Expression, Renaturierung und Charakterisierung von menschlichem p53

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1 Institut für Organische Chemie und Biochemie Lehrstuhl für Biotechnologie Expression, Renaturierung und Charakterisierung von menschlichem p53 Stefan Bell Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. St. Glaser Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. J. Buchner 2. Univ.-Prof. Dr. A. Gierl Die Dissertation wurde am bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät für Chemie am angenommen.

2 Inhaltsverzeichnis 1 1 EINLEITUNG Expression rekombinant erzeugter Proteine in E.coli Expressionsvektoren und stämme Expression als inclusion bodies Proteinfaltung Proteinfaltung in vivo Proteinfaltung in vitro Renaturierung von inclusion body -Proteinen Das Tumorsuppressorprotein p Die p53-familie Struktur von p Funktion und Regulation Konformationelle Flexibilität Faltung und Stabilität Wechselwirkung mit Chaperonen Problemstellung MATERIAL UND METHODEN Verwendetes Material Chemikalien Enzyme und Proteine Antikörper Standards und Kits Materialien für die Chromatographie Weitere Materialien Bakterienstämme Plasmide Oligodesoxynukleotide Antibiotika und Nährmedien (Sambrook et al., 1989) Puffer und Lösungen Geräte Computerprogramme Molekularbiologische Methoden Kultivierung und Konservierung von E.coli-Stämmen (Sambrook et al., 1989) Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli PCR-Amplifikation (Mullis & Faloona, 1987) Extraktion von DNA aus Agarosegelen Reinigung von PCR-Produkten und DNA-Fragmenten Enzymatische Modifizierung von DNA Agarose-Gelelektrophorese (Sambrook et al., 1989) Transformation von E.coli-Zellen Sequenzierung von Plasmid-DNA Fällung von DNA Test auf Plasmidstabilität Präparative Methoden Analyse der Proteinexpression Anzucht und Induktion Zellernte und Aufschlußmethoden Präparation und Solubilisierung von inclusion bodies Chromatographische Methoden Aufkonzentrierung und Dialyse... 64

3 Inhaltsverzeichnis Proteinchemische Methoden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Protein-Nachweismethoden Densitometrie Immunoblotting (Western Blot) Protein-Sequenzblot Renaturierung von p Analytische Proteinfällungsmethoden Analytische Gelfiltration durch HPLC Quervernetzung von Proteinen Analytische Ultrazentrifugation Immunopräzipitation Blue Native PAGE Spektroskopische Methoden Absorptionsspektroskopie Fluoreszenzspektroskopie Circulardichroismus (CD) Lichtstreuung Lichttrübung DNA-Bindungsassay (EMSA) Methoden zur Untersuchung der Stabilität von Proteinen In vitro Translation/Transkription von Proteinen In vitro Translation/Transkription im RTS-System In vitro Translation/Transkription im Retikulozytenlysat ERGEBNISSE Konstruktion der Expressionsplasmide Expressionsanalysen von wt-p Expression im Gesamtlysat Analyse der verschiedenen Zellfraktionen Einfluss der Temperatur auf die lösliche Expression Einfluss von Chaperonen und Thioredoxin Induktionsbedingungen Einfluss des dnay/argu-genprodukts Vergleich verschiedener Aufschlussmethoden Reinigungsanalysen und Optimierungen Renaturierung von wt-p53 aus inclusion bodies Produktion als inclusion bodies Renaturierungsprotokoll Optimierung des Renaturierungspuffers Einfluss von ph-wert und Temperatur Aggregation und Konzentrationsabhängigkeit Renaturierungskinetik und Pulsrenaturierung Ausbeuten und Quantifizierung Reinigung von renaturiertem p Charakterisierung von renaturiertem wt-p Allgemeine Eigenschaften von menschlichem wt-p Aktivität von renaturiertem p Quartärstruktur von renaturiertem p Spektroskopische Charakterisierung von renaturiertem p

4 Inhaltsverzeichnis Konformation von renaturiertem p Stabilität und Lagerung von renaturiertem p Expression und Reinigung von His-p Expression und Reinigung von N93p Charakterisierung von wt-p53 und N93p Allgemeine Eigenschaften von menschlichem N93p53 und wt-his-p Aktivität Quartärstruktur Spektroskopische Charakterisierung Konformation Stabilität gegen Denaturierung p53 und seine Wechselwirkung mit Chaperonen Renaturierung von p53 mit Chaperonen Expression im E.coli-Lysat (RTS-System) Expression im Retikulozyten-Lysat DISKUSSION Rekombinante Expression von p Expression in E.coli Expression in in vitro-systemen Renaturierung von p Charakterisierung von renaturiertem p53, wt-p53 und N93p ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS ABKÜRZUNGEN

5 Einleitung 4 1 Einleitung 1.1 Expression rekombinant erzeugter Proteine in E.coli Die Wahl des Expressionssystems zur Produktion großer Mengen rekombinanten Proteins hängt von vielen Faktoren ab, wie z.b. Zellwachstum, Expressionslevel, evtl. nötige oder zu vermeidende posttranslationale Modifikationen, biologische Aktivität, Fermentationsbedingungen und Handhabbarkeit. Neben Hefe, Insekten- und Säugerzellen ist besonders die Expression in Bakterien gut untersucht und wird oft verwendet (Makrides, 1996; Swartz, 1996). Die Produktion rekombinant erzeugter Proteine in E.coli gelang erstmals für Somatostatin (Itakura et al., 1977), Insulin (Goeddel et al., 1979a) und menschliches Wachstumshormon (Goeddel et al., 1979b). Prinzipiell versucht man, ein rekombinant erzeugtes Protein in löslicher Form, biologisch aktiv und in möglichst hohen Ausbeuten zu erhalten. Das E.coli-Expressionssystem besitzt zahlreiche Vorteile, die es in vielen Fällen zum Mittel der Wahl machen. E.coli ist einer der genetisch und physiologisch am besten verstandenen Organismen. Dies erlaubt eine rasche genetische Manipulation und Anpassung sowohl des Expressionsvektors inklusive des Proteingens, als auch des gesamten Bakteriengenoms, wie z.b. die Reduktion der Proteaseaktivität (Baneyx et al., 1991) oder spezifische Anpassungen des Metabolismus an die erhöhte Proteinsyntheserate. Aufgrund des schnellen Wachstums zu hohen Zelldichten und der einfachen Handhabung ist eine preiswerte Produktion des rekombinanten Proteins möglich. In E.coli stehen zur Expression rekombinanter Proteine mehrere Strategien mit individuellen Vor- und Nachteilen zur Verfügung (Cornelis, 2000; Makrides, 1996; Swartz, 1996): Expression im Zytoplasma (löslich oder als inclusion body ) Expression durch Sekretion (Periplasma oder extrazellulär) Expression als Fusionsprotein bzw. mit Tags Die begrenzte Fähigkeit zur Ausbildung von Disulfidbrücken und die mögliche toxische Wirkung eines Fremdproteins auf das Wachstum und die Lebensfähigkeit der Zelle stellen Nachteile der Expression in E.coli dar (Makrides, 1996). Weitere Einschränkungen, die zum Teil aber auch vorteilhaft sein können, bestehen zum einen darin, dass E.coli nicht in der Lage ist, posttranslationale Modifikationen von Proteinen durchzuführen, was vor allem für eukaryotische Proteine wichtig sein kann. Zum anderen kann das Problem der Bildung von unlöslichen inclusion bodies auftreten, die eine anschließende Extraktion und in vitro-faltung nötig machen. Die Extraktion und Rückfaltung aus inclusion bodies kann inzwischen aber häufig erfolgreich durchgeführt werden (Buchner & Rudolph, 1991; De Bernadez Clark, 1998; Lilie et al., 1998; Rudolph, 1990; Rudolph & Lilie, 1996). Das Auftreten von inclusion bodies kann

