SERION ELISA antigen Candida

Transkript

1 YOUR GLOBAL PARTNER IN DIAGNOSTICS Hersteller Manufacturer Fabricant Fabbricante Institut Virion\Serion GmbH \ Friedrich-Bergius-Ring D Würzburg, Germany D , Telefon/: +49 (0) 9 31 / Fax/: +49 (0) 9 31 / / : dialog@virion-serionde Internet/: wwwvirion-serionde SERION ELISA antigen Candida SERION ELISA antigen Candida Gebrauchsanweisung - Deutsch Instructions - English Mode d emploi - Français Istruzioni per l uso - Italiano (Version/Versione/ 112/09-1) KAL200-1

2 SERION ELISA antigen Candida DE INHALTSVERZEICHNIS 1 ANWENDUNGSBEREICH 2 DIAGNOSTISCHE BEDEUTUNG 3 SERION ELISA antigen - TESTPRINZIP 4 INHALT UND ZUSAMMENSETZUNG 5 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE MATERIALIEN FR EN 6 LAGERUNG UND HALTBARKEIT 7 DURCHFÜHRUNG DES SERION ELISA antigen 71 Allgemeine Hinweise 72 Probenvorbereitung und Lagerung 73 Reagenzienvorbereitung 74 Übersicht - Testablauf 75 Manuelle Testdurchführung 76 Automatische Testdurchführung 77 Positivkontrolle / Richtigkeitskontrolle RU IT 8 TESTAUSWERTUNG 81 Ein-Punkt-Quantifizierung nach der 4PL-Methode 82 Testgültigkeitskriterien 83 Auswertung SERION ELISA antigen Candida 84 Quantifizierungsgrenzen 85 Grenzwertbereich 86 Interpretation der Ergebnisse 87 Referenzbereich gesunder Probanden 9 LEISTUNGSMERKMALE 91 Sensitivität und Spezifität 92 Präzision 10 SICHERHEITSMASSNAHMEN 101 Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen 102 Entsorgung 11 LITERATUR vorliegende Version: V 112/09-1 Vorversion: --

3 Pos: 1 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/allgemei ne Texte ELISA antigen/einl eitung " Enzymimmunoassay" C andi da Pos: 3 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/allgemei ne Texte ELISA antigen/kapitelüberschrift " Anwendungsber 1 SERION ELISA antigen Candida Enzymimmunoassay zur Bestimmung von Candida Antigen für die in vitro-diagnostik Pos: 2 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/bestellnummer n/c andida antigen: Bestell SERION ELISA antigen Candida Best-Nr: ESR200 1 ANWENDUNGSBEREICH Pos: 4 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/anwendungsbereich/c andi da antigen: Der SERION ELISA antigen Candida ist ein qualitativer und quantitativer Immunoassay für den Nachweis von Candida Antigen in humanem Serum und Plasma Der Test dient zur Unterstützung bei der Erfassung von systemischen Candidosen Pos: 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/allgemei ne Texte ELISA antigen/kapitelüberschrift "Diag nostische 1 2 DIAGNOSTISCHE BEDEUTUNG Pos: 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/di agnostische Bedeutung/Candida antigen: Diag nostische albicans ist ein ubiquitär vorkommender Hefepilz, der wie alle Candida ssp zur Familie der Sprosspilze zählt Neben der Hefeform, welche in erster Linie bei oberflächigen Infektionen auftritt, sind so genannte Pseudomyzelien eine weitere morphologische Erscheinungsform Die Ausbildung von Keimschläuchen sowie die Entwicklung der Pseudomyzelien treten überwiegend bei systemischen Mykosen auf Candida Sprosspilze produzieren und sezernieren eine Vielzahl von Enzymen, die den fakultativ pathogenen Mikroorganismen die Penetration von Blutgefäßen und Schleimhautbarrieren ermöglichen Meist werden Candida ssp über Schmierkontaminationen von Mensch zu Mensch übertragen Die Haupteintrittspforte ist der Mund-Rachen-Raum Bei Störungen der fungistatischen Eigenschaften der Hautoberfläche, die durch einen leicht sauren ph-wert und eine antagonistisch wirkende Standortflora vermittelt werden, können oberflächige, superfizielle Candidosen entstehen Systemische Mykosen gehen im Anschluss an eine Besiedlung der Schleimhäute vor allem vom Bereich des Gastrointestinaltraktes aus (Abb 1) Kolonisierung des Mund-Rachen-Raums Passage des Magenlumens Übertritt in das Darmlumen Eintritt in die Blutbahn Übertritt in das Lymphsystem Persorption der Candida-Zellen Invasion einer Vielzahl von Organen Abbildung 1: Verlauf von Candida-Infektionen deutsch 2

4 Die Anheftung der Sprosspilze an Epithelien unterschiedlicher Schleimhäute erfolgt durch Adhärenzproteine und andere Strukturen der äußeren Zellhülle In der Übersicht sind die (hypothetischen) Schritte dargestellt, die im Falle schwerwiegender Grunderkrankungen zu disseminierten Infektionen führen können Eine exakte Abtrennung der Stadien ist dabei kaum möglich DE Generell können Candidosen in zwei große Gruppen eingeteilt werden, deren Hauptmerkmale in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst sind Candida-Infektionen oberflächig (superfiziell) Tiefenmykose (invasiv) Lokalisierung Haut, Schleimhäute Hauptorgane Immunkompetenz + +, -/- des Wirtes Risikofaktoren Schwangerschaft Diabetes AIDS Chemotherapie iatrogene Immunsuppression zentrale Venenkatheter Störungen der Hauteigenschaften Radiotherapie mangelnde Mundhygiene hochgradige Verbrennungen chirurgische Eingriffe klinischer Verlauf meist harmlos, keine Lebensgefahr oft lebensbedrohlich Therapie gut therapierbar stadiumabhängige Therapierbarkeit Tabelle 1: Charakteristika von Candida-Infektionen Die serologische Diagnostik bei Candida-Infektionen gestaltet sich als schwierig Einerseits können auch transiente Hefebesiedelungen eine Antikörperantwort induzieren, andererseits führen systemische Candida Mykosen bei immunsupprimierten Patienten häufig nur zu geringen Titerbewegungen Erschwerend kommt hinzu, dass es sich bei der Gruppe der Patienten mit hohem Mykoserisiko häufig um immunologische Problempatienten handelt und somit serologische Befunde einer besonderen Interpretation bedürfen Systemische Candida-Infektionen verursachen zudem kein typisches Krankheitsbild Beim aktuellen Stand der Candida Serologie kann nicht davon ausgegangen werden, dass die Ergebnisse verschiedener Testsysteme zur Antikörperbestimmung vergleichbar oder sogar austauschbar sind Die Spezifität der in einer Untersuchungsprobe nachgewiesenen Antikörper hängt entscheidend vom Testsystem (ELISA oder HAT) bzw von der verwendeten Antigenpräparation ab Beim HAT werden IgM Antikörper aufgrund ihres Agglutinationsverhaltens stärker erfasst als IgG Antikörper Dies macht die serologische Befundinterpretation noch komplexer, eröffnet aber auch die Möglichkeit einer differenzierteren Befundinterpretation So ermöglicht die Kombination von HAT und ELISA, selbst bei stagnierenden HAT Titern potentielle Veränderungen der Immunglobulinklassen-spezifischen Antikörperaktivität zu erkennen Derzeit bietet keine Nachweismethode allein die Möglichkeit einer umfassenden serologischen Diagnostik Zur optimalen Überwachung von Risikopatienten und zur Therapiesteuerung sollten deshalb mehrere Nachweismethoden kombiniert eingesetzt werden Der Antigennachweis mit SERION ELISA antigen Candida stellt dabei eine wichtige unterstützende Maßnahme dar deutsch 3

5 Pos: 7 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/t estprinzi p/t estprinzi p ELISA 1 Pos: 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/inhalt und Z usammensetzung/c andi da antigen: Inhalt und 1 3 SERION ELISA antigen - TESTPRINZIP Der ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ist ein immunologisches Verfahren, das sich insbesondere in der Infektionsserologie zur Erfassung von Antikörpern und Antigenen bewährt hat Die Nachweisreaktion im vorliegenden Sandwich ELISA basiert auf der spezifischen Interaktion von Antikörpern und Antigenen Zu diesem Zweck wurden die Teststreifen der Mikrotiterplatten des SERION ELISA antigen mit spezifischen, gegen den Erreger gerichteten Antikörpern zur Bindung der in der Patientenprobe vorhandenen Antigene beschichtet Weitere, mit Peroxidase markierte Sekundärantikörper detektieren die so gebildeten Immunkomplexe Das Enzym katalysiert eine Reaktion, in deren Verlauf das farblose Substrat Wasserstoffperoxid und das Chromogen Tetramethylbenzidin in einen blauen Farbstoff umgewandelt werden Durch Zugabe der Stopplösung erfolgt ein Farbumschlag zu gelb Die Signalstärke des Reaktionsprodukts ist proportional zur Antigenkonzentration in der Probe und wird photometrisch erfasst deutsch 4

6 Pos: 9 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/z usätzlich benötigte M ateriali en/zusätzlich benötigte M ateri 1 4 INHALT UND ZUSAMMENSETZUNG DE Testkomponenten Stück / Volumen Brechbare Mikrotiterstreifen mit je acht antikörperbeschichteten Einzelkavitäten (insg 96) MTP, 1 Testrahmen 12 Stück Standardserum STD, Candida albicans Antigen in Humanserum mit Zusatz von fötalem Kälberserum (FKS); negativ getestet für anti-hiv-ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) und anti-hcv-ak; Konservierungsmittel: < 0,1 % Natriumazid Negatives Kontrollserum NEG, Humanserum mit Zusatz von fötalem Kälberserum (FKS); negativ getestet für anti-hiv-ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) und anti-hcv-ak; Konservierungsmittel: < 0,1 % Natriumazid Anti-Candida albicans Konjugat (gebrauchsfertig) PODCR, Gegen Candida albicans gerichteter Antikörper konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, stabilisiert in proteinhaltiger Lösung mit Detergenz; Konservierungsmittel: 0,1 % ProClin 300 Waschlösungskonzentrat (ausreichend für 1500 ml) WASH, TRIS-gepufferte Natriumchlorid Lösung mit Tween 20; 30-fach konzentriert; Konservierungsmittel: < 0,1 % ProClin 300 Verdünnungspuffer SAMB, Saure Lösung ohne Konservierungsmittel Stopplösung STOP, 0,5 N Schwefelsäure TMB-Substratlösung (gebrauchsfertig) TMB, TMB-Wasserstoffperoxid-Substratlösung; Konservierungmittel: < 0,01% Kathon CG Qualitätskontrollzertifikat mit Standardkurve und Wertetabelle INFO, (Quantifizierung des Antigens in U/ml) 3 x 3 ml 2 x 3 ml 13 ml 2 x 25 ml 15 ml 13 ml 13 ml 2 Stück deutsch 5

