Anzahl der Aminosäuren Leu 5 -Enkephalin H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH 5 Neurotensin [8-13] Cha 13 -Bombesin [7-14] Neuropeptid Y [28-36]

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1 6 Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit wurden 19 Alkinderivate biogener Peptide hergestellt. Dazu wurden Methoden entwickelt, um die Alkingruppe während der Festphasenpeptidsynthese in das Peptid einzuführen. Es wurden Methoden etabliert, um die Alkinpeptide unabhängig von ihrer Sequenz mit Dicobaltoctacarbonyl in guter Ausbeute und Reinheit zu Cobaltalkin- Biokonjugaten umzusetzen. Diese wurden umfassend charakterisiert. Umfangreiche physikalisch-chemische Untersuchungen zur Stabilität, zur Lipophilie und zur Wechselwirkung mit Proteinen lieferten wichtige Anhaltspunkte für den Verbleib der Biokonjugate im menschlichen Körper. Im Hinblick auf die Aufklärung des zytotoxischen Wirkmechanismus wurden bei Zytotoxizitätsstudien an diversen humanen Krebszelllinien und Hefezellen vielversprechende IC 50 -Werte bestimmt. Darüber hinaus wurden im Hefeassay Hinweise auf DNA-Schädigung gefunden und die intrazelluläre Aufnahme der Biokonjugate wurde quantifiziert. Tabelle 6.1 Aminosäuresequenzen der biogenen Peptide, die im Rahmen dieser Arbeit mit einer Alkingruppe funktionalisiert wurden Peptid Aminosäuresequenz Anzahl der Aminosäuren Leu 5 -Enkephalin H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH 5 Neurotensin [8-13] Cha 13 -Bombesin [7-14] Neuropeptid Y [28-36] H-Arg-Arg-Pro-Phe-Ile-Leu-OH 6 H-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Cha-Met-NH 2 8 H-Ile-Asn-Pro-Ile-Phe-Arg-Leu-Arg-Tyr-NH 2 9 Tat [48-57] H-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-OH 10 Es wurden die Neuropeptide Enkephalin, Neurotensin, Neuropeptid Y, Bombesin und das cell penetrating peptide Tat zur Funktionalisierung mit der Cobaltalkingruppe ausgewählt (s. Tabelle 6.1). Die Neuropeptide binden hochaffin und selektiv an ihre Rezeptoren in den Zielgeweben. Diese Rezeptoren werden in Tumorzellen überexprimiert, zum Beispiel findet sich eine erhöhte Anzahl von Neuropeptid Y- und Bombesin-Rezeptoren in Brustkrebsgeweben. 118

2 Die zytotoxische Cobaltcarbonyl-Alkin-Gruppe wurde mit einem Neuropeptid konjugiert, welches selektiv an überexprimierte Rezeptoren in Tumorgeweben bindet. Die Biokonjugate wurden in die Tumorzellen aufgenommen und führten zum Absterben der Zellen. Das Peptid stellt mit der Alkin-Funktion den Liganden für die Cobaltcarbonyl-Gruppe bereit. Da die Kopplung von Dicobaltoctacarbonyl selektiv an der Dreifachbindung erfolgt, wird durch die Position der Alkingruppe im Peptid auch die Position des Cobaltalkins im Biokonjugat bestimmt. Für die Bindung eines Neuropeptid-Konjugats an seinen Rezeptor ist die Primärstruktur des Peptids wichtig. Ein freier Amino- oder Carboxyterminus oder bestimmte Aminosäuren können essentiell für die Rezeptorbindung sein. Daher ist es wichtig Methoden zu entwickeln, die es erlauben, die Cobaltalkingruppe an verschiedenen Positionen in ein Peptid einzubringen. Abbildung 6.1 Alkin-Funktionalisierung während der Festphasenpeptidsynthese (SPPS) an verschiedenen Positionen am Beispiel von Enkephalin: a) am C-Terminus durch Abspalten mit Propargylamin von einem Harz mit Sulfamylbutyryl-Linker, b) am N-Terminus durch Kopplung von Propinsäure, c) an der Seitenkette durch Einbau von Propargylglycin in die Sequenz Die Peptide wurden an der festen Phase synthetisiert (Fmoc-Solid Phase Peptide Synthesis, Fmoc-SPPS). Es wurden Methoden entwickelt, um die Alkinfunktion während der SPPS am 119