6 Einleitung 5 in vielen Fällen durch die Erzeugung von Fusionsproteinen, der Verwendung von N- oder C- terminalen Tags, Ko-Expression von Chaperonen oder Thioredoxin (Yasukawa et al., 1995) oder durch periplasmatische Expression umgangen werden (Plückthun & Skerra, 1989). Ein grundsätzliches Problem der Expression rekombinanter Proteine ist ihre Stabilität in der Zelle. E.coli besitzt eine große Zahl von Proteasen im Zytoplasma, im Periplasma und in der inneren und äußeren Membran, die dem selektiven Abbau abnormer bzw. fremder Proteine dienen (Goldberg & Goff, 1986; Maurizi, 1992). Inaktivierende Mutationen in den verschiedenen Proteasegenen haben sich als hilfreich erwiesen, können aber auch den Zellmetabolismus negativ beeinflussen (Baneyx et al., 1991; Gottesman, 1990). Für eine Akkumulation von Proteinen sind, abhängig vom Zielkompartiment, Inaktivierungen der zytoplasmatischen Proteasen La und Clp und des Sigmafaktors htpr/rpoh (induziert Hitzeschockproteine und Proteasen) sowie der periplasmatischen Proteasen HtrA, OmpT und Protease III sinnvoll (Makrides, 1996; Swartz, 1996) Expressionsvektoren und stämme Das verwendete Expressionsplasmid zur Produktion des gewünschten Proteins muss zahlreiche Voraussetzungen erfüllen, um eine erfolgreiche Expression zu gewährleisten. Essentielle Elemente sind ein Replikationsursprung, ein Selektionsmarker (im allgemeinen ein Antibiotikumresistenzgen), eine multiple cloning site (MCS) und die Proteinexpressionselemente, bestehend aus Promotor, Ribosomenbindestelle (RBS), Sekretionssignal und Transkriptions- bzw. Translationsterminator (Makrides, 1996; Swartz, 1996). Der Replikationsursprung bestimmt die Anzahl der Plasmide pro Bakterienzelle (Polisky, 1988). Eine hohe Plasmidanzahl führt zu einem höheren Gendosiseffekt, hat aber den Nachteil, dass der Aufwand für die Plasmidreplikation eine erhebliche Belastung des Metabolismus darstellen kann (Betenbaugh et al., 1989; Birnbaum & Bailey, 1991; Seo & Bailey, 1985). Entscheidender für die Steigerung der Produktmenge ist deshalb eher die Wahl des Promotors. Ein guter Promotor sollte hohe Transkriptionsraten haben, einfach induzierbar und streng reguliert sein (Makrides, 1996; Swartz, 1996). Letzteres verhindert eine basale Expression des evtl. toxischen Strukturgens (Brown & Campell, 1993), was auch Plasmidinstabilität und eine Verringerung der Wachstumsrate verursachen kann (Bentley et al., 1990). Häufig verwendete Promotoren sind der lacuv5-promotor, der trp-promotor, das Arabinose-System, der T5- und der T7-Promotor (Makrides, 1996; Swartz, 1996; Studier et al., 1990). Neben den Transkriptionselementen stellen die Translationselemente ebenfalls einen sehr wichtigen Punkt für die Expression rekombinanter Proteine dar. Für die Initiation der Translation ist eine starke Ribosomenbindestelle mit optimalem Abstand zum Startcodon AUG und eine

7 Einleitung 6 Minimierung der Stabilität der RNA-Sekundärstruktur in diesem Bereich von Vorteil (Ringquist et al., 1992). Desweiteren kann die Codonusage einen Effekt auf die Proteinproduktion haben (Brinkmann et al., 1989; Schenk et al., 1995). Wie auch die Transkription benötigt die Translation ein eindeutiges und effektives Terminationssignal (z.b. UAAU in E.coli) (Poole et al., 1995). Die Wahl des E.coli-Stamms als Wirtsorganismus hat ebenfalls eine große Bedeutung für eine erfolgreiche Expression, denn die Bakterienzelle stellt die komplette Zellumgebung für die Proteinproduktion zur Verfügung und muss gleichzeitig das erzeugte Protein evtl. exportieren oder stabil lagern (Swartz, 1996). Durch gentechnische Methoden konnten sowohl Verbesserungen bzgl. des Grundmetabolismus eingeführt werden (Jensen & Carlsen, 1990), als auch die Proteaseaktivität verringert werden (Meerman & Georgiou, 1994) Expression als inclusion bodies Die Überexpression rekombinanter Proteine führt, unabhängig vom Wirtsorganismus oder Zellkompartiment, häufig zur Bildung von unlöslichem, nicht-nativen Protein in Form von inclusion bodies (IBs) (Lilie et al., 1998). Dies konnte auch in einem Structural Genomics - Ansatz für ein Archaebakterium bestätigt werden, bei dem 1/3 aller nicht-membranproteine unlöslich als inclusion bodies exprimiert wurde (Christendat et al., 2000). Dabei konnte bisher nur eine schwache Korrelation zwischen der Bildung der IBs und den Eigenschaften des exprimierten Proteins festgestellt werden (Christendat et al., 2000), abgesehen von Proteinen mit Disulfidbrücken. Der Anstieg der Konzentration nicht-nativer Polypeptidketten aufgrund hoher Expressionsraten scheint allein für die Aggregation und Ausbildung der IBs verantwortlich zu sein. Nach einem kinetischen Modell hängt die Ausbeute an nativem, löslichen Protein damit von der Geschwindigkeit der Faltung, der Aggregation und der Synthese ab (Hoffmann et al., 2001; Kiefhaber et al., 1991; Lilie et al., 1998). Oft enthalten IBs ausschließlich das überexprimierte Protein, so dass eine nachfolgende Reinigung schneller und leichter durchgeführt werden kann. Die Aggregation als inclusion bodies schützt das exprimierte Protein größtenteils vor proteolytischem Abbau in der Zelle. Dennoch können manchmal Abbauprodukte in IBs gefunden werden (Lilie et al., 1998). Da das überexprimierte Protein direkt aggregiert, ohne seine native Struktur zu bilden, können auf diese Weise auch für die Wirtszelle toxische Proteine hergestellt werden. Die Expression rekombinanter Proteine als IBs ist einer der effektivsten Produktionsstrategien, sofern das IB-Protein erfolgreich rückgefaltet werden kann. Verschiedene Möglichkeiten erlauben eine Erhöhung des Anteils an löslich produziertem Protein (und damit eine Reduktion der Bildung von IBs), gehen aber in der Regel auf Kosten der Gesamtmenge an produziertem Protein:

