Aus der Strahlenklinik Direktor: Prof. Dr. med. Rainer Fietkau

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1 Tumortoxischer Effekt und strahlensensibilisierende Wirkung des Nicht-nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitors Efavirenz bei Rektumkarzinomzellen Aus der Strahlenklinik Direktor: Prof. Dr. med. Rainer Fietkau Der medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med. vorgelegt von Julian Alban Reif aus Ingolstadt

2 Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler Gutachter: Gutachter: PD Dr. L. Distel Prof. Dr. R. Fietkau Tag der mündlichen Prüfung: 11. April. 2017

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4 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Methoden Ergebnisse und Beobachtungen Schlussfolgerungen Summary Background and aims Methods Results and observations Conclusion Einleitung Material und Methoden Zellkulturen Bestrahlung Efavirenz Koloniebildungstest Prinzip Durchführung Auswertung Flusszytometrische Messungen Prinzip Durchführung Auswertung Immunostaining Prinzip Durchführung Auswertung... 20

5 5 Ergebnisse Koloniebildungstest Flusszytometrische Messungen Immunostaining Diskussion Literaturverzeichnis Anhang Abkürzungen Verwendete Lösungen Medien für Zellkulturen Lösungen für Immunostaining Danksagung... 63

6 1 Zusammenfassung 1.1 Hintergrund und Ziele Der nicht-nukleosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitor (NNRTI) Efavirenz (EFV) zählt in Deutschland zu den Standardmedikamenten in der Therapie von HIV-1 (Humanes Immundefizienz Virus Typ 1) -infizierten Patienten. Außerdem wirkt Efavirenz in vitro zytotoxisch auf Tumorzellen. Es wurde bei einigen HIV-1-infizierten Patienten mit Tumorerkrankungen eine erhöhte Nebenwirkungsrate bei Strahlentherapien festgestellt. Diese könnte durch eine strahlensensibilisierende Wirkung von Efavirenz verursacht worden sein. Eine strahlensensibilisierende Wirkung könnte auch zu einer höheren Empfindlichkeit von Tumoren bei Bestrahlung führen. In dieser Arbeit soll nun anhand von Rektumkarzinomzellen getestet werden, ob ein tumortoxischer Effekt bei Efavirenz besteht und sich dieser in Kombination mit ionisierender Strahlung verstärkt. 1.2 Methoden Eine mögliche zytotoxische und strahlensensibilisierende Wirkung von Efavirenz wurde zunächst durch Koloniebildungstests mit den Rektumkarzinomzelllinien HCT15 und SW480 geprüft. Die Auswirkungen bezüglich einer Apoptose- und Nekroseinduktion untersuchte man mittels Durchflusszytometrie an den Rektumkarzinomzellen SW480, HCT15 und den Fibroblastenzellen MZF5. Durch Färbung mit den Fluoreszenzfarbstoffen Annexin-V-APC und 7-AAD konnte man sowohl apoptotische als auch nekrotische Zellen detektieren. Die Expression der aktivierten Faktoren der DNA-Doppelstrangbruchreparatur γh2ax, DNAPK und PML wurde mittels Immunostaining an der Rektumkarzinomzelllinie HCT15 in Abhängigkeit der Zellproliferationsrate, die man durch den Zellproliferationsmarker Ki-67 erfasste, untersucht. 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Die Koloniebildungstests zeigten durch die Behandlung mit Efavirenz sowohl bei den SW480- als auch bei den HCT15-Zellen bereits ohne Bestrahlung mit ansteigender Dosis einen zunehmend verminderten Anteil an teilungsfähigen Zellen gegenüber der Kontrolle, sodass die EC50 (50% toxische Konzentration) bei den SW480-Zellen ca. bei 1

7 25µmol/l EFV und bei den HCT15-Zellen ca. bei 10µmol/l EFV lag. Bei Kombination mit Bestrahlung bestand bei beiden Zelllinien ein additiver Effekt, der bei höheren Bestrahlungsdosen abnahm. Die flusszytometrischen Messungen zeigten eine dosisabhängige Zunahme an apoptotischen und nekrotischen Zellen, wobei der Anteil nekrotischer Zellen bei höheren Efavirenzdosen überwiegt. Die EC50 lag bei den SW480-Zellen ca. bei 30µmol/l EFV und bei den HCT15-Zellen ca. bei 35µmol/l EFV. Das Immunostaining zeigte durch die Behandlung mit Efavirenz ohne ionisierende Strahlung bei allen untersuchten Proteinen kaum einen nennenswerten Unterschied zur Kontrolle. Bei der Kombination von Efavirenz und ionisierender Strahlung kam es jedoch zu einem Anstieg um 3,7 γh2ax-foci pro Zelle in den proliferierenden Ki-67- positiven Zellen verglichen mit alleiniger Bestrahlung. Bei den ruhenden Ki-67- negativen Zellen war der Anstieg mit 4,4 γh2ax-foci pro Zelle noch deutlicher ausgeprägt. Die Phosphorylierung von DNAPK war bei Kombination von Efavirenz mit ionisierender Strahlung um 2,9 Foci pro Zelle und der Anstieg von PML um 0,3 Foci pro Zelle höher als bei alleiniger Bestrahlung. Allerdings waren diese Unterschiede statistisch nicht signifikant. 1.4 Schlussfolgerungen Efavirenz zeigt in vitro einen tumortoxischen Effekt, der sich durch ionisierende Strahlung additiv verstärkt. Somit könnten Patienten, die Efavirenz einnehmen bei einer Strahlentherapie vermehrt Nebenwirkungen erleiden. Aus diesem Grund sollten HIV-1- infizierte Patienten mit dieser Medikation, die eine Strahlentherapie benötigen, vorher auf individuelle Strahlenempfindlichkeit untersucht werden. Durch den tumortoxischen Effekt von Efavirenz und seiner im Vergleich zu Chemotherapeutika geringeren Nebenwirkungen könnte es eine neue mögliche medikamentöse Therapie für Krebserkrankungen darstellen. Durch seine additive Toxizität mit ionisierender Strahlung könnte Efavirenz ebenfalls in Kombination mit Strahlentherapie verwendet werden. 2

8 2 Summary 2.1 Background and aims The Non-Nucleoside Reverse-Transcriptease-Inhibitor (NNRTI) Efavirenz (EFV) is a standard medication in the therapy of HIV-1-infected patients in Germany. Furthermore Efavirenz is cytotoxic against cancer cells. An increased risk of adverse effects of radiation therapy in HIV-1-infected patients with cancer was reported. This might be caused by a radiosensitizing effect of Efavirenz. A radiosensitizing effect could also result in a higher sensitivity of cancer to ionizing radiation. In this work a tumor-toxic effect of Efavirenz alone and in combination with ionizing radiation will be studied in colorectal cancer cell lines. 2.2 Methods A possible cytotoxic and radiosensitizing effect of Efavirenz was studied in colonyformation assays of the colorectal cancer cell lines HCT15 and SW480. The effects on apoptosis and necrosis were examined with flow cytometry after Annexin-V-APC/7- AAD staining in SW480, HCT15 and fibroblast cells MZF5. The phosphorylation of the double-strand break-repair factors H2AX, DNAPK and PML was examined by immunostaining in HCT15-cells in dependence of the cell proliferation marked with Ki Results and observations The colony-formation assays showed a reduced survival fraction after therapy with Efavirenz as well in SW480 as in HCT15 even without radiation. The EC50 (50% toxic concentration) was 25µmol/l EFV in the SW480-cells and 10µmol/l in the HCT15-cells. The combination with ionizing radiation showed additive effects in both cell-lines, which decreased with increasing radiation doses. Flow cytometry showed an increase of apoptotic and necrotic cells after EFV treatment, whereas necrosis was the leading type of death. Immunostaining of H2AX, DNAPK and PML treated with Efavirenz without ionizing radiation does not show a significant difference at all. The combination of Efavirenz and radiation showed an increase of 3,7 γh2ax-foci per cell in the proliferative Ki-67-positive cells compared to radiation alone. The increase in the inactive Ki-67-negative cells was even 4,4 γh2ax-foci per cell. The phosphorylation of DNAPK in the combination of Efavirenz with ionizing radiation was 2,9 Foci per cell 3

9 and the increase of PML was 0,3 Foci per cell compared to radiation alone. But no result of the immunostaining gained statistical significance. 2.4 Conclusion Efavirenz is toxic against colorectal cancer cell lines in vitro and the toxicity is additive in combination with ionizing radiation. Therefore patients taking Efavirenz might suffer from adverse effects during radiation therapy. HIV-1-infected patients with this medication who need a radiation therapy should be tested for individual radiosensitivity. Efavirenz might also become a new drug against cancer and might be used in combination with ionizing radiation. 4

