von PS kann trotz des Abbaus von ES und BS weiter anhalten, da der PS-Abbau den thermodynamisch ungünstigsten Abbauschritt unter hohen Säurekonzentrationen darstellt (Boe et al., 2010). I-BS, VS und i-vs stellen Abbauprodukte verschiedener Aminosäuren dar (Ramsay und Pullammanappallil, 2001), die aufgrund des hohen Proteingehaltes der Algenzellen im System freigesetzt werden. Die signifikanten Veränderungen der Säurekonzentrationen hatten keine relevanten Auswirkungen auf den ph-wert (Daten nicht gezeigt). Dieser verzeichnete einen Anstieg von 7,59 zu Beginn der

91 4 Auswertung 83 Versuchsreihe auf 7,85. Durch die Zunahme des ph-wertes verändert sich die Löslichkeit für Kohlendioxid, was einen positiven Einfluss auf die Pufferkapazität des Systems hat. Im linearen Anstiegsbereich des FOS-Wertes, in dem auch der Methangehalt kurzzeitig abnahm, konnte auch eine Abnahme des ph-wertes vom Maximalwert dieser Versuchsreihe von 7,99 auf das Minimum von 7,49 beobachtet werden. Dadurch wurde das Dissoziationsgleichgewicht in Richtung Kohlensäure verschoben, wodurch die Löslichkeit von Kohlendioxid abnimmt (siehe Abschnitt 2.2.4). Die daraus resultierende Ausgasung von Kohlendioxid erklärt die Abnahme des TAC-Wertes und die Abnahme des Methangehaltes durch die Zunahme des Kohlendioxidanteils im Biogas. Die Entwicklung der Säurekonzentration und der Pufferkapazität innerhalb des Fermenters erklärt zum einen die geringe, schwankende Biogasproduktion und zum anderen die geringe Abbaubarkeit des Substrats. Allerdings ist die Entwicklung der Säurekonzentration nur ein Indikator für eine Prozessstörung, deren Ursache durch die Entwicklung anderer chemischer Parameter verursacht wird. In Abbildung 4.22 ist die Entwicklung der Leitfähigkeit und des Ammoniumgehaltes im Verlauf der Monovergärung der Algenbiomasse dargestellt. Für beide Parameter konnte ein signifikanter Anstieg beobachtet werden. Die Leitfähigkeit nahm im Verlauf der Versuchsreihe von 18,2 auf 57,5 ms cm -1 zu. Zusammen mit den organischen Anteilen der Biomasse wurden auch Nährsalze aus dem Anzuchtmedium von N. salina in den Prozess eingebracht. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Leitfähigkeit des Substrats mit dem TS-Gehalt korreliert (siehe Abschnitt 4.1.2). Die Leitfähigkeit der Algenbiomasse im verwendeten TS-Bereich lag zwischen 20 und 35 ms cm -1. Durch die tägliche Beschickung der Anlage mit frischen Substrat und einem Abbau der organischen Bestandteile kam es im Verlauf des Versuches zu einer Akkumulierung und Aufkonzentrierung von Nährsalzen mit zunehmendem Einfluss auf die Leitfähigkeit. Für den Ammoniumgehalt im Fermenter wurde ebenfalls eine Zunahme im Verlauf der Versuchsreihe bestimmt. Der Ammoniumgehalt verzeichnete eine Zunahme von 1,8 auf 7,2 g kg FM -1. Durch den geringen Abbaugrad des Substrats in der Anfangsphase der Versuche konnte nach 57 Versuchstagen zunächst eine rückläufige Entwicklung des Ammoniumgehaltes beobachtet werden. Mit Verwendung von thermisch vorbehandelter Algenbiomasse nach 88 Versuchstagen wurde bis zum Ende der Versuchsreihe durch den verbesserten Abbaugrad eine annähernd lineare Zunahme des Ammoniumgehaltes bestimmt. Durch die Algenbiomasse wurden hohe Mengen an Protein (21% der TS) in den Prozess eingebracht. Beim Abbau von Proteinen wird die Aminogruppe der einzelnen Aminosäuren als Ammoniak (NH 3 ) freigesetzt. NH 3 kann passiv in Zellen von Mikroorganismen diffundieren (Chen et al., 2008). Hemmungen durch NH 3 können durch die Veränderung des intrazellulären ph- Wertes, durch einen erhöhten Energiebedarf der Zellen oder durch Beeinflussung spezifischer Enzymreaktionen ausgelöst werden (Wittmann et al., 1995). In Abhängigkeit von Temperatur und ph-wert dissoziiert NH 3 zu Ammonium (NH + 4 ). Unter den Bedingungen dieser Versuchsreihe lagen ca. 90% als NH + 4 vor. Der maximale Ammoniumgehalt (NH 3 + NH + 4 ) betrug im Rahmen der semi-kontinuierlichen Versuchsreihe 7,2 g L -1. Ein Ammoniumgehalt unterhalb von 0,2 g L -1 gilt als begünstigend für anaerobe Prozesse (Liu und Sung, 2002). Der Bereich, in dem eine 50%ige

92 84 4 Auswertung Hemmung durch NH 3 auf die Methanproduktion beobachtet wurde, liegt in Abhängigkeit vom Substrat, dem Inoculum, den Prozessbedingungen und Adaptionsphasen zwischen 1,7 und 14 g L -1 Ammonium (Chen et al., 2008). Durch die verschiedenen Einflussfaktoren sind absolute Konzentrationen zwischen verschiedenen Studien nur bedingt vergleichbar. Die erhaltenen Werte liegen aber im Mittelfeld beobachteter Hemmkonzentrationen anderer Studien. Allerdings konnte durch Angelidaki und Ahring (1993) gezeigt werden, dass nach einer Adaptionsphase erhöhte NH 3 - Konzentrationen eine Akkumulation von FOS bewirken, die allerdings nicht die Prozessstabilität, sondern lediglich den Betrag der Biogasausbeute beeinflussen (Angelidaki und Ahring, 1993). Abbildung 4.22 Entwicklung der Leitfähigkeit und des Ammoniumgehaltes während der semikontinuierlichen anaeroben Monovergärung der Algenbiomasse Ausgehend von diesen Beobachtungen beeinflusst in dieser Versuchsreihe die Freisetzung von NH 3 aus dem Proteinabbau die Biogasausbeute und die Prozessstabilität durch die Akkumulation von FOS. Die Biozönose adaptiert an diese Bedingungen, wodurch letztenendes ein stabiler Abbauprozess, auch durch die Erhöhung der Pufferkapazität, bei erhöhten Säurekonzentrationen mit verminderter Biogasproduktion ablaufen kann. Zusätzlich wird durch die erhöhten Säurekonzentrationen eine Hemmung durch die NH 3 -Freisetzung verhindert, indem ein weiterer Anstieg des ph-wertes in den alkalischen Bereich verhindert wird. Die Algenbiomasse von BlueBioTech, die für die kontinuierlichen Versuche verwendet wurde, wies im Vergleich zu der Algenbiomasse von Phytolutions (C/N: 6,5) ein höheres C/N-Verhältnis von 12,2 auf. Dadurch lag das C/N-Verhältnis der Algenbiomasse deutlich höher als das durchschnittliche C/N-Verhältnis mariner Mikrolagen von 7,0 (Geider R. und La Roche J., 2002)

93 4 Auswertung 85 und näher am für die anaerobe Vergärung optimalen C/N-Verhältnisses des Substrats zwischen 15 und 30 (Weiland, 2010). Abbildung 4.23 Entwicklung des Kohlenstoff- und Stickstoffgehaltes und des C/N-Verhältnisses im Fermenter während der anaeroben Monovergärung der Algenbiomasse In Abbildung 4.23 ist die Entwicklung des Kohlenstoff- und Stickstoffgehaltes und des C/N- Verhältnisses über den Versuchszeitraum dargestellt. Durch die geringe Abbaubarkeit der Algenbiomasse ohne Vorbehandlung kam es in den ersten 88 Versuchstagen zu einer Zunahme des Kohlenstoffgehaltes und dadurch auch zu einer Zunahme des C/N-Verhältnisses. Durch die bessere Abbaubarkeit mit Verwendung von vorbehandelter Algenbiomasse blieb der Kohlenstoffgehalt im weiteren Verlauf zunächst konstant und verzeichnete zum Ende der Versuchsreihe eine Abnahme. Gleichermaßen nahm durch den hohen Proteingehalt der Stickstoffgehalt im Fermernter über den Versuchszeitraum zu, so dass zum Ende der Versuchsreihe auch eine Abnahme des C/N- Verhältnisses beobachtet werden konnte. Abschießend soll eine Betrachtung der Entwicklung der relevantesten SE erfolgen, die durch die Algenbiomasse in den Prozess eingebracht wurden. Abbildung 4.24 und Abbildung 4.25 zeigen die Entwicklung von Kobalt (Co), Molybdän (Mo), Nickel (Ni), Natrium (Na), Kupfer (Cu), Mangan (Mn), Zink (Zn) und Eisen (Fe). Gemäß den Spurenelementanteilen, die in der Algenbiomasse nachgewiesen wurden (siehe Abschnitt 4.1.2), konnte für Ni, Mo, Fe, Zn und Cu eine Abnahme der Spurenelementanteile im Vergleich zum Inoculum beobachtet werden. Für Co, Mn und insbesondere Na wurde eine Zunahme der Anteile durch die Algenbiomasse bestimmt. Zum Ende der Versuchsreihe konnte eine stabile Biogasproduktion und eine Abnahme der akkumulierten organischen Säuren beobachtet werden. In diesem Bereich blieben die Anteile der bestimmten SE