8 Einleitung 7 Senkung der Wachstumstemperatur bzw. Reduktion der Metabolismusrate (Schein und Noteborn, 1988) Senkung der Induktionsstärke der Expression (Sawyer et al., 1994; Studier et al., 1990) Fusion mit hydrophilen Proteinen (Hlavac und Rouer, 1997; Oswald et al., 1994) Koexpression von Chaperonen (Cole, 1996; Yasukawa et al., 1995) Speziell für Proteine mit Disulfidbrücken: Expression ins Periplasma, Zugabe reduzierender Substanzen oder Deletion/Insertion von Genen (Hsiung et al., 1986; Prinz et al., 1997; Skerra & Plückthun, 1988) Inclusion bodies sind sehr dichte Partikel aus aggregiertem Protein, die bis zu einem Mikrometer groß werden können und eine amorphe oder parakristalline Struktur aufweisen (Lilie et al., 1998). Strukturelle Untersuchungen von IB-Protein konnten zeigen, dass die Aggregate einen bestimmten Anteil an Sekundärstruktur besitzen (Oberg et al., 1994) und sogar verschiedene Konformationszustände vorhanden sein können (Bowden et al., 1991; Carrio et al., 2000). Vermutlich bestehen die IBs also eher aus einer Reihe von Faltungsintermediaten als aus vollständig entfaltetem Protein (Carrio et al., 2001). Die meisten Zellen enthalten nur einen inclusion body im Zytoplasma, wie durch elektronenmikroskopische Aufnahmen nachgewiesen werden konnte. Neben den IBs im Zytoplasma konnten IBs bei periplasmatischer Expression eines Proteins auch im Periplasma detektiert werden. Interessanterweise werden durch die Ü- berexpression des rekombinanten Proteins zwei E.coli-eigene Proteine, IbpA und IbpB, induziert, die fest mit den gebildeten IBs assoziieren (Allen et al., 1992; Hoffmann et al., 2001; Marston, 1986). Das inclusion body -Protein kann durch Wirtsproteine, Nukleinsäuren und Zellmembrankomponenten verunreinigt sein, die eine nachfolgende Rückfaltung stören können (De Bernadez Clark, 1998; Lilie et al., 1998). Um diese Verunreinigungen zu entfernen, werden die IBs, die aufgrund ihrer hohen Dichte leicht durch Zentrifugation isoliert werden können, nach dem vollständigen Zellaufschluss extensiv mit Puffern gewaschen, die Detergentien und/oder chaotrope Agentien in niedriger Konzentration enthalten (Rudolph et al., 1997). Im Durchschnitt enthält diese inclusion body -Präparation mehr als 50% des rekombinanten Proteins, der Reinheitsgrad kann unter optimalen Bedingungen bis zu 90% betragen (Lilie et al., 1998). Bevor die Renaturierung begonnen werden kann, muss das inclusion body -Material mit Hilfe starker Denaturierungsmittel und unter Zugabe von Reduktionsmittel solubilisiert werden. Je nach Bedarf kann das solubilisierte Protein auch unter denaturierenden Bedingungen gereinigt werden, um etwaige Fremdproteine schon vor der Rückfaltung zu entfernen (De Bernadez Clark, 1998; Lilie et al., 1998).

9 Einleitung Proteinfaltung Proteine sind nahezu an allen biologischen Prozessen beteiligt. Sie erfüllen vielfältige Funktionen in der Zelle, z.b. enzymatische Katalyse, Transport, Bewegung und Immunabwehr. Voraussetzung für ihre Funktion ist die Ausbildung der korrekten dreidimensionalen Struktur. Ein Verlust dieser geordneten Struktur kann zu einer Funktionseinschränkung bzw. dem Funktionsverlust und damit auch zu Krankheiten führen. Die lineare Aminosäuresequenz bestimmt dabei den Strukturbildungsprozess (Faltung), die Proteinfunktion und auch die Degradation (Wetlaufer, 1980), wobei die Evolution für jedes Protein einen optimalen Kompromiss zwischen Flexibilität und Stabilität entwickelt hat Proteinfaltung in vivo In der lebenden Zelle ist ein neu synthetisiertes Protein Bedingungen ausgesetzt, die die Faltung im Vergleich zu den in vitro Renaturierungsbedingungen (vgl. Kapitel 1.2.2) auf den ersten Blick sehr erschweren. In der Zelle ist die Konzentration an Gesamtprotein sehr hoch und kann bis zu einigen 100 mg/ml betragen (Morimoto et al., 1994). Damit wird die Aggregation, eine der Hauptnebenreaktionen während des Faltungsablaufes, durch Wechselwirkung exponierter, hydrophober Oberflächen schneller und insgesamt begünstigt (Buchner, 1996; Radford, 2000). Ein weiteres Problem für die Proteinfaltung in vivo ist die Kopplung der Faltung mit der Proteinbiosynthese (Radford, 2000). Das Protein liegt zu Beginn des Faltungsweges nicht vollständig zugänglich vor, sondern wird Schritt für Schritt durch die vektorielle Synthese vom N- zum C- Terminus am Ribosom bzw. beim vektoriellen Transport durch eine Membran freigesetzt (Jaenicke, 1999). Dies hat zur Folge, dass eine Domäne schon mit der Faltung beginnen kann, während die restlichen Teile des Proteins noch nicht für die Faltung zur Verfügung stehen. Diese Domänen sind dabei als stabile Faltungseinheiten anzusehen. Insbesondere bei Multidomänen- Proteinen besteht hier die Gefahr der Aggregation durch exponierte Domänenoberflächen. Trotz dieser Probleme erreicht die Zelle eine sehr hohe Effizienz und Geschwindigkeit bei der Proteinfaltung vor allem durch die Unterstützung des Prozesses durch Faltungsenzyme und der Proteinfamilie der molekularen Chaperone. In der Zelle gibt es zwei Klassen von Faltungsenzymen, die die langsamen Schritte der Faltung katalysieren und in allen Organismen vorkommen: Proteindisulfidisomerasen (PDI) (Bardwell, 1994) und Peptidyl-Prolyl-Isomerasen (PPI) (Fischer, 1994). Molekulare Chaperone, wie z.b. Hsp60, Hsp70, Hsp90 und shsps, sind keine Enzyme, sondern unterdrücken Nebenreaktionen wie die Aggregation, indem sie selektiv nicht-natives Protein an exponierten, hydrophoben Oberflächen binden, ohne dabei sterische Informationen zur Faltung zu liefern (Buchner, 1996; Hartl, 1996; Jaenicke, 1996). Vor allem große, komplexe