10 3 Einleitung Das kolorektale Karzinom ist in Deutschland die zweithäufigste Krebserkrankung bei Männern und Frauen (Wannenmacher M. 2013). Außerdem ist es in Deutschland die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache nach dem Lungenkarzinom bei Männern und dem Mammakarzinom bei Frauen. Bei den über 40-jährigen verdoppelt sich die Inzidenz alle 10 Jahre (Herold 2014). Das Lebenszeitrisiko in der Normalbevölkerung für ein kolorektales Karzinom beträgt ca. 6% (Herold 2014; Wannenmacher M. 2013). Jedes Jahr erkranken ca Menschen an Rektumkarzinomen. Der Altersgipfel liegt etwa bei 68 Jahren und 90% der Patienten sind bei Erstdiagnose älter als 50 Jahre (Wannenmacher M. 2013). Die häufigste Vorstufe eines kolorektalen Karzinoms ist das Adenom, der sog. Dickdarmpolyp, was eine Proliferation der Mukosaschleimhaut ist. Es hängt von der genetischen Prädisposition des einzelnen und von weiteren exogenen karzinogenen Einflüssen ab, ob aus dem Adenom ein Karzinom entsteht. Die Latenzzeit für die Entwicklung eines Adenoms zu einem Karzinom kann Jahre betragen (Wannenmacher M. 2013). Außerdem können genetische Faktoren das Auftreten eines kolorektalen Karzinoms wesentlich begünstigen und damit auch wahrscheinlicher machen. Hereditäre kolorektale Karzinome machen etwa 15-20% aus. Dabei ist es wichtig darauf zu achten, ob kolorektale Karzinome häufiger in einer Familie auftreten. Hierbei sind Erkrankungen wie die Familiäre adenomatöse Polyposis (FAP) zu nennen, die eine obligate Präkanzerose darstellt, sodass diese Patienten etwa im Alter von Jahren mit nahezu 100%-iger Penetranz an einem kolorektalen Karzinom erkranken. Nach Pubertätsende sollten diese Patienten deshalb prophylaktisch proktokolektomiert werden. Des Weiteren wäre auch das Lynch-Syndrom zu erwähnen, das auch hereditäres, nicht polypöses Kolonkarzinom-Syndrom (HNPCC) bezeichnet wird. Dieser Erkrankung liegen Keimbahnmutationen der Missmatch-Repair Gene zugrunde, was zu einer genetischen Instabilität und einem mehr als 80%-igem Erkrankungsrisiko für kolorektale Karzinome einhergeht. Über dies hinaus können auch chronisch entzündliche Darmerkrankungen wie Colitis Ulcerosa das Risiko an einem kolorektalen Karzinom zu erkranken um das 20-fache erhöhen. Auch Patienten mit Morbus Crohn weisen ein deutlich erhöhtes Risiko auf (Herold 2014; Wannenmacher M. 2013). Histologisch sind 85-90% der kolorektalen Karzinome Adenokarzinome (Wannenmacher M. 2013). Das Grading erfolgt nach dem histologischen Differenzierungsgrad der Zellen. Man bezeichnet gut differenzierte G1 und mäßig 5

11 differenzierte G2 Karzinome als Low-grade-Karzinome. Schlecht differenzierte Karzinome G3, Siegelringzellkarzinome, kleinzellige und undifferenzierte Karzinome G4 werden High-grade-Karzinome genannt. 50% der kolorektalen Karzinome befinden sich im Rektum, 30% im Sigma, 10% im Coecum sowie im Colon ascendens und im restlichen Kolon weitere 10% (Herold 2014). Standard für die Stadieneinteilung ist international die UICC-Klassifikation, die 2010 mit der TNM-Einteilung und Stadiengruppierung verändert wurde (Wannenmacher M. 2013). Die Therapie des kolorektalen Karzinoms hängt von der Lokalisation des Tumors und dem Tumorstadium ab. Chirurgisch erfolgen bei Rektumkarzinomen im oberen und mittleren Rektumdrittel kontinenzerhaltende, restaurative Resektionsverfahren, wie die anteriore Rektumresektion mit totaler Mesorektumexzision (TME). Eine kontinenzerhaltende Chirurgie ist bei Rektumkarzinomen, deren distaler Tumorrand 5 cm von der Anokutanlinie entfernt ist, was auf 85% aller Rektumkarzinome zutrifft, noch möglich (Herold 2014). Bei einem UICC-Stadium I-Tumor sind adjuvante, das heißt postoperative therapeutische Maßnahmen, in der Regel nicht erforderlich. Eine neoadjuvante (präoperative) Radiochemotherapie mit 5-FU wird für Rektumkarzinome im UICC-Stadium II und III empfohlen, was die Lokalrezidivrate um 50% senkt und die 5-Jahresüberlebensrate um 10% verbessert. Außerdem erhöht eine neoadjuvante Radiochemotherapie deutlich die Chance auf eine R0-Resektion unter Umständen auch mit Sphinktererhalt (Herold 2014; Rodel et al. 2000). Zur präoperativen Strahlentherapie existieren zwei Schemata. Das eine ist die Kurzzeitvorbestrahlung mit 5x5 Gy ohne zusätzlicher Chemotherapie und das andere die konventionelle neoadjuvante Radiochemotherapie mit einer Gesamtdosis von 50,4 Gy (Wannenmacher M. 2013). Eine schwedische Studie zeigte, dass die präoperative Kurzzeitbestrahlung der alleinigen Operation überlegen ist (Trial 1997), was eine niederländische Studie bestätigen konnte (Kapiteijn et al. 2001). Allerdings zeigten Langzeitbeobachtungen der schwedischen Studie, dass das Risiko für Zweitkarzinome in unmittelbarer Umgebung des Bestrahlungsfeldes bei den Patienten mit präoperativer Kurzzeitbestrahlung signifikant höher war als nach alleiniger Operation (Birgisson et al. 2005). Eine niederländische Studie berichtete, dass die zusätzliche präoperative Bestrahlung bei manchen Patienten zu sexueller Dysfunktion und Defäkationsbeschwerden führte 6

12 (Marijnen et al. 2005). Ob die präoperative Kurzzeitbestrahlung der konventionellen Radiochemotherapie ebenbürtig ist, wird noch erforscht. Die aktuelle S3-Leitlinie empfiehlt jedoch die konventionell fraktionierte neoadjuvante Radiochemotherapie (Wannenmacher M. 2013). Efavirenz ist ein nicht-nukleosidischer Reverse-Transkriptase-Inhibitor, der nach Nevirapin entwickelt wurde. Es wurde im September 1998 von der amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) und in Deutschland 1999 zugelassen. Außerdem war es das erste zugelassene HIV-Medikament, das man nur einmal täglich einnehmen musste. Efavirenz ist sehr lipophil und besitzt mit 52-76h eine lange Eliminationshalbwertszeit (Katsounas 2006). Efavirenz gehört mit Nevirapin zu den first-line Medikamenten in der High Aktive Antiretroviral Therapy (HAART) für Patienten, die mit dem Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) infiziert sind und ist insgesamt gut verträglich (Azijn et al. 2010; Corbau et al. 2010). Es hemmt im Gegensatz zu den nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NRTI) nicht kompetitiv das katalytische Zentrum der HIV-1-typischen Reversen Transkriptase. Es erreichte in einem Bereich von 0,46-6,8 nm eine 90-95%-ige Hemmung des Wildtyp-HI-Virus in Monozyten- und Makrophagenkulturen (Katsounas 2006). ATRIPLA (Bristol-Myers Squibb and Gilead Sciences) ist ein Regime, das aus einer einzigen Tablette besteht, die 600 mg Efavirenz, 200 mg Emtricitabin und 300 mg Tenofovir disoproxil fumarat enthält. Diese Dreifachkombinationstherapie wird aktuell aufgrund seiner guten Wirksamkeit und seiner geringen Nebenwirkungen in der HIV- Therapie häufig verwendet und muss bedingt durch die lange Eliminationshalbwertszeit der Substanzen nur einmal täglich eingenommen werden (Dejesus et al. 2009; Goicoechea et al. 2007; Katsounas 2006). Die Kombination von Efavirenz und zwei nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitoren wie Emtricitabin und Tenofovir disoproxil fumarat ist die üblichste Variante dieses Regimes. Es kann aber auch um die zusätzliche Gabe eines Proteaseinhibitors erweitert werden (Goicoechea and Best 2007; Katsounas 2006). Efavirenz darf bei Patienten mit einer Leberzirrhose im Stadium C der Child-Pugh- Kriterien nicht appliziert werden (Katsounas 2006). Es wird durch die Enzyme CYP3A4 und CYP2D6 des Cytochrom P450-Systems abgebaut (Fletcher et al. 2000). Efavirenz ist gleichzeitig ein CYP3A4-Induktor und -Inhibitor, weshalb sich diverse 7