94 86 4 Auswertung nahezu konstant, so dass eine Hemmung des Biogasprozesses durch einen Spurenelementmangel im Verlauf dieser Versuchsreihe ausgeschlossen werden kann. Abbildung 4.24 Entwicklung der Kobalt-, Nickel-, Molybdän- und Natriumkonzentrationen in der semi-kontinuierlichen Monovergärung der Algenbiomasse Für den Na-Gehalt wurde im Rahmen der Versuche eine Zunahme von auf über mg kg TS -1 bestimmt. Unter der Annahme, dass die Dichte des Fermenterinhalts annähernd 1 kg L -1 ist, entspricht der Na-Gehalt einer Konzentration von mg L -1. Na ist in geringen Mengen zwischen 100 und 350 mg L -1 essentiell für methanbildende Mikroorganismen (Chen et al., 2008). Konzentrationen zwischen und mg L -1 können hemmend auf die Biozönose von Biogasreaktoren wirken (McCarty, 1964). Die tatsächliche Hemmkonzentration ist abhängig von antagonistischen und synergistischen Effekten mit anderen Kationen und von der Adaptionsfähigkeit der Biozönose an saline Bedingungen (Chen et al., 2008). Chen et al. (2003) konnten zeigen, dass Methanogene an Na-Konzentrationen von mg L -1 adaptieren konnten. Zudem konnten für Ammonium synergistische Effekte gegenüber Na nachgewiesen werden (Kugelman und McCarty, 1965).

95 4 Auswertung 87 Abbildung 4.25 Entwicklung der Kupfer-, Eisen-, Mangan- und Zinkkonzentration in der semikontinuierlichen Monovergärung der Algenbiomasse Zusammenfassend lassen sich die Abnahme von Biogasproduktion und Methangehalt und der Anstieg der organischen Säuren als Konsequenz aus einer Hemmung der methanbildenden und acetogenen Mikroorganismen deuten. Diese Hemmung resultierte aus einer deutlichen Veränderung zweier physio-chemischer Parameter durch die kontinuierliche Zufuhr von Algenbiomasse: die Leitfähigkeit, maßgeblich durch die Akkumulation von Na geprägt und der Ammoniumgehalt nahmen im Laufe der Versuchsreihe signifikant zu. Sowohl die Hemmung der methanbildenden Biozönose, als auch die stabile Biogasproduktion mit verminderter Biogasmenge am Ende der Versuchsreihe können auf eine Kombination der Zunahme beider Parameter zurückgeführt werden. Im Verlauf der Versuchsreihe kam es zu einer Adaption der Mikroorganismen an die veränderten Bedingungen, wobei zusätzlich durch synergistische Effekte von Na und Ammonium die jeweilige Hemmung der Substanz abgeschwächt wurde. Letztenendes konnte dadurch ein stabiler Abbauprozess mit verminderter Biogasproduktion erreicht werden Kovergärung von Maissilage und Algenbiomasse Die Monovergärung von MS und die Kovergärung von MS mit Algenbiomasse (1A/6MS) unter semi-kontinuierlichen Bedingungen sollen im Folgenden zusammen betrachtet werden. Aufgrund der geringen Menge an Algenbiomasse, die in der Kovergärung eingesetzt wurde (1A/6MS auf ots-basis), konnte für die Monovergärung von MS und die Kovergärung eine vergleichbare RB über den Versuchszeitraum gewährleistet werden. Diese beiden Versuchsansätze sind im

96 88 4 Auswertung Gegensatz zur Monovergärung der Algenbiomasse dadurch auch quantitativ miteinander vergleichbar. Die semi-kontinuierlichen Versuche wurden über einen Zeitraum von 244 Tagen durchgeführt. Die durchschnittliche Verweilzeit der Substrate im Fermenter betrug für MS 112±28 und für 1A/6MS 109±27 Tage. Durch die anfänglich geringe RB von 2 kg ots m -3 d -1 kam es zu einer kontinuierlichen Abnahme des Volumens in beiden Anlagen. Dadurch nahm die RB zunächst kontinuierlich auf 2,6 kg ots m -3 d -1 zu (siehe Abbildung 4.26). Im weiteren Verlauf der Versuchsreihe wurde die RB nach 188 Versuchstagen schrittweise auf 3,7 kg ots m -3 d -1 und nach 218 Versuchstagen auf 4,7 kg ots m -3 d -1 angehoben. Für die Erhöhung der RB auf 4,7 kg ots m -3 d -1 ist zu beachten, dass die Versuche nur 26 Tage bis zum Abbruch weiterliefen. Die Verweilzeit war zu diesem Zeitpunkt bei 60 Tagen, so dass noch kein stationärer Zustand eingestellt war und demnach in diesem Zeitraum nur Tendenzen abzuzeichnen sind. In Abbildung 4.26 ist die Entwicklung der Biogasrate, der Biogasausbeute und des Methangehaltes im Biogas über den Versuchszeitraum dargestellt. Die ersten 50 Versuchstage sollen in der folgenden Betrachtung der Auswertung nicht berücksichtigt werden. Aufgrund von Undichtigkeiten und Aufzeichnungsproblemen mit der Messsoftware konnte in diesem Bereich keine kontinuierliche Biogasproduktion sicher gestellt werden. Abbildung 4.26 Entwicklung der Biogasrate, Biogasausbeute, Faulraumbelastung und desmethangehaltes in der semi-kontinuierlichen Monovergärung von Maissilage und Kovergärung von Maissilage und Algenbiomasse