10 Einleitung 9 Proteine benötigen in vivo die Unterstützung der Chaperone, deren Wirkung dabei oft in der Erleichterung des Dockingprozesses von Domänen besteht (Coyle et al., 1999) Proteinfaltung in vitro Erste Überlegungen zum Faltungsproblem ergaben, dass ein Protein seine native Konformation nicht durch einen rein statistischen Prozess erlangen kann, da dies in biologisch relevanten Zeiträumen nicht möglich wäre (Levinthal-Paradox; Levinthal, 1968). Daraus wurde abgeleitet, dass es einen oder mehrere Faltungswege geben muss, auf dem das Polypeptid schnell zum korrekt gefalteten Zustand findet (Kim & Baldwin, 1990). Anfinsen konnte Ende der 60er Jahre zeigen, dass die Renaturierung bzw. Rückfaltung eines Proteins in vitro spontan und autonom möglich ist (Anfinsen, 1973). Dies bewies, dass sich die native Proteinstruktur in einem Zustand minimaler freier Energie befinden muss und dass die lineare Aminosäuresequenz alle nötigen Informationen für die Ausbildung der 3D-Struktur enthält. Experimente an verschiedenen Modellsystemen haben seither Einblicke in die kinetischen und thermodynamischen Aspekte der Faltung gewährt, wenn auch die Aufklärung des universellen Faltungscodes bisher nicht gelang (Jaenicke, 1996, 1999; Radford, 2000). Triebkraft der Proteinfaltung ist der Unterschied in der freien Enthalpie zwischen nativem und denaturiertem Zustand ( G N-U = H N-U - T S N-U ). Hierbei sind dieselben Wechselwirkungen und Effekte beteiligt, die auch zur Proteinstabilität beitragen: Wasserstoffbrücken, elektrostatische und van-der-waals Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen, optimierte Packungsdichte verbunden mit einer Minimierung hydrophober Innenräume und entropische Effekte (Jaenicke, 1996, 1999). Ausgehend vom denaturierten Zustand, der im Gegensatz zum nativen Protein aus einem Ensemble verschiedener, ungeordneter Konformationen ähnlicher Energie besteht und sich durch hohe Lösungsmittelzugänglichkeit bei geringer Reststruktur auszeichnet (Shortle, 1996), beginnt der hierarchische Faltungsprozess höchst wahrscheinlich mit der Ausbildung fluktuierender nativer oder nicht-nativer Sekundärstrukturelemente aufgrund von Wechselwirkungen zwischen direkt benachbarten Seitenketten (Goldberg, 1985). Direkt im Anschluss erfolgt ein hydrophober Kollaps, bei dem hydrophobe Seitenketten aus der wässrigen Umgebung ins Proteininnere verlagert werden (Dill, 1990; Jaenicke, 1996). Letztendlich erhält man ein labiles Intermediat mit Sekundärstruktur, den sog. molten globule (Ptitsysn, 1992). Das Packen von Domänen und die Ausbildung der Tertiärstruktur werden durch Verdrängung von Wasser aus dem Proteininneren bzw. von Andockflächen erreicht. Bei Proteinen, die aus mehreren Untereinheiten bestehen, schließt die Oligomerisierung die Faltung ab (Baldwin & Rose, 1999; Jaenicke,

11 Einleitung , 1999). Die Assoziation zur korrekten Quartärstruktur ist dabei in der Regel von intramolekularen Umlagerungen begleitet. Dieser allgemeine Konsensusweg ist inzwischen durch mehrere Modelle, die auf entsprechenden theoretischen und experimentellen Ergebnissen basieren, verfeinert bzw. variiert worden. Es gibt die klassischen Modelle, die Faltungswege mit definierten Intermediaten auf dem Weg zum nativen Zustand postulieren, wobei zwischen sequentiellen oder parallelen Faltungswegen und Faltungswegen mit Verzweigungen unterschieden wird: nucleation growth model, framework model und hydrophobic collapse model (Harrison & Durbin, 1985; Kim & Baldwin, 1982, 1990; Radford, 2000). Dagegen stehen neuere Überlegungen, die sowohl die Existenz nur eines einzigen Faltungsweges, als auch die von Faltungsintermediaten bezweifeln. Sie postulieren, dass Intermediate als Produkt einer inkorrekten Faltung entstehen und in einer kinetischen Falle angehäuft werden ( classical vs. new view ; Baldwin, 1995, 1996; Onuchic et al., 1997). Diese Betrachtungsweise basiert auf dem Jigsaw-Puzzle -Modell bzw. dem Konzept von dreidimensionalen, holprigen Energielandschaften ( folding funnels ), bei dem sich der native Zustand in einem auf vielen Wegen zugänglichen Energieminimum befindet (Dill & Chan, 1997; Onuchic et al., 1997; Radford, 2000). Es scheint aber so zu sein, dass einige der postulierten parallelen Faltungswege dabei häufiger benutzt werden als andere, um die Faltung in biologisch relevanten Zeiträumen zu ermöglichen (Chan & Dill, 1998; Lazaridis & Karplus, 1997). Neueste Untersuchungen schreiben den Intermediaten aber wieder eine wichtige Rolle auf dem Weg zum nativen Protein zu (Baldwin, 2001; Bachmann & Kiefhaber, 2001). So wurde ein on-pathway -Intermediat für sowohl ein apparentes Zweizustandssystem als auch für ein hierarchisch faltendes Dreizustandssystem nachgewiesen (Bachmann & Kiefhaber, 2001; Capaldi et al., 2001). Um Faltungsmechanismen zu verstehen, ist neben der thermodynamischen Betrachtung vor allem eine kinetische Untersuchung wichtig. Die eigentliche Faltung ist im allgemeinen ein sehr schneller Prozess, der innerhalb von Sekunden oder Minuten abgeschlossen ist. Langsamere Schritte, die sich dirigierend und geschwindigkeitsbestimmend auswirken können, sind die Ausbildung korrekter Disulfidbrücken (Creighton, 1986), Prolin-cis/trans-Isomerisierungen (Fischer & Schmid, 1990) oder Assoziationsreaktionen (Jaenicke, 1987). Die Bildung von Disulfidbrücken ist vor allem bei extrazellulären Proteinen ein wichtiger Schritt des Faltungsweges. Ihre Bildung ist oft geschwindigkeitsbestimmend, wobei die Disulfidbrücke nur stabilisierend wirkt, aber keinen Einfluss auf den Faltungsweg selbst hat (Jaenicke, 1996). Für die Verknüpfung der Cysteine scheint auch die Zugänglichkeit von Oxidationsmitteln und damit die Konformation möglicher Intermediate wichtig zu sein (Hamaguchi, 1991). Die Isomerisierung von Prolyl-Peptidbindungen erfolgt an nicht-nativen Prolinbindungen und vollzieht sich sehr langsam, da die Umwandlung der trans-konformation in die cis- Konformation, die im nativen Protein bei ca. 7% aller Prolinreste gefunden wird, eine sehr hohe

