Entwicklung einer Fucose-defizienten humanen Zelllinie zum verstärkten Einbau von Fucose-Analoga in Glykoproteinen

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1 Entwicklung einer Fucose-defizienten humanen Zelllinie zum verstärkten Einbau von Fucose-Analoga in Glykoproteinen Dr. Stefan O. Reinke, Prof. Dr. Stephan Hinderlich Forschungsschwerpunkt: Glykobiotechnologie Kooperationspartner: Glycotope GmbH Kurzfassung Die Modifikation mit Kohlenhydratketten ist essentiell für physiologische sow ie pathologische Funktionen von Zellmembranproteinen. Diese Glykane haben eine komplexe Struktur, unter anderem mit dem Desoxyzucker Fucose. Als vielversprechendes Werkzeug für die Produktion von nicht-fucosylierten Glykoproteinen haben wir eine Zelllinie entwickelt, die biosynthetisch keine Fucose mehr produziert. Diese Zellen können auch für den gezielten Einbau reaktiver funktioneller Gruppen über Fucoseanaloga mit anschließender Konjugation biophysikalischer Label genutzt werden. Abstract Modification of cell membrane proteins by carbohydrate chains is essential for their physiological as well as pathological functions. These glycans display a complex structure, including the desoxy sugar fucose. As a promising tool for the production of non-fucosylated glycoproteins a cell line was develpoped which is unable for the bioynthetic production of fucose. These cells are also suited for the incorporation of functional groups via fucose analogues, followed by the conjugation of biophysical labels. Einleitung Die Glykobiotechnologie beschäftigt sich mit der Glykosylierung von Proteinen, eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen, sowie mit der Herstellung neuartiger Glykoproteine. Für die volle Funktionalität werden membrangebundenen und sekretorischen Glykoproteine durch Kohlenhydrateinheiten (Glykane) spezifisch modifiziert (Abbildung 1A). Der Kohlenhydratanteil kann bis zu 85 % betragen und in Zusammensetzung und Struktur variieren. Die Glykane bestehen aus zahlreichen verschiedenen Zuckern (Monosacchariden). Einer der funktionell wichtigsten Zucker ist der Desoxyzucker Fucose (Abbildung 1B), welcher terminal in den Glykanketten zu finden ist. In aktuellen Studien lässt sich eine direkte Korrelation zwischen einer erhöhten Fucosylierung und dem erhöhten Aufkommen verschiedener Karzinome feststellen. Die Fucose kommt in der Natur als L-Form vor, was bei Zuckern selten der Fall ist, während die D-Form ein künstlich hergestelltes Galactose-Analogon ist. Nach der zellulären Aufnahme von D-Mannose und die Umwandlung in die aktive Form GDP-D-Mannose startet die de novo-biosynthese der L-Fucose (Abbildung 2). In einem ersten Schritt wird GDP-D-Mannose durch das Enzym GDP-Mannose-4,6-Dehydratase (GMD) oxidiert und zu GDP-4-Keto-6-Deoxymannose A B Abb. 1: (A) Schematischer Aufbau eines komplexen, tetraantennären N-Glykans. Fucose ( ) kann sowohl verschiedene Positionen als auch unterschiedliche Verknüpfungen einnehmen. (B) Struktur der L-Fucose. Fucose zählt zu den Aldohexosen und gehört zu den Desoxyzuckern, da an der C6-Position eine Methylgruppe vorhanden ist. 33