97 4 Auswertung 89 Zwischen dem 50. und dem 188. Versuchstag konnten bis auf eine Undichtigkeit in der Kovergärung zwischen dem 165. und 184. Versuchstag kontinuierliche Biogasraten und Biogasausbeuten beobachtet werden. Zunächst wurde für MS eine höhere Biogasrate bestimmt als für die Kovergärung. Durch die Verwendung von vorbehandelter Algenbiomasse (nach 88 Tagen für 2 Stunden bei 100 C und nach 124 Tagen für 2 Stunden bei 120 C) nahm die Biogasrate nach 110 Versuchstagen zu und verlief in gleicher Größenordnung wie bei der Monovergärung von MS. Nach 188 Versuchstagen wurde die RB in beiden Anlagen schrittweise auf 3,7 kg ots m -3 d -1 erhöht. Dadurch nahm auch in beiden Anlagen die Biogasrate gleichmäßig zu. Nach 218 Versuchstagen wurde die RB ein weiteres Mal schrittweise auf 4,7 kg ots m -3 d -1 erhöht. Der Anstieg der Biogasrate durch die Fütterungserhöhung fiel bei reiner MS geringer aus als für die Kovergärung. Im weiteren Verlauf konnte zum Ende der Versuchsreihe eine deutliche Abnahme der Biogasrate bei MS beobachtet werden (wird im Folgenden diskutiert). Die Biogasausbeute in der Monovergärung verlief bis zum 218. Versuchstag leicht oberhalb der Biogasausbeute der Kovergärung. Ab dem 218. Versuchstag nahm die Biogasausbeute bei MS kontinuierlich und zum Ende der Versuchsreihe deutlich ab. Die Biogasausbeute in der Kovergärung verlief abgesehen von den Undichtigkeiten in der Anlage annähernd konstant. Anders als bei der Biogasrate, bei der eine Zunahme durch die Erhöhung der RB beobachtet werden konnte, wies die Entwicklung der Biogasausbeute eine leicht abnehmende Tendenz auf. Durch die Erhöhung der RB wurde die Menge an täglich zugeführter organischer Fracht erhöht. Gleichermaßen wurde durch diese Erhöhung die Verweilzeit des Substrates im Fermenter vermindert. Diese betrug im Vergleich zum Beginn der Versuchsreihe (140 Tage) zum Ende weniger als 60 Tage. Durch die verminderte Verweilzeit nahm die Biogasproduktion weniger stark zu als die Menge an organischer Fracht, wodurch die Biogasausbeute leicht rückläufig war. Ohne Berücksichtigung der Bereiche mit Undichtigkeiten und der ersten 50 Versuchstage lagen Biogasrate und Biogasausbeute für MS durchschnittlich bei 1,76±0,28 m 3 m -3 d -1 und 0,62±0,08 m 3 kg ots -1 und für die Kovergärung bei 1,71±0,39 m 3 m -3 d -1 und 0,60±0,05 m 3 kg ots -1. Der Methangehalt von Mono- und Kovergärung verlief zwischen dem 50. und dem 100. Versuchstag in gleicher Größenordnung. Durch die Verwendung vorbehandelter Algenbiomasse konnte in der Kovergärung bis zum Versuchsende eine kontinuierliche Zunahme des Methangehaltes von 51 Vol.% auf 55 Vol.% beobachtet werden. Der durchschnittliche Methangehalt lag bei 53,6±1,2 Vol.%. Im Vergleich dazu lag der durchschnittliche Methangehalt bei MS bei 51,8±3,0 Vo.%. Nach der zweiten Erhöhung der RB konnte eine deutliche Abnahme des Methangehaltes beobachtet werden. Diese konnte sich nach einigen Tagen zunächst wieder stabilisieren. Zum Ende der Versuchsreihe fiel der Methangehalt analog zur Biogasproduktion auf unter 30 Vol.%. Diese Entwicklung deutet auf eine Hemmung der Methanbildner hin. In Abbildung 4.27 ist die Entwicklung von TS- und ots-gehalt sowie dem ots-abbaugrad des Substrates im Fermenter dargestellt. Für die Monovergärung konnte im Verlauf der Versuchsreihe durch die geringe RB eine Abnahme des TS-Gehaltes von 8,6 auf 8,0% FM beobachtet werden. Zum Ende der Versuchsreihe stieg der TS-Gehalt auf 9,5% FM. Analog nahm der ots-gehalt im Fermenter von 78% TS auf 77% TS ab mit einem Anstieg zum Ende der Versuchsreihe auf 84% TS. Der ots-abbaugrad des Substrates blieb ohne Berücksichtigung der ersten 50

98 90 4 Auswertung Versuchstage bis zum 141. Versuchstag konstant bei ca. 80%. Nach 141 Versuchstagen wies die eingebrachte MS einen verminderten TS-Gehalt (27% FM) auf. Dadurch verringerte sich der Abbaugrad schlagartig auf 75%. Nach der zweiten Erhöhung der RB fiel der Abbaugrad deutlich auf 71% ab. Abbildung 4.27 Entwicklung des Trockensubstanzgehaltes, des organischen Trockensubstanzgehaltes und des ots-abbaugrades in der semi-kontinuierlichen Monovergärung von Maissilage und Kovergärung von Maissilage und Algenbiomasse In der Kovergärung nahm der TS-Gehalt durch den höheren anorganischen Anteil der Algenbiomasse über den Versuchszeitraum kontinuierlich von 8,6% FM auf 9,7% FM zu. Der ots-gehalt im Fermenter nahm abgesehen von den Schwankungen in den ersten 50 Versuchstagen von 78 auf 80% TS zu. Insgesamt lag der ots-abbaugrad des Substrats unterhalb des Abbaugrads der Monovergärung. Von Versuchsbeginn bis zum 141. Versuchstag konnte eine Abnahme des Abbaugrades von 79 auf 76% beobachtet werden. Durch die Beschickung mit MS mit vermindertem TS-Gehalt nach 141 Versuchstagen fiel der Abbaugrad wie bei der Monovergärung von MS sprungartig auf 72%. Bis zum Ende der Versuchsreihe schwankte der Abbaugrad zwischen 72 und 74%. Bei Betrachtung von Abbaugrad, Biogasproduktion und Methangehalt fällt auf, dass obwohl der Abbaugrad in der Kovergärung abnimmt, durch die Verwendung von thermisch vorbehandelter Algenbiomasse eine Zunahme des Biogasertrags und eine Zunahme des Methangehaltes beobachtet werden konnte. Dies deutet darauf hin, dass der Abbaugrad des Algenanteils im Fermenter im

99 4 Auswertung 91 Verlauf der Versuche zunimmt. Insgesamt sinkt der Gesamtabbaugrad der Substratmischung durch den deutlich höheren Anteil an MS. Die Entwicklung des Kohlenstoff- und Stickstoffgehalts und des C/N-Verhältnisses entspricht den Entwicklungen des TS- und ots-gehaltes im Fermenter. Diese Daten sind in Abbildung 4.28 gezeigt. Der C-Gehalt in der Monovergärung nahm analog zur Zunahme des ots-gehaltes zum Ende der Versuchsreihe von 39,3 auf 43,1% TS zu. Der N-Gehalt war durch die Monovergärung von MS, die nur eine geringe Proteinfracht in den Fermenter bringt, leicht rückläufig von 3,1 auf 2,6% TS. Dies resultierte in einer deutlichen Zunahme des C/N-Verhältnisses im Fermenter von 12,5 auf 16,9. In der Kovergärung konnte durch den höheren Lipid- und Proteinanteil, der durch die Algenbiomasse in den Prozess eingebracht wurde, zunächst eine Zunahme des C-Gehaltes von 39,3 auf 44,0% TS beobachtet werden. Dieser bleibt bis zum Versuchsende annähernd konstant. Der N- Gehalt wies einen geringen konstanten Anstieg von 3,1 auf 3,5% TS auf. Dadurch blieb das C/N- Verhältnis im Fermenter über den gesamten Versuchszeitraum annähernd konstant. Abbildung 4.28 Entwicklung des Kohlenstoff- und Stickstoffgehaltes sowie des C/N-Verhältnisses in der semi-kontinuierlichen Monovergärung von Maissilage und der Kovergärung von Maissilage und Algenbiomasse Durch das im Vergleich zu den Batchversuchen, in denen ein optimales C/N-Verhältnis in der Kovergärung zwischen 21 und 26 bestimmt wurde, höhere C/N-Verhältnisse der beiden Substrate lag das C/N-Verhältnis in der Substratmischung der semi-kontinuierlichen Versuche bei 30,6. Dies bedeutet, dass eine Erhöhung des Anteils der Algenbiomasse in den semi-kontinuierlichen

100 92 4 Auswertung Versuchen hinsichtlich des optimalen C/N-Verhältnisses eine Erhöhung der positiven Effekte der Kovergärung aufweisen könnte. Durch Betrachtung der FOS und des TAC wird der Einfluss der Algenbiomasse auf die Vergärung von MS deutlich. Abbildung 4.29 zeigt die Entwicklung des FOS- und TAC-Wertes sowie des FOS/TAC-Verhältnisses. In der Kovergärung wurde durch eine Zunahme des TAC-Wertes von auf mg L -1 und einen konstanten FOS-Wert um mg L -1 ein leicht abnehmendes FOS/TAC-Verhältnis von 0,36 auf 0,22 beobachtet. Abbildung 4.29 Entwicklung der flüchtigen organischen Säuren (FOS), des anorganischen Carbonats (TAC) und des FOS/TAC-Verhältnisses in der semi-kontinuierlichen Monovergärung von Maissilage und Kovergärung von Maissilage und Algenbiomasse Bei der Monovergärung von MS wurde nach 188 Versuchstagen eine Abnahme des TAC-Wertes und eine Zunahme des FOS-Wertes bestimmt. Nach 203 Versuchstagen konnte auch ein Einfluss dieser Entwicklung auf den ph-wert beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Dieser verzeichnete eine Abnahme unter einen Wert von 6,0 zum Ende der Versuchsreihe. Nach 239 Versuchstagen lag das FOS/TAC-Verhältnis bei 1,0, wodurch das Gleichgewicht von Säurebildung und der Umsetzung der Säuren zu Methan deutlich gestört wurde. Daraus resultierte eine Abnahme der Methanproduktion. Analog zur Zunahme des FOS-Wertes konnte bei der Monovergärung von MS eine Veränderung der Zusammensetzung der FOS bestimmt werden. Die Entwicklung der organischen Säuren ist in Abbildung 4.30 dargestellt. Die Entwicklung der Säuren in der Kovergärung wurde in dieser Abbildung nicht dargestellt, da ES konstant um 200 mg kg FM -1 und alle anderen Säuren über den gesamten Versuchszeitraum unter der Nachweisgrenze lagen.