12 Einleitung 11 Aktivierungsenergie besitzt (Brandts et al., 1975; Goto & Hamaguchi, 1982; Fischer & Schmid, 1990; Schmid, 1992). Nebenreaktionen des Faltungsweges, die mit korrekter Faltung und Assoziation konkurrieren, können an drei Stellen auftreten: (i) beim hydrophoben Kollaps, (ii) bei der Bildung von Domänenkontakten, und (iii) bei der Assoziation von Untereinheiten. Sie führen in der Regel zur Bildung unlöslicher Aggregate durch intermolekulare Wechselwirkung der exponierten, hydrophoben Regionen ( kinetic partitioning ; Jaenicke, 1996; Jaenicke & Seckler, 1997). So lange falsche Kontaktstellen exponiert werden, können Kollisionen Aggregation anstelle von korrekter Faltung bewirken. Bei diesen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Ketten handelt es sich um multimolekulare Reaktionen mit Geschwindigkeitskonstanten höherer Ordnung, so dass bei hohen Proteinkonzentrationen die Aggregationsreaktionen überwiegen, während bei niedrigen Konzentrationen diese Nebenreaktionen geringer sind (vgl. Kapitel 1.1.2; Jaenicke, 1996; Jaenicke & Seckler, 1997; Kiefhaber et al., 1991) Renaturierung von inclusion body -Proteinen Die Renaturierung von solubilisierten inclusion body -Proteinen beginnt mit der Entfernung des Denaturierungsmittels durch Verdünnung oder Dialyse. Die Effizienz der Renaturierung wird dabei maßgeblich von der Konkurrenz zwischen Faltung und Aggregation bestimmt. Um eine möglichst hohe Ausbeute beim Renaturierungsprozess zu erreichen, müssen zahlreiche Parameter für das jeweilige Protein optimiert werden, wobei das Hauptaugenmerk auf einer Unterdrückung der Aggregation bei möglichst hoher Proteinkonzentration liegt (De Bernadez Clark, 1998; Jaenicke & Seckler, 1998; Lilie et al., 1998). Der einfachste Weg, die Aggregation zu verlangsamen, ist die Renaturierung bei niedrigen Proteinkonzentration ( µg/ml) (Zettlmeissl et al., 1979). Während der Rückfaltung ist die Konzentration des nicht-nativen Proteins bzw. von aggregationsanfälligen Intermediaten, die hydrophobe Bereiche exponieren, für die Aggregation entscheidend. Da diese Spezies in der Regel am Ende des Faltungsprozess nicht mehr existieren, kann die Konzentration an renaturiertem Protein erhöht werden, indem diskontinuierlich immer wieder Portionen an denaturiertem Protein zum Renaturierungsansatz hinzugegeben werden (Pulsrenaturierung; Rudolph, 1990). Außerdem ist eine sorgfältige Optimierung externer Parameter, wie z.b. der Temperatur oder des ph, nötig, um die Ausbeute zu steigern. Insbesondere hat eine hohe Temperatur einen negativen Einfluss auf das Aggregationsverhalten während der Renaturierung, da die hydrophoben Wechselwirkungen als Basis für die unspezifische Aggregation mit steigender Temperatur stärker werden.

13 Einleitung 12 Proteine, die Disulfidbrücken enthalten, erfordern die Verwendung eines Redoxsystems, das die Bildung und Umordnung von Disulfidbrücken ermöglicht. Die häufigsten Methoden sind die Verwendung von Luftoxidation, gemischten Disulfiden oder Oxidoshuffling-Systemen (De Bernadez Clark, 1998; Lilie et al., 1998). Eine einfache Strategie, die Ausbeute zu erhöhen und Aggregationsreaktionen zu unterdrücken, ist die Verwendung niedermolekularer Substanzen. Neben Kofaktoren und prostethischen Gruppen sind dies vor allem chaotrophe Substanzen, L-Arginin und Detergentien (De Bernadez Clark, 1998; Lilie et al., 1998). Einige Beispiele sind in Tabelle 1.1 aufgeführt. Insbesondere L- Arginin konnte erfolgreich bei Renaturierungen eingesetzt werden (Buchner & Rudolph, 1991; Buchner et al., 1992; Hsih et al., 1997; Lin & Traugh, 1993). Es ist noch nicht vollständig verstanden, wie L-Arginin wirkt, aber es gibt Hinweise, dass es Faltungsintermediate solubilisiert (Lilie et al., 1998). Auf ähnliche Weise wird der positive Effekt von Detergentien auf die Rückfaltung erklärt. Dabei werden Detergentien einzeln eingesetzt (Goldberg et al., 1996; Tandon & Horowitz, 1987; Wetlaufer & Xie, 1995) oder in Kombination mit Cyclodextrin (Rozema & Gellman, 1996). Additiv Protein Referenz GdnCl Carboanhydrase II Wetlaufer & Xie, 1995 Harnstoff Wachstumshormon Cardamone et al., 1995 L-Arginin Fab-Fragment Acetylcholin-Rezeptor Buchner & Rudolph, 1991 Schrattenholz et al., 1998 Ammoniumsulfat Hühnerlysozym Maeda et al., 1996 Ethylammoniumnitrat Hühnerlysozym Summers & Flowers, 2000 Glyzerin Hühnerlysozym Maeda et al., 1996 Glucose Hühnerlysozym Maeda et al., 1996 Tween Wachstumshormon Bam et al., 1996 Phospholipide TGF-β-ähnliche Proteine Cerletti et al., 1997 Sulfobetaine β-d-galactosidase Goldberg et al., 1996 Alkohole Carboanhydrase II Wetlaufer & Xie, 1995 Tabelle 1.1: Überblick über einige Additive zur Unterstützung der in vitro Faltung Eine weitere Möglichkeit, unspezifische, intermolekulare Wechselwirkungen zu unterdrücken, ist die matrix-unterstützte Rückfaltung (De Bernadez Clark, 1998; Lilie et al., 1998). Dabei wird das denaturierte Protein über ein Affinitätstag an eine Matrix gebunden und im gebundenen Zustand renaturiert (Holzinger et al., 1996; Stempfer et al., 1996).

14 Einleitung 13 Sofern die Renaturierungen im analytischen Bereich durchgeführt werden, besteht auch die Möglichkeit, Chaperone und/oder Faltungshelferenzyme (PPI, PDI) analog zu den in vivo Bedingungen zuzugeben (Thomas et al., 1996). Ein interessanter Ansatz, der die Funktion von Chaperonen mit der matrix-unterstützten Rückfaltung kombiniert, ist die Kopplung sogenannter Minichaperone (GroEL-Fragmente) an ein Chromatographiematerial (Altamiro et al., 1997). Es bleibt festzuhalten, dass das detaillierte Wissen über Proteinfaltung und seine Nebenreaktionen es möglich machten, prinzipielle Renaturierungsprotokolle zu entwerfen. Neben der systematischen, schrittweisen Analyse der einzelnen Parameter wurden dazu in letzter Zeit auch faktorielle Screening-Methoden entwickelt, die eine schnelle und gleichzeitige Analyse verschiedener Faktoren erlauben (Armstrong et al., 1999; Chen & Gouaux, 1997). Dennoch müssen die Bedingungen für jedes Protein neu optimiert werden, um maximale Ausbeuten zu gewährleisten. 1.3 Das Tumorsuppressorprotein p53 Tumorsuppressorgene wirken als negative Regulatoren des normalen Zellzyklusses von Wachstum, DNA-Replikation und Zellteilung. Wenn die zugehörigen Genprodukte nicht mehr korrekt funktionieren, findet unkontrolliertes Wachstum statt ein entscheidendes Merkmal für Krebs. Das p53-gen, erstmals 1979 beschrieben (Chang et al., 1979; Kress et al., 1979; Lane & Crawford, 1979; Linzer & Levine, 1979), kodiert für einen klassischen Transkriptionsfaktor und war das erste identifizierte Tumorsuppressorgen. In über 50% aller menschlichen Krebsarten ist das p53-protein inaktiviert, meistens aufgrund von Mutationen im p53-gen, seltener aufgrund von Inaktivierung durch die Bindung viraler Proteine (Soussi et al., 1994; Vogelstein et al., 2000). Das p53-gen und seine tumorassoziierten Mutationen wurden bisher hauptsächlich in Vertebraten untersucht, es konnte aber auch in Drosophila (Ollmann et al., 2000) und Muscheln (Van Beneden et al., 1997) nachgewiesen werden. p53 übernimmt in der Zelle die Rolle eines Wächters des Genoms (Lane, 1992) und induziert bei Zell- bzw. DNA-Schädigung entweder einen Zellzyklusarrest zur Reparatur des Schadens oder die Apoptose (programmierter Zelltod), wenn die Schädigungen irreparabel sind. Die Bedeutung, die p53 für die Krebsforschung erlangt hat, spiegelt sich unter anderem darin wider, dass es 1993 vom Science-Magazin zum Molekül des Jahres nominiert wurde (Culotta & Koshland, 1993), und dass seit seiner Entdeckung über Publikationen zu p53 erschienen sind, allein im vergangenen Jahr. Im Folgenden kann daher nur ein Überblick über einige wichtige Teilaspekte gegeben werden, für ein vertieftes Studium sei auf zahlreiche, exzellente