13 Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten ergeben. Deshalb darf es beispielsweise nicht mit Benzodiazepinen kombiniert werden. Da diese durch CYP3A4 metabolisiert werden und Efavirenz dieses Enzym hemmt, ergibt sich die Gefahr einer schweren Atemdepression. Ebenso sollte es auch nicht mit Johanniskraut-Präparaten kombiniert werden, weil diese als CYP3A4-Induktoren die Serumkonzentration von Efavirenz vermindern würden und die erwünschte therapeutische Wirkung somit beeinträchtigt würde. In der Schwangerschaft ist Efavirenz auch kontraindiziert, da in Tierversuchen fetale Fehlbildungen auftraten (Katsounas 2006). Am häufigsten werden im Zusammenhang mit Efavirenz in klinischen Studien zentralnervöse Nebenwirkungen, die bei ca. 50% der Patienten auftraten, beschrieben. Dazu zählen Symptome wie Kopfschmerzen, Schwindel, Konzentrationsstörungen, Angststörungen, Alpträume, Dysphorie und auch Euphorie (Goicoechea and Best 2007; Katsounas 2006). Weitere Symptome sind in absteigender Häufigkeit Hautausschlag (11,6%), Schwindel (8,5%), Übelkeit (8%) und Müdigkeit (5,5%). Sehr selten sind dagegen allergische Reaktionen, Ataxie, Koordinationsstörungen, Stupor, Verwirrung, Amnesie, Delirium, Halluzinationen, Erbrechen, Durchfall und Hepatitis (Katsounas 2006). Es gibt noch nicht sehr viele Studien, die einen tumortoxischen Effekt von NNRTIs zeigten, weshalb man die Äußerung aufstellen kann, dass dieser Effekt der NNRTIs noch nicht gut erforscht ist. Manche Studien konnten zeigen, dass NNRTIs einen Rückgang der Zellproliferationsrate und morphologische Veränderungen in Tumorzellen induzierten (Dong et al. 2013; Pittoggi et al. 2008; Stefanidis et al. 2008). Stefanidis et al. konnten zeigen, dass der NNRTI Nevirapin neben dem Wachstumsarrest und morphologischen Veränderungen, eine vorzeitige Zellalterung in Cervixkarzinomzellen induzierte (Stefanidis 2008). Ähnliche antiproliferative Effekte von Nevirapin zeigte eine weitere Studie an anaplastischen Schilddrüsenkarzinomzellen (Dong 2013). Pittoggi et al. demonstrierten an Nierenzellkarzinomzellen, dass Efavirenz vergleichbare Effekte verursachen kann (Pittoggi 2008). Es existieren zu diesem Thema zwei klinische Fallberichte. Der eine beschreibt einen Rückgang der Lymphadenopathie im Rahmen eines Diffusen großzelligen B-Zell Lymphoms allein durch die Therapie mit ATRIPLA, die Efavirenz, Emtricitabin und Tenofovir enthält (Amengual et al. 2008) und der andere die Remission eines MALT-Lymphoms bei einem HIV-Patienten allein durch die HAART-Therapie, die neben anderen Medikamenten Nevirapin enthielt 8

14 (Girard et al. 2005). Des Weiteren konnten einige Studien bei dem NRTI Zidovudin einen strahlensensibilisierenden Effekt zeigen (Hiraoka et al. 1988; Zhou et al. 2007). Ähnliche Effekte wurden auch für Proteaseinhibitoren wie Nelfinavir (Chapman et al. 2009) und Saquinavir (Pajonk et al. 2002) beschrieben. Eine Arbeit zeigte eine tumortoxische Wirkung des NNRTI Efavirenz an diversen Tumorzellen (Hecht et al. 2013). Über dies hinaus wurde eine strahlensensibilisierende Wirkung bei Efavirenz beobachtet (Keller et al. 2015). Angesichts dieser Daten ist es nun Ziel dieser Arbeit den tumortoxischen und strahlensensibilisierenden Effekt des NNRTI Efavirenz an Rektumkarzinomzellen zu bestätigen. Durch die tumortoxische Wirkung könnte man Efavirenz als neue mögliche medikamentöse Therapie für Patienten mit Krebserkrankungen, bei denen eine Chemotherapie aus diversen Gründen nicht in Frage kommt, einsetzen. Die strahlensensibilisierende Wirkung würde eine Erklärungsmöglichkeit für die erhöhte Nebenwirkungsrate bei HIV-Patienten im Rahmen einer Strahlentherapie darstellen und bietet die Möglichkeit Efavirenz gezielt als Radiosensitizer einzusetzen. In dieser Arbeit wurde Efavirenz allein und in Kombination mit ionisierender Strahlung an Rektumkarzinomzellen getestet. Der Koloniebildungstest wurde verwendet um die Auswirkungen auf die Zellproliferation zu testen und die flusszytometrischen Messungen erfolgten um die Effekte auf die Apoptose-Nekrose-Induktion zu überprüfen. Die Auswirkungen hinsichtlich DNA-Schäden wurden mittels Immunostaining untersucht, da man in dieser Methode durch fluoreszenzfarbstoffmarkierte Antikörper die Expression verschiedener Faktoren der DNA-Schadenserkennung und Reparatursysteme sichtbar machen kann. 9

15 4 Material und Methoden 4.1 Zellkulturen Für die Versuche wurden die Fibroblastenzelllinie MZF5 und die beiden Rektumkarzinomzelllinien SW480 und HCT15 verwendet. Das Medium F-12 (Hersteller: gibco by life technologies) mit 12% FBS (fetal bovine serum), 2% NEA (non-essential AminoAcids) und 1% Penicillin/Streptomycin diente den Fibroblastenzellen MZF5 als Nährmedium. Für die Rektumkarzinomzelllinie SW480 wurde DMEN (Hersteller: PAN Biotech GmbH) mit zusätzlich 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin verwendet. Für die Rektumkarzinomzelllinie HCT15 kam das Medium RPMI-1640 (Hersteller: SIGMA-ALDRICH) mit 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin zum Einsatz. 4.2 Bestrahlung Die Applikation ionisierender Strahlen wurde mit einer 120 kv Röntgenröhre (ISOVOLT Titan, GE, Ahrensburg, Deutschland) durchgeführt. 4.3 Efavirenz Der nicht-nukleosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitor Efavirenz (EFV) wurde von dem Hersteller Sequoia Research Products bezogen und als 10 mmol/l Stammlösung in DMSO (Dimethylsulfoxid) gelöst. Entsprechend der erforderlichen Menge für die gewünschte Konzentration von EFV wurde die Stammlösung dem jeweiligen Nährmedium hinzugegeben. 4.4 Koloniebildungstest Prinzip Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit Noxen wie z.b. zytostatische Medikamente oder ionisierende Strahlung auf ihre zellschädigenden Effekte zu testen und damit zu überprüfen, ob Zellen nach Applikation der zu untersuchenden Noxe noch teilungsfähig sind. Zellen werden einzeln in einer Petrischale ausgesät und mit der zu testenden Noxe behandelt, was dazu führt, dass einige Zellen absterben oder sich nicht mehr teilen können. Einige Zellen sind weiterhin zur Zellteilung in der Lage und können sich folglich vermehren. Eine unbehandelte Negativkontrolle benötigt man als Referenz um die Überlebensrate zu ermitteln, also den Anteil der teilungsfähigen Zellen unter dem Einfluss der zu testenden Noxe im Vergleich zur Kontrolle. Die vermehrungsfähigen 10