7 Pos: 10 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/lager ung und H altbarkeit/lagerung und H altbar 1 5 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE MATERIALIEN - Übliche Laborausrüstung - Spektralphotometer für Mikrotiterplatten mit Filter, Wellenlänge 450 nm, empfohlene Referenzwellenlänge im Bereich von 620 nm nm (z B 650 nm) - Inkubator 37 C - Heizblock 110 C - feuchte Kammer - Aqua dest - Click-Clips (Best-Nr VT120) deutsch 6

8 6 LAGERUNG UND HALTBARKEIT DE Reagenz Lagerung Haltbarkeit Mikrotiterstreifen (mit Antikörper beschichtet) Kontrollseren / Standardseren ungeöffnet nach Anbruch bei 2 8 C in Gegenwart von Trockenmittel und wieder verschlossen gelagert Die unbenutzten Kavitäten sollen trocken und luftdicht im verschlossenen Aluminiumbeutel gelagert werden nach Anbruch bei 2 8 C Konjugat Gebrauchsfertige Lösung bei 2 8 C Kontaminationen sind u a durch den Gebrauch steriler Pipettenspitzen unbedingt zu vermeiden bis Verfallsdatum; Mindesthaltbarkeit: 4 Wochen Haltbarkeit bei sachgerechter Lagerung: bis zum Verfallsdatum bis Verfallsdatum; 24 Monate ab Herstellungsdatum bis Verfallsdatum; 18 Monate ab Herstellungsdatum Verdünnungspuffer ungeöffnet nach Anbruch bei 2 8 C Eingetrübte Lösungen bitte verwerfen bis Verfallsdatum; 24 Monate ab Herstellungsdatum 6 Monate Waschlösung Konzentrat nach Anbruch bei 2 8 C Gebrauchsverdünnung bei 2 8 C Gebrauchsverdünnung bei Raumtemperatur Behälter für Gebrauchsverdünnung regelmäßig reinigen! Eingetrübte Lösungen bitte verwerfen bis Verfallsdatum; 24 Monate ab Herstellungsdatum 2 Wochen; 1 Woche Substrat Gebrauchsfertige Lösung bei 2 8 C, lichtgeschützt gelagert Kontaminationen sind u a durch den Gebrauch steriler Pipettenspitzen unbedingt zu vermeiden Bei stärkerer Blaufärbung (Extinktion bei 650 nm gegen Aqua dest > 0,2 OD) bitte verwerfen bis Verfallsdatum; 24 Monate ab Herstellungsdatum Stopplösung nach Anbruch bei Raumtemperatur bis Verfallsdatum Pos: 11 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/testdurchführung/überschrift: 1 deutsch 7

9 Pos: 12 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/allgemei ne Hinweise ELISA antig 2 7 DURCHFÜHRUNG DES SERION ELISA antigen 71 Allgemeine Hinweise Für die sachgemäße Anwendung des SERION ELISA antigen sind ausschließlich die SERION ELISA antigen Komponenten zu verwenden Letztere können nicht durch Reagenzien anderer Hersteller ersetzt werden Die Standard- und Kontrollseren sowie das Konjugat des SERION ELISA antigen sind chargenspezifisch für jeden Testkit optimal eingestellt und können nicht in anderen Chargen eingesetzt werden Verdünnungspuffer, Waschlösung, Substratlösung und Stopplösung können mit allen SERION ELISA antigen chargen- und kitunabhängig angewendet werden Unter Voraussetzung einer sachgerechten Lagerung sind alle Komponenten des SERION ELISA antigen ungeöffnet bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett) verwendbar Die Reagenzien sollen nicht über das Verfallsdatum hinaus benutzt werden Die unsachgemäße Verdünnung der Reagenzien kann zum Verlust an Nachweisempfindlichkeit führen Die Testreagenzien sollen während der Lagerung und Inkubation vor hellem Licht geschützt werden Nach Gebrauch sind die Komponenten gut zu verschließen, um deren Austrocknung und Kontamination zu vermeiden Der Verschlussbeutel für die Kavitäten der Mikrotiterplatte soll nur an der Schweißnaht aufgeschnitten werden, um ein Wiederverschließen zu gewährleisten Bei Beschädigung sowie nach unsachgemäßem Verschließen des Verschlussbeutels zur Aufbewahrung der nicht benutzten Kavitäten sollen die Mikrotiterstreifen nicht mehr verwendet werden Um Kontamination zu vermeiden, sollten immer aseptische Techniken zur Entnahme von Reagenzienaliquots angewendet werden Zur Vermeidung verfälschter Ergebnisse darf die Pipettenspitze bei der Konjugatpipettierung keinesfalls den oberen Rand der Kavitäten berühren und benetzen Beim Verschließen der Fläschchen ist darauf zu achten, wieder den entsprechenden, zur Flasche gehörenden Deckel einzusetzen Insbesondere die TMB-Substratlösung ist empfindlich gegenüber oxidierenden Substanzen und Schwermetallionen Sie ist ständig lichtgeschützt aufzubewahren Die TMB-Substratlösung ist unter möglichst geringer Lichteinwirkung kurz vor Gebrauch zu öffnen Diese Lösung ist schwach blau-grün gefärbt Der Hautkontakt mit Substrat und Stopplösung ist zu vermeiden! Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ist u a von der sorgfältigen Mischung der angesetzten Reagenzien abhängig Aus diesem Grund sollen die Behältnisse von Kontrollseren und Konjugaten vor Entnahme gut geschüttelt werden Auch die Probenverdünnungen sollen vor dem ersten Pipettierschritt mit einem Monomixer (z B Vortex) gut durchmischt werden Weiterhin ist auf eine sorgfältige Pipettierung und die Einhaltung der vorgegebenen Inkubationszeiten und -temperaturen zu achten Große Zeitdifferenzen zwischen der Pipettierung der ersten und der letzten Kavität bei der Zugabe von Proben- und deutsch 8

10 Pos: 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/pr obenvor ber eitung und Lagerung/Candida antigen: Probenvorbereitung und Lager 2 Pos: 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/pr obenver dünnung/candida antigen: 3 Kontrollseren, Konjugat und Substrat führen zu unterschiedlichen Inkubationszeiten, welche die Präzision und Reproduzierbarkeit der Messwerte beeinflussen können DE Nur die strikte Einhaltung der Arbeitsvorschrift gewährleistet korrekte Ergebnisse Der SERION ELISA antigen kann nur ausgewertet werden, wenn die chargenspezifischen Validitätswerte des im Kit enthaltenen Qualitätskontrollzertifikates erfüllt wurden Korrektes Waschen verhindert Testunspezifitäten Aus diesem Grund sollten die Gebrauchsanleitungen der verwendeten Waschgeräte befolgt werden Wichtig sind die gleichmäßige Befüllung der Kavitäten der Flachbodenplatten mit Waschlösung und deren vollständige Entfernung, um unkontrollierbare Verdünnungseffekte auszuschließen Schaumbildung ist in jedem Fall zu vermeiden! Die Beschriftung der Mikrotiterstreifen mit den Kürzeln des Erregers in Kombination mit dem Kürzel AG für SERION ELISA antigen sollte nicht zerkratzt werden, um ein Verwechseln zu vermeiden 72 Probenvorbereitung und Lagerung Lipämische, hämolytische sowie ikterische Proben (Serum oder Plasma) sollten nur unter Vorbehalt eingesetzt werden Bakteriell kontaminierte Proben sollten nicht verwendet werden Geeignete Untersuchungsmaterialien sind nach Standardlabortechniken gewonnene Seren oder Plasmen (EDTA, Citrat, Heparin) deutsch 9

11 Pos: 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/probenl agerung ELISA antig 3 Pos: 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/r eagenzienvorbereitung ELISA Probenvorbereitung Vor Testbeginn die Proben (Patientenproben, Standard und Negativkontrolle) (V 1 ) in Verdünnungspuffer (V 2 ) verdünnen: V 1 + V 2 = 3+1 je 300 µl Probe (V 1 ) zu je 100 µl Verdünnungspuffer (V 2 ) Nach jeder Verdünnung und vor dem Pipettierschritt sollten die Proben mit einem Monomixer (z B Vortex) gut durchmischt werden, um eine homogene Lösung herzustellen Im Anschluss werden die Proben 10 Min bei 110 C (+/- 5 C) erhitzt Es ist unbedingt darauf zu achten, dass sowohl die Zeit als auch die Temperatur eingehalten werden! Standardreaktionsgefäße sind für die Thermolyse nicht geeignet Wir empfehlen Safe- Lock Reaktionsgefäße bzw Reaktionsgefäße mit Drehverschluss Bei Verwendung von Heizblockthermostaten sollte die eingestellte Temperatur von 110 C (+/- 5 C) mit einem geeichten Thermometer überprüft werden Bei Diskrepanzen ist das Heizblockthermometer entsprechend zu justieren Die gerätespezifische Vorheizdauer ist zu berücksichtigen Während der Thermolyse bildet sich ein weißer, fester Niederschlag Die Probe wird anschließend mit einer auf 4 C vorgekühlten Tischzentrifuge für 10 Min bei g zentrifugiert und der klare Überstand für den weiteren Testablauf verwendet 722 Probenlagerung Die so behandelten Proben sollten nicht länger als 24 Stunden bei 2 8 C aufbewahrt werden Unbehandelte Patientenproben sollten nicht länger als 7 Tage bei 2 8 C aufbewahrt werden Eine längere Lagerung der Proben ist bei -20 C möglich Mehrmaliges Auftauen und Wiedereinfrieren soll vermieden werden deutsch 10