15 Einleitung 14 Reviews verwiesen (Albrechtsen et al., 1999; Hupp, 1999; Hupp et al., 2000; Jayaraman & Prives, 1999; Lohrum & Vousden, 2000; May & May, 1999; Prives & Hall, 1999; Vogelstein et al., 2000) Die p53-familie p53 ist ein komplexes Multidomänen-Protein, das sich aus drei großen Bereichen zusammensetzt: die N-terminale Region mit einer Transaktivierungsdomäne, die zentrale Region mit der DNA-bindenden Domäne und die C-terminale Region mit der Oligomerisierungsdomäne. Lange Zeit ging man davon aus, dass es keine homologen Proteine zu p53 gibt. Erst vor kurzem konnten zwei verwandte Proteine p63 und p73 nachgewiesen werden, die, ähnlich wie p53, über Transkriptionsaktivierung zu Zellzyklusarrest und Apoptose führen können (De Laurenzi & Melino, 2000; Lohrum & Vousden, 2000). Die Proteine der p53-familie sind ähnlich aufgebaut und zeigen die größten Homologien in der Transaktivierungsdomäne, der DNA- Bindedomäne und der Oligomerisierungsdomäne (Abbildung 1.1; vgl. Kapitel 1.3.2). Unterschiede ergeben sich vor allem im C-terminalen Teil, an dem sowohl p63 (Schmale & Bamberger, 1997) als auch p73 (Kaghad et al., 1997) Verlängerungen haben. Abbildung 1.1: Vergleich der Proteinstruktur von p53, p63 und p73 Im direkten Vergleich sind p63 und p73 untereinander ähnlicher als zu p53. Die höchste Homologie findet sich in der zentralen, sequenzspezifischen DNA-Bindedomäne (ca. 60% Homologie). Die prolinreiche Region und die SAM ( sterile alpha-motif )-ähnliche Domäne sind mögliche Proteininteraktionsstellen (adaptiert nach Lohrum & Vousden, 2000). Während p53 ein eindeutiges Tumorsuppressorgen darstellt, konnte eine solche Funktion für p63 und p73 noch nicht nachgewiesen werden (Tabelle 1.2). Beide Gene scheinen zudem in menschlichen Krebsformen selten mutiert zu sein. Dafür spielen sie im Gegensatz zu p53 eine größere Rolle in der Entwicklung des Organismus (Kaelin, 1999; Mills et al., 1999; Yang et al., 1999; Yang et al., 2000).

16 Einleitung 15 p53 p73 p63/ket/p51 Chromosomale Lokalisation: 17p13 1p36 3q27-8 Isoformen: Bereich höchster Homologie: DNA-Bindedomäne DNA-Bindedomäne DNA-Bindedomäne Transkriptionsfaktor: Mutationen in Tumoren: häufig selten selten Rolle in Entwicklung: Rolle als Tumorsuppressor: + -/+ (?)? Apoptotische Funktion: Aktivierung durch Stresssignale: + teilweise? Hemmung durch Mdm2: Expressionlevel: niedrig?? Bindung viraler Onkoproteine: Tabelle 1.2: Vergleich der verschiedenen Funktionen von p53, p63 und p73 (adaptiert nach Lohrum & Vousden, 2000) Im Vergleich zu p53 zeigen p63 und p73 ein deutlich komplexeres Expressionsmuster aufgrund mehrerer, durch alternatives Spleissen hervorgerufener Isoformen (Kaelin, 1999). Diese Isoformen haben z.t. unterschiedliche Funktionen in der Zelle und können mit p53 und untereinander Heterooligomere bilden, was zu einer Vielfalt von gegenseitigen Regulationsmöglichkeiten führt (Di Como et al., 1999; Yang et al., 1998). Inwieweit die Regulationsnetzwerke gegeneinander abgegrenzt sind, welche Funktionen sie übernehmen bzw. ob sie sich teilweise in ihrer Funktion überlappen und redundant sind, ist eine noch offene Frage und Gegenstand intensiver Untersuchung Struktur von p53 Das menschliche p53-gen umfasst ca. 20 kb DNA und befindet sich auf dem kurzen Arm des Chromosoms 17 (17p13). Es besteht aus 11 Exons, wovon das erste nicht-kodierend und die Exons 2 bis 11 kodierend sind (Benchimol et al., 1985; Isobe et al., 1986; McBride et al., 1986; Miller et al., 1986). Das menschliche p53-protein besteht aus 393 Aminosäuren und enthält vier funktionelle Domänen (Abbildung 1.2). In der N-terminalen Region befinden sich die Transkriptionsaktivierungsdomäne (Aminosäuren 1-42) und eine prolinreiche Region (SH3-Zieldomäne; Aminosäuren 60-97), zentral liegt die sequenzspezifische DNA-Bindedomäne (Aminosäuren ),

17 Einleitung 16 während der C-terminale Bereich einen flexiblen Linker, gefolgt von der Tetramerisierungsdomäne (Aminosäuren ) und der Regulationsdomäne (Aminosäuren ) enthält. p53 ist ein in der Evolution konserviertes Protein. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen verschiedener Spezies konnten fünf hochkonservierte Regionen nachgewiesen werden: A- minosäuren 13-23, , , und Diese Regionen, die als Domänen I V bezeichnet werden, aber nicht dem üblichen Domänenbegriff einer stabilen Faltungseinheit entsprechen, decken sich mit den für die Funktionen von p53 wichtigen Bereichen (Soussi et al., 1990; Soussi & May, 1996). Abbildung 1.2: Strukturelle und funktionelle Organisation von p53 Schematische Darstellung der strukturellen und funktionellen Organisation des menschlichen p53-proteins. Oben sind verschiedene virale und zelluläre Proteine und ihre Interaktionsregionen gezeigt. Darunter befindet sich die Darstellung der funktionellen Domänen und der hochkonservierten Regionen (I-V) (adaptiert nach May & May, 2000; Ko & Prives, 1996) Die N-terminale Region Diese saure, prolinreiche Region enthält die Transkriptionsaktivierungsdomäne (Aminosäuren 1-42) (Fields & Jang, 1990), die es p53 erlaubt, die basale Transkriptionsmaschinerie (z.b. TATA-box binding protein TBP) zu binden und die Transkription eines Zielgens zu aktivieren (Lu & Levine, 1995; Thut et al., 1995). Interessanterweise bindet TBP neben der Aktivierungsdomäne auch einen C-terminalen Bereich von p53 (Aminosäuren ; Horikoshi et al., 1995). Es gibt ferner Hinweise, dass p53 nicht nur als Transkriptionsaktivator, sondern auch