16 Zellen bilden nach wenigen Wochen Kolonien, welche kleine Zellnester mit mehr als 50 Zellen darstellen, die mit dem Auge sichtbar sind und nach Färbung mit Methylenblau hinsichtlich ihrer Anzahl ausgewertet werden können (siehe Abbildung 1). Abbildung 1: Koloniebildungstest der Zelllinie SW Durchführung Dieser Test wurde mit den Rektumkarzinomzelllinien SW480 und HCT15 durchgeführt. Es wurden Versuche mit Efavirenz allein in unterschiedlichen Dosierungen und Versuche mit 30µmol/l EFV und zusätzlicher Bestrahlung in unterschiedlichen Dosierungen durchgeführt. Jeder Versuch wurde dreimal wiederholt. Bei den Versuchen, bei denen nur EFV getestet wurde, wurden die Zellen in den Zellkulturflaschen mittels Trypsin vereinzelt, dann in Petrischalen eingesät und nach 3 Stunden mit Efavirenz behandelt. Somit blieb den Zellen eine Zeit von 3 Stunden um anzuwachsen. Bei den Versuchen, bei denen auch ionisierende Strahlung zum Einsatz kam, gab es zwei Gruppen. Die erste Gruppe wurde nicht mit EFV behandelt, sondern nur bestrahlt und die zweite Gruppe wurde 3 Stunden nach dem Einsähen mit 30µmol/l EFV behandelt. Nach 24 Stunden erfolgte bei beiden Gruppen die Bestrahlung. Nach weiteren 48 Stunden wurde das Medium, bei den mit Efavirenz behandelten 11

17 Petrischalen abgesaugt und durch neues Nährmedium ersetzt, wodurch die Behandlung mit Efavirenz beendet wurde. Nach 12 Tagen wurde das Medium erneut durch Frisches ersetzt um bestmögliche Wachstumsbedingungen für die Zellen zu schaffen und am Tag 18 wurden die Zellkolonien mit Methylenblau gefärbt. Dieser Farbstoff wurde nach 30 Minuten mit destilliertem Wasser abgewaschen und nach 2 Tagen Trocknung an der Luft konnten die gefärbten Kolonien mittels eines digitalen Zählstifts ausgewertet werden. Es gab folgende Bedingungen in den Versuchen, die nur EFV testeten: Kontrolle, 5µmol/l EFV, 10µmol/l EFV, 20µmol/l EFV, 40µmol/l EFV, 60µmol/l EFV und 80µmol/l EFV. Für jede Bedingung wurden in zwei Petrischalen jeweils 200 Zellen pro µl und in zwei weiteren Petrischalen jeweils 400 Zellen pro µl eingesät, sodass für jede Bedingung insgesamt vier Petrischalen existierten. Wie bereits erwähnt, bestanden die Versuche, bei denen ionisierende Strahlung verwendet wurde, aus zwei Gruppen. Gruppe 1 wurde nach 24 Stunden nur bestrahlt und bei Gruppe 2 wurden zusätzlich 30µmol/l EFV appliziert. Für diese Versuche gab es folgende Bedingungen: Eine Kontrolle, die bei Gruppe 1 nicht bestrahlt und nicht mit EFV behandelt wurde und bei Gruppe 2 nur mit 30µmol/l EFV behandelt wurde, 1 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy und 10 Gy. Für jede Bedingung wurden Zellen in jeweils drei Petrischalen eingesät Auswertung Nachdem die mit Methylenblau gefärbten Zellkolonien getrocknet waren, konnte man sie per Hand mit Hilfe eines digitalen Zählstiftes (Hersteller: BIO KOBE, Japan) auswerten. Mit diesem Zählstift (colony counter) kann man die Zellkolonien, die sich am Boden der Petrischalen befinden, markieren und das Display des Zählstiftes zählt durch das Aufdrücken auf eine Unterlage automatisch um eins weiter. 4.5 Flusszytometrische Messungen Prinzip Die Durchflusszytometrie ermöglicht es in relativ kurzer Zeit eine große Anzahl von Zellen zu analysieren. Dazu muss die zu untersuchende Struktur der in Suspension gelösten Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszenzmarkierten Antiköpern gegen die entsprechende Struktur markiert werden. Dann fließen die in Suspension 12

18 gelösten Zellen durch ein Messgerät mit einer Kapillare, die sie nur einzeln und nacheinander passieren können und werden von einem Laserstrahl angeregt. Es wurde ein Flusszytometer mit drei Lasern und insgesamt zehn Messkanälen/Farbfiltern, von denen zwei genutzt wurden, verwendet. So konnten zeitgleich mehrere Fluoreszenzfarbstoffe auf jeder einzelnen Zelle erfasst werden. Zur Detektion von apoptotischen und nekrotischen Zellen wurden die Fluoreszenzfarbstoffe Annexin-V-APC und 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) verwendet. Bei der Apoptose, dem programmierten Zelltod, verlieren die Zellen die Phospholipid-Asymmetrie der Plasmamembran in einer Weise, dass Phosphatidylserin an die Oberfläche der Zellmembran gelangt (Koopman et al. 1994). Die Zellmembran besteht aus einem Phospholipid-Bilayer, der normalerweise eine äußere Schicht, bestehend aus Phosphatidylcholin und Sphingomyelin und eine innere Schicht, bestehend aus Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylserin, aufweist. In apoptotischen Zellen wird Phosphatidylserin in die äußere Schicht verlagert und Annexin-V-APC bindet an negativ geladene Phospholipide wie Phosphatidylserin, wodurch man apoptotische Zellen mit Hilfe von Annexin-V-APC detektieren kann (Koopman 1994; Lecoeur et al. 1997; van Engeland et al. 1998). Annexin-V-APC kann die Plasmamembran vitaler Zellen nicht durchdringen und somit auch nicht an Phosphatidylserin, das in der inneren Membranschicht des Phospholipid-Bilayers liegt, binden. Nekrotische Zellen verlieren allerdings die Integrität der Plasmamembran, was bedeutet, dass die Zellmembran für größere Moleküle durchlässiger wird und Annexin- V-APC kann die beschädigte Membran durchdringen und an Phosphatidylserin binden (van Engeland 1998). Der Fluoreszenzfarbstoff 7-AAD kann die Zellmembran nur bei nekrotischen Zellen, die die Integrität der Plasmamembran verloren haben, durchdringen und so an die DNA binden (Lecoeur 1997). Vitale Zellen reagieren demnach auf Annexin-V-APC und 7-AAD negativ, apoptotische Zellen auf Annexin-V- APC positiv, aber auf 7-AAD negativ und nekrotische Zellen sowohl auf Annexin-V- APC als auch auf 7-AAD positiv Durchführung Mit dieser Methode wurden die Rektumkarzinomzelllinien SW480, HCT15 und die Fibroblastenzelllinie MZF5 nur mit der Behandlung von Efavirenz und ohne ionisierender Strahlung untersucht. Die Zellen wurden zunächst in Zellkulturflaschen eingesät und nach 48 Stunden mit unterschiedlichen Dosen von Efavirenz behandelt, 13

19 womit den Zellen 48 Stunden Zeit zum Anwachsen blieb. Efavirenz wirkte dann 48 Stunden auf die Zellen ein, weshalb also am 4. Tag nach dem Einsäen die Färbung der Zellen erfolgte. Dazu wurden die Zellen aus den Zellkulturflaschen in Zentrifugenröhrchen überführt und bei 24 C 8 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das verbleibende Zellpellet in 1,2 ml Medium gelöst. Für jede Versuchsbedingung erfolgten drei Messungen aus denen bei der Auswertung der Mittelwert berechnet wurde. Deshalb wurden für jede Versuchsbedingung drei FACS-Röhrchen vorbereitet, die jeweils mit 400 µl Zellsuspension befüllt wurden. Danach wurden die FACS-Röhrchen erneut 6 Minuten lang bei 20 C zentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum abgesaugt und das verbleibende Zellpellet in 200 µl Ringerlösung gelöst. Daraufhin wurden jeweils 5 µl Annexin-V-APC und 7-AAD hinzupipettiert und das Ganze mit Hilfe eines Vortexers vermischt. Die gefärbten Zellsuspensionen wurden daraufhin 30 Minuten lang auf Eis lichtgeschützt gelagert. Anschließend wurden die gefärbten Zellsuspensionen erneut bei 20 C 6 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und die verbleibenden Pellets in 400 µl Ringerlösung gelöst und konnten nun im Durchflusszytometer gemessen werden Auswertung Die Daten wurden mit der Kaluza Analysis Software 1.1 (Beckman Coulter, Krefeld, Germany) ausgewertet. Dazu wurden standardisierte Protokolle für die Farbstoffe unter Verwendung von Histogrammen und Dot-plots erstellt. Diese Protokolle mussten am Durchflusszytometer einmal eingestellt werden und konnten dann bei jeder Messung erneut benutzt werden. Die Farbstofflösungen wurden in Fluoreszenzkanälen aufgenommen. Der Kanal FL4 (695 / 30 nm) wurde für 7-AAD, FL6 (660 / 20 nm) für Annexin-V-APC verwendet. Dabei wurden Annexin-V-APC und 7-AAD logarithmisch ausgewertet. Die Dot-plot Diagramme sind in vier Quadranten unterteilt und den jeweiligen Farbstoffen zugeordnet. Je nachdem in welchem Quadrant die Punktwolke erscheint, handelt es sich entweder um vitale, apoptotische oder nekrotische Zellen, siehe Abbildung 2a und b. Diese Daten wurden anschließend mittels Microsoft Excel 2010 graphisch und statistisch aufgearbeitet. 14