12 73 Reagenzienvorbereitung Alle Testreagenzien müssen vor dem Testansatz auf Raumtemperatur erwärmt werden DE 731 Mikrotiterstreifen Die Teststreifen bzw Kavitäten sind zusammen mit einem Trockenmittel verpackt Nicht benötigte Teststreifen bzw Kavitäten sollten wieder mit dem Trockenmittel im Aluminiumbeutel luftdicht eingeschlossen werden 732 Kontrollseren / Standardseren Kontroll- und Standardseren müssen mit Probenpuffer verdünnt und anschließend denaturiert werden Bei jedem Testlauf müssen unabhängig von der Anzahl der eingesetzten Teststreifen Kontrollseren in Einfach-, Standardseren in Doppelbestimmung mitgeführt werden 733 Konjugat (gebrauchsfertig) Kontaminationen des gebrauchsfertigen Konjugats sind u a durch den Gebrauch steriler Pipettenspitzen unbedingt zu vermeiden 734 Waschlösung Das Waschlösungskonzentrat (V 1 ) ist im Verhältnis 1:30 mit Aqua dest auf ein Endvolumen (V 2 ) zu verdünnen Beispiel: Waschlösungskonzentrat (V 1 ) Endvolumen (V 2 ) 25 ml 750 ml 1 ml 30 ml 735 TMB-Substratlösung (gebrauchsfertig) Kontaminationen der gebrauchsfertigen Substratlösung sind u a durch den Gebrauch steriler Pipettenspitzen unbedingt zu vermeiden Die TMB-Substratlösung ist schwach blau-grün gefärbt; stark gefärbte Lösungen (Extinktion bei 650 nm gegen Aqua dest > 0,2 OD) bitte verwerfen 736 Stopplösung (gebrauchsfertig) Pos: 17 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/testdurchführung/testablauf/überschrift 2 deutsch 11

13 Pos: 18 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/t establauf/testablauf Candida Pos: 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/testdurchführ ung/c andi da antigen: Manuelle Testdurchführ Übersicht - Testablauf SERION ELISA antigen Candida quantitativ Vorbereitung der Proben, des Kontroll- und Standardserums Probenverdünnung (Patientenproben, Kontroll- und Standardserum) 300 µl Probe µl Verdünnungspuffer INKUBATION 10 Min / 110 C ZENTRIFUGATION 10 Min / g / 4 C Überstand abnehmen, Pellet verwerfen Pos: 26 /Arbeitsanleitungen/Gültig für alle Zugabe der Überstände (je 100 µl) INKUBATION 60 Min / 37 C feuchte Kammer WASCHEN (5 x 300 µl DIL WASH ) Zugabe der Konjugatlösung PODCR (100 µl) INKUBATION 60 Min / 37 C feuchte Kammer WASCHEN (5 x 300 µl DIL WASH ) Zugabe der Substratlösung TMB (100 µl) INKUBATION 30 Min / 37 C feuchte Kammer Zugabe der Stopplösung STOP (100 µl) EXTINKTIONSMESSUNG bei 450 nm (Ref 650 nm) deutsch 12

14 Pos: 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/automatische T Manuelle Testdurchführung DE 1 Vorbehandlung der Proben (Patientenproben, Standard- und Kontrollserum) wie beschrieben 2 Erforderliche Anzahl Kavitäten in den Testrahmen einsetzen und Protokollblatt anlegen 3 Je 100 µl der Überstände von Standard (Doppelansatz) sowie von Negativkontrolle und Patientenproben in die benötigten Kavitäten der Teststreifen pipettieren Eine Kavität für den Substratleerwert (Blank) freilassen, z B: Candida antigen quantitativ Kavität A1 Kavität B1 Kavität C1 Kavität D1 Substratleerwert (Blank) Negative Kontrolle Standardserum Standardserum Kavität E1 Patientenprobe 1 4 Probeninkubation für 60 Minuten (+/- 3 Min) bei 37 C (+/- 1 C) in der feuchten Kammer 5 Am Ende der Inkubationszeit die Kavitäten waschen (mit Waschgerät oder manuell): - Inkubationsflüssigkeit aus den Kavitäten absaugen oder ausschütten - in jede Kavität 300 µl Waschlösung füllen - Waschlösung absaugen oder ausschütten - Vorgang 4 x wiederholen (also insgesamt 5 x waschen) - die Platte auf Papiertüchern ausklopfen 6 Konjugatzugabe Je 100 µl des gebrauchsfertigen Konjugats in die entsprechenden Kavitäten pipettieren (ohne Substratleerwert) 7 Konjugatinkubation für 60 Minuten (+/- 3 Min) bei 37 C (+/- 1 C) in der feuchten Kammer 8 Am Ende der Inkubationszeit die Kavitäten waschen (wie oben) 9 Substratzugabe Je 100 µl gebrauchsfertige TMB-Substratlösung in alle Kavitäten (auch Substratleerwert) pipettieren 10 Substratinkubation für 30 Minuten (+/- 1 Min) bei 37 C (+/- 1 C), lichtgeschützt in der feuchten Kammer 11 Stoppen der Reaktion Je 100 µl Stopplösung in alle Kavitäten pipettieren Mikrotiterplatte zum Mischen leicht schütteln 12 Extinktionsmessung Innerhalb 60 Minuten bei 450 nm gegen den Substratleerwert messen; Referenzwellenlänge im Bereich zwischen 620 nm und 690 nm (z B 650 nm) deutsch 13

15 Pos: 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/positi vkontrolle / Richtig 2 Pos: 22 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: T ESTAU SWERTUN G Automatische Testdurchführung Die SERION ELISA sind validiert für die Anwendung auf Immunomat TM und Gemini und geeignet für die Anwendung auf baugleichen Automaten Die automatische Prozessierung erfolgt analog zur manuellen Bearbeitung Bitte beachten Sie, dass unter speziellen Arbeitsbedingungen laborinterne Anpassungen der Inkubationszeiten notwendig sein können 77 Positivkontrolle / Richtigkeitskontrolle Zur periodischen Überprüfung der Untersuchungsmethode im Rahmen des laborinternen Qualitätsmanagements empfehlen wir die Anwendung unserer SERION ELISA control Die Positivkontrollen dienen als Richtigkeitskontrollen sowie zur Überprüfung der Präzision der angewandten Methode Der Gebrauch ist in einer separaten Arbeitsanleitung beschrieben deutsch 14

16 Pos: 24 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estg ültig keitskriteri 2 8 TESTAUSWERTUNG SERION ELISA antigen Candida Pos: 23 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estauswertung: Ein- Punkt- Quantifizier Ein-Punkt-Quantifizierung nach der 4PL-Methode DE Die größtmögliche Genauigkeit der Zuordnung von Messsignalen zu quantitativen Werten bieten nichtlineare Funktionen, die sigmoidale Kurven direkt, ohne jede weitere Transformation, der OD-Skala anpassen Die Konzentrationsbestimmung des Antigens im SERION ELISA antigen erfolgt nach dem 4-Parameter logistic-log-modell (4PL), dessen mathematische Funktion durch folgende Formel beschrieben wird: OD = A e D - A B(C - ln Konz) Die Parameter A, B, C und D geben den Kurvenverlauf exakt wieder und definieren 1 die untere Asymptote Parameter A 2 die Steigung der Kurve im Wendepunkt Parameter B 3 den Wendepunkt der Kurve Parameter C 4 die obere Asymptote Parameter D Die Institut Virion\Serion GmbH (Würzburg) ermittelt für jede Kitcharge die Standardkurven in mehrfachen Testläufen unter Einhaltung optimaler Bedingungen Auf diese Weise entfällt die kosten- und zeitintensive Konstruktion der Standardkurve durch den Anwender Zur Auswertung der Testläufe wird jedem SERION ELISA antigen ein chargenspezifisches Qualitätskontrollzertifikat mit Standardkurve und Wertetabelle beigelegt Die Software SERION evaluate sowie die Microsoft Excel-basierte Auswertehilfe SERION activity werden auf Anfrage gerne zur Verfügung gestellt Zum Ausgleich von Testschwankungen und um die Qualität des Testlaufes zu überprüfen, wird das so genannte Standardserum mitgeführt Diesem Standardserum werden in der Qualitätsendkontrolle ein Sollwert sowie ein Gültigkeitsbereich zugeordnet, innerhalb dessen Grenzen eine sichere und zuverlässige Bewertung der Testergebnisse garantiert wird deutsch 15