101 4 Auswertung 93 Abbildung 4.30 Entwicklung der Zusammensetzung der flüchtigen organischen Säuren in der semi-kontinuierlichen Monovergärung von Maissilage Anhand der beschriebenen Entwicklungen verschiedener Prozessparameter konnte ein signifikanter Einfluss der Algenbiomasse auf den Verlauf der anaeroben Vergärung von MS nachgewiesen werden. Unter erhöhter RB konnte für die Monovergärung von MS eine deutliche Prozessstörung beobachtet werden, deren Beginn nach 188 Tagen durch eine Abnahme des TAC-Wertes und eine Zunahme des FOS-Wertes und des Fettsäurespektrums nachgewiesen werden konnte. Ein erster Einfluss auf den ph-wert war nach 203 Tagen erkennbar, wobei die Biogasproduktion erst nach 239 Tagen zusammen mit dem Methangehalt deutlich zurückging als der FOS-Wert über den TAC- Wert anstieg. Der Grund für die Hemmung in der Monomaisvergärung muss in einer unterschiedlichen Entwicklung einer oder mehrerer chemischer Prozessparameter begründet liegen. Diese sollen zur Identifizierung dieses Einflussparameters im Folgenden näher untersucht werden. Abbildung 4.31 zeigt die Entwicklung des Ammoniumgehaltes und der Leitfähigkeit. Mono- und Kovergärung wiesen bis zum 75. Versuchstag den gleichen Verlauf des Ammoniumgehaltes auf. Durch die Verwendung von thermisch vorbehandelter Algenbiomasse wurde mehr Ammonium freigesetzt, so dass ein Anstieg der Ammoniumkonzentration bis zum 148. Versuchstag beobachtet werden konnte. Im weiteren Verlauf wurde durch die Abnahme des Abbaugrads auch eine leichte Abnahme der Ammoniumkonzentration beobachtet. Insgesamt nahm die Ammoniumkonzentration über den gesamten Versuchszeitraum von 1,8 auf 3,6 g kg FM -1 zu. In der Monovergärung von MS nahm die Ammoniumkonzentration nach 75 Versuchstagen geringfügig ab, lag allerdings bei jeder Bestimmung oberhalb des Anfangswertes des Inoculums. Zum Versuchsende konnte ein signifikanter Zuwachs des Ammoniumgehaltes auf 3,1 g kg FM -1 beobachtet werden. Bei der Ammoniumbestimmung werden im Gegensatz zur Elementaranalyse, bei der alle im Fermenter befindlichen N-Verbindungen analysiert werden, nur gelöste, nicht in

102 94 4 Auswertung Biomasse oder Substrat gebundene Ammoniummoleküle bestimmt. Der Gesamt-N-Anteil im Fermenter war über die gesamte Versuchsreihe rückläufig. Beim Ammoniumgehalt konnte trotz einer deutlichen Abnahme des Abbaugrades in den letzten Versuchstagen eine Freisetzung von Ammonium beobachtet. Durch die ph-wert-veränderung verschiebt sich das Dissoziationsgleichgewicht von NH 3 zu NH + 4, so dass der Phasenübergang von Ammonium als NH 3 von der flüssigen Phase in die Gasphase vermindert wird und mehr Ammonium gelöst bleibt. Abbildung 4.31 Entwicklung der Leitfähigkeit und des Ammoniumgehaltes in der Monovergärung von Maissilage und in der Kovergärung von Maissilage und Algenbiomasse Der Ammoniumgehalt kann als Einflussfaktor für die Hemmung in der Monovergärung ausgeschlossen werden. Der Gehalt an Ammonium liegt in der ungehemmten Kovergärung über dem Gehalt an Ammonium in der Monovergärung. Ein Ammoniummangel ist ebenfalls auszuschließen, da die Konzentration an Ammonium zu allen Versuchszeitpunkten höher als im Inoculum ist, bei dem keine Hemmung der Biogasbildung beobachtet werden konnte. Zudem würde sich ein Ammoniummangel auf die gesamte Biozönose auswirken, da viele Mikroorganismen zum Wachstum auf Ammonium angewiesen sind. Insbesondere hydrolytische Bakterien, die durch die Freisetzung von Enzymen die Substratbestandteile abbauen, benötigen für die Produktion dieser Enzyme Ammoniumstickstoff. Die weitere Zunahme der organischen Säuren trotz Hemmung der Biogasproduktion weist aber auf eine fortgesetzte Aktivität dieser Organismen hin. Die Leitfähigkeit in der Monovergärung nahm im Verlauf der Versuchsreihe bis zum 141. Versuchstag von 18 auf 25 ms cm -1 zu. Die im weiteren Verlauf folgende Abnahme der Leitfähigkeit auf 23 ms cm -1 korreliert mit der Abnahme des Abbaugrades. Durch den geringeren Abbau des Substrats werden weniger leitfähige Ionen, die bei MS in den Zellen vorliegen, aus dem

103 4 Auswertung 95 Substrat freigesetzt. Die Leitfähigkeit ist in der Monovergärung über die gesamte Versuchsreihe geringer als in der ungehemmten Kovergärung, aber höher als im Inoculum zu Beginn der Versuchsreihe. Die Gesamtkonzentration an leitfähigen Ionen ist demnach nicht für die Hemmung der Monovergärung verantwortlich. Bei der Kovergärung nahm die Leitfähigkeit im Verlauf der Versuchsreihe von 18 auf 30 ms cm -1 zu. Der Verlauf erreichte am Ende der Versuchsreihe eine Sättigung. Durch die Algenbiomasse wurden höhere Mengen an leitfähigen Ionen, insbesondere Natrium, in den Prozess eingebracht. Diese liegen zum großen Teil nicht in der Biomasse gebunden vor, sondern stammen aus den Restanteilen des Nährmediums, die mit in den Prozess eingebracht werden. Zum Ende der Versuchsreihe kam es daher aufgrund der Abnahme des Abbaugrades und der Erhöhung der RB zu einer gleichbleibenden Konzentration der leitfähigen Ionen. Die Hemmung in der Monomaisvergärung konnte nicht durch eine quantitative Veränderung der Ammoniumkonzentration oder der Gesamtheit der leitfähigen Ionen ausgelöst werden. Im Folgenden soll daher die qualitative Entwicklung der relevantesten SE der Monomaisvergärung mit der Entwicklung bei der Kovergärung verglichen werden. Selen lag in allen gemessenen Proben unterhalb der Nachweisgrenze und wurde aufgrund der fehlenden Relevanz nicht dargestellt. Abbildung 4.32 zeigt die Entwicklung von Fe, Mn, Zn und Cu und Abbildung 4.33 die Entwicklung von Co, Mo, Ni und Na. Abbildung 4.32 Entwicklung der Kupfer-, Eisen-, Mangan- und Zinkkonzentrationen in der Monovergärung von Maissilage und in der Kovergärung von Maissilage und Algenbiomasse Der Verlauf der Konzentration von Zn, Mn, Fe und Cu ist in beiden Anlagen annähernd gleich. Im Vergleich zum Inoculum nahmen die Konzentrationen der betrachteten SE leicht ab. Der Kupfer-