2 Abb. 2: De novo-biosynthese und Salvage-Pathway von GDP-L-Fucose in humanen Zellen. umgesetzt. In den nächsten beiden Schritten wird GDP- 4-Keto-6-Deoxymannose zunächst epimerisiert zu GDP- 4-Keto-6-Deoxygalactose und anschließend reduziert zu GDP-Fucose. Diese beiden Schritte werden von einem Enzym (FX-Protein) katalysiert, welches sowohl eine Epimerase- als auch eine Reduktaseaktivität besitzt. Abschließend wird GDP-Fucose in den Golgi-Apparat transportiert und dort von spezifischen Fucosyltransferasen auf die Glykane der Glykokonjugate übertragen. L-Fucose kann ebenfalls zellulär aufgenommen und über einen Recyclingweg (Salvage-Pathway) in zwei Schritten zu GDP-L-Fucose umgewandelt werden (Abbildung 2). Ziel des Projektes der Forschungsassistenz war die Entwicklung von Methoden für den effizienten Einbau von Fucose-ähnlichen Substanzen (Fucoseanaloga) in die Glykanen von Glykoproteinen. Für die Inkorporation musste zunächst die zelluläre Synthese der endogenen Fucose herunterreguliert werden. Dazu musste ein universell geeignetes Tool gefunden werden, da die Zahl humaner Zelllinien mit intaktem Fucose-Stoffwechsel sehr vielfältig ist. Diese unterscheiden sich unter anderem in adhärente (anhaftende) Zellen und Suspensionszellen. Das Ausschalten des intakten Fucose-Stoffwechsel humaner Zelllinien erfolgte über die verminderte Expression (Knock-Down) der GDP-Mannose-4,6-Dehydratase (GMD) mittels RNA-Interferenz. Die RNA-Interferenz ist eine Methode, die mrna- Expression sequenzspezifisch zu regulieren. Durch die Transfektion (Einbringen von Fremd-RNA) humaner Zelllinien mit short hairpin RNA (shrna) kommt es innerhalb der Zelle zur Bildung doppelsträngiger RNA-Moleküle (dsrna). Diese dsrna wird enzymatisch zu Basenpaar-langen Fragmenten, die jeweils am 3 -Ende einen Dinukleotid-Überhang besitzen, gespalten. Diese Fragmente werden als small interfering RNA (sirna) bezeichnet. Anschließend kommt es zum Entwinden der sirna-fragmente am sogenannten RISC-Komplex (RNA-induced silencing complex). Nach Anlagern des Antisense-Strangs an die Ziel-mRNA kommt es zur Spaltung und damit zum gezielten Abbau der mrna durch den RISC-Komplex. Durch den Knock-Down der Fucose-spezifischen Stoffwechselenzyme war ein gezielter Einbau von Fucoseanaloga möglich und es konnten durch chemische Modifikationen der Fucoseanaloga Kopplungsreaktionen (Click-Chemie) an den Glykoproteinen stattfinden. Ergebnisse Der Knock-Down der GDP-Mannose-4,6-Dehydratase (GMD) wurde in adhärenten humanen embryonalen Nierenzellen (HEK293T) durchgeführt. Die Zellen wurden mit verschiedenen shrna-vektoren transfiziert, wobei sich herausstellte, dass sich drei der Vektoren zu einem sichtlichen Knock-Down der mrna eigneten. Von den erfolgreich transfizierten Zellen wurde eine Subklonierung durchgeführt, was schlussendlich zu fünf stabilen 34

3 A B Abb. 3: (A) Agarose-Gelelektrophorese der stabil transfizierten shrna-subklone. Fünf Subklone zeigen eine deutliche Reduzierung des GMD-mRNA-Level gegenüber den untransfizierten HEK293T-Zellen. (B) Western-Blot-Analyse der stabil transfizierten shrna-klone. Die Subklone zeigen auf Proteinebene ebenfalls eine signifikante Reduktion der GMD- Expression. Abb. 4: Lektin-Blot-Analyse von isolierten Membranproteinen, die elektrophoretisch aufgetrennt und mit dem AAL-I-Lektin nachgewiesen wurden. Die Klone sh71/c1 und sh71/e3 zeigen ein verminderten Fucose-Spiegel gegenüber den untransfizierten HEK293T-Zellen. Klonen führte, die einen defizienten Fucosestoffwechsel aufwiesen. Die HEK293T-Klone wurden durch Reverse- Transkriptase-PCR und Western-Blot-Analysen untersucht (Abbildung 3). Für die RT-PCR wurde jeweils die mrna der Zellen isoliert und in cdna umgeschrieben. Letztlich wurde die GMD mit genspezifischen Primern nachgewiesen. Für den Western-Blot wurden die Zellen aufgeschlossen und die cytosolischen Proteine wurden elektrophoretisch aufgetrennt. Nach dem Western- Blotting-Verfahren erfolgte der Nachweis über einen Abb. 5: Exemplarisches Chromatogramm einer HPAEC-PAD-Analyse des sh71/e3-hek293t-klons. Chromatographische Auftrennung der einzelnen Monosaccharide der Membranproteine von shrna-transfizierten, subklonierten HEK 293T-Zellen. Durch Zusetzen eines internen Standards lässt sich der Fucose-Gehalt quantifizieren und vergleichen. 35