20 Abbildung 2a und b: Zelllinie HCT15 nach Behandlung mit 40µmol/l EFV und Kontrolle a) Kontrolle b) 40µmol/l EFV 15

21 4.6 Immunostaining Prinzip Mit dieser Methode ist es möglich Proteine im Zellkern mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper als kleine Punkte, die als Foci bezeichnet werden, unter dem Mikroskop sichtbar zu machen. In dieser Arbeit wurden Antikörper verwendet, die gegen bestimmte Reparaturproteine und dem Proliferationsmarker Ki-67 gerichtet sind. Es wurde die Technik der indirekten Immunfluoreszenz angewendet, bei der zwei Antikörper benötigt werden. Beide Antikörper werden aus einer bestimmten Tierart gewonnen. Der erste Antikörper, der sog. Primärantikörper richtet sich gegen das zu untersuchende Zielprotein und der zweite Antikörper, der Sekundärantikörper bezeichnet wird, ist gegen das Fc-Fragment der Tierart des Primärantikörpers gerichtet. Da der Sekundärantikörper mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert ist, kann der an das zu untersuchende Zielprotein gebundene Primärantikörper unter dem Mikroskop betrachtet werden. Nun kann man mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops die Anzahl der Foci einer Zelle auswerten (siehe Abbildung 3) und durch entsprechende Wahl von Primär- und Sekundärantikörpern daraus schließen, welche Proteine beispielsweise nach Applikation ionisierender Strahlung in der Zelle auftreten. Außerdem wurde der DNAspezifische Fluoreszenzmarker 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) verwendet, der sich in AT-reichen Stellen in die DNA einlagert (Kapuscinski 1995), um Gewissheit zu haben, dass nur Foci in Zellkernen ausgewertet werden (siehe Abbildung 4a-d). 16

22 Abbildung 3: Zellkern einer HCT15-Zelle in 40-facher Vergrößerung nach der Behandlung mit 20µmol/l EFV und 2 Gy Grün: γh2ax-foci Rot: Ki-67-Foci Abbildung 4: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen in 40-facher Vergrößerung der Färbungen von Immunostaining der Zelllinie HCT15 nach der Behandlung mit 30µmol/l EFV und 2 Gy a) Zellkerne mit γh2ax-, Ki-67- b) γh2ax-foci und DAPI-Färbung im Overlay 17

23 c) Ki-67-Foci d) Zellkerne mit DAPI gefärbt Durchführung Mit dieser Methode wurden die Auswirkungen von Efavirenz allein und in Kombination mit ionisierender Strahlung an der Rektumkarzinomzelllinie HCT15 untersucht. Dazu wurden die Zellen in zwei Quadripermschalen eingesät. Eine wurde nur mit Efavirenz behandelt und die andere zusätzlich mit 2 Gy bestrahlt. In beiden Quadripermschalen wurde das erste Abteil nicht mit Efavirenz behandelt, damit man eine Negativkontrolle als Referenz hatte, das zweite Abteil wurde mit 20µmol/l EFV behandelt, das dritte mit 25µmol/l EFV und das vierte mit 30µmol/l EFV. Die Behandlung mit Efavirenz erfolgte nach 48 Stunden, sodass die Zellen ausreichend Zeit hatten um anzuwachsen und diverse Zellschäden zu reparieren. 72 Stunden nach dem Einsäen wurde die zweite Quadripermschale zusätzlich mit 2 Gy bestrahlt, sodass Efavirenz 24 Stunden Zeit hatte seine Wirkung zu entfalten. 24 Stunden nach der Bestrahlung erfolgte das Fixieren und Blocken. Dazu wurde das Medium verworfen und die Deckgläser kurz mit PBS (phosphate buffered saline) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen 15 Minuten lang mittels einer Fixierlösung bestehend aus PBS, 37%-igem Formaldehyd und 0,1%- igem Triton X-100 (siehe Anhang Tabelle 6) fixiert. Dies ist nötig, dass die Zellen auf den Deckgläsern fixiert sind und sowohl die Zell- als auch Kernmembran permeabler wird, da es nur so den Antikörpern möglich ist in den Zellkern zu gelangen. Darauf wurden die Deckgläser dreimal 5 Minuten lang auf einem Schwenkapparat mit TBS (tris buffered saline) gewaschen. Nach diesem Vorgang wurde die Blocking-Lösung bestehend aus PBS, FBS, BSA (bovine serum albumin) und Natriumazid (siehe Anhang Tabelle 7) dazugegeben, die 1 Stunde lichtgeschützt bei Raumtemperatur auf dem Schwenkapparat wirken konnte. Danach musste die Blocking-Lösung durch dreimal 18

24 fünfminütiges Waschen in TBS abgespült werden. Nach kurzem Trocknen wurden die Deckgläser mit einem Liquidstift (Fettstift) in zwei etwa gleich große Hälften geteilt, sodass die Antikörper nicht zur anderen Seite diffundieren konnten. Man benötigte nun jeweils für die linke und rechte Seite zwei unterschiedliche Mischungen von Primärantikörpern. Diese Mischungen bestanden wiederum jeweils aus zwei verschiedenen Primärantikörpern, die in 1%-igem BSA in TBS verdünnt waren. Diese entsprechenden Primärantikörpermischungen wurden nun auf die rechte und linke Seite appliziert und anschließend die Deckgläser mit einem zurechtgeschnittenen Parafilmplättchen abgedeckt. Rechts wurden die Primärantikörper gegen γh2ax und Ki-67 aufgetragen und die gegen DNAPK sowie PML links. Die verwendeten Primärantikörper sind in Tabelle 1 genauer dargestellt. Tabelle 1: Primärantikörper für das Immunostaining Antikörper Hersteller Verdünnung Anti-phospho-Histone Upstate, New York, USA 1:1500 H2AX (Ser139), Mouse Ki-67, Rabbit Santa Cruz Biotechnology, CA, USA 1:50 DNAPKcs (pt2609), Biozol 1:250 Mouse Promyelozyten-Leukämie- Protein (PML), Rabbit Santa Cruz Biotechnology, CA, USA 1:50 Nach dem Auftragen der Primärantikörper wurden die Deckgläser in eine Feuchtkammer gelegt und 24 Stunden lang lichtgeschützt im Kühlschrank gelagert. Am nächsten Tag wurden die Deckgläser erneut dreimal 5 Minuten lang in TBS gewaschen und danach kurz getrocknet. Anschließend wurden die mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Sekundärantikörpermischungen, die ebenfalls mit 1%-igem BSA in TBS verdünnt waren, darauf pipettiert und mit einem Parafilmplättchen bedeckt. Die Mischung aus Sekundärantikörpern bestand aus rot und grün fluoreszierenden Antikörpern. Die grün fluoreszierenden Antikörper waren gegen die Mouse- 19