104 96 4 Auswertung und Zinkgehalt nahmen in beiden Anlagen von 29 auf 14 mg kg TS -1 bzw. von 240 auf 160 mg kg TS -1 ab. Die Konzentrationen an Eisen und Mangan nahmen bei der Monovergärung geringfügig stärker ab als für die Kovergärung. Der Eisengehalt nahm in der Kovergärung von 652 auf 604 mg kg TS -1 und in der Monovergärung von 652 auf 518 mg kg TS -1 ab. Für Mangan nahm die Konzentration in der Kovergärung von 146 auf 139 mg kg TS -1 und in der Monovergärung von 146 auf 83 mg kg TS -1 ab. Die Abnahme dieser SE im Vergleich zum Inoculum ist darauf zurückzuführen, dass die Biogasanlage, aus der das Inoculum entnommen wurde, zusätzlich zu NawaRos auch mit Wirtschaftsdünger beschickt wurde. Wirtschaftsdünger enthalten im Vergleich zu NawaRos und auch der Algenbiomasse einen hohen Anteil an Schwermetallen (Nicholson et al., 1999). Bei der Monovergärung von Mais oder anderer Substrate wurde bislang keine Hemmung durch einen Mangel an Mangan und Eisen beschrieben. Die geringe Abnahme dieser SE kann daher nicht als Ursache für die Hemmung in Betracht gezogen werden. Abbildung 4.33 Entwicklung der Kobalt-, Molybdän-, Nickel- und Natriumkonzentrationen in der Monovergärung von MS und in der Kovergärung von MS und Algenbiomasse Für Nickel konnte in beiden Anlagen eine Zunahme der Konzentration über den Versuchszeitraum beobachtet werden. Für die Kovergärung war die Zunahme von 4,7 auf 7,8 mg kg TS -1 geringer als für die Monovergärung (Zunahme auf 11,6 mg kg TS -1 ), da durch MS im Vergleich zur Algenbiomasse höhere Mengen an Nickel in den Prozess eingebracht wurden (siehe Abschnitt 4.1.2). Für Mo ist die Entwicklung analog zur Entwicklung von Ni zu betrachten, da ebenfalls höhere Mengen an Mo in MS nachgewiesen wurden. Die Mo-Konzentration nahm in der Kovergärung von 2,5 auf 3,4 mg kg TS -1 und in der Monovergärung von 2,5 auf 3,9 mg kg TS -1 zu. Die Entwicklung von Natrium und Kobalt wiesen zwischen der Kovergärung und der Monovergärung signifikante Unterschiede auf. In der Kovergärung nahm der Natriumgehalt durch

105 4 Auswertung 97 die hohe Natriumkonzentration der Algenbiomasse von auf mg kg TS -1 zu. In der Monovergärung konnte eine Abnahme von auf 630 mg kg TS -1 beobachtet werden. Die geringste Natriumkonzentration in der Monovergärung entspricht einer Konzentration von 59 mg L -1 (mit der Annahme, dass die Dichte des Fermenterinhalts 1 kg L -1 ist), die unterhalb des Konzentrationsbereich von 100 bis 350 mg L -1 liegt, der als förderlich für methanbildende Mikroorganismen gilt (Chen et al., 2008). Natriumionen spielen als Substituent von Protonen für osmotische chemische und mechanische Reaktionen eine entscheidende Rolle in bioenergetischen Prozessen verschiedener Mikroorganismen (Ferry, 1993). Die Rolle von Natrium auf die Prozessstabilität wurde durch Munk et al. (2010) untersucht. Natriumkonzentrationen unterhalb von 10 mg L -1 führten zur Versäuerung des Fermenters. Die Kobaltkonzentration nahm durch das Vorhandensein in der Algenbiomasse im Verlauf der Versuche in der Kovergärung von 0,8 auf 1,4 mg kg TS -1 zu. In der Monovergärung konnte eine Abnahme der Kobaltkonzentration von 0,8 (0,07 mg L -1 ) unter die Nachweisgrenz von 0,3 mg kg TS -1 (0,03 mg L -1 ) beobachtet werden. Kobalt wurde von Lebuhn et al. (2008) als das limitierenste Spurenelement in der Monovergärung von Mais bereits unter geringer RB nachgewiesen. Unter diesen Bedingungen konnte eine Versäuerung des Fermenters durch einen Kobaltmangel beobachtet werden (Lebuhn et al., 2008). In der Literatur wird ein Co-Bedarf zwischen 0,003 und 20 mg L -1 genannt (Schattauer et al., 2011). Aus diesem Grund wird die Veränderung im Verlauf der Co-Konzentration, nicht aber die absolute Menge im Vergleich zu anderen Studien, als Indiz für eine Hemmung durch Kobaltmangel in der Monovergärung von MS gewertet. Im Rahmen dieser Versuchsreihe konnte ein Mangel an Kobalt und eventuell Natrium als Grund für eine Versäuerung in der Monovergärung von Mais unter erhöhter RB identifiziert werden. Durch die Algenbiomasse wurden diese Elemente in den Prozess eingebracht, so dass in der Kovergärung über den gesamten Versuchsverlauf ein ausgeglichenes Verhältnis von Säurebildung und Methanbildung beobachtet werden konnte. Anders als in der Monovergärung der Algenbiomasse konnte kein negativer Einfluss der Algenbiomasse hinsichtlich der Zunahme des Ammoniumgehaltes und der Leitfähigkeit, insbesondere durch die Zunahme des Natriumgehaltes, nachgewiesen werden. Durch die Algenbiomasse konnte in der Kovergärung aber ein positiver Einfluss auf die Prozessstabilität, hinsichtlich einer Steigerung der Pufferkapazität, des Methangehaltes des Biogases und einer quantitativen Verfügbarkeit von SE (Kobalt und Natrium) gezeigt werden. Für die Abbaubarkeit der Algenbiomasse in der Kovergärung scheint auch ein positiver Einfluss durch die MS vorzuliegen. Trotz geringeren Abbaugrades und geringerer Biogasproduktion in der Monovergärung der Alge wurden der Abbaugrad, die Biogasausbeute (-3%) und der Biogasertrag (-3%) im Vergleich zur Monovergärung nur geringfügig reduziert. Zudem konnte in der Kovergärung anders als in der Monovergärung der Algenbiomasse ein stabiler Abbau der Algenbiomasse gewährleistet werden, da Natrium- und Ammoniumgehalt, die für die Prozessstörung in der Monovergärung der Algenbiomasse verantwortlich waren, sich in der Kovergärung nicht auswirkten.

106 98 4 Auswertung Genomanalysen Im Rahmen der semi-kontinuierlichen Versuche wurden in den drei verschiedenen Fermentern (A: Monovergärung der Algenbiomasse; MS: Monovergärung der Maissilage; 1A/6MS: Kovergärung von Algenbiomasse und Maissilage) zu verschiedenen Versuchszeitpunkten Proben zur Untersuchung der Entwicklung der mikrobiellen Gemeinschaft genommen. Der stabile Betrieb eines Reaktors zur Biogaserzeugung hängt von syntrophen Beziehungen der mikrobiellen Gemeinschaft in dem System ab (Werner et al., 2011). Diese Beziehungen bestehen aus fermentativen Bakterien, spezialisierten acidogenen und acetogenen Bakterien und methanogenen Archaea mit verschiedenen und parallel ablaufenden Stoffwechselwegen zur Umsetzung des eingebrachten Substrats (Briones und Raskin, 2003). Die Dynamik einer Population zur Erhaltung der Funktion einer mikrobiellen Gemeinschaft kann dabei in drei grundlegende Mechanismen unterteilt werden: Resistenz (die Population liegt über die Zeit im Überfluss vor), Widerstandsfähigkeit (Erholung der Population nach einer Prozessstörung) und Redundanz (eine gestörte Population wird durch eine neue Population mit gleicher Funktion ersetzt) (Allison und Martiny, 2008). Die vorliegenden Untersuchungen der mikrobiellen Gemeinschaft dienten der Beobachtung und Beurteilung der Dynamik verschiedener Organismengruppen hinsichtlich der unterschiedlichen Entwicklung von Prozessparametern durch die Verwendung unterschiedlicher Substrate oder Substratmischungen. Anhand der verwendeten Primersets konnte die Gesamtheit aller Bacteria (BAC), Archaea (ARC) und hydrogenotrophen Methanogenen (ME) sowie aller Mitglieder der Methanosarcinaceae (MSarc) und Methanosaetaceae (MSaet) untersucht werden. Für die Analyse der mikrobiellen Gemeinschaft wurde zunächst die DNS aus den jeweiligen Proben extrahiert und die Ausbeute und Reinheit der extrahierten DNS bestimmt. Ein Überblick aus der Dreifachbestimmung der DNA-Extraktion ist in Tabelle 4.5 dargestellt. Als Startwert für die drei verschiedenen Fermenter wurde das Inoculum untersucht. Für die Monovergärung der Algenbiomasse wurden Proben nach 88, 164, 188 und 227 Tagen genommen. Für die Monovergärung von MS und die Kovergärung wurde zusätzlich eine Probe nach 245 Tagen untersucht. Die DNA-Ausbeute der Proben lag zwischen 4,55 und 39,41 ng µl -1. Die teilweise hohe Standardabweichung der einzelnen Präparationen zeigt die Notwendigkeit einer Dreifachbestimmung bei der DNS-Extraktion aus komplexen, faserhaltigen Umweltproben. Die Reinheit von DNS-Proben kann über die Verhältnisse der optischen Dichte bei 260 und 280 nm (OD 260 /OD 280 ) bzw. 260 und 230 nm (OD 260 /OD 230 ) beurteilt werden. Dabei gibt das Verhältnis OD 260 /OD 280 die Verunreinigung der Probe mit Proteinen und das Verhältnis OD 260 /OD 230 die Verunreinigung der Probe mit Kohlenhydraten, Phenol oder aromatischen Substanzen an. Das Verhältnis OD 260 /OD 280 sollte für reine Präparationen zwischen 1,8 und 2,2 und das Verhältnis OD 260 /OD 230 zwischen 1,5 und 1,8 liegen (Weiss et al., 2007). Für komplexe Umweltproben wie Präparationen aus Biogasanlagen ist das Erreichen einer solchen Reinheit unwahrscheinlich (Weiss et al., 2007). Für alle Proben (außer MS 245 d) ist das Verhältnis OD 260 /OD 280 unter 1,8 und das Verhältnis OD 260 /OD 230 unter 1,5. Trotz der Verunreinigung der Proben kann vorweg genommen werden, dass durch die folgende Verdünnung der Proben keine Auswirkung der Verunreinigung auf die PCR-Effizienz der einzelnen Proben beobachtet werden konnte. Die PCR-Effizienz war in allen Proben vergleichbar mit den Messungen der Standardreihen, für die reine DNS-Proben verwendet wurden.