18 Einleitung 17 als Transkriptionsrepressor wirken kann (Agoff et al., 1993; Ginsberg et al., 1991; Mack et al., 1993; Murphy et al., 1996). Die N-terminale Region enthält außerdem zahlreiche Bindungsstellen für virale und zelluläre Proteine (vgl. Abbildung 1.2), die in der Regel durch ihre Bindung die Transaktivierungsfunktion von p53 inhibieren: Adenovirus E1B-55 kda Protein, Mdm2 und Hepatitis B Virus X Protein (Levine, 1997; Momand et al., 1992; Oliner et al., 1993; Yew & Berk, 1992). Die wichtigsten Aminosäuren für die Bindung der Partnerproteine und die Transaktivierungsfunktion befinden sich dabei in der konservierten Domäne I, die die Aminosäuren umfasst (Soussi & May, 1996). Während einzelne Punktmutationen in der zentralen, DNA-bindenden Domäne zur Krebsentstehung beitragen (vgl. Kapitel ), ist eine einzelne Punktmutation in dieser Region erstaunlicherweise nicht in der Lage, die Transaktivierungsaktivität von p53 vollständig zu inhibieren (Lin et al., 1994). Dies erklärt auch, warum keine Krebs-hervorrufenden Mutationen in diesem Bereich beschrieben sind. Im Bereich der Aminosäuren existiert eine prolinreiche Region, die große Ähnlichkeit zu SH3-Bindeproteinen aufweist. Sie wird für die p53-vermittelte Apoptose (Sakamuro et al., 1997), für die Unterdrückung von Tumorzellwachstum (Walker & Levine, 1996) und für die von humanem Papillomavirus E6-Protein induzierte Degradation benötigt (Li & Coffino, 1996). Das Vorhandensein des SH3-Bindemotivs PXXP legt eine Interaktion von p53 mit Proteinen aus Signaltransduktionswegen nahe. Die N-terminale Region ist der Endpunkt einiger Signaltransduktionswege zur Aktivierung von p53 und damit Ziel von Phosphorylierungen durch zahlreiche Proteinkinasen. Auf diese Weise können die Stabilität und die Transaktivierungsaktivität von p53 reguliert werden (vgl. Kapitel 1.3.3). Strukturell gibt es nur wenige Informationen über diesen Bereich. Durch NMR- Untersuchungen und andere Experimente konnte gezeigt werden, dass die isolierte Region (Aminosäuren 1-73) weitestgehend unstrukturiert zu sein scheint, bis auf die Existenz kurzer instabiler Sekundärstrukturelemente (Chang et al., 1995; Lee et al., 2000;). Wie bei vielen Transaktivierungsdomänen kommt es vermutlich erst im Kontakt mit dem Transkriptionsapparat zur Strukturbildung (Hahn, 1993; Sigler, 1988) Die zentrale Region Die zentrale Region von p53 umfasst die Aminosäuren und enthält die vier konservierten Domänen II-V (Abbildung 1.2). Innerhalb dieser Region liegen fast 90% aller tumorassoziierten Mutationen. Die zentrale Region entspricht der sogenannten core-domäne, die gegenüber proteolytischem Verdau mit Enzymen wie Thermolysin oder Subtilisin stabil ist (Bargonetti et al., 1993; Pavletich et al., 1993). Die core-domäne vereinigt zwei sich gegenseitig

19 Einleitung 18 ausschließende Funktionen in sich: die sequenzspezifische DNA-Bindung (Bargonetti et al., 1993; El-Deiry et al., 1992; Pavletich et al., 1993) und eine 3-5 Exonukleaseaktivität (Mummenbrauer et al., 1996). Das Konsensus-DNA-Bindemotiv besteht aus zwei Kopien eines 10 bp Motivs (5 -PuPuPuCWWGPyPyPy-3 ; Pu: Purin, Py: Pyrimidin, W: A oder T), die durch einen Abstand von 0-13 bp getrennt sein können (El-Deiry et al., 1992). Auf der Ebene eines Pentanukleotidmotivs betrachtet, kann man von vier invertierten Wiederholungen sprechen (!"!"). Die Affinität der isolierten core-domäne für das Erkennungsmotiv im gadd45-gen beträgt knapp 100 nm (Nikolova et al., 1998). Aufgrund der kooperativen Bindung kann man für das Tetramer von einer höheren DNA-Affinität ausgehen. Interessanterweise hat die Analyse verschiedener Erkennungssequenzen von p53-induzierten Genen ergeben, dass starke Abweichungen von der Konsensussequenz möglich sind und trotzdem erkannt werden (Bargonetti et al., 1993; Foord et al., 1993). Für die nötige Spezifität und Selektivität scheinen weitere Mechanismen nötig zu sein, wie z.b. die interne Symmetrie und Konformation der DNA-Sequenz (Kim et al., 1997). Röntgenstrukturanalysen der isolierten core-domäne mit und ohne DNA-Konsensussequenz haben gezeigt, dass die DNA-Bindedomäne von p53 aus einem β-sandwich besteht, das als Gerüst für ein Loop-Sheet-Helix-Motiv und zwei Loops dient (L1-S-H, L2 und L3 in Abbildung 1.3; Cho et al., 1994; Zhao et. al., 2001). Der Sandwich besteht aus zwei antiparallelen β- Faltblättern, die aus 4 bzw. 5 β-strängen zusammengesetzt sind. Damit ergibt sich eine bemerkenswerte Ähnlichkeit zur Struktur von Immunoglobulinen (Amzel & Poljak, 1979) und des Transkriptionsfaktors NF-κB (Muller et al., 1995). Der erste Loop L1 (Teil des Loop-Sheet- Helix-Motivs) bindet an die DNA innerhalb der major groove, während der zweite Loop L3 Kontakte in der minor groove herstellt. Der dritte Loop L2 ist gegen den Loop L3 gepackt und stabilisiert diesen. In Abwesenheit der DNA-Konsensussequenz nimmt der L1-Loop allerdings eine andere Konformation ein, so dass für die Bindung an die DNA eine strukturelle Umordnung dieses Loops postuliert wird (Zhao et. al., 2001). Die Loops L2 und L3 sind durch ein Zn 2+ -Ion verbunden, das tetraedrisch durch drei Cysteine und ein Histidin (C176 und H179 aus Loop L2, C238 und C242 aus Loop L3) koordiniert wird (Abbildung 1.3). Das Zn 2+ -Ion ist wichtig für die Stabilität der Struktur. Entfernt man es z.b. durch Metallchelatoren, ist keine spezifische DNA-Bindung mehr möglich, und es kommt zu einer Konformationsänderung im Protein (Hainaut & Milner, 1993a, 1993b).