17 Pos: 26 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/nichtautomatisi erte Auswertung ELISA Testgültigkeitskriterien - Der Substratleerwert sollte einen OD-Wert < 0,25 aufweisen - Die negative Kontrolle muss in der Testauswertung als negativ bewertet werden - Bei quantitativen SERION ELISA antigen muss der OD-Mittelwert des Standardserums nach Abzug des Substratleerwertes innerhalb des Gültigkeitsbereiches liegen, welcher auf dem chargenspezifischen Qualitätskontrollzertifikat angegeben ist - Die OD-Werte des Standardserums dürfen nicht mehr als 20 % differieren Sind diese Kriterien nicht erfüllt, ist der Testlauf ungültig und muss wiederholt werden antigen/testauswertung/auswertung: Pos: 2 ELISA antigen/gültig für 8\mod_ _6doc alle 83 Auswertung SERION ELISA antigen Candida 831 Nichtautomatisierte Auswertung Zur Auswertung der Testläufe wird jedem SERION ELISA antigen ein chargenspezifisches Qualitätskontrollzertifikat mit Standardkurve und Wertetabelle beigelegt Der Substratleerwert (Blank) muss vor den Auswertungen von allen Messergebnissen abgezogen werden Pos: 27 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estauswertung Methode 1: Qualitative Auswertung Zur Festlegung des cut-off Bereiches in OD multipliziert man den Mittelwert der gemessenen OD des Standardserums mit dem angegebenen Zahlenwert auf dem Qualitätskontrollzertifikat (siehe Formeln für spezielle Auswertesysteme), z B: OD = 0,502 x MW(STD) bei oberer cut-off Grenze OD = 0,352 x MW(STD) bei unterer cut-off Grenze Wird beispielsweise ein Extinktionmittelwert des Standardserums von OD 0,970 gemessen, ergibt sich ein cut-off Bereich von OD 0,341 bis 0,487 Methode 2: Stufenlose Bestimmung der Antigenaktivitäten mittels Standardkurve: Pos: 39 /Ar bei tsanl eitungen/gültig für alle Dokumente/Testauswertung/T estauswertung: M ethode 2 (für alle T Testschwankungen, die von Tag zu Tag sowie von Labor zu Labor auftreten können, so genannte Interassay-Varianzen, werden durch Multiplikation des aktuellen Messwerts der Patientenproben mit dem Korrekturfaktor F ausgeglichen: F = OD-Sollwert (des Standardserums) OD-Tageswert (des Standardserums) deutsch 16

18 Pos: 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/automatische 3 Pos: 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/quantifizi 2 Dieses Verfahren ist notwendig, um das aktuelle Testniveau des Anwenders an die chargenspezifische Standardkurve anzugleichen bzw zu normalisieren Auf diese Weise werden Tageswertschwankungen korrigiert DE 1 Mittelwert aus den beiden Extinktionswerten des Standardserums bilden und prüfen, ob der ermittelte Wert im angegebenen Gültigkeitsbereich liegt 2 Berechnung des Faktors F: Der angegebene Sollwert des Standards wird durch den Mittelwert der Extinktion des Standardserums geteilt: F = Sollwert Extinktion Standardserum / Mittelwert Extinktion Standardserum 3 Alle Messwerte der Patientenproben werden mit F multipliziert 4 Über die korrigierten Messwerte können anhand der Standardkurve Antigenaktivitäten in IU/ml bzw U/ml abgelesen werden 832 Automatische Testauswertung mit der Software SERION evaluate Durch Eingabe der vier Parameter und des Sollwertes des Standardserums werden Antigenaktivitäten nach Prozessierung und Messung des SERION ELISA antigen durch das Auswerteprogramm SERION evaluate errechnet Falls ein Wert außerhalb des Gültigkeitsbereiches liegt, werden folgende Fehlermeldungen in englischer Sprache angezeigt: Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24 bzw Standard value differ more than 20 % in following groups: Group 1-24 In diesen Fällen ist der Testlauf ungültig und muss wiederholt werden Die vier Kurvenparameter und der Sollwert müssen nur bei Chargenwechsel geändert werden (Parameter und Sollwert sind auf der Wertetabelle angegeben) Die korrekte Eingabe dieser chargenspezifischen Daten kann anhand der dem Standardserum zugeordneten Aktivität (in IU/ml bzw U/ml) überprüft werden Der erhaltene Mittelwert der Antigenaktivität muss mit der auf dem chargenspezifischen Qualitätskontrollzertifikat angegebenen Bewertung übereinstimmen Eine Messwertkorrektur erfolgt automatisch Im Ausdruck der Messergebnisse erscheint: Probenbezeichnung OD-Wert U/ml Bewertung deutsch 17

19 Pos: 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa 2 Pos: 31 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: Inter pretati on der 2 Pos: 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: R eferenzber eich gesunder Pr Quantifizierungsgrenzen Die Quantifizierungsgrenzen kennzeichnen den Bereich der zulässigen Wertelage Sie sind auf dem Kontrollzertifikat des SERION ELISA antigen angegeben Im Rahmen der Leistungsbewertungsstudie wurde die Verdünnungslinearität über diesen Bereich nachgewiesen Sollten Patientenproben Messwerte oberhalb dieses Bereichs erzielen, können die Proben in einer höheren Verdünnung analysiert werden Die erhaltenen Antigenkonzentrationen sind dann mit dem zusätzlichen Verdünnungsfaktor zu multiplizieren 85 Grenzwertbereich Der Grenzwertbereich des SERION ELISA antigen Candida ist auf dem Qualitätskontrollzertifikat angegeben und kennzeichnet den Bereich grenzwertiger Messergebnisse Die Bewertung einer Patientenprobe unterhalb des Grenzwertbereichs charakterisiert ein negatives Testergebnis; die Bewertung einer Patientenprobe oberhalb des Grenzwertbereichs wird als positives Testergebnis interpretiert Im Falle eines grenzwertigen Ergebnisses ist keine sichere Bewertung der Patientenprobe möglich In einem solchen Fall sollte der Test parallel mit einer, im Abstand von ein bis zwei Wochen entnommenen, neuen Serumprobe (Serumpaar) wiederholt werden 86 Interpretation der Ergebnisse Pos: 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estauswertung/candi da antigen/candi da antig en: Interpr etation der Ergebni Ein positives Testergebnis im Patienten-Material weist auf eine Candida-Fungämie hin Die Interpretation der Ergebnisse kann nur in Zusammenhang mit dem klinischen Bild und anderen Nachweismethoden erfolgen Ein positives Ergebnis liegt vor, wenn mindestens 2,6 Units ermittelt werden Dieses Ergebnis in einer Probe bedeutet, dass darin die Menge an Mannan nachgewiesen werden kann, die mit 2,6 ng Protein des Candida-Erregers assoziiert ist Dabei kann es sich um lebende bzw um tote Erreger handeln Ein negatives Testergebnis schließt eine akute Infektion mit den entsprechenden Erregern nicht aus Besonders bei hohen anti-candida Antikörper-Titern kann es sein, dass die Antikörper das Antigen so stark maskieren, dass selbst durch die Denaturierungsschritte in der Probenvorbereitung das Antigen nicht erkannt wird Auch der Zeitpunkt der Probennahme während der Infektion, eine ungeeignete Probennahme, Probenvorbereitung oder Probenlagerung können ein negatives Testergebnis verursachen deutsch 18

20 Pos: 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift Leistungsmer 1 Pos: 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift Pr äzisi Referenzbereich gesunder Probanden DE Pos: 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estauswertung/candi da antigen/candi da antig en: R efer enzbereich g esunder Die Untersuchung von Seren unselektierter Blutspender aus dem süddeutschen Raum mit dem SERION ELISA antigen Candida ergab folgende Verteilung: Von 103 untersuchten Blutspenderseren wurden 92 (89,3 %) mit dem SERION ELISA antigen Candida negativ bewertet, sechs Seren (5,8 %) lieferten einen positiven Befund und fünf Seren (4,9 %) wurden grenzwertig bewertet 9 LEISTUNGSMERKMALE antigen/leistungsmerkmale/kapitelüberschrift: 8\mod_ _6doc Pos: 36 /Arbeitsanleitungen Sensitivität für alle Dokumente/ELISA und 91 Sensitivität und Spezifität Pos: 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur Dokument/Leistungsmer kmale/candi da antig en/candi da antig en: Sensiti vität und In einer internen Studie zur Validierung des SERION ELISA antigen Candida wurden 148 Seren von erwachsenen Blutspendern bzw von 93 Patienten, die im Laufe einer intensivmedizinischen Behandlung Anzeichen einer systemischen Candidose zeigten, untersucht und mit den Ergebnissen eines kommerziell erhältlichen Antigennachweises verglichen Für die Berechnung der Sensitivität und Spezifität wurden die grenzwertig eingestuften Seren nicht berücksichtigt Leistungsmerkmale Sensitivität Spezifität SERION ELISA antigen Candida > 99,9 % 97,8 % In einer weiteren internen Studie wurden Kreuzreaktionen mit den Candida-Spezies Candida guillermondii, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis und Candida tropicalis im SERION ELISA antigen Candida festgestellt, so dass eine umfangreiche Candida Diagnostik gewährleistet ist Weiterhin wurde die Kreuzreaktivität von Hydroxyethylstärke (HES) untersucht, die als Plasmaexpander bei der Behandlung von Kreislaufschwächen (hypovolämischer, hämorrhagischer und septischer Schock) eingesetzt wird Trotz der molekularen Ähnlichkeit dieser Substanz mit Mannan konnte keine Kreuzreaktivität im SERION ELISA antigen Candida nachgewiesen werden deutsch 19

21 Pos: 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/allgemeine T exte ELISA Präzision Pos: 39 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Leistungsmer kmale/candi da antig en/candi da antig en: Pr Die intraserielle Präzision wurde mit unterschiedlich reaktiven Seren im Mehrfachansatz (n = 20) innerhalb einer antigenbeschichteten Platte ermittelt Für die Bestimmung der interseriellen Präzision wurden Serumproben mit unterschiedlicher Reaktivität in 10 unabhängig voneinander durchgeführten Ansätzen geprüft Standardabweichung Variationskoeffizient (VK %) = x 100 Mittelwert SERION ELISA antigen Candida: Probe Mittlere Extinktion (OD) Intraassay (VK %) Mittlere Extinktion (OD) Interassay (VK %) negativ 0,223 9,6 0,225 7,3 grenzwertig 0,507 2,4 0,476 5,3 positiv 1,413 2,5 1,356 2,7 positiv 2,851 2,0 2,442 8,1 deutsch 20

