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1 (19) *DE A * (10) DE A (12) Offenlegungsschrift (21) Aktenzeichen: (22) Anmeldetag: (43) Offenlegungstag: (66) Innere Priorität: (71) Anmelder: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Halle, DE (51) Int Cl.: C12N 1/16 ( ) A61K 36/06 ( ) C12P 13/08 ( ) C12P 7/40 ( ) C12P 7/06 ( ) C12P 21/00 ( ) A23J 1/18 ( ) (72) Erfinder: Urubschurov, Vladimir, Bad Doberan, DE; Zeyner, Annette, Leipzig, DE; Souffrant, Wolfgang-Bernhard, Rostock, DE; Büsing, Kirsten, Schwaan, DE Prüfungsantrag gemäß 44 PatG ist gestellt. Die folgenden Angaben sind den vom Anmelder eingereichten Unterlagen entnommen. (54) Bezeichnung: Verwendung der im Schweinedarm endemisch vorkommenden Hefe Kazachstania slooffiae zur Gewinnung proteinreicher Biomasse sowie von Ameisensäure und Ethanol (57) Hauptanspruch: Verwendung der Hefe Kazachstania slooffiae zur Gewinnung proteinreicher Nahrungs- und Futtermittel mit einem hohen Anteil der Aminosäure Lysin.