25 Primärantikörper gerichtet und die rot fluoreszierenden Antikörper gegen die Rabbit- Primärantikörper. Die Sekundärantikörper sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Sekundärantikörper für das Immunostaining Antikörper Hersteller Verdünnung Alexa Fluor 488 (grün), Goat anti Mouse Molecular Probes 1:400 Alexa Fluor 594 (rot), Molecular Probes 1:200 Chicken anti Rabbit Die Sekundärantikörper wirkten 1,5 Stunden lang lichtgeschützt bei Raumtemperatur ein. Nach diesem Prozess wurden die Deckgläser wiederum dreimal 5 Minuten lang in TBS gewaschen und anschließend kurz getrocknet. Nun konnte die DAPI-Färbung durchgeführt werden. Die DAPI-Lösung bestand aus 0,1 µl DAPI SL (Stammlösung) und 1 ml 4xSSC/Tween. Diese wurde in jedem Feld aufgetragen und 1 Minute lang mit Parafilmplättchen abgedeckt. Danach wurden die Deckgläser kurz in destilliertem Wasser gewaschen. Durch die DAPI-Färbung werden die Zellkerne blau angefärbt, wodurch sie im Fluoreszenzmikroskop schnell gefunden werden können. Nun musste man die Deckgläser kurz trocknen lassen. Dann wurde das Eindeckmedium Vectashield Mounting Medium for Fluorescence (Hersteller: Vector Laboratories) auf Objektträger gegeben, damit die Deckgläser auf den Objektträgern haften bleiben und die Deckgläser wurden mit der zellbeschichteten Seite auf die Objektträger gelegt Auswertung Die Objektträger mit der Zelllinie HCT15 wurden dazu unter einem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axioplan 2 Imaging) mit drei verschiedenen Farbfiltern mittels einer CCD-Kamera in 40-facher Vergrößerung abfotografiert. Dazu musste man eine Stelle auf dem Objektträger suchen, an der die Zellen zwar zahlreich, aber dennoch einzeln und nicht übereinander gelagert, vorkamen. Der blaue Farbfilter diente zur Darstellung der DAPI-Färbung und der rote und grüne Farbfilter zur Darstellung der Foci der gefärbten Proteine. Mit dem grünen Farbfilter konnte man die γh2ax- und die DNAPK-Foci sehen und mit dem roten Farbfilter die Ki-67- und die PML-Foci. Die weitere Bearbeitung und Auswertung der mittels CCD-Kamera aufgenommenen Bilder 20

26 wurde mit der Bildanalyse-Software Biomas 2.3 (MSAB, Erlangen, Germany) durchgeführt. Dieses Programm ist in der Lage die mit DAPI angefärbten Zellkerne und deren Grenzen zu detektieren. Die Empfindlichkeit dafür muss allerdings manuell eingestellt werden. Diese Markierungen werden bei den Bildern mit den Proteinfärbungen dann automatisch vorgenommen. Anschließend werden die Zellen entsprechend der Färbungen sortiert. Nach der Sortierung der Zellen erfolgt die Markierung der Foci automatisch, wenn man vorher die Sensitivität für die Erkennung der Foci manuell eingestellt hat. Diese Ergebnisse, die unter anderem die Anzahl der Foci pro Zelle enthalten, werden automatisch in eine Excel-Datei übertragen. Dadurch konnten die Mittelwerte der Ergebnisse aller Versuche erstellt und in einer Graphik dargestellt werden. 21

27 5 Ergebnisse 5.1 Koloniebildungstest Der Koloniebildungstest ist ein Testverfahren um Noxen auf ihre zellschädigende Wirkung zu testen und damit zu überprüfen, ob die Zellen nach Applikation der Noxe noch teilungsfähig sind. Für alle Versuche dieses Testverfahrens wurden die Rektumkarzinomzelllinien SW480 und HCT15 verwendet. Jeder Versuch wurde dreimal durchgeführt. Es wurden bei beiden Zelllinien jeweils Versuche durchgeführt, anhand derer die zytotoxische Wirkung von Efavirenz allein getestet wurde und Versuche anhand derer die strahlensensibilisierende Wirkung von Efavirenz geprüft werden sollte. Bei der nicht mit EFV behandelten und nicht bestrahlten Kontrolle betrug der Anteil überlebender Zellen im Mittel 33,5% bei der SW480-Zelllinie und 50,2% bei der HCT15-Zelllinie. Bei jedem Versuch wurde der überlebende Anteil der nicht mit EFV behandelten und nicht bestrahlten Kontrolle auf 1 festgelegt und die übrigen Werte als Anteil davon berechnet. Jeder Balken in den Säulendiagrammen stellt einen Mittelwert aus zwölf Einzelwerten bei den Versuchen, die die zytotoxischen Effekte von Efavirenz allein testeten, dar. Bei den Versuchen, bei denen die strahlensensibilisierende Wirkung von Efavirenz geprüft werden sollte, wurden die Ergebnisse aus neun Einzelwerten berechnet und logarithmisch dargestellt. Bei diesen Versuchen wurde Efavirenz 3 Stunden nach dem Einsäen hinzugegeben und nach 48 Stunden wurde das mit Efavirenz behandelte Medium wieder durch frisches Medium ersetzt. Zusätzlich wurden die absoluten Mittelwerte mit Hilfe eines zweiseitigen T-Tests für unabhängige Stichproben mit einem Signifikanzniveau von p 0,05 auf Ungleichheit getestet. Werte mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit p 0,05 sind demnach als statistisch signifikant unterschiedlich zu bewerten. Aus den Ergebnissen geht hervor, dass bei der Zelllinie SW480 ab 10µmol/l EFV mit p<0,001 und bei den HCT15-Zellen bereits ab 5µmol/l EFV mit p=0,032 ein signifikanter Unterschied im Vergleich zur Kontrolle besteht. In Abbildung 5 und 6 sind die Ergebnisse graphisch dargestellt. 22

28 Überlebensrate in % Überlebensrate in % Abbildung 5: Graphische Darstellung des Anteils überlebender Zellen der Zelllinie SW480 nach der Behandlung mit Efavirenz 1,2 SW ,8 0,6 0,4 0, Efavirenz in µmol/l Abbildung 6: Darstellung des Anteils überlebender Zellen der Zelllinie HCT15 nach der Behandlung mit Efavirenz 1,2 HCT15 1 0,8 0,6 0,4 0, Efavirenz in µmol/l 23

29 Bei beiden Zelllinien zeigt sich mit zunehmenden Efavirenzdosen eine deutliche Abnahme des Anteils an teilungsfähigen Zellen. Der Anteil überlebender Zellen reicht von 87,4% bei der SW480-Zelllinie und 82,2% bei der HCT15-Zelllinie bei einer EFV- Dosis von 5µmol/l, bis 0 überlebende Zellen bei den SW480-Zellen und 0,2% bei den HCT15-Zellen bei einer EFV-Dosis von 80µmol/l. Bereits zwischen 5 und 10µmol/l EFV sinkt der Anteil teilungsfähiger Zellen von 87,4% auf 62,4% bei der Zelllinie SW480 und von 82,2% auf 49,8% bei der Zelllinie HCT15, was einen deutlich zytotoxischen Effekt bei relativ geringen Konzentrationen zeigt. Bei den Versuchen, bei denen die strahlensensibilisierende Wirkung von EFV getestet wurde, wurden zwei Gruppen verglichen. Bei der ersten Gruppe wurden die Zellen nur bestrahlt. Bei der zweiten Gruppe wurden die Zellen zusätzlich mit 30µmol/l EFV behandelt. Die Wahl dieser Dosis basierte auf den Ergebnissen der Versuche, die die zytotoxische Wirkung von EFV gezeigt hatten. Bei beiden Zelllinien war bei einer Dosis zwischen 20 und 40µmol/l EFV ein deutlicher zytotoxischer Effekt zu beobachten, weshalb man sich für die Versuche, die die strahlensensibilisierende Wirkung von EFV untersuchen sollten, für den Mittelwert entschied. 3 Stunden nach dem Einsäen erfolgte bei der zweiten Gruppe die Behandlung mit EFV und nach 24 Stunden wurden die Zellen beider Gruppen mit den Dosen 1, 2, 4, 6, 8 und 10 Gy bestrahlt. Nach weiteren 24 Stunden wurde das mit EFV behandelte Medium durch neues Nährmedium ersetzt. Im zweiseitigen T-Test für unabhängige Stichproben mit einem Signifikanzniveau von p 0,05 besteht bereits ab 1 Gy bei den SW480-Zellen mit p<0,001 und den HCT15- Zellen mit p<0,001 ein signifikanter Unterschied im Vergleich zur Kontrolle. Bei 30µmol/l EFV besteht bei den HCT15-Zellen (p<0,001) und bei den SW480-Zellen (p<0,001) ein signifikanter Unterschied. Bei der Zelllinie SW480 besteht durch die zusätzliche Behandlung mit 30µmol/l EFV bei 1 Gy mit p=0,003, bei 2 Gy mit p=0,002 und bei 4 Gy mit p=0,047 ein signifikanter Unterschied im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung. Ab 6 Gy existiert kein signifikanter Unterschied im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung. Bei den HCT15-Zellen besteht durch die zusätzliche Behandlung mit 30µmol/l EFV bei 1 Gy bis 6 Gy (p<0,001) ebenfalls ein signifikanter Unterschied im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung. Bei 8 Gy und bei 10 Gy dagegen nicht mehr. In Abbildung 7 und 8 sind die Ergebnisse graphisch dargestellt. 24