22 Pos: 41 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/liter atur /Kapi tel überschrift: SICHERHEITSMASSNAHMEN DE 101 Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen Der SERION ELISA antigen ist nur für die Anwendung durch Fachpersonal vorgesehen, welches die Arbeitstechniken einwandfrei beherrscht Für die Handhabung der Testreagenzien und der Patientenproben gelten die anerkannten Laborregeln: - Die Testpackung enthält Verdünnungen humaner Seren Obwohl alle eingesetzten Seren negativ auf anti-hiv-ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) und anti- HCV-Ak getestet wurden, müssen sie als potentiell infektiös betrachtet werden - Nicht mit dem Mund pipettieren - In Bereichen, in denen mit Testreagenzien oder mit Patientenproben gearbeitet wird, nicht essen, trinken oder rauchen - Beim Umgang mit Testreagenzien und Patientenproben direkten Kontakt durch das Tragen von Laborkittel, Einweghandschuhen und Schutzbrille vermeiden Hände anschließend gründlich reinigen - Die Patientenproben und alle potentiell infektiösen Materialien sind nach der Testdurchführung zu dekontaminieren - Die Reagenzien sind unzugänglich für Kinder aufzubewahren 102 Entsorgung Bitte beachten Sie die jeweils geltenden gesetzlichen Vorschriften! deutsch 21

23 === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt === 11 LITERATUR Pos: 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Liter atur/c andida antigen: [1] Fegeler, W (1992) Möglichkeiten einer differenzierten Candida-Serologie Pilzdialog 4, 61-2 [2] Fegeler, W, Kipp, F (2004) Candida- und Aspergillus-Antikörper-ELISA Erwartungs-werte positiver Antikörpernachweise aus Seren der klinischmykologischen Routine-diagnostik Mycoses 47, 41 7 [3] Fukazawa, Y (1989) Antigenic structure of Candida albicans Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts Immunol Serol 47, [4] Jones, JM (1990) Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis Clin Microbiol Rev 3, [5] Matthews, RC, Burnie, JP, Tabaqchali, S (1987) Isolation of Immunodominant Antigens from Sera of Patient with Systemic Candidiasis and Characterization of Serological Response to Candida albicans J Clin Microbiol 25, [6] Müllensiefen, M, Ringelmann, R (1991) Labor-Diagnostik systemischer Candidosen Lab med 15, [7] Repentigny, L (1989) Serological Techniques for Diagnosis of Fungal Infections Eur J Clin Microbio Infec 8, [8] Robert Koch-Institut (2008) Epidemiologisches Bulletin 29 [9] Ruhnke, M, Rosseau, S, Graf, B (2004) Invasive Pilzinfektionen auf der Intensivstationen Arzneimitteltherapie 22, [10] Rüchel, R, Debusmann, F (2008) Serologie in der Diagnostik von Mykosen Chemother J 17, [11] Sendid, B, Poirot, JL, Tabouret, M, Bonnin, A, Caillot, D, Camus, D, Poulain, D (2002) Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species Med Microbiol 51, [12] Sendid, B et al (2006) Candidaemia and antifungal therapy in a French University Hospital: rough trends over a decade and possible links Infect Dis 6, 80 [13] Tietz, H-J, Tausch, I (1993) Differenzierte Candidaserologie auf dem Prüfstand Pilzdialog 4, 55-6 [14] Walsh, TJ et al (1991) Detection of Circulating Candida Enolase by Immunoassay in Patients with Cancer and Invasive Candidiasis New Engl J Med 324, [15] Werle, E, Kappe, R, Fiehn, W, Sonntag, H-G (1994) Nachweis von Anti- Candida-Antikörpern der Klassen IgM, IgG und IgA mittels Enymimmunoassays in sequentiellen Serumproben hospitalisierter Patienten Mycoses 36, 71-8 [16] Zöller, L, Krämer, I, Kappe, R, Sonntag, HG (1991) Enzyme Immuno Assay for Invasive Candida Infections: Reactivity of somatic Antigens of Candida albicans J Clin Microbiol 29, deutsch 22

24 SERION ELISA antigen Candida EN CONTENTS 1 INTENDED USE 2 DIAGNOSTIC RELEVANCE 3 SERION ELISA antigen - TEST PRINCIPLE 4 KIT COMPONENTS EL EN 5 MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 6 STORAGE AND STABILITY 7 TEST PROCEDURE SERION ELISA antigen 71 General Notes 72 Sample Preparation and Storage 73 Preparation of Kit Reagents 74 Overview - Test Procedure 75 Manual Test Procedure 76 Automated Test Procedure 77 Positive Control / Accuracy Control CS PT 8 TEST EVALUATION 81 Single-Point Quantification with the 4PL Method 82 Criteria of Validity 83 Calculation SERION ELISA antigen Candida 84 Limits of Quantification 85 Borderline Range 86 Interpretation of Results 87 Reference Range of healthy Individuals 9 PERFORMANCE CHARACTERISTICS 91 Sensitivity and Specificity 92 Reproducibility 10 SAFETY MEASURES 101 Statements of Warning 102 Disposal 11 REFERENCES current version No: V 112/09-1 previous version: --

25 Pos: 1 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/allgemei ne Texte ELISA antigen/einl eitung " Enzymimmunoassay" C andi da Pos: 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/allgemei ne Texte ELISA antigen/kapitelüberschrift "Diag nostische 1 SERION ELISA antigen Candida Enzyme-immunoassay for determination of Candida Antigen for in vitro diagnostic use Pos: 2 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/bestellnummer n/c andida antigen: Bestell SERION ELISA antigen Candida Order Nr: ESR200 Pos: antigen/allgemeine 8\mod_ _18doc 3 /Arbeitsanleitungen Texte antigen/kapitelüberschrift 1 für alle Dokumente/ELISA 1 INTENDED USE Pos: 4 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/anwendungsbereich/c andi da antigen: SERION ELISA antigen Candida is a quantitative and qualitative immunoassay for the detection of Candida antigen in human serum or plasma The assay is recommended for the detection of systemic candidosis 2 DIAGNOSTIC RELEVANCE Pos: 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/di agnostische Bedeutung/Candida antigen: Diag nostische albicans is an ubiquitous yeast which, like all Candida species, belongs to the family of yeast-like fungi Apart from the yeast form which primarily causes superficial infections, so called pseudo mycelia are a further morphologic manifestation of yeast-like fungi Germ tubes and the development of pseudo mycelia mainly occur in cases of systemic mycosis Candida ssp produce and excrete a range of destructive enzymes that enable the facultative pathogen microorganisms to penetrate mucous membrane barriers and blood vessels barriers Candida ssp are primarily transmitted by smear contamination from person to person The primary portal of entry is the oral cavity Changes in the fungistatic properties of the skin, which are a consequence of a slightly acidic ph value and the antagonistic bacterial flora, can facilitate the establishment of superficial candidiasis of the skin surface Systemic mycosis results from colonization of mucous membranes, particularly in the gastrointestinal tract Candida ssp are able to adhere to the epithelia of a variety of mucosal membranes by adherence proteins and other cell surface structures The schematic below shows hypothetical steps that may lead to disseminated infections in cases of severe underlying conditions An exact description of the various stages is not practical (Fig 1) english 2

26 colonization of the nasopharyngeal tract passing of the stomach lumen transfer to the intestine lumen EN entry into blood circulation transfer to lymphoid system persorption of Candida - ssp EL EN Figure 1: invasion of multiple organs progression of Candida-infections Candidiasis can generally be classified into two major groups whose main characteristics are listed in the table below CS PT superficial Candida-infections deep mycosis (invasive) localization skin, mucosa prime organs immunocompetence of the host risk factors clinical progression + +,-/- pregnancy diabetes AIDS dysfunction of the skin deficient oral hygiene harmless in most cases, no danger of life chemo therapy iatrogene immune suppression central vein catheter radiotherapy high-grade burns surgery life-threatening in most cases therapy effective therapy effectiveness of therapy depends on stage of infection Table 1: Characteristics of Candida-infections english 3

27 Pos: 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/inhalt und Z usammensetzung/c andi da antigen: Inhalt und 1 The diagnosis of candidiasis on the basis of serological methods is not straight forward: On the one hand transient yeast colonization may induce an antibody response, on the other hand systemic Candida mycosis in immunosuppressed patients may only lead to minor changes in antibody activities Such situations make critical interpretation of serological findings necessary In addition, systemic Candida-infections may not cause typical symptoms Currently it is not possible to conclude that the results of different test systems for anti- Candida antibody detection are comparable or even exchangeable Specificity of detected antibodies significantly depends on the test system (ELISA or HAT) or on the antigen preparation used The detection of IgM antibodies with HAT is better than the IgG detection due to higher agglutination properties of IgM molecules HAT mainly detects antibodies against cell wall antigens of yeast-like fungi which makes serological interpretation even more complex but gives the opportunity for differentiation Changes in antibody concentrations may be detectable with ELISA but not with HAT, making a combination of the two techniques advantageous, eg in case of decreasing IgM antibody activity and simultaneously increasing IgG antibody activity Currently no single technique in isolation allows for a definitive serological diagnosis of candidiasis Surveillance of at risk patients and therapy control requires the use of a variety of methods including serology and antigen detection The SERION ELISA antigen Candida test is of particular help in such situations by detecting Candida specific antigen in patient samples Pos: 7 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/testprinzip/testprinzip ELISA 1 3 SERION ELISA antigen - TEST PRINCIPLE The ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) is an immunoassay, which is particularly suited to the determination of antibodies and antigens in the field of infectious serology The reaction is based on the specific interaction of antibodies with their corresponding antigen The test strips of the SERION ELISA antigen microtiter plate are coated with specific antibodies directed against the pathogen of interest If antigens in the patient s sample are present, they bind to the fixed antibody A secondary antibody, which has been conjugated with the enzyme peroxidase, detects and binds to the immune complex The colourless substrate hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and the chromogen tetramethylbenzidine (TMB) are converted into a blue coloured product Addition of stopping solution changes the colour to yellow The signal intensity of this reaction product is proportional to the concentration of the antigen in the sample and is measured photometrically english 4