107 4 Auswertung 99 Tabelle 4.5 DNS-Ausbeute und Reinheit (OD 260 /OD 280 und OD 260 /OD 230 ) der extrahierten DNS zur Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft Probe Probenahme DNS-Ausbeute OD 260 /OD 280 OD 260 /OD 230 d ng µl Inoculum 0 16,35 ± 6,68 1,21 ± 0,08 0,48 ± 0, ,41 ± 14,37 1,51 ± 0,08 0,87 ± 0, ,01 ± 6,31 1,60 ± 0,25 0,66 ± 0,27 A ,16 ± 7,37 1,57 ± 0,18 0,60 ± 0, ,47 ± 9,33 1,63 ± 0,04 0,65 ± 0, ,06 ± 1,65 1,26 ± 0,05 0,47 ± 0, ,64 ± 7,06 1,12 ± 0,05 0,45 ± 0,05 MS ,28 ± 7,73 1,04 ± 0,04 0,40 ± 0, ,87 ± 4,58 1,16 ± 0,06 0,49 ± 0, ,55 ± 0,16 1,89 ± 0,15 0,58 ± 0, ,82 ± 2,45 0,98 ± 0,14 0,35 ± 0, ,44 ± 11,84 1,07 ± 0,06 0,35 ± 0,10 1A/6MS ,40 ± 8,12 1,05 ± 0,00 0,36 ± 0, ,25 ± 6,28 1,04 ± 0,18 0,35 ± 0, ,20 ± 1,18 0,98 ± 0,24 0,35 ± 0,06 Nach der Extraktion der DNS aus den Fermenterproben wurde die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft mittels quantitativer Real-Time PCR (qpcr) für die fünf verschiedenen Primersets (BAC, ARC, ME, MSarc und MSaet) untersucht. Für alle Messungen wurde jeweils 1 ng DNS aus den Proben eingesetzt. Die erhaltenen C T -Werte wurden mit der eingesetzten Menge an Fermenterprobe und der Menge an extrahierter DNS aus den Fermenterproben auf g Frischmasse bezogen. Die Primersets, die als Zielsequenz ein Gen der 16S rrns aufweisen (BAC, ARC), können nicht quantitativ mit Primersets verglichen werden, die als Zielsequenz das mcra-gen aufweisen (ME, MSarc, MSaet). Unterschiedliche Mikroorganismen können eine unterschiedliche Anzahl an 16S rrns-kopien enthalten und eine unterschiedliche physiologische Aktivität aufweisen (Bergmann, 2011). Ein quantitativer Vergleich ist daher nur zwischen Proben zulässig, die mit dem gleichen Primerset untersucht wurden. Die Primersets mit dem mcra-gen als Zielsequenz können nicht untereinander verglichen werden, da für die einzelnen Sets abweichende PCR-Effizienzen bestimmt wurden. Aus diesem Grund wird im Folgenden ausschließlich die Entwicklung der

108 100 4 Auswertung jeweiligen Organismengruppe dargestellt und verglichen. Durch die Korrelation der Anzahl der Mikroorganismen mit verschiedenen Prozessparametern zum Zeitpunkt der Probenahme sollen Einflussfaktoren auf die Entwicklung der jeweiligen Organismengruppe identifiziert werden. Als Maß für die Korrelation wurde der Korrelationskoeffizient (R 2 ) aus der linearen Regression der zu vergleichenden Parameter gebildet. Korrelationskoeffizienten >0,5 deuten auf eine Korrelation der jeweiligen Parameter hin. Dabei wurden die Werte des Inoculums zu Beginn der Versuchsreihe, aufgrund der abweichenden Bedingungen zu den Versuchsanlagen, nicht berücksichtigt. Eine Korrelation mit einzelnen Spurenelementen war aufgrund der wenigen Spurenelementanalysen nicht möglich. Für das MSaet-Primerset wurde aufgrund der geringen Effizienz eine Nachweisgrenze bei einem C T -Wert von 24,71 bestimmt. Aufgrund der hohen Nachweisgrenze konnten keine Vertreter der Methanosaetaceae in den Fermenterproben nachgewiesen werden. Nachweis der Bacteria Der Nachweis aller Bacteria in Fermenterproben der semi-kontinuierlichen Monovergärung von Algenbiomasse und MS und in der Kovergärung der beiden Substrate erfolgte durch Quantifizierung (qpcr) eines 16S rrns-gens mit dem BAC-Primerset. Die Standardgerade wies für eine absolute Quantifizierung eine ausreichende Steigung (-3,42) und PCR-Effizienz (1,96) sowie eine gute Korrelation (R 2 =0,993) auf (siehe Abschnitt 3.5.3). Die Nachweisgrenze lag bei einem C T -Wert von 32,47 (mit steigendem CT-Wert nimmt die Anzahl der DNS-Kopien ab, siehe Abschnitt 3.5.3). Alle Messwerte der Fermenterproben wiesen einen C T -Wert zwischen 16,28 und 20,41 und lagen somit über der Nachweisgrenze im linearen Bereich der Standardgerade. Über die Parameter der Standardgerade wurden die CT-Werte in 16S rrns-kopien umgerechnet und auf g FM bezogen. Die Entwicklung der 16S rrns-kopien in den drei semi-kontinuierlichen Vergärungen über den Versuchszeitraum ist in Abbildung 4.34 dargestellt. In der semi-kontinuierlichen Monovergärung der Algenbiomasse konnte nach 88 Tagen eine signifikante Zunahme der Bakterien von 8, auf 2, S rrna-kopien pro g FM (+201%) im Vergleich zum Inoculum beobachtet werden. Durch die Verwendung von Algenbiomasse als Monosubstrat lag im Vergleich zum Inoculum ein Substrat mit deutlich abweichender chemischer Zusammensetzung vor, wodurch eine Anpassung der bakteriellen Biozönose an die veränderten Bedingungen notwendig war. Im weiteren Verlauf der Versuchsreihe konnte zunächst eine Abnahme der Bakterien auf 9, (nach 164 Tagen) und auf 4, S rrna-kopien pro g FM (nach 188 Tagen) und zum Ende eine Zunahme auf 6, S rrna-kopien pro g FM beobachtet werden. Diese Veränderungen korrelieren mit der Zunahme der Leitfähigkeit (R 2 =0,773), des Ammoniumgehaltes (R 2 =0,764), des FOS/TAC-Wertes (R 2 =0,833) und des ph- Wertes (R 2 =0,665). Die Veränderung von Leitfähigkeit und Ammoniumgehalt wurden in dieser Arbeit bereits als Einflussfaktoren für den anaeroben Abbau bei der Monovergärung der Algenbiomasse identifiziert. Zusätzlich zu diesen Einflussfaktoren hat die Akkumulierung der FOS als Endprodukte der acidogenen und acetogenen Reaktionswege einen negativen Einfluss auf die bakterielle Biozönose, vermutlich da die Zunahme der Endprodukte Einfluss auf freie Reaktionsenthalpien der bakteriellen Stoffwechselwege nimmt. Die Zunahme des ph-wertes durch die Freisetzung von Ammonium und trotz des Anstiegs von FOS weist einen negativen Einfluss auf die bakterielle Biozönose auf. Das ph-optimum der hydrolytischen und acidogenen Bakterien liegt