30 Überlebensrate in % Überlebensrate in % Abbildung 7: Darstellung des Anteils überlebender Zellen der Zelllinie SW480 nach Applikation ionisierender Strahlung und im Vergleich zur zusätzlichen Behandlung mit 30µmol/l Efavirenz ,1 0,01 0,001 SW480 Bestrahlung SW480 Bestrahlung und 30µmol/l EFV 0,0001 0,00001 Bestrahlungsdosis in Gy Abbildung 8: Darstellung des Anteils überlebender Zellen der Zelllinie HCT15 nach Applikation ionisierender Strahlung und im Vergleich zur zusätzlichen Behandlung mit 30µmol/l Efavirenz ,1 0,01 0,001 HCT15 Bestrahlung HCT15 Bestrahlung und 30µmol EFV 0,0001 0,00001 Bestrahlungsdosis in Gy 25

31 Bei beiden Zelllinien nimmt der Anteil an teilungsfähigen Zellen mit zunehmender Strahlendosis deutlich ab. Bei beiden Zelllinien ist die Überlebensrate durch die zusätzliche Applikation von 30µmol/l EFV im Vergleich zu den Zellen, die nur bestrahlt wurden, deutlich vermindert. Dieser Unterschied nimmt mit zunehmender Strahlendosis ab. 5.2 Flusszytometrische Messungen Mit Hilfe der flusszytometrischen Messungen sollten die Auswirkungen des NNRTIs Efavirenz auf die Apoptose- oder Nekrose-Induktion untersucht werden. Die Versuche wurden mit den Rektumkarzinomzelllinien SW480 und HCT15, sowie mit der Fibroblastenzelllinie MZF5 durchgeführt. Es wurde ebenfalls jeder Versuch dreimal durchgeführt. Da für jede Bedingung jeweils drei Einzelmessungen erfolgten, wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen aus neun Einzelmesswerten berechnet. Die Ergebnisse wurden ebenfalls graphisch als Säulendiagramme dargestellt, in denen jeder Balken einen Mittelwert aus neun Einzelwerten darstellt. Um apoptotische und nekrotische Zellen zu erfassen wurden die Fluoreszenzfarbstoffe Annexin-V-APC und 7-AAD verwendet. Überlebende Zellen stellen sich dabei als Annexin-V-APC und 7- AAD negativ dar, apoptotische Zellen als Annexin-V-APC positiv, aber 7-AAD negativ und nekrotische Zellen als Annexin-V-APC und 7-AAD positiv (Koopman 1994; Lecoeur 1997; van Engeland 1998). Im zweiseitigen T-Test für unabhängige Stichproben mit einem Signifikanzniveau von p 0,05 ist der Anteil toter Zellen der Zelllinie SW480 bereits ab 10µmol/l EFV mit p=0,009 signifikant unterschiedlich im Vergleich zur Kontrolle. In Abbildung 9 sind die Ergebnisse graphisch dargestellt. 26

32 Anteil apoptotischer und nekrotischer Zellen in % Abbildung 9: Anteil apoptotischer und nekrotischer Zellen der Zelllinie SW480 nach Behandlung mit Efavirenz Ann7AAD++ Ann7AAD Efavirenz µmol/l Der größte Sprung findet auch hier zwischen den Konzentrationen 20 und 40µmol/l von 21,6% auf 75,1% statt. Bei 5µmol/l ist der Anteil nekrotischer Zellen gegenüber dem Anteil an apoptotischen Zellen nur geringfügig erhöht. Aber mit zunehmenden Konzentrationen steigt der Anteil nekrotischer Zellen nahezu exponentiell auf 76,5% bei 60µmol/l an. Daraus geht hervor, dass die toten Zellen überwiegend aus nekrotischen Zellen bestehen. Bei der HCT15-Zelllinie besteht ab 30µmol/l EFV mit p=0,01 ein signifikanter Unterschied im Vergleich zur Kontrolle. Bis 20µmol/l EFV ist der Unterschied noch nicht signifikant. In Abbildung 10 sind die Ergebnisse graphisch dargestellt. 27

33 Anteil apoptotischer und nekrotischer Zellen in % Abbildung 10: Anteil apoptotischer und nekrotischer Zellen der Zelllinie HCT15 nach Behandlung mit Efavirenz Ann7AAD++ Ann7AAD Efavirenz µmol/l Ein deutlich toxischer Effekt zeigt sich erst bei 40µmol/l mit einem Anteil an toten Zellen von 67,2%. Der Anteil an apoptotischen und nekrotischen Zellen ist bis 20µmol/l kaum unterschiedlich, erst bei 30µmol/l liegen mehr nekrotische Zellen vor und erst ab 40µmol/l sind deutlich mehr nekrotische Zellen zu verzeichnen. Auch hier besteht der überwiegende Anteil aus nekrotischen Zellen. Bei den MZF5-Fibroblasten besteht bereits ab 20µmol/l EFV mit p=0,001 ein signifikanter Unterschied im Vergleich zur Kontrolle. In Abbildung 11 sind die Ergebnisse graphisch dargestellt. 28

34 Anteil apoptotischer und nekrotischer Zellen in % Abbildung 11: Anteil apoptotischer und nekrotischer Zellen der Zelllinie MZF5 nach der Behandlung mit Efavirenz Ann7AAD++ Der Anteil toter Fibroblasten nimmt von 19,3% auf 69,7% mit steigenden Efavirenz- Konzentrationen zu. Bei jeder Bedingung liegen mehr nekrotische als apoptotische Zellen vor, wobei bei 80µmol/l mit 57,1% die Nekroserate am höchsten ist. Die Apoptoserate steigt erst bei 60µmol/l an, wohingegen sie bis 40µmol/l nahezu unverändert bleibt. Der Anteil nekrotischer Zellen nimmt dagegen annähernd kontinuierlich zu. Des Weiteren wurden mit den Fibroblasten MZF5 Versuche durchgeführt, die den Einfluss von Efavirenz in unterschiedlich zusammengestellten Nährmedien untersuchten. Dabei wurden für jede Versuchsbedingung drei Nährmedien mit unterschiedlichen Proteinkonzentrationen erstellt. Jedes zusammengestellte Nährmedium sollte insgesamt 45 ml enthalten. Das erste Medium enthielt dazu 39,6 ml des Mediums F-12, 5,4 ml FBS, was 12% entspricht und eine Proteinmenge von 181,8 mg enthält. Für das zweite Medium wurden 31,5 ml F-12 und 13,5 ml FBS verwendet, was 30% entspricht und eine Proteinmenge von 420,75 mg enthält. Das dritte Nährmedium enthielt 39,6 ml F-12, 5,4 ml FBS, was 12% entspricht und eine Proteinmenge von 181,8 mg enthält und zusätzlich 238,95 mg BSA. Die BSA-Menge wurde so gewählt um die gleiche Proteinmenge wie in Medium 2 zu erreichen. Weil Ann7AAD Efavirenz in µmol/l 29

35 Überlebensrate in % bekannt ist, dass Efavirenz ein äußerst lipophiles Medikament ist (Katsounas 2006) und lipophile Medikamente eine hohe Bindungsaffinität zu Albumin aufweisen und somit nicht mehr wirken können, wenn sie an Albumin gebunden haben, da nur freie Medikamente wirken, ist ein protektiver Effekt durch die Gegenwart von Albumin zu erwarten. Da derartige Versuche mit Efavirenz schon häufiger durchgeführt wurden, beschränkte man sich bei der Auswertung auf die Darstellung der Überlebensrate. Diese Versuche sollten untersuchen, ob die durch den höheren FCS-Anteil zur Proliferation angeregten Fibroblasten empfindlicher gegenüber Efavirenz sind. In Abbildung 12 sind die Ergebnisse graphisch dargestellt. Abbildung 12: Anteil überlebender Zellen der Zelllinie MZF5 nach der Behandlung mit Efavirenz in unterschiedlich zusammengestellten Nährmedien Ann 7AAd-- Efavirenz in µmol/l In den Kontrollen ist die Überlebensrate mit ca. 70% in allen drei Nährmedien nahezu gleich. Mit steigenden EFV-Konzentrationen fällt die Überlebensrate von 11,5% bei 60µmol/l auf 3,5% bei 100µmol/l in allen 12% FBS-haltigen Medien. In allen EFV- Konzentrationen ist der Anteil überlebender Zellen in den 30% FBS- und 12% + BSAhaltigen Medien im Vergleich zu den 12% FBS-haltigen Medien erhöht. Dieses 30