28 4 KIT COMPONENTS EN Test Components Pieces / Volume Break apart microtiter test strips each with eight antibody coated single wells, (altogether 96) MTP, 1 frame Standard serum STD, Candida albicans antigen in human serum supplemented with fetal calf serum (FCS); negative for anti-hiv Ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus surface antigen) and anti-hcv Ab; preservative: < 01 % sodium azide 12 pieces 3 x 3 ml EL EN Negative control serum NEG, Human serum supplemented with fetal calf serum (FCS); negative for anti-hiv Ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus surface antigen) and anti-hcv Ab; preservative: < 01 % sodium azide Anti-Candida albicans conjugate (ready-to-use) PODCR, Anti-Candida albicans antibody conjugated to horseradish-peroxidase; stabilised with protein stabilisation solution containing detergent; preservative: 01 % ProClin x 3 ml 13 ml CS PT Washing solution concentrate (sufficient for 1500 ml) WASH, TRIS-buffered salt solution with Tween 20; 30-fold concentrated; preservative: < 01 % ProClin x 25 ml Dilution buffer SAMB, Acid solution without preservative 15 ml Stopping solution STOP, 05 N sulfuric acid 13 ml TMB-substrate solution (ready-to-use) TMB, TMB-hydrogen peroxide substrate solution; preservative: < 001 % Kathon CG 13 ml Quality control certificate with standard curve and evaluation table INFO, (quantification of antigens in U/ml) 2 pieces Pos: 9 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/zusätzlich benötigte Materialien/Zusätzlich benötigte 1 english 5

29 5 MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED - common laboratory equipment - photometer for microtiter plates with filter, wavelength 450 nm, recommended reference wavelength 620 nm nm (eg 650 nm) - incubator 37 C - heating block 110 C - moist chamber - distilled water - Click-Clips (order no VT120) Pos: 10 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/lagerung und Haltbarkeit/Lagerung und 1 english 6

30 Pos: 11 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/ü berschrift: D 1 6 STORAGE AND STABILITY EN Reagent Storage Stability Microtiter strips (coated with antibody) Control sera / Standard sera unopened after opening at 2 8 C in closed aluminum bag with desiccant Strips which are not used must be stored dry and air tight in the closed aluminum bag after opening at 2 8 C Conjugate ready-to-use solution at 2 8 C Dilution buffer Avoid contamination eg by using sterile tips unopened after opening at 2 8 C Discard cloudy solutions see expiry date; minimum shelf-life: 4 weeks shelf-life in case of proper use and storage: until expiry date see expiry date; 24 months as of date of production see expiry date; 18 months as of date of production see expiry date; 24 months as of date of production 6 months EL EN CS PT Washing solution Concentrate after opening at 2 8 C TMB substrate working dilution at 2 8 C working dilution at room temperature Bottles used for the working dilution should be cleaned regularly Discard cloudy solutions ready-to-use solution at 2 8 C, stored protected from light Avoid contamination eg by using sterile tips Discard if solution turns blue (extinction at 650 nm against aqua dest > 02 OD) see expiry date; 24 months as of date of production 2 weeks 1 week see expiry date; 24 months as of date of production Stopping solution After opening at room temperature see expiry date english 7

31 Pos: 12 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/allgemei ne Hinweise ELISA antig 2 7 TEST PROCEDURE SERION ELISA antigen 71 General Notes Only use SERION ELISA antigen reagents when using SERION ELISA antigen immunoassays The components must not be exchanged for reagents of other manufacturers Standard and control sera as well as the conjugate of SERION ELISA antigen immunoassays are defined exclusively for the test kit to be used and must not be used in other lots Dilution buffer, washing solution, substrate and stop solution can be used for all SERION ELISA antigen immunoassays irrespective of the lot and the test Unopened, all components of the SERION ELISA antigen tests may, if stored accordingly, be used up to the expiry dates given on the labels Reagents may not be used after date of expiry Dilution or alteration of the reagents may result in a loss of sensitivity Avoid exposure of reagents to strong light during storage and incubation Reagents must be tightly closed after use to avoid evaporation and contamination To open the aluminium bag of the microtiter plate please cut off the top of the marked side only, in order to guarantee proper resealing Do not use the strips if the aluminium bag is damaged or if the bag with remaining strips and desiccant was not properly resealed Use aseptic techniques when removing aliquots from the reagent tubes to avoid contamination To avoid false positive results ensure not to contact or splash the top-walls of wells while pipetting conjugate Take care not to mix the caps of the bottles and/or vials In particular, the TMB-substrate solution is sensitive to oxidising substances and heavy metal ions It must be stored away from light at all times and only opened in low light conditions immediately prior to use This solution is coloured light blue-green Skin contact with substrate and stop solution should be avoided Reproducibility of test results is dependent on thorough mixing of the reagents Agitate the flasks containing control sera before use and also all samples after dilution (eg by using a vortex mixer) Be sure to pipette carefully and comply with the given incubation times and temperatures Significant time differences between pipetting the first and last well of the microtiter plate when dispensing samples and control sera, conjugate or substrate can result in different pre-incubation times, which may influence the precision and reproducibility of the results Optimum results can only be achieved if the instructions are strictly followed The SERION ELISA antigen immunoassay is only valid if the lot-specific validation criteria on the quality control certificate are fulfilled english 8

32 Pos: 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/pr obenvor ber eitung und Lagerung/Candida antigen: Probenvorbereitung und Lager 2 Pos: 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/pr obenver dünnung/candida antigen: 3 Pos: 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/r eagenzienvorbereitung ELISA Adequate washing avoids test unspecificities Therefore, the washing procedure should be carried out carefully All of the flat bottom wells should be filled with equal volumes of washing buffer At the end of the procedure ensure that the wells are free of all washing buffer in order to avoid uncontrolled dilution effects Avoid foaming! Take care not to damage the inscription (pathogen / AG) on the microtiter test strips during washing and aspiration to avoid confusion 72 Sample Preparation and Storage Lipaemic, hemolytic or icteric samples (serum or plasma) should only be tested with caution Obviously contaminated samples should not be tested Serum or plasma (EDTA, citrate, heparin) collected according to standard laboratory methods are suitable samples 721 Sample Preparation Before running the test, specimens (patient samples, standard and negative control) (V 1 ) must be diluted in dilution buffer (V 2 ) as follows: EN EL EN CS PT V 1 + V 2 = 3+1 add 300 µl sample (V 1 ) each to 100 µl dilution buffer (V 2 ) After dilution and before pipetting into the microtiter plate, the samples must be mixed thoroughly to prepare a homogenous solution Finally, the samples must be heated at 110 C (+/- 5 C) for 10 minutes It is essential to keep both the time and temperature stated! Standard reagent vessels are not suitable for this thermolysis step and we recommend the use of safe-lock reaction vessels or similar vessels with a screw closure Usage of a heating block thermostat requires controlling of the actual temperature by a calibrated thermometer Consider the device-specific pre-heating period of the heating block If necessary, the heating block must be adjusted to the required temperature During thermolysis, a white cloudy precipitate will form and should be removed by centrifugation in a pre-cooled (4 C) table top centrifuge at 10,000 g for 10 minutes The clear supernatant can then be used in the test Pos: 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/probenl agerung ELISA antig Sample Storage The treated patient s samples should not be stored for more than 24 hours at 2 8 C Untreated samples should not be stored at 2 8 C for more than 7 days Extended storage is possible at -20 C Avoid repeated freezing and thawing of samples english 9

33 Pos: 17 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/t establauf/überschrift T Preparation of Kit Reagents Bring all reagents to room temperature before testing 731 Microtiter Test Strips The microtiter test strips in frames are packed with a desiccant in an aluminum bag Take unrequired cavities out of the frame and put them back into the aluminum bag Close bag carefully to ensure airtight conditions 732 Control Sera / Standard Sera Control and standard sera must be diluted with sample buffer and subsequently denatured For each test run independent of the number of microtiter test strips to be used control and standard sera must be included The standard sera should be set up in duplicate 733 Conjugate (ready-to-use) Avoid contamination of the ready-to-use conjugate, eg by using sterile tips 734 Wash solution Dilute washing buffer concentrate (V 1 ) 1:30 with aqua dest to a final volume of V 2 Example: Buffer concentrate (V 1 ) Final volume (V 2 ) 25 ml 750 ml 1 ml 30 ml 735 TMB Substrate (ready-to-use) Avoid contamination of the ready-to-use substrate solution, eg by using sterile tips The TMB substrate is coloured light blue-green and any solutions which exhibit a strong colour (extinction at 650 nm against distilled water of >02 OD) should be discarded 736 Stopping Solution (ready-to-use) english 10

34 Pos: 18 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/t establauf/testablauf Candida Pos: 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/testdurchführ ung/c andi da antigen: Manuelle Testdurchführ Overview - Test Procedure EN SERION ELISA antigen Candida quantitativ Preparation of samples, control and standard serum Sample dilution (Patient samples, control and standard serum) 300 µl Sample µl Dilution buffer EL EN INCUBATION 10 min / 110 C CENTRIFUGATION 10 min / 10,000 g / 4 C Retain supernatant, discard pellet Add supernatant from samples (100 µl) INCUBATION 60 min / 37 C moist chamber WASH (5 x 300 µl DIL WASH ) Pipette conjugate solution PODCR (100 µl) INCUBATION 60 min / 37 C moist chamber WASH (5 x 300 µl DIL WASH ) Pipette substrate solution TMB (100 µl) INCUBATION 30 min / 37 C moist chamber Pipette stop solution STOP (100 µl) READ EXTINCTION at 450 nm (ref 650 nm) CS PT english 11

35 Pos: 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/automatische T Manual Test Procedure 1 Pretreatment of samples (patient samples, standard and control serum) as described 2 Place the required number of cavities in the frame and prepare a protocol sheet 3 Add each 100 µl of the supernatants from the standard serum (in duplicate), negative control and patient samples into the appropriate wells of microtiter test strips Spare one well for substrate blank, eg: Candida antigen quantitative cavity A1 cavity B1 cavity C1 cavity D1 Substrate blank Negative control Standard serum Standard serum cavity E1 Patient sample 1 4 Sample incubation for 60 minutes (+/- 3 min) at 37 C (+/- 1 C) in moist chamber 5 After incubation wash all wells with washing solution (by automated washer or manually): - aspirate or shake out the incubation solution - fill each well with 300 µl washing solution - aspirate or shake out the washing buffer - repeat the washing procedure 4 times (altogether 5 times!) - dry by tapping the microtiter plate on a paper towel 6 Addition of conjugate Add 100 µl of the ready-to-use conjugate into the appropriate wells (except substrate blank) 7 Conjugate incubation for 60 minutes (+/- 3 min) at 37 C (+/- 1 C) in moist chamber 8 After incubation wash all wells with washing solution (see above) 9 Addition of substrate Add 100 µl of ready-to-use TMB-substrate solution into each well (including well for substrate blank!) 10 Substrate incubation for 30 minutes (+/- 1 min) at 37 C (+/- 1 C), protected from light in moist chamber 11 Stopping of the reaction Add 100 µl stopping solution into each well Agitate the microtiter plate gently to mix 12 Read extinction Read optical density (OD) within 60 minutes at 450 nm against substrate blank, reference wavelength between 620 nm and 690 nm (eg 650 nm) english 12