4 Abb. 6: Kopplungsreaktion des in den Membranproteinen eingebauten Fucose-Alkin. Das Alkin reagiert Kupfer(I)-katalytisch mit der Azid-Gruppierung unter einer Ringbildung. Das Biotin kann mit dem natürlichen Liganden Streptavidin, konjugiert mit einer Peroxidase, nachgewiesen werden. GMD-spezifischen Antikörper. Es wurden stark verminderte Expressionsraten des Stoffwechselenzyms sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene nachgewiesen. Als nächstes sollte untersucht werden, ob der defiziente Fucosestoffwechsel auch zu einer verminderten Fucosylierung der Glykane führt. Dazu wurden die kovalent verknüpften Glykane der Membranproteine der transfizierten Zellen mittels eines Lektin-Blots (Abbildung 4) und einer hochauflösenden Anionenaustauschchromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion (HPAEC-PAD) zur Analyse der Monosaccharide untersucht und mit den untransfizierten Zellen auf ihren Fucosylierungsgrad hin verglichen. Dazu wurden für den Lektin-Blot die Membranproteine mittels Rohmembranpräparation isoliert und anschließend jeweils gleiche Mengen auf eine SDS-PAGE aufgetragen. Es erfolgte ein Transfer auf eine Nitrocellulose-Membran und der spezifische Nachweis von Fucosen durch das Lektin AAL-I-, welches mit Biotin konjugiert war. Die Entwicklung erfolgte über ein Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Biotin-Antikörper. Die Ergebnisse des Lektin-Blots korrelieren mit den RT-PCR- und Western-Blot-Ergebnissen. In den Klonen sh68/2 C3, sh71/2 C1 und sh71/2 E3 ist ein signifikant verminderter Fucosylierungsgehalt in den Glykanen der Membranproteine zu beobachten. Zur Verifizierung der oben erhaltenen Ergebnisse wurde zusätzlich eine HPAEC-PAD durchgeführt. Dafür wurden von den nach der Rohmembranpräparation erhaltenen Proteinen die Glykane säurehydrolytisch mittels Trifluoressigsäure abgespalten und in die einzelnen Monosaccharide zerlegt. Die Monosaccharide wurden anschließend säulenchromatographisch aufgetrennt, was einen spezifischen Fucosenachweis ermöglichte (Abbildung 5). Die Quantifizierung der Chromatogramme ergab für die Fucosestoffwechsel-defizienten HEK293T-Zellklone sh71/c1 und sh71/e3 eine Reduzierung des Fucose-Gehalts von mehr als 50 % im Vergleich zu unmodifizierten HEK293T-Zellen bzw. Kontrollklonen. Für die Optimierung der Inkorporation des kommerziell erhältlichen Zuckeranalogons Fucose-Alkin wurde zunächst die humane Jurkat-Zelllinie, in der der Fucose-Stoffwechsel nicht manipuliert ist, mit verschiedenen Analogakonzentrationen gefüttert. Der Nachweis für einen erfolgreichen Einbau erfolgte über Kopplungsreaktionen mit einem Biotin-Azid (Abbildung 6). Nach der Click-Reaktion wurde erneut ein Western-Blot-Verfahren durchgeführt. Dazu wurden die isolierten Membranproteine elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Dort erfolgte der Nachweis des gekoppelten Biotins mittels Streptavidin, einem natürlichen Liganden des Biotins, welches mit einer Peroxidase konjugiert ist, die wiederum eine enzymatische Farbreaktion katalysiert. Für die Jurkat-Zellen konnte bei einer Konzentration ab 50 μm Fucose-Alkin ein effektiver Einbau des Fucoseanalogons in Glykoproteine nachgewiesen werden (Abbildung 7). Abb. 7: Western-Blot-Analyse von Membranproteinen, die Fucose-Alkin inkorporiert haben und anschließend mit Biotin gekoppelt wurden. Ab einer Konzentration von 50 μm lässt sich in Jurkat-Zellen ein erhöhter Einbau an Fucose-Analoga effektiv nachweisen. 36