36 Verhältnis nimmt mit zunehmenden EFV-Dosen ab. Dieser Effekt liegt vermutlich daran, dass die Efavirenzmoleküle an Proteine binden und somit nicht mehr wirken können. Mit zunehmender Efavirenzkonzentration können nicht mehr alle Efavirenzmoleküle an Proteine binden, da diese bereits mit Efavirenzmolekülen gesättigt sind und man erhält mehr freie Efavirenzmoleküle, die ihre Wirkung entfalten können, womit der protektive Effekt durch den Proteinanteil im FBS abnimmt. Am Tag der Färbung nachdem Efavirenz 48 Stunden einwirken konnte, wurden von allen verwendeten Zelllinien Fotos erstellt, aus denen hervorgeht, dass mit zunehmender Dosis weniger Zellen anwachsen können und sich auch morphologisch verändern. Bei den Rektumkarzinomzellen ist zu sehen, dass sich mit steigender Dosis immer mehr Zellen vom Boden abzulösen beginnen. Siehe dazu die Abbildungen 13a-f, 14a-f und 15a-e Abbildung 13a-f: Fotos am Tag der Färbung der Zelllinie SW480 in 10-facher Vergrößerung nach der Behandlung mit Efavirenz a) Kontrolle b) 5µmol/l Efavirenz 31

37 c) 10µmol/l Efavirenz d) 20µmol/l Efavirenz e) 40µmol/l Efavirenz f) 60µmol/l Efavirenz Abbildung 14a-f: Fotos am Tag der Färbung der Zelllinie HCT15 in 10-facher Vergrößerung nach der Behandlung mit Efavirenz a) Kontrolle b) 5µmol/l Efavirenz 32

38 c) 10µmol/l Efavirenz d) 20µmol/l Efavirenz e) 40µmol/l Efavirenz f) 60µmol/l Efavirenz 33

39 Abbildung 15a-e: Fotos am Tag der Färbung der Zelllinie MZF5 in 10-facher Vergrößerung nach der Behandlung mit Efavirenz a) Kontrolle b) 20µmol/l Efavirenz c) 40µmol/l Efavirenz d) 60µmol/l Efavirenz e) 80µmol/l Efavirenz 34

40 5.3 Immunostaining Unterschiedliche Auslöser können in Zellen DNA-Schäden hervorrufen. Die schwerwiegendsten Schäden stellen Doppelstrangbrüche dar, die beispielsweise durch ionisierende Strahlung oder Chemikalien verursacht werden können (Scully et al. 2013). In dieser Arbeit wurden als Marker von DNA-Schäden die Histon- Phosphorylierung γh2ax in Kombination mit dem Proliferationsmarker Ki-67, die DNA abhängige Proteinkinase DNAPK und die nuclear bodies PML an den Rektumkarzinomzellen HCT15 untersucht. Jeder Versuch enthielt zwei Gruppen. Beide Gruppen wurden mit Efavirenz behandelt, aber nur die zweite Gruppe wurde bestrahlt. 48 Stunden nach dem Einsäen wurden die Zellen mit unterschiedlichen Dosen von Efavirenz behandelt und 24 Stunden nach der Behandlung mit Efavirenz wurde die zweite Gruppe mit 2 Gy bestrahlt. Nach 24 Stunden Reparaturzeit wurden die Zellen fixiert. Demnach hatten die Zellen 24 Stunden Zeit die entstandenen DNA-Schäden zu reparieren. In diesen Versuchen wurde untersucht, ob Efavirenz die Reparatur von DNA-Schäden behindert, was sich durch einen erhöhten Anteil aktivierter DNA- Reparatursysteme aufgrund noch vorhandener DNA-Schäden darstellen würde. Die verwendeten Faktoren der DNA-Reparatur konnten als Foci im Zellkern unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Jeder Versuch wurde wiederum dreimal durchgeführt. Deshalb konnten die Mittelwerte und Standardabweichungen der Anzahl der Foci pro Zelle, die in der mit Hilfe der Biomas-Software erstellten Excel- Datei enthalten waren, berechnet werden. Jeder Mittelwert wurde aus drei Einzelmesswerten berechnet. Im zweiseitigen T-Test für unabhängige Stichproben mit einem Signifikanzniveau von p 0,05 besteht bei keiner Versuchsbedingung ein signifikantes Ergebnis. In Abbildung 16a-d sind die Ergebnisse graphisch dargestellt. 35

41 Foci pro Zelle Foci pro Zelle Abbildung 16a: γh2ax-foci pro Zelle der Ki-67-negativen Zellen der Zelllinie HCT γh2ax/ki-67-negativ Efavirenz in µmol/l und Bestrahlungsdosis in Gy Abbildung 16b: γh2ax-foci pro Zelle der Ki-67-positiven Zellen der Zelllinie HCT γh2ax/ki-67-positiv Efavirenz in µmol/l und Bestrahlungsdosis in Gy 36

42 Foci pro Zelle Foci pro Zelle Abbildung 16c: Mittelwerte der γh2ax-foci pro Zelle der Ki-67-negativen und - positiven Zellen der Zelllinie HCT γh2ax gesamt Efavirenz in µmol/l und Bestrahlungsdosis in Gy Abbildung 16d: DNAPK-Foci pro Zelle der Zelllinie HCT DNAPKcs Efavirenz in µmol/l und Bestrahlungsdosis in Gy 37

43 Foci pro Zelle Abbildung 16e: PML-Foci pro Zelle der Zelllinie HCT PML Efavirenz in µmol/l und Bestrahlungsdosis in Gy Die Ki-67-negativen Zellen zeigen erst bei einer Efavirenzkonzentration von 30µmol/l eine geringe Zunahme der γh2ax-foci pro Zelle von 1,9 bei der Kontrolle auf 3,1 bei 30µmol/l EFV. Die Bestrahlung mit 2 Gy zeigt mit 3,6 Foci pro Zelle kaum einen toxischeren Effekt als die 30µmol/l EFV. Jedoch ab der Kombination von 20µmol/l EFV und der Bestrahlung steigt die Anzahl der Foci pro Zelle im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung weiter an. Bei den Ki-67-positiven Zellen ist die Anzahl der γh2ax-foci pro Zelle im Vergleich zur Kontrolle erst bei der Bestrahlung mit 9 Foci pro Zelle erhöht. Ab der Kombination von 20µmol/l EFV und Bestrahlung ist eine Zunahme im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung vorhanden. Die Mittelwerte der γh2ax-foci pro Zelle der Ki-67-negativen und -positiven Zellen verhalten sich analog dazu. Der Anstieg der γh2ax-foci bei den Ki-67-negativen und bei den Ki-67- positiven Zellen bei der Kombination von EFV und Bestrahlung ist allerdings lediglich ein Trend. Die Anzahl der DNAPK-Foci pro Zelle ist erst bei 30µmol/l EFV mit 4,5 Foci pro Zelle im Vergleich zur Kontrolle gering erhöht. Die Bestrahlung zeigt mit 9,1 Foci pro Zelle einen etwas toxischeren Effekt. Ebenso zeigt sich durch die Kombination von 20µmol/l EFV und Bestrahlung eine weitere Zunahme, die mit zunehmender Efavirenzkonzentration abnimmt. Durch die alleinige Applikation von Efavirenz ist die 38

44 Anzahl der PML-Foci pro Zelle im Vergleich zur Kontrolle kaum verändert. Erst bei der Bestrahlung mit 2 Gy ist die Anzahl der Foci pro Zelle mit 2,4 geringfügig erhöht. Ebenso nimmt die Anzahl der Foci pro Zelle durch die Kombination von Efavirenz mit Bestrahlung leicht zu, jedoch mit steigenden Efavirenzkonzentrationen wieder ab. Allerdings sind die Ergebnisse im zweiseitigen T-Test für unabhängige Stichproben mit einem Signifikanzniveau von p 0,05 bei allen Bedingungen nicht signifikant. Die generelle Abnahme der Foci pro Zelle bei der Kombination von 30µmol/l EFV und Bestrahlung lässt sich möglicherweise dadurch erklären, dass so viele Foci pro Zelle (Focicluster) entstanden sind, dass sie nicht mehr von der Biomas-Software als einzelne erfasst werden konnten. Siehe dazu Abbildung 17a und b. Abbildung 17: Jeweils eine HCT15-Zelle in 40-facher Vergrößerung a) HCT15-Zelle mit γh2ax-foci nach b) HCT15-Zelle mit DNAPK-Foci nach der Behandlung mit 30µmol/l EFV und der Behandlung mit 30µmol/l EFV und 2 Gy 2 Gy 39