2 Beschreibung [0001] Protein und essentielle Aminosäuren stellen im globalen Maßstab eine knappe Ressource für die Ernährung von Mensch und Tier dar, wobei Lysin für die meisten Situationen als die erstlimitierende Aminosäure gilt. In der Produktion tierischer Lebensmittel sind vor allem monogastrische Spezies auf die Zufuhr essentieller Aminosäuren angewiesen aber auch Milchkühe der höheren Leistungsebene bedürfen in bestimmten Fällen einer Supplementation der Aminosäure als Futterzusatzstoff. [0002] Die bedarfsgerechte Versorgung landwirtschaftlicher Nutztiere mit Protein und Lysin kommt zumindest auf der höheren Leistungsebene kaum ohne Sojaextraktionsschrot aus, welches der mit Abstand am meisten exponierte Lieferant dieser Nährstoffe darstellt. [0003] Durch die Problematik gentechnisch veränderter Organismen (GVO) in Gemengelage mit diesbezüglichen politischen Entscheidungen ist die Zukunft des Einsatzes von Sojaprodukten in der EU fraglich. [0004] In Deutschland gibt es Bestrebungen, Alternativen für den Einsatz von Soja zu finden, so z. B. durch einheimische großkörnige Leguminosen bzw. fettreduzierten Nebenprodukten aus der Rapssaat, welche jedoch durch Ertragsunsicherheit, uneinheitliche Abreife bzw. antinutritive Inhaltstoffe nicht durchgängig in ausreichender Menge zur Verfügung gestellt werden können. Aber auch andere Proteinträger lassen den erwünschten Ersatz von Sojaprodukten derzeit und wohl auch auf absehbare Zeit nicht zu. [0005] Es ist bekannt, Zellbiomasse der Bier- oder Zuckerhefe Saccharomyces cerevisiae, welche einen relativ hohen Proteingehalt aufweist, als Zusatzstoff in der Tierernährung zu verwenden. Nachteilig ist jedoch der Gehalt an Lysin im Protein, welcher nicht mit dem in der Sojabohne konkurrieren kann und daher keinen adäquaten Ersatz darstellt. [0006] Aufgabe der Erfindung war es, einen natürlich vorkommenden, alternativen Produzenten von proteinreicher Biomasse mit hohem Lysingehalt im Protein als Ersatz für die bisher bekannten Proteinträger zu finden. Untersuchungen ergaben, dass die endemisch im Schweinedarm vorkommende Hefe Kazachstania slooffiae einen Proteingehalt vergleichbar dem Sojaextraktionsschrot aufweist und der Lysingehalt im Protein in einer vergleichbaren Größenordnung liegt. [0007] Für die Untersuchungen wurde ein Stamm der Hefe K. slooffiae aus dem Kot von Schweinen isoliert. [0008] In vivo-versuche haben gezeigt, dass eine Supplementation der K. slooffiae einen signifikanten Einfluss auf die Zusammensetzung der Darmmikrobiota sowie auch auf die Produktion der Metaboliten ausübt. Dabei wurde die mehrmalige Verabreichung der K. slooffiae überaschenderweise mit einer erhöhten sowohl saccharolytischen als auch proteolytischen Aktivität im Darm verbunden. Ziel der Untersuchungen war es zu klären, ob der Hefestamm sowohl verschiedene N -Quellen, z. B. Aminosäuren, Pepton, Ammoniumsulfat und Harnstoff, als auch Essig-, Propion-, Milch- und n-buttersäure als mögliche C -Quellen in vitro verwertet und dabei organische Säure, Ammoniak und Aminosäuren (AS) bilden kann. [0009] Die in vitro-versuche wurden in 2 folgende Hauptteile untergliedert: Assimilationsteste (AT) in Kulturröhrchen und Untersuchungen in einem AN- KOM RF Gasbildungssystem. In allen Untersuchungen wurde ein Basalmedium, welches als fertige Mischung (Zusammensetzung siehe Fig. 1) bei Formedium TM erworben wurde, verwendet. Alle Substratlösungen wurden unmittelbar vor dem Einsatz mit Hilfe eines 20 μm Filter sterilisiert und je nach Untersuchung entweder in autoklavierte Kulturröhrchen (10 ml), die anschließend mit sterilen Kapsenberg-Kappen verschlossen wurden, oder in die 100 ml heißluftsterilisierte Ankom-Flaschen (30 ml) überführt. Nach dem Verschließen der Flaschen mit den Ankom-Drucksensormodulen (Dichtungen und Innengewinde mit 70%-igen Ethanol sterilisiert) wurden die Proben mit CO 2 durch den Luer begast und in einem Wasserbad bei 39 C inkubiert. [0010] Für jede Untersuchung wurde ein Inokulum frisch, wie im Nachfolgenden kurz beschrieben, hergestellt. Eine Kolonie von K. slooffiae wurde im Sabouraud-2%-Glucose (SG) Bouillon suspendiert, über Nacht bei 39 C in einem Brutschrank inkubiert, abzentrifugiert und mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen. Der Waschvorgang, inklusive Zentrifugation, wurde noch einmal wiederholt. Um die Konzentration der K. slooffiae zu bestimmen, wurde die optische Dichte (OD 600nm ) der Zellflüssigkeit in einem Spektralphotometer (Spectronics Genesys 5) bestimmt und die Anzahl der KBE ml 1 mittels eine Trendfunktion in MS Excel geschätzt. Anschließend wurde die Zellsuspension so verdünnt, dass die Konzentration von K. slooffiae pro Dosis (100 μl aqua dest.) 1, KBE betrug. [0011] Insgesamt wurden in den AT 40 verschiedene Varianten (mit/ohne Substrat) untersucht (Fig. 1). Dabei wurden 2 Varianten von Harnstoff in niedriger (2.272 g L 1 gleiche N-Menge wie bei Ammoniumsulfat) und höherer ( g L 1 ) Konzentrationen getestet. In den AT wurden in zwei separaten Versuchsreihen jeweils 5 Kulturröhrchen pro Variante: 2 aerob, 2 anaerob (in Anaerobiertöpfen unter Verwendung 2/9