36 Pos: 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/positi vkontrolle / Richtig 2 Pos: 22 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: T ESTAU SWERTUN G Automated Test Procedure EN SERION ELISA are suited for processing on automats and evaluated for use with Immunomat TM and Gemini The automated processing is performed analogous to manual use Please note, that under special working-conditions internal laboratory adaptations of the incubation times may be necessary 77 Positive Control / Accuracy Control For the periodic verification of the test method, in order to fulfil the requirements of laboratory internal quality management systems, we recommend using SERION ELISA controls to determine precision and accuracy of SERION ELISA antigen test runs The use of SERION ELISA controls is described in specific instruction manuals EL EN CS PT english 13

37 Pos: 24 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estg ültig keitskriteri 2 8 TEST EVALUATION SERION ELISA antigen Candida Pos: 23 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estauswertung: Ein- Punkt- Quantifizier Single-Point Quantification with the 4PL Method Optimised assignment of extinction signals to quantitative values is guaranteed by using non-linear functions, which adjust a sigmoide curve without any further transformation to OD-values Determination of antigen concentrations with the SERION ELISA antigen is carried out by the 4 parameter logistic-log-model (4 PL) which is ideal for exact curvefitting It is based on the formula: OD = A e D - A B(C - ln Conc) The parameters A, B, C, and D are representative for the exact shape of the curve: 1 lower asymptote parameter A 2 slope of the curve parameter B 3 turning point parameter C 4 upper asymptote parameter D For each lot the standard curve is evaluated by Institut Virion\Serion GmbH (Würzburg, Germany) in repeated test runs under optimal conditions Time consuming and cost intensive construction of the standard curve by the user is not necessary For evaluation of antigen concentrations a lot specific standard curve as well as a lot specific evaluation table is included with each SERION ELISA antigen test kit The evaluation software SERION evaluate as well as the Microsoft Excel-based software tool SERION activity are available on request To compensate for normal test variations and also for test run control a standard serum is used in each individual test run For this control serum a reference value with a validity range is determined by the quality control of the producer Within this range a correct quantification of antigen concentration is ensured english 14

38 Pos: 25 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/auswertung: Ü 2 Pos: 26 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/nichtautomatisi erte Auswertung ELISA Criteria of Validity EN - The substrate blank must be < 025 OD - The negative control must produce a negative test result - By use of quantitative SERION ELISA antigen tests the mean OD-value (after subtraction of the substrate blank!) of the standard serum must be within the validity range, which is given on the lot specific quality control certificate - The variation of OD-values of the standard serum may not be higher than 20 % EL EN If these criteria are not met, the test is not valid and must be repeated 83 Calculation SERION ELISA antigen Candida 831 Non-automated Evaluation For the SERION ELISA antigen test evaluation a lot-specific quality control certificate with standard curve and an evaluation table is included in the test kit The substrate blank must be substracted from all OD values prior to evaluation antigen/testauswertung/testauswertung 11\mod_ _18doc Pos: 27 /Arbeitsanleitungen Methoden alle Dokumente/ELISA Method 1: Qualitative Evaluation CS PT To fix the cut-off ranges multiply the mean value of the measured standard OD with the numerical data of the quality control certificate (see special case formulas), eg: OD = 0502 x MW(STD) with upper cut-off OD = 0352 x MW(STD) with lower cut-off If the measured mean absorbance value of the standard serum is 0970 OD, the range of the cut-off is in between OD Method 2: Continuous Determination of Antigen Activities using the Standard Curve So called interassay variations (day to day deviations and laboratory to laboratory deviations) are compensated by multiplication of the current measured value obtained with a patient s sample with the correction factor F This factor is calculated as follows: F = OD-reference value (of standard serum) OD-current value (of standard serum) english 15

39 Pos: 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/automatische 3 Pos: 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/quantifizi 2 The procedure is necessary to adjust the current test level of the user with the lot-specific standard curve First, daily deviations have to be corrected by calculating the correction factor F 1 The mean of the two OD-values of the standard serum has to be calculated and checked that it is within the given validity range 2 Calculation of the factor F: the given reference value is divided by the mean of the extinction of the standard serum: F = reference value extinction STD serum / mean value extinction STD serum 3 All measured values of patient samples are multiplied by F 4 Antigen activities in IU/ml or U/ml can be determined from the standard curve with the corrected values 832 Automatic Test Evaluation with Software SERION evaluate After input of the four parameters and the reference value of the standard serum, antigen activities are calculated online from processed and measured SERION ELISA antigen test runs by the evaluation software SERION evaluate If the optical density of the standard is out of the valid range, the following message will appear Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24 or Standard values differ more than 20 % in following groups: Group 1-24 In such cases the test run is invalid and should be repeated Parameters and reference value need to be changed only if there is a change of lot (evaluation table shows parameters and reference values) Correct input of the lot specific data can be checked on the basis of the standard serum activity (in IU/ml or U/ml) assigned to the standard serum The calculated mean value of the units has to correspond to the unit value indicated on the lot specific certificate There is an automatic correction of the measured values In the standard version the printout displays the following: Sample code OD-value U/ml Evaluation english 16

40 Pos: 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa 2 Pos: 31 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: Inter pretati on der 2 Pos: 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: R eferenzber eich gesunder Pr 2 Pos: 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift Leistungsmer Limits of Quantification EN The limits of quantification are specified on the quality control certificate of the SERION ELISA antigen test The linearity of dilution within this range has been demonstrated in comprehensive evaluation studies In case a patient sample shows a test result above the upper limit of quantification, the sample may be tested at a higher dilution The thereby determined antigen activity must be multiplied by the additional dilution factor 85 Borderline Range The borderline range of the SERION ELISA antigen Candida test is specified on the quality control certificate and indicates the range for borderline test results Values obtained, when testing a patient s sample, which fall below this range indicate a negative test result; values above the borderline range are interpreted positive In cases where the results are within the borderline range a definitive interpretation of the result is not possible In such cases, the test should be repeated in parallel with a follow-up sample taken one to two weeks later (serum pair) EL EN CS PT 86 Interpretation of Results Pos: 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estauswertung/candi da antigen/candi da antig en: Interpr etation der Ergebni Positive test results for patient samples indicate a Candida fungemia Results can only be interpreted in combination with the clinical picture and other detection methods A result can be considered as positive when at least 26 units are measured in the test Such a result indicates that the sample contains the quantity of Mannan that is associated with 26 ng of Candida protein However, it cannot distinguish between live or dead organisms, respectively Negative test results do not exclude an acute infection, especially if high antibody titers are found In such cases it may be that the antigen is completely masked by antibodies and even the denaturing procedure during sample preparation is not sufficient to allow detection of the antigen In addition, the point in time during an infection when a sample is obtained, an unsuitable sample, poor sample preparation and storage can all lead to a negative result 87 Reference Range of healthy Individuals Pos: 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estauswertung/candi da antigen/candi da antig en: R efer enzbereich g esunder Testing of random blood donor sera, collected in the region of southern Germany, with the SERION ELISA antigen Candida test resulted in the following distribution From 103 sera tested with the SERION ELISA antigen Candida test, 92 (893 %) were negative, six sera (58 %) gave a positive result and five samples (49 %) were determined to be borderline english 17

41 Pos: 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift: Sensiti vi tät und 2 Pos: 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift Pr äzisi 2 9 PERFORMANCE CHARACTERISTICS 91 Sensitivity and Specificity Pos: 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Leistungsmer kmale/candi da antig en/candi da antig en: Sensiti vität und The SERION ELISA antigen Candida test was validated by the analysis of 148 serum samples from blood donors and 93 specimens from patients, who showed signs of candidiasis during intensive care treatment, in comparison to the results obtained with a commercially avaliable assay of a leading European manufacturer Sera classified as borderline were not included in the calculation of sensitivity and specificity values Performance Characteristics Sensitivity Specificity SERION ELISA antigen Candida > 999 % 978 % In another internal study, cross-reactivity with the species Candida guillermondii, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis and Candida tropicalis with the SERION ELISA antigen Candida was demonstrated in order to guarantee a comprehensive Candida diagnosis Due to a similiarity of mannan with hydroxyethylstarch (HES), which is used in plasma expanders for treatment of circulatory failure (hypovolemic, hemorrhagic and septic shock), potential cross-reactivity was assessed However, no cross-reaction with HES was measureable when using the SERION ELISA antigen Candida test 92 Reproducibility Pos: 39 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Leistungsmer kmale/candi da antig en/candi da antig en: Pr Intraassay reproducibility was determined by testing sera of different reactivities 20 times in one test run Interassay reproducibility was determined by testing sera of different reactivities in 10 independent test runs Standard deviation Coefficient of Variation (CV %) = x 100 Mean value SERION ELISA antigen Candida: Sample Mean Value Intraassay Mean Value Interassay (OD) (CV %) (OD) (CV %) negative borderline positive positive english 18