109 4 Auswertung 101 zwischen 5,5-6,5 und wird durch die Zunahme weiter aus dem Optimalbereich für die Bakterien verschoben. Zum Ende der Versuchsreihe nimmt die Bakterienanzahl analog zur Abnahme des FOS/TAC-Wertes wieder zu. Der weitere Anstieg der Leitfähigkeit und des Ammoniumgehaltes deutet auf eine Adaption der Biozönose an die veränderten Bedingungen hin. Abbildung 4.34 Entwicklung der Anzahl bakterieller 16S rrna-kopien pro g Frischmasse (logarithmische Auftragung) in der semi-kontinuierlichen Monovergärung von Algenbiomasse (A) und Maissilage (MS) und der Kovergärung (1A/6MS) durch quantitative Real-Time PCR mit dem BAC-Set In der Monovergärung von MS wurde nach 88 Tagen eine Abnahme der Bakterien (von 8, auf 6, S rrna-kopien pro g FM) im Vergleich zum Inoculum beobachtet. Im Vergleich zum Fermenterinhalt der großtechnischen Biogasanlage (Inoculum), welcher mit Maissilage und Rindergülle gefüttert wurde, liegt durch die Beschickung von MS als Monosubstrat im Versuch ein weniger komplexes Substratgemisch vor. In Anpassung an die weniger komplexe Beschickung und geringere RB nimmt die Anzahl der Bakterien ab. Im weiteren Verlauf lag in der Entwicklung ein weitestgehend positiver Trend (1, S rrna-kopien pro g FM nach 164 d, 9, S rrna-kopien pro g FM nach 188 d, 1, S rrna-kopien pro g FM nach 227 d) vor. Diese Entwicklung korreliert mit der Zunahme der RB (R 2 =0,928) und des FOS/TAC-Wertes (R 2 =0,865). Mit zunehmender Menge an Organik durch Erhöhung der RB liegt dementsprechend mehr verfügbare Organik für das Wachstum von Bakterien vor. Dies führt zu einer Erhöhung der Endprodukte (FOS) der bakteriellen Stoffwechselwege. Mit weiterer Erhöhung der RB wurde eine Abnahme der Bakterien (5, S rrna-kopien pro g FM nach 245 d) und eine Zunahme des

110 102 4 Auswertung FOS/TAC-Wertes beobachtet. Demnach führt die Zunahme der FOS über einen bestimmten Schwellenwert zu negativen Auswirkungen auf die bakterielle Biozönose. In der Kovergärung von Algenbiomasse und MS konnte zunächst eine Abnahme (6, S rrna-kopien pro g FM nach 88 d und 5, S rrna-kopien pro g FM nach 164 d) der Bakterienanzahl beobachtet werden. Nach 188 Versuchstagen nahm die Anzahl der Bakterien auf 5, S rrna-kopien pro g FM zu und nach 227 Versuchstagen auf 5, S rrna-kopien pro g FM ab. Zum Ende der Versuchsreihe konnte eine weitere Steigerung der Bakterienanzahl auf 7, S rrna-kopien pro g FM beobachtet werden. Während der Kovergärung von Algenbiomasse und Maissilage lag über den gesamten Versuchszeitraum ein stabiler Abbauprozess ohne Zunahme von FOS vor. Dies zeigt, dass keine der Prozessstufen im Verlauf des Versuchs aus dem Gleichgewicht gebracht wurde. Die Anzahl der Bakterien weist eine leichte Korrelation mit dem ph-wert (R 2 =0,523) auf, wobei die Bakterienanzahl wie bei der Monovergärung der Algenbiomasse mit steigendem ph-wert abnimmt. Anders als bei den Monovergärungen von Algenbiomasse und MS sind keine Abhängigkeiten von steigender Leitfähigkeit oder zunehmendem Ammoniumgehalt zu beobachten. Lediglich zum Versuchsende nahm die Bakterienzahl mit deutlicher Erhöhung der RB zu. Die Bakterienanzahl ist trotz der höchsten Substratkomplexität in der Kovergärung am geringsten und schwankt unabhängig von den Prozessbedingungen im Fermenter. Diese Entwicklung deutet darauf hin, dass die Kovergärung durch das komplexe Zusammenspiel der einzelnen Einflussfaktoren eine ausbalancierte bakterielle Biozönose aufrechterhalten kann, indem negativ wirkende Faktoren durch Anpassung der Biozönose ausgeglichen werden können. Die Funktionalität des Gesamtsystems verbleibt dadurch über den gesamten Versuchszeitraum im Gleichgewicht. Nachweis der Archaea Der Nachweis aller Archaea in Fermenterproben der semi-kontinuierlichen Monovergärung von Algenbiomasse und MS und in der Kovergärung der beiden Substrate erfolgte durch Quantifizierung (qpcr) eines 16S rrns-gens mit dem ARC-Primerset. Die Standardgerade wies für eine absolute Quantifizierung ausreichende Steigung (-3,85) und PCR-Effizienz (1,82) sowie eine gute Korrelation (R 2 =0,999) auf (siehe Abschnitt 3.5.3). Die Nachweisgrenze lag bei einem C T -Wert von 38,48. Alle Messwerte der Fermenterproben wiesen einen C T -Wert zwischen 24,12 und 30,92 und lagen somit über der Nachweisgrenze im linearen Bereich der Standardgerade. Über die Parameter der Standardgerade wurden die C T -Werte in 16S rrns-kopien umgerechnet und auf g FM bezogen. Die Entwicklung der 16S rrns-kopien in den drei semi-kontinuierlichen Anlagen über den Versuchszeitraum ist in Abbildung 4.35 dargestellt. In der Monovergärung der Algenbiomasse konnte eine Zunahme der Archaea von 3, auf 1, S rrna-kopien pro g FM (+308% nach 88 d) und auf 1, S rrna-kopien pro g FM bis zum 164. Versuchstag beobachtet werden. Im weiteren Verlauf nahm die Anzahl der Archaea bis zum Versuchsende ab (1, S rrna-kopien pro g FM nach 188 d, 4, S rrna-kopien pro g FM nach 227 d). Anders als bei den Bacteria wurden zunächst eine höhere Zunahme der Leitfähigkeit und des Ammoniumgehaltes toleriert bevor eine Abnahme der Archaea beobachtet werden konnte. Aufgrund der stabilen Methanproduktion am Ende der

111 4 Auswertung 103 Versuchsreihe kann angenommen werden, dass trotz der Abnahme der Gesamtanzahl ein geringerer Anteil spezialisierter Archaea unter den veränderten Bedingungen ausreichende physiologische Aktivität aufweist. Abbildung 4.35 Entwicklung der 16S rrna-kopien aller Archaea pro g Frischmasse (logarithmische Auftragung) in der semi-kontinuierlichen Monovergärung von Algenbiomasse (A) und Maissilage (MS) und der Kovergärung (1A/6MS) durch quantitative Real-Time PCR mit dem ARC-Set In der Monovergärung von MS wurde eine signifikante Zunahme der Archaea von 3, auf 3, S rrna-kopien pro g FM (+800%) in den ersten 88 Versuchstagen durch Anpassung an die veränderten Prozessbedingungen im Vergleich zum Inoculum bestimmt. Im weiteren Verlauf liegt die Veränderung der Anzahl der Archaea im Rahmen der Standardabweichung bei 2, S rrna-kopien pro g FM (nach 164, 188 und 227 Versuchstagen). Zum Versuchsende nimmt die Anzahl der Archaea signifikant auf 3, S rrna-kopien pro g FM ab. Die Abnahme der Organismen korreliert mit der Abnahme des ph-wertes (R 2 =0,560) sowie der Zunahme der RB (R 2 =0,521) und des FOS/TAC-Wertes (R 2 =0,888). Generell kann eine höhere Sensitivität der Archaea gegenüber einem Anstieg der FOS als bei Bacteria beobachtet werden, da die Anzahl der Organismen bereits nach 227 Versuchstagen abnimmt. Die Abnahme der Organismen zum Ende der Versuchsreihe betrifft Vertreter der Archaea und der Bacteria. Sowohl acetogene Bakterien, als auch syntrophe Acetatoxidierer sind aufgrund der thermodynamisch ungünstigen Reaktionen auf die Entfernung des gebildeten H 2 aus dem Reaktionsgleichgewicht durch Methanogene angewiesen (Vrieze et al., 2012). Aus diesem Grund wirkt sich eine signifikante Hemmung der Methanogenen auch auf die vorausgehenden Prozessstufen aus.