3 Carboxyterminus, am Aminoterminus oder in die Seitenkette der Peptidsequenz einzuführen. Einen Überblick über die verschiedenen Funktionalisierungsstellen am Beispiel von Enkephalin gibt Abbildung 6.1. Alle Alkinpeptide wurden in guter Ausbeute und Reinheit erhalten, ohne dass eine Aufreinigung nötig war. Da der Carboxyterminus während der Peptidsynthese an die feste Phase gebunden ist, wurde die C-terminale Alkinfunktion durch nucleophile Abspaltung von einem Sulfamylbutyryl-Linker mit Propargylamin eingeführt. Um den N-Terminus der Peptide mit der Alkingruppe zu funktionalisieren, wurde entweder mit einem modifizierten Kopplungsprotokoll Propinsäure oder unter Standardbedingungen Pentinsäure an die Peptidkette gekoppelt. An der Seitenkette wurde die Alkinfunktion durch Einbau der artifiziellen Aminosäure Propargylglycin (Pgl) eingeführt. Die Alkinkonjugate wurden mit allen gängigen Analysentechniken charakterisiert. Die Reinheit und Identität der Konjugate wurde mit HPLC und ESI-MS bestimmt, eine Sequenzierung des Peptids erfolgte durch Fragmentierung mit ESI-MS/MS. In 1 H-, 13 C- und 2D-NMR-Experimenten weisen die verschiedenen Alkingruppen charakteristische Verschiebungen und Kopplungen auf, die Aufschluss über die lokale Symmetrie geben. Abbildung 6.2 Reaktion von Propi-Enk-NH 2 21 mit Dicobaltoctacarbonyl zu Co-Propi-Enk-NH 2 41 Es wurden Cobaltalkin-Biokonjugate der Alkin-funktionalisierten Peptide hergestellt, die Reaktion ist am Beispiel der Umsetzung von Propi-Enk-NH 2 21 zu Co-Propi-Enk-NH 2 41 in Abbildung 6.2 gezeigt. Wie vollständig die Komplexierung mit Dicobaltoctacarbonyl abläuft, hängt von der Lipophilie der Alkinpeptide und somit von der Aminosäuresequenz ab. Tetrahydrofuran ist das Lösemittel der Wahl für die Cobalt-Komplexierung, da sich Dicobaltoctacarbonyl gut darin löst und stabil ist. Die Kopplung verlief stöchiometrisch, wenn auch das Alkinpeptid im Lösemittel Tetrahydrofuran (THF) löslich war. Mit anderen Lösemitteln oder bei Vorlage des Peptids als Suspension verlief die Kopplung zufriedenstellend aber nicht vollständig. In den meisten Fällen konnte das reine Cobaltalkin- Biokonjugat durch Filtrieren gewonnen werden. Die Biokonjugate wurden umfassend charakterisiert. Dabei konnten die in Tabelle 6.2 aufgelisteten spektroskopischen 120