3 von Anaerokult A und Anaerobier-Indikatorstreifen; Merck) und eines als Kontrolle ohne Hefe verwendet. Nach der 7-tägigen Inkubation bei 39 C wurde in den Röhrchen, in denen das Hefewachstum visuell ermittelbar war, OD 600nm der Proben wie oben beschrieben gemessen. Auf Basis der AT Ergebnisse wurden die Mengen an Substrate für weitere Untersuchungen im Ankom RF Gasbildungssystem ausgewählt. Die Zielstellung der Ankom-Versuche war die Messung der kumulativen Gasbildung von K. slooffiae sowie Analyse der zurückbleibenden Flüssigkeiten. Die Fermentationsrückstände der anaerob inkubierten Varianten wurden auf die Konzentrationen an Metaboliten und auf den AS-Gehalt mittels HPLC analysiert. [0012] Es wurde festgestellt, dass der K. slooffiae Stamm in der Lage war 9 (L-Asparaginsäure, L-Leucin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Tryptophan, L- Tyrosin, L-Valin, L-Glutaminsäure und L-Alanin) von 18 getesteten AS und zusätzlich Pepton, Ammoniumsulfat und Harnstoff (nur in höherer Konzentration) aerob und anaerob als einzelne N-Quelle zu nutzen (Fig. 1). Zwei AS (L-Threonin und L-Serin) wurden allerdings nur anaerob verwertet. Es wurde festgestellt, dass die Hefe kein L-Lysin verwertet, das als wichtigste erstlimitierende AS beim Schwein gilt. [0013] Ammoniumsulfat, Pepton und Harnstoff wurden für die kumulative Messung der Gasproduktion mittels Ankom-System gewählt. Von diesen 3 Substraten erreichte am schnellsten Pepton gefolgt von Ammoniumsulfat die Plateauphase (Fig. 2). Pepton ist eine reiche Stickstoffquelle (N = 12,9% OS 1 ), die sich aus vielen für die K. slooffiae verwertbaren AS (Fig. 1) zusammensetzt. Ammoniumsulfat ist ein Salz von Ammoniak und Schwefelsäure und es wird in Universalmedien bei der Anzucht von Hefen und Bakterien verwendet. Dass Stickstoff und Schwefel primär futterbürtiger und endogener Herkunft im Gastrointestinaltrakt (GIT) von Schweinen genügend vorhanden sind, bedeutet dass die Hefe kein Stickstoffmangel im Darm hat. [0014] Die Untersuchungen der Fermentationsüberstände haben gezeigt, dass K. slooffiae aus allen Substraten, die sie verwerten konnte, keine freien AS, dafür aber beachtliche Mengen an Ethanol und Ameisensäure produziert hat (Fig. 2). Aufgrund ihrer natürlichen antibakteriellen Eigenschaften wird Ameisensäure in der Landwirtschaft weltweit zur Konservierung von Futtermitteln, Hygienisierung von Tränkwassersystemen und zur Milieuregulation im Verdauungsraum eingesetzt. Im Gegensatz zum GIT hatte die Hefe, als Monokultur unter in vitro-bedingungen, reichlich Nährstoffe und keine Konkurrenz. [0015] Zwei Proben mit Zellbiomasse von K. slooffiae wurden untersucht. Die erste Probe wurde mittels Kultivierung in einem Fermenter und nachfolgender Sprühtrocknung hergestellt. Die Gewinnung der zweiten Probe erfolgt durch Kultivierung in der SG-Bouillon, Filtrierung und abschließender Trocknung bei 60 C. Die Hefezellen wurden auf ihren Gehalt an Rohasche, Stickstoff, AS und TS analysiert. [0016] Im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Leiber Bierhefe (Saccaromyces cerevisiae) weist K. slooffiae einen deutlich höheren Gehalt an Rohprotein auf (Fig. 3). Bei der Gegenüberstellung der Daten der Vergleichshefen ist zu erkennen, dass K. slooffiae einen um 1,7- bis 3,8-fach höheren Gehalt an Lysin im Gegensatz zu den anderen Hefen hat. [0017] Die Hefe K. slooffiae ist daher zur Gewinnung proteinreicher Futtermittel mit hohem Lysinanteil bestens geeignet. Erläuterung zu den Figuren Fig. 1: Substrate und Ergebnisse der Assimilationstests in Kulturröhrchen [0018] Die Substrate von 2 bis 36 wurden im Basalmedium (BM, Yeast Nitrogen w/o Amino Acids and w/o Ammonium Sulfate) mit Glucose suspendiert. In den Varianten 37 bis 40 wurde Glucose durch organische Säuren ersetzt, dabei wurde in diesen Varianten Pepton (5 g L 1 ) als N Quelle verwendet. Vor Beimpfung wurde der ph-wert im Basalmedium mittels einer HCl-Lösung auf 6,4 eingestellt. Die Aminosäurengehalte wurden in Anlehnung an die Hopkins Mischung (Hopkins Mixture F. Spencer et al. Methods Companion to ME 5:173, 1993) gewählt. Als Grundlage für die Berechnung der Konzentration an organischen Säuren dienten eigene Ergebnisse aus einer früheren Studie, in der die Konzentrationen von Säuren in Caecuminhalten von Absetzferkeln bestimmt wurden. Die Proben ohne K. slooffiae dienten als Kontrolle. Das Minuszeichen bedeutet keine positive Reaktion. Die Zusammensetzung des BM: Kaliumphosphat (1, 0 g L 1 ), Magnesiumsulfat (0,5 g L 1 ), Calciumchlorid (0,1 g L 1 ), Natriumchlorid (0,1 g L 1 ), Inositol (2,0 mg L 1 ), Borsäure (0,5 mg L 1 ), Niacin (0,4 mg L 1 ), Thiaminhydrochlorid (0,4 mg L 1 ), Pyridoxinhydrochlorid (0,4 mg L 1 ), Calciumpantothenat (0,4 mg L 1 ), Mangansulfat (0,4 mg L 1 ), Zinksulfat (0,4 mg L 1 ), P-Aminobenzoesäure (0,2 mg L 1 ), Eisenchlorid (0,2 mg L 1 ), Riboflavin (0,2 mg L 1 ), Natriummolybdat (0,2 mg L 1 ), Kaliumjodid (0,1 mg L 1 ), Kupfersulfat (0,04 mg L 1 ), Biotin (0,002 mg L 1 ), Folsäure (0,002 mg L 1 ) Die Zusammensetzung des Peptons nach der Hydrolyse bezogen auf g/kg Originalsubstanz: L-Arginin (48,1 g), L-Asparaginsäure (67,6 g), L-Isoleucin (25, 5 g), L-Leucin (54,9 g), L-Lysin (37,8 g), L-Methionin (10,6 g), L-Phenyl-alanin (31,1 g), L-Threonin (27,0 g), L-Tryptophan (3,23 g), L-Tyrosin (14,6 g), L-Valin (38,5 g), L-Histidin (11,4 g), L-Prolin (60,1 g), L- Glutaminsäure (104,1 g), L-Cystein (3,86 g), L-Glycin (105,5 g), L-Serin (28,3 g), L-Alanin (59,1 g) 3/9