112 104 4 Auswertung In der Kovergärung von Algenbiomasse und MS liegen deutliche Schwankungen bezüglich der Anzahl von Archaea in den Fermenterproben vor. In den ersten 88 Versuchstagen nimmt die Anzahl der Archaea signifikant von 3, auf 4, S rrna-kopien pro g FM (+1141%) zu. Im weiteren Verlauf sinkt die Anzahl auf 2, (nach 164 Tagen) und auf 1, S rrna- Kopien pro g FM (nach188 Tagen). Nach 227 Versuchstagen konnte eine Zunahme der Vertreter der Archaea auf 5, S rrna-kopien pro g FM beobachtet werden. Zum Versuchsende nimmt die Anzahl auf 1, S rrna-kopien pro g FM ab. In den ersten 88 Versuchstagen konnte eine signifikante Veränderung der Leitfähigkeit und des Ammoniumgehaltes beobachtet werden, die das Wachstum der Archaea positiv beeinflusst hat. Weitere Abhängigkeiten der Anzahl der Organismen mit den vorliegenden Prozessparametern konnten nicht beobachtet werden. Nachweis der hydrogenotrophen Methanogenen und der Methanosarcinaceae Der Nachweis aller hydrogenotrophen Methanogenen und der Vertreter der Methanosarcinaceae in Fermenterproben der semi-kontinuierlichen Monovergärung von Algenbiomasse und MS und in der Kovergärung der beiden Substrate erfolgte durch Quantifizierung (qpcr) der α-untereinheit der Methyl-Coenzym-M Reduktase (mcra-gen) mit dem ME- bzw. dem MSarc-Primerset. Die Standardgerade des ME-Primersets wies aufgrund der hohen Steigung (-5,38) eine geringe PCR- Effizienz (1,53) auf, die für eine absolute Quantifizierung der Proben nicht ausreichend ist. Für den Standard mit 10 1 DNS-Kopien pro Ansatz konnte kein C T -Wert bestimmt werden, so dass die Nachweisgrenze bei 39,08 (höchster Messwert der Standardreihe, siehe Abschnitt 3.5.3) liegt. Alle C T -Werte der Fermenterproben lagen bis auf die Probe der Monovergärung von MS nach 245 Tagen (41,89) zwischen 29,36 und 36,95 im linearen Bereich der Standardgerade. Trotz der geringen Effizienz und der daraus resultierenden ungenauen absoluten Quantifizierung können die Proben für das Primerset untereinander verglichen werden. Die Entwicklung der auf mcra-kopien pro g Frischmasse bezogenen Werte sind in Abbildung 4.36 dargestellt. Die Standardgerade für das MSarc-Primerset wies für eine absolute Quantifizierung eine ideale Steigung (-3,32) und PCR-Effizienz (2,00) sowie eine gute Korrelation (R 2 =0,998) auf (siehe Abschnitt 3.5.3). Die Nachweisgrenze lag bei einem C T -Wert von 31,94. Alle Messwerte der Fermenterproben wiesen einen C T -Wert zwischen 20,36 und 25,15 auf und lagen somit über der Nachweisgrenze im linearen Bereich der Standardgerade. Über die Parameter der Standardgerade wurden die C T -Werte in mcra-kopien umgerechnet und auf g FM bezogen. Die Entwicklung der mcra-kopien in den drei semi-kontinuierlichen Vergärungen über den Versuchszeitraum ist in Abbildung 4.37 dargestellt. Sowohl die Entwicklung aller hydrogenotropher Methanogenen, als auch die Entwicklung der Vertreter der Methanosarcinaceae weisen einen ähnlichen Verlauf zur Entwicklung der Archaea auf. Für die Methanosarcinaceae und die Archaea liegt in der Monovergärung der Algenbiomasse eine Korrelation von 0,951, in der Monovergärung von MS von 0,912 und für die Kovergärung von 0,558 vor. Ohne die Archaea-Probe nach 227 Tagen, die eine hohe Standardabweichung in der Entwicklung der Proben in der Kovergärung zeigt, ergibt sich eine Korrelation von 0,984. Ohne Berücksichtigung der Proben nach 227 Tagen ergibt sich zwischen den hydrogenotrophen Methanogenen und Archaea eine Korrelation von 0,966 (Monovergärung A), 0,950

113 4 Auswertung 105 (Monovergärung MS) und 0,932 (Kovergärung). Aus diesen Beobachtungen lässt sich schließen, dass die hydrogenotrophen Methanogenen in allen drei Fermentern dominant sind. Abbildung 4.36 Entwicklung der mcra-kopien aller Methanosarcinaceae pro g Frischmasse (logarithmische Auftragung) in der semi-kontinuierlichen Monovergärung von Algenbiomasse (A) und Maissilage (MS) und der Kovergärung (1A/6MS) durch quantitative Real-Time PCR mit dem MSarc-Set Vertreter der Methanosarcinaceae können Methan sowohl hydrogenotroph (aus CO 2 und H 2 ), als auch acetoklastisch (aus Acetat) produzieren. Im Falle der hydrogenotrophen Bildung wird zusätzlich zum CO 2 und H 2 aus der hydrolytischen und acidogenen Phase das Acetat durch syntrophe Acetatoxidierer zu CO 2 und H 2 abgebaut (Vrieze et al., 2012). Die Messungen mit unterschiedlichen Primersets können aufgrund der unterschiedlichen PCR-Effizienz und der unterschiedlichen Zielgene nicht absolut miteinander verglichen werden. Aus diesem Grund kann der Anteil der Methanosarcinaceae an der Gesamtheit der Methanogenen nicht bestimmt und dementsprechend keine Aussage über den ablaufenden Stoffwechselweg getätigt werden. Allerdings wurde ein Wechsel von acetoklastischer zu hydrogenotropher Methanogenese bei Ammoniumkonzentrationen über 1,5-3 g L -1 oder erhöhter RB mit Akkumulierung von FOS (3 g L - 1 Acetat) beobachtet (Bergmann et al., 2010; Nettmann et al., 2010; Sasaki et al., 2011; Schnürer und Nordberg, 2008; Vrieze et al., 2012). Vertreter der Methanosaetaceae, die in dieser Arbeit aufgrund der hohen Nachweisgrenze nicht bestimmt werden konnten, dürften zum einem durch die hohen Ammoniumkonzentrationen (>1,8 g L -1 ) und durch das Vorhandensein von Vertretern der Methanosarcinaceae keine Rolle spielen. Vertreter der Methanosarcinaceae weisen gegenüber

114 106 4 Auswertung Methanosaetaceae einen Selektionsvorteil bei höheren Raumbelastungen (>2 kg ots m -3 d -1 ) und FOS-Konzentrationen (>1 g L -1 Acetat) auf (Nikolausz et al., 2013). In landwirtschaftlichen Biogasanlagen wurden bei RB über 1 kg ots m -3 d -1 ohne Versäuerung Vertreter der Methanobacteriales (obligat hydrogenotroph) und Methanosarcinaceae als dominant identifiziert (Munk et al., 2010). Vertreter der Methanosaetaceae lagen nur bei geringen Acetatkonzentrationen vor. Unter Bedingungen mit erhöhten Säurekonzentrationen dominierten Vertreter der Methanomicrobiales (obligat hydrogenotroph). Diese Beobachtungen konnten durch Bergmann et al. (2010) in einem mesophilen Fermenter mit Schweinegülle, Maissilage und Getreide als Hauptsubstrate bestätigt werden. Hier waren Vertreter der Methanomicrobiales aufgrund der Ammoniumkonzentration (4,3 g L -1 ) dominant. Die drei Laborfermenter in dieser Arbeit wiesen über den gesamten Versuchszeitraum entweder erhöhte Ammoniumkonzentrationen und/oder erhöhte Säurewerte auf. Zusammen mit der Korrelation der hydrogenotrophen Methanogenen mit der Gesamtanzahl der Archaea kann daher angenommen werden, dass das Methan in den semi-kontinuierlichen Versuchen vornehmlich über syntrophe Acetatoxidation und hydrogenotrophe Methanogenese gebildet wurde. Abbildung 4.37 Entwicklung der mcra-kopien aller hydrogenotropher Methanogenen pro g Frischmasse (logarithmische Auftragung) in der semi-kontinuierlichen Monovergärung von Algenbiomasse (A) und Maissilage (MS) und der Kovergärung (1A/6MS) durch quantitative Real- Time PCR mit dem ME-Set Zusammenfassend liegen in der Monovergärung der Algenbiomasse weniger Archaea vor als in der Monovergärung von MS und in der Kovergärung. In der Monovergärung der Algenbiomasse liegen zum einen ein geringerer Abbaugrad und eine geringere RB vor. Dies führt insgesamt zu einem