4 Besonderheiten von Dicobalthexacarbonyl-Acetylen-Komplexen identifiziert werden. Dicobaltoctacarbonyl koppelte auch erfolgreich an ein an der festen Phase gebundenes Alkin- Neurotensinderivat, was sich über die Intensität der Carbonylbanden im Infrarotspektrum verfolgen ließ. Jedoch zersetzte sich das Biokonjugat während des Abspaltens von der festen Phase. Tabelle 6.2 Charakteristika von Cobaltalkin-Biokonjugaten bei verschiedenen Analysentechniken Technik HPLC UV Besonderheit der Cobaltalkin-Biokonjugate Erhöhung der Retentionszeit gegenüber dem Alkinpeptid 3 min < Δ t R < 5 min Bande bei λ = 354 nm 41: ε DMSO = 1687 l/mol cm, ε MeOH = 4386 l/mol cm IR intensive Carbonylbanden um ν = 2000 cm -1 ESI-MS FAB-MS NMR sukzessive Fragmentierung von cobaltgebundenem CO Δ m/z = 28 gleichzeitige Fragmentierung von cobaltgebundenem CO Δ m/z = 6 x 28 starke Tieffeldverschiebung des Alkinprotons Δ δ 3.5 ppm Die Cobaltalkin-Biokonjugate erwiesen sich bei Lagerung als Feststoff im Kühlschrank über Monate als stabil. Lösungen in Dimethylsulfoxid müssen dagegen direkt vor der Verwendung hergestellt werden. In Puffer gelöst sedimentiert das Biokonjugat nach einigen Stunden, was sich jedoch nicht nachteilig auf die Zellaufnahme und Zytotoxizität auswirkt. Als Maß für die Lipophilie wurde der logp-wert der Biokonjugate mit HPLC bestimmt. Durch die Komplexierung von Dicobalthexacarbonyl erhöht sich der logp-wert der Derivate um 1-2 Einheiten. Die logp-werte der Cobaltalkinderivate von Enkephalin und Pseudoneurotensin liegen zwischen 3 und 5, dem optimalen Bereich für gute Bioverfügbarkeit. Die Biokonjugate sind damit lipophil genug, um in die Zellmembran einzudringen, aber auch hydrophil genug, um die Zellmembran zum Zytoplasma hin wieder zu verlassen. Bei der Inkubation eines Biokonjugats mit kurzen artifiziellen Modellpeptiden werden Co 2+/3+ -Ionen aus dem Biokonjugat freigesetzt. Bei Fragmentierung der cobalthaltigen Spezies im ESI-MS wurde eine unspezifische Bindung des freigesetzten Cobaltatoms an das 121

5 Peptidrückgrat der Modellpeptide gefunden. Die Bindung findet nicht an einer klassischen Metallkoordinationsstelle in der Seitenkette des Modellpeptids statt. Alle getesteten Cobaltalkin-Biokonjugate zeigten zytotoxische Wirkung auf die humanen Zelllinien HeLa, HepG2 und HT-29 und auf Hefezellen, während die metallfreien Alkinpeptide keine Toxizität ausübten. Die höchste Zytotoxizität weist das N-terminalmodifizierte Enkephalinderivat Co-Propi-Enk-NH 2 41 auf. Die IC 50 -Werte bewegen sich hier zwischen 18 und 49 µm. Im Genotoxizität-Hefeassay finden sich für das getestete Biokonjugat 41 Hinweise auf DNA-Schäden. In Zellaufnahmestudien mit Atomabsorptionsspektroskopie akkumuliert 41 nach 6 h Inkubationszeit 1.5 fach in der Zelle. Tabelle 6.3 Charakteristika von Cobaltalkin-Biokonjugaten bei physikalisch-chemischen und biologischen Studien Studie Stabilität Lipophilie Wechselwirkung mit Peptid Zytotoxizität Genotoxizität Charakteristika von Cobaltalkin-Biokonjugaten stabil bei Lagerung als Feststoff bei 20 C Halbwertszeit in Phsophatpuffer, t 1/2 = 32 min logp-wert zwischen 3 und 5: gute Bioverfügbarkeit Freisetzung von Cobaltionen aus dem Biokonjugat Bindung am Peptidrückgrat IC 50 -Werte auf humane Krebszellinien und Hefezellen zwischen 18 und 70 µm DNA-Schädigung im Hefestamm GenTO1 Zellaufnahme 1.5 fache intrazelluläre Anreicherung von Cobalt nach 6 h Möglicherweise basiert die zytotoxische Wirkung von Cobaltalkin-Peptiden auf einer intrazellulären Freisetzung von Cobaltionen. Zum einen zersetzen sich die Biokonjugate in Puffer, zum anderen wurden Cobaltionen bei Inkubation mit Peptiden gefunden, was nahe legt, dass auch unter physiologischen Bedingungen Cobaltionen aus den Biokonjugaten freigesetzt werden. Die hohe Lipophilie (hoher logp-wert) der Biokonjugate und die intrazelluläre Anreicherung von Cobalt legt nahe, dass die Freisetzung von Cobaltionen erst nach Passieren der Zellmembran in der Zelle stattfindet. Auch die im Hefeassay gefundene genotoxische Wirkung der Biokonjugate durch DNA-Schädigung kann nur mit einer 122