20 Abbildung 1.3: Struktur der p53-core-domäne und der Tetramerisierungsdomäne Rechts oben ist die core-domäne im Komplex mit der DNA-Konsensussequenz dargestellt. β-stränge sind türkis, α-helizes sind rot, das Zn 2+ -Ion ist grün und das Epitop des Antikörpers Ab240 ist gelb markiert. Die für die Znund DNA-Bindung wichtigen Loops sind beschriftet. Rechts unten ist die Umgebung und die Koordination des Zn 2+ -Ions dargestellt. Die DNA-Helix erscheint orange, ein DNA-Kontakt, Arg248, ist herausgehoben. Links oben sind zwei Ansichten der Tetramerisierungsdomäne abgebildet. Jede Untereinheit ist unterschiedlich eingefärbt. Der Pfeil markiert die Blickrichtung für die rechte Hälfte der Darstellung 19 Einleitung

21 Einleitung 20 Die Daten der dreidimensionalen Struktur korrelieren sehr gut mit den funktionellen Daten zu p53-mutationen. Es gibt mehr als bekannte Punktmutationen, von denen ca. 96% in der DNA-bindenden Domäne von p53 zu finden sind ( Hernandez- Boussard et al., 1999). Die Mehrzahl aller krebsverursachenden Mutationen liegt in den Bereichen der drei DNA-bindenden Loops und überlappt mit den hochkonservierten Domänen II-IV. Die sechs häufigsten Missense-Mutationen (R175, G245, R248, R249, R273 und R282) sind auch als sog. hot spots bekannt. Aufgrund der Strukturdaten werden die krebsassozierten Mutationen in zwei Klassen eingeteilt: DNA-Kontaktmutanten (class I mutants) betreffen Aminosäuren, die direkt an der DNA-Bindung beteiligt sind, z.b. Arg248 (Brachmann et al., 1998; Cho et al., 1994), Strukturmutanten (class II mutants) dagegen Aminosäuren, die für die Konformation oder Stabilität der Loops bzw. der Gesamtstruktur wichtig sind und die zur partiellen bis globalen Destabilisierung und Entfaltung des Proteins führen können (Brachmann et al., 1998; Cho et al., 1994; vgl. auch Kapitel und 1.3.5). Die Effekte der hot spot - Mutationen auf die Struktur der core-domäne wurden mit Hilfe von NMR-Untersuchungen analysiert. Aufgrund der Zuordnung der NMR-Signale ergibt sich, dass die wt-domäne in Lösung der Struktur der wt-domäne im Kristall entspricht, wobei in beiden Fällen der Bereich der Aminosäure unstrukturiert ist (Cho et al., 1994; Wong et al., 1999). Die hot spot - Mutationen G245S, R248Q, R249S und R273H führen zu lokalen Änderungen bzw. Störungen der DNA-Bindeoberfläche (LSH, L2 und L3), ohne die Gesamtstruktur stark zu beeinflussen (Wong et al., 1999). Interessant ist, dass auch die Kontaktmutante R248Q starke strukturelle Änderungen hervorruft und destabilisierend wirkt (Wong et al., 1999). Die Mutation von V143, einer Aminosäure im hydrophoben Kern der Domäne, bewirkt starke Änderungen in gesamten β-sandwich und der DNA-Bindeoberfläche, und hat somit im Gegensatz zu den anderen Mutationen einen globalen Einfluss auf die Struktur und Stabilität der core-domäne (Wong et al., 1999). Erst vor kurzem konnte für die core-domäne von p53 eine 3-5 -Exonukleaseaktivität nachgewiesen werden (Mummenbrauer et al., 1996). Diese Exonukleaseaktivität und die sequenzspezifische DNA-Bindeaktivität sind diametral reguliert, d.h. p53 verliert seine Exonukleaseaktivität, wenn es für die sequenzspezifische DNA-Bindung aktiviert wird und umgekehrt (Janus et al., 1999). p53 produziert als Exonuklease Desoxynukleosidmonophosphate, ist Mg 2+ - abhängig und wird durch GMP gehemmt. Welche Reste für die Aktivität verantwortlich sind, konnte bis jetzt noch nicht ermittelt werden. Möglicherweise spielt die Exonukleaseaktivität eine Rolle für DNA-Reparaturmechanismen (vgl. Kapitel 1.3.3).

22 Einleitung Die C-terminale Region Die C-terminale Region (Aminosäuren ) enthält einen flexiblen Linker (Aminosäuren ) mit einer Kernlokalisierungssequenz (NLS1; Dang & Lee, 1989), die Tetramerisierungsdomäne (Aminosäuren ) und eine basische Regulationsdomäne (Aminosäuren ) (Abbildung 1.2; May & May, 1999). Wildtyp-p53 liegt in der Zelle als Tetramer vor und bindet in dieser Form mit höchster Affinität an die DNA (Delphin et al., 1994; Friedman et al., 1993; Hupp et al., 1992; Kraiss et al., 1988; Sturzbecher et al., 1992; Wang et al., 1994). Es konnte gezeigt werden, dass die Aminosäuren für die Tetramerbildung ausreichend sind (Wang et al., 1994). Die Struktur dieser Tetramerisierungsdomäne ist mit Hilfe von NMR (Clore et al., 1994) und Röntgenkristallographie (Jeffrey et al., 1995) aufgeklärt worden. Jedes Monomer besteht aus einem Turn (Asp324-Gly325), einem β-strang (Glu326-Arg333), einem zweiten Turn (Gly334) und einer α-helix (Arg335-Gly356). Zwei Monomere bilden ein Dimer, in dem die α-helizes und die β- Stränge antiparallel vorliegen. Die beiden Dimere bilden über die α-helizes ein symmetrisches Tetramer aus (Abbildung 1.3). Man kann dieses Tetramer auch als Dimer von Dimeren beschreiben, wobei die beiden primären Dimere ungefähr orthogonal angeordnet sind und ein ungewöhnliches Vier-Helix-Bündel ausbilden. Hierdurch entstehen drei Axen mit zweizähliger Symmetrie. Interessanterweise kommt es dadurch zu einer Symmetriediskrepanz zur zweizähligen, zyklischen Symmetrie der p53-dna-erkennungssequenz. Daher wird für den p53-dna- Komplex eine asymmetrische Anordnung des Linkers zwischen core- und Tetramerisierungsdomäne postuliert (Waterman et al., 1995). Deletiert man die p53-tetramerisierungsdomäne, kommt es in vivo nicht mehr zu einer effektiven Transaktivierung oder zu einer Wachstumsunterdrückung in Krebszellen (Pietenpol et al., 1994). Dennoch liegen nur in wenigen Krebsformen Mutationen vor, die eine Ausbildung von Tetrameren verhindern (Waterman et al., 1995). Allerdings ist die Tetramerisierungsdomäne für die Ausbildung des dominant-negativen Phänotyps aufgrund von Heterooligomerisierung zwischen Wildtyp-p53 und mutiertem p53-protein verantwortlich und trägt auf diese Weise sehr oft zur Krebsentwicklung bei (Chene, 1998; Shaulian et al., 1992; Wang et al., 1994). Die basische Regulationsdomäne am C-terminalen Ende von p53 fungiert als negativer Regulator für die sequenzspezifische DNA-Bindung. Nach dem allosterischen Modell für die Regulation der p53-aktivität muss latentes, also inaktives p53 erst für die DNA-Bindung aktiviert werden (Halazonetis & Kandil, 1993; Hupp & Lane, 1994a; Hupp et al., 1995; vgl. Kapitel 1.3.3). Dies kann über verschiedene posttranslationale Modifikationen in der C-terminalen Region erfolgen, wobei eine entsprechende Konformationsänderung ausgelöst wird (May & May, 1999).