4 Fig. 2: Darstellung des Verlaufes der kumulativen Gasproduktion im Ankom- System a und Konzentrationen an Ethanol und Ameisensäure b in den Proben nach der Inkubation DE A a Da die Gasbildung in den Flaschen mit Ammoniumsulfat (5 g L 1 ) und Pepton (5 g L 1 ) bereits nach ca. 20 bzw. 35 Stunden der Inkubation der Plateau-Phase erreichte, wurden diese Proben nach 40-stündige Bebrütung nicht mehr weiter inkubiert. b Für die Konzentrationsmessung an Metaboliten wurden nur die Proben mit dem positiven Hefewachstum ausgewählt. 1 Proben von Ankom-Versuch; 2 Proben vom Assimilationsversuch. Fig. 3: Aminosäuren-, Stickstoff- und Rohproteingehalte (g 1 kg TS) von Zellbiomassen unterschiedlicher lebensmittelrelevanter Hefespezies [0019] Abgesehen von K. slooffiae wurden die Daten der anderen Hefespezies aus dem Manuskript von Martini et al (1979) J Agric Food Chem, v. 27, no. 5, p entnommen. Der Faktor 6,25 wird üblicherweise für die Berechnung des pflanzlichen Proteins verwendet. Der Faktor 5,73 (durchschnittlicher Faktor von 6 unterschiedlichen Hefen) wurde unter Berücksichtigung des Stickstoffgehaltes im Protein von Hefen gewählt. 4/9

5 ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG DE A Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen. Zitierte Nicht-Patentliteratur - Hopkins Mixture F. Spencer et al. Methods Companion to ME 5:173, 1993 [0018] - Martini et al (1979) J Agric Food Chem, v. 27, no. 5, p [0019] 5/9

6 Patentansprüche 1. Verwendung der Hefe Kazachstania slooffiae zur Gewinnung proteinreicher Nahrungs- und Futtermittel mit einem hohen Anteil der Aminosäure Lysin. 2. Verwendung der Hefe Kazachstania slooffiae zur gleichzeitigen Erzeugung von Ameisensäure und Ethanol mittels Fermentation. Es folgen 3 Seiten Zeichnungen DE A /9

7 Anhängende Zeichnungen 7/9

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