5 Durch den Nachweis einer verminderten Fucosylierung wurden die stabil shrna-transfizierten HEK293T- Zellen ebenfalls mit dem Zuckeranaloga Fucose-Alkin in verschiedenen Konzentrationen gefüttert, um den Einbau in den Glykanen zu untersuchen. Zum einen läßt sich in den Fucosestoffwechsel-defizienten sh71/e3-zellen ein stärkerer Einbau an Fucose-Alkin gegenüber den HEK293T-Zellen feststellen, zum anderen konnte schon ab einer Konzentration von 20 μm ein Einbau beobachtet werden (Abbildung 8). Dadurch gelang der erste Nachweis der Optimierung des Fucoseanaloga-Einbaus durch die Generierung Fucosestoffwechsel-defizienter Zellen. Abb. 8: Western-Blot-Analyse von Membranproteinen aus Fucose-defizienten HEK293T-Zellen, die Fucose-Alkin inkorporiert haben und anschließend mit Biotin gekoppelt wurden. Bereits ab einer Konzentration von 20 μm lässt sich ein Einbau nachweisen. Ausblick Die Glykosylierung als eine der wichtigsten Modifikationen von Proteinen ist das Kernthema der Glykobiotechnologie. Die Herstellung von Glykoproteinen mit modifizierter und dadurch optimierter Glykosylierung ist das Ziel der zweiten Phase glykobiotechnologischer Entwicklungen. Wir konnten humane HEK293T-Zelllinien so manipulieren, dass es zu einem stark reduzierten Einbau von Fucose in die Kohlenhydratketten gekommen ist. Gleichzeitig gelang durch die äußere Zugabe von Fucoseanaloga die gezielte Integration reaktiver funktioneller Gruppen in Glykane. Durch Kopplungsreaktionen (Click-Chemie) konnte der Einbau der Analoga über Biotin nachgewiesen werden. Langfristig können in den Kopplungsreaktionen anstatt Biotin Fluoreszenzfarbstoffe oder radioaktive Substanzen für diagnostische Zwecke, bildgebene Verfahren, oder Zytostatika für die Krebstherapie verwendet werden. Literatur C.P. Hackenberger, S. Hinderlich. Chemoselective labeling of engineered fucosylated glycoproteins. Chembiochem. 2007; 8; H. Imai-Nishiya, K. Mori, M. Inoue, M. Wakitani, S. Iida, K. Shitara, M. Satoh. Double knockdown of alpha1,6-fucosyltransferase (FUT8) and GDPmannose 4,6-dehydratase (GMD) in antibodyproducing cells: a new strategy for generating fully non-fucosylated therapeutic antibodies with enhanced ADCC. BMC Biotechnol. 2007; 7:84. A. Varki, R.D. Cummings, J.D. Esko, H.H. Freeze, P. Stanley, C.R. Bertozzi, G.W. Hart and M.E. Etzler. Essentials of Glycobiology (2nd edition). Cold Spring Harbor, NY, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press K.W. Dehnert, B.J. Beahm, T.T. Huynh, J.M. Baskin, S.T. Laughlin, W. Wang, P. Wu, S.L. Amacher, C.R. Bertozzi. Metabolic labeling of fucosylated glycans in developing zebrafish. ACS Chem Biol. 2011; 6; T.W. Liu, H. Kaji, A. Togayachi, H. Ito, T. Sato, H. Narimatsu. A chemoenzymatic approach toward the identification of fucosylated glycoproteins and mapping of N-glycan sites. Glycobiology. 2012; 22; S.O. Reinke, M. Bayer, M. Berger, S. Hinderlich, V. Blanchard. The analysis of N-glycans of cell membrane proteins from human hematopoietic cell lines reveals distinctions in their pattern. Biol Chem. 2012; 393; Kontakt Dr. Stefan Reinke Beuth Hochschule für Technik Berlin Fachbereich V Life Sciences & Technology Seestr Berlin Tel: (030) stefan.reinke@beuth-hochschule.de Prof. Dr. Stephan Hinderlich Beuth Hochschule für Technik Berlin Fachbereich V Life Sciences & Technology Seestr Berlin Tel: (030) stephan.hinderlich@beuth-hochschule.de 37

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