6 intrazellulären Cobalt-Freisetzung erklärt werden. Der im Hefeassay gefundene DNA- Schaden durch die Biokonjugate lässt sich auf die intrazelluläre Wirkung von Cobaltionen zurückführen, da Cobaltsalze bekanntlich Krebs erzeugen. In Zytotoxizitätsstudien zeigte sich, dass die toxische Wirkung der Konjugate auf die Cobaltalkin-Einheit zurückzuführen ist. Sowohl das acetylierte Peptid als auch das Alkinfunktionalisierte Peptid weist keine Zytotoxizität auf. Auch für Dicobaltoctacarbonyl wurde nur eine geringe Toxizität gefunden. Daraus kann man folgern, dass das Peptid als Vektor dient, der die zytotoxische Cobalt-Alkin-Gruppe in die Zelle transportiert. Außerdem zeigt das Cobalt-Enkephalin-Derivat bei HT-29 Zellen, die einen Opioidrezeptor exprimieren, eine höhere Zytotoxizität, als bei anderen Zelllinien. Diese Beobachtung führt zu der Annahme, daß eine rezeptorvermittelte Aufnahme die Zytotoxizität der Biokonjugate verstärkt. Der auslösende Faktor der Zytotoxizität und Genotoxizität der Biokonjugate kann die Bindung der Cobaltionen an DNA, RNA oder DNA-assoziierte Proteine in der Zelle sein. Des Weiteren findet in der Zelle eine Redox-Reaktion statt, um die Cobaltionen aus dem Cobaltalkin-Biokonjugat freizusetzen. Da die Cobaltatome im Alkinkomplex in der Oxidationsstufe 0 vorliegen, müssen sie zu den in Lösung vorliegenden Oxidationsstufen II und III oxidiert werden. Bei der Aktivierung durch intrazelluläre Redoxprozesse kann es zur Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) kommen, was zu oxidativem Stress führt, der eine apoptotische Reaktion auslösen kann. Die Alkin-funktionalisierten Peptide sind ein gutes Ausgangsmaterial um weitere Organometall-Alkin-Komplexe herzustellen. Zum einen könnten Metallcarbonyl-Komplexe mit Ruthenium, Molybdän oder Osmium hergestellt werden. Deren Wirkung auf Zellen ließe sich mit der Wirkung von Cobaltalkin-Verbindungen vergleichen, um einen Einfluss des Metallzentrums zu analysieren. Zum anderen bieten Alkin-funktionalisierte Peptide Zugang zu einem weiten Feld von Biokonjugaten z.b. über Platin- und Gold-Phosphan-Verbindungen. Für die Aufklärung des Wirkmechanismus ist es wichtig, zu ermitteln in welchen subzellulären Kompartimenten (wie Zellkern oder Mitochondrien) das Cobalt-Biokonjugat engereichert wird, oder ob eine Bindung an bestimmte Proteine oder andere Zellstrukturen stattfindet. Interessant wäre auch, die Spezifizität der Rezeptorbindung von Peptid- Biokonjugaten über radioaktive Markierung zu quantifizieren. Weiterhin sollten mit den in dieser Arbeit etablierten Techniken weitere Konjugate von Neuropeptiden zum gezielten Ansteuern von Tumorgewebe hergestellt werden und auf ihre Wirkung untersucht werden. 123

7 Cobaltalkin-Biokonjugate konnten in guter Ausbeute und Reinheit über Festphasenpeptidsynthese gefolgt von der stöchiometrischen Umsetzung mit Dicobaltoctacarbonyl hergestellt werden. Die Biokonjugate wurden umfassend charakterisiert und weisen in biologischen Aktivitätsstudien mit humanen Krebszelllinien und Hefezellen Zytotoxizität auf. Die Freisetzung von Cobaltionen aus dem Biokonjugat, die hohe Lipophilie der Biokonjugate und die Anreicherung von Cobalt in der Zelle legen einen intrazellulären, Cobalt-vermittelten Wirkmechanismus nahe. Cobaltalkin-Peptid-Biokonjugate stellen daher einen guten Vektor dar, um die metallbasierte Zytotoxizität gezielt in Tumorzellen einzbringen. 124

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