42 Pos: 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/allgemeine T exte ELISA 122 Pos: 41 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/liter atur /Kapi tel überschrift: 1 EN 10 SAFETY MEASURES 101 Statements of Warning The SERION ELISA antigen is designed for use by qualified personnel who are familiar with good laboratory practice All kit reagents and human specimens should be handled carefully, using established good laboratory practice EL EN - This kit contains human blood components Although all control- and cut-off sera have been tested and found negative for anti-hiv-ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virussurface Antigen) and anti-hcv-ab, they should be considered potentially infectious - Do not pipette by mouth - Do not smoke, eat or drink in areas in which specimens or kit reagents are handled - Wear disposable gloves, laboratory coat and safety glasses while handling kit reagents or specimens Wash hands thoroughly afterwards - Patient s material and other potentially infectious material should be decontaminated after the test run - Reagents should be stored safely and be unaccessible to unauthorized access eg children CS PT 102 Disposal Please observe the relevant statutory requirements! english 19

43 === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt === 11 REFERENCES Pos: 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Liter atur/c andida antigen: [1] Fegeler, W (1992) Möglichkeiten einer differenzierten Candida-Serologie Pilzdialog 4, 61-2 [2] Fegeler, W, Kipp, F (2004) Candida- und Aspergillus-Antikörper-ELISA Erwartungs-werte positiver Antikörpernachweise aus Seren der klinischmykologischen Routine-diagnostik Mycoses 47, 41 7 [3] Fukazawa, Y (1989) Antigenic structure of Candida albicans Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts Immunol Serol 47, [4] Jones, JM (1990) Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis Clin Microbiol Rev 3, [5] Matthews, RC, Burnie, JP, Tabaqchali, S (1987) Isolation of Immunodominant Antigens from Sera of Patient with Systemic Candidiasis and Characterization of Serological Response to Candida albicans J Clin Microbiol 25, [6] Müllensiefen, M, Ringelmann, R (1991) Labor-Diagnostik systemischer Candidosen Lab med 15, [7] Repentigny, L (1989) Serological Techniques for Diagnosis of Fungal Infections Eur J Clin Microbio Infec 8, [8] Robert Koch-Institut (2008) Epidemiologisches Bulletin 29 [9] Ruhnke, M, Rosseau, S, Graf, B (2004) Invasive Pilzinfektionen auf der Intensivstationen Arzneimitteltherapie 22, [10] Rüchel, R, Debusmann, F (2008) Serologie in der Diagnostik von Mykosen Chemother J 17, [11] Sendid, B, Poirot, JL, Tabouret, M, Bonnin, A, Caillot, D, Camus, D, Poulain, D (2002) Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species Med Microbiol 51, [12] Sendid, B et al (2006) Candidaemia and antifungal therapy in a French University Hospital: rough trends over a decade and possible links Infect Dis 6, 80 [13] Tietz, H-J, Tausch, I (1993) Differenzierte Candidaserologie auf dem Prüfstand Pilzdialog 4, 55-6 [14] Walsh, TJ et al (1991) Detection of Circulating Candida Enolase by Immunoassay in Patients with Cancer and Invasive Candidiasis New Engl J Med 324, [15] Werle, E, Kappe, R, Fiehn, W, Sonntag, H-G (1994) Nachweis von Anti- Candida-Antikörpern der Klassen IgM, IgG und IgA mittels Enymimmunoassays in sequentiellen Serumproben hospitalisierter Patienten Mycoses 36, 71-8 [16] Zöller, L, Krämer, I, Kappe, R, Sonntag, HG (1991) Enzyme Immuno Assay for Invasive Candida Infections: Reactivity of somatic Antigens of Candida albicans J Clin Microbiol 29, english 20

44 SERION ELISA antigen Candida SOMMAIRE 1 UTILISATION PRÉVUE 2 PERTINENCE DU DIAGNOSTIC 3 SERION ELISA antigen - PRINCIPE DU TEST 4 COMPOSANTS DE LA TROUSSE 5 PRODUITS NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNIS FR 6 STOCKAGE ET STABILITÉ 7 PRINCIPLE DU TEST SERION ELISA antigen 71 Remarques générales 72 Préparation et stockage de l'échantillon 73 Préparation des réactifs de la trousse 74 Aperçu général - Procédure de test 75 Procédure de test manuel 76 Procédure de test automatisée 77 Contrôle positif / Contrôle de la précision 8 ÉVALUATION DU TEST 81 Quantification en un point selon la méthode 4PL 82 Critères de validité 83 Calcul SERION ELISA antigen Candida 84 Limites de la quantification 85 Fourchette limite 86 Interprétation des résultats 87 Fourchette de références des personnes en bonne santé 9 CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE 91 Sensibilité et Spécificité 92 Reproductibilité 10 MESURES DE SÉCURITÉ 101 Mises en garde 102 Élimination 11 RÉFÉRENCES Version actuelle nr: V 112/09-1 version précédente: --

45 Pos: 1 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/allgemei ne Texte ELISA antigen/einl eitung " Enzymimmunoassay" C andi da Pos: 3 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/allgemei ne Texte ELISA antigen/kapitelüberschrift " Anwendungsber 1 SERION ELISA antigen Candida Tests immuno-enzymatiques pour la détermination de l'antigène de Candida pour le diagnostic in vitro Pos: 2 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/bestellnummer n/c andida antigen: Bestell SERION ELISA antigen Candida N o de commande: ESR200 1 UTILISATION PRÉVUE Pos: 4 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/anwendungsbereich/c andi da antigen: SERION ELISA antigen Candida est un test immuno-enzymatique quantitatif et qualitatif pour le dépistage de l'antigène Candida dans le sérum humain ou le plasma L'essai est recommandé pour la détection de la candidose systémique Pos: antigen/allgemeine Bedeutung" 5 8\mod_ _23doc Texte ELISA antigen/kapitelüberschrift alle 1 Dokumente/ELISA "Diagnostische 2 PERTINENCE DU DIAGNOSTIC Candida albicans est une levure ubiquitaire qui, comme toutes les sous-espèces de Candida, appartient à la famille de champignons lévuliformes (voir tableau 1) À l'exception de la forme levure qui donne principalement des infections superficielles, les dits pseudomycéliums représentent une autre forme morphologique de la manifestation des lévuliformes La formation de tubes germinatifs et le développement de pseudo-mycèles ne sont observés que dans les cas de mycose systémique Candida ssp produit et sécrète une diversité d enzymes destructrices qui permettent aux microorganismes facultativement pathogènes de pénétrer les barrières vaisseaux sanguins et de la membrane muqueuse Les espèces de Candida ssp sont principalement transmises par contact avec des matières biologiques souillées de personne à personne La voie d'entrée principale étant la cavité orale La perturbation des propriétés fongistatiques de la peau, qui est la conséquence d un ph légèrement acide et une flore bactérienne antagoniste, peut faciliter une candidose sur la surface de la peau La mycose systémique peut être due à une colonisation de la membrane muqueuse et en particulier le tractus gastro-intestinal Les Candida ssp sont capables de se fixer à l'épithélium d'une diversité de membranes muqueuses grâce aux protéines d'adhérence et autres structures de la surface cellulaire Le schéma ci dessous illustre des étapes hypothétiques qui peuvent entraîner des infections disséminées en présence de conditions existantes graves Une description exacte des différents stades n'est pas réalisable ici (Figure 1) français 2

46 FR Figure 1 : évolution des infections à Candida Les Candidoses peuvent généralement être classée en deux groupes principaux dont les caractéristiques sont énumérées dans le tableau ci dessous superficielle Infections au Candida Mycose profonde (invasive) localisation Peau, muqueuse Organes principaux Immunocompétence de l'hôte Facteurs de risque Évolution clinique + +,-/- grossesse diabète SIDA Dysfonctionnement de la peau Hygiène buccale déficiente Bénigne dans la plupart des cas, Ne met pas la vie en danger chimiothérapie Immunosuppression iatrogène Cathéter veineux central radiothérapie Brûlures de hauts degrés chirurgie Dans la plupart des cas, met la vie en danger thérapie Thérapie efficace Efficacité de la thérapie dépend du stade de l'infection Tableau 1 : Caractéristiques des infections aux Candida français 3

47 Le diagnostic sérologique des infections Candida est particulièrement difficile D un côté, des colonies temporaires de levures peuvent aussi induire une réponse des anticorps, de l'autre, des mycoses systémiques par Candida chez des patients dont l immunité a été supprimée, ne produisent souvent que des changements mineurs au niveau de l activité de l anticorps Cette situation rend nécessaire l'interprétation critique des résultats sérologiques En outre, les infections systémiques de Candida ne causent pas de symptômes types Actuellement, il est impossible de conclure si les résultats des différents systèmes de test pour la détection des anticorps anti-candida sont comparables ou même échangeables La spécificité des anticorps détectés dépend significativement du système de test (ELISA ou test d hémagglutination) ou de la préparation d'antigène utilisée La détection des anticorps de classe IgM avec le test d hémagglutination est meilleure que la détection d'igg, étant donné que les molécules d IgM ont de meilleures propriétés d'agglutination Le test d hémagglutination détecte principalement des anticorps dirigés contre les antigènes de la paroi cellulaire des levures telles que les champignons lévuliformes, ce qui complique encore plus l'interprétation sérologique mais qui permet aussi la possibilité d une interprétation différentielle des résultats Les modifications au niveau des concentrations des anticorps peuvent être détectables avec l'elisa mais pas avec le test d'hémagglutination, ce qui rend l'association des deux techniques très avantageuse, par ex, dans le cas d'une diminution de l'activité des anticorps IgM et d'une augmentation, simultanée, de l'activité des anticorps IgG Actuellement, il n'existe pas de technique qui procure, à elle seule, un diagnostic sérologique complet de Candida Le suivi des patients à risque et la thérapie de contrôle exigent l utilisation d une diversité de méthodes comme la sérologie et la détection de l antigène Le test SERION ELISA antigen Candida nous aide particulièrement dans ces situations en détectant l'antigène spécifique au Candida dans les échantillons de sérums Pos: 7 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/testprinzip/testprinzip ELISA 1 3 SERION ELISA antigen - PRINCIPE DU TEST L'ELISA (test utilisant un immunosorbant lié à une enzyme) est un test immunoenzymatique, qui convient particulièrement à la détermination d'anticorps et des antigènes dans le domaine de la sérologie infectieuse La réaction est basée sur l'interaction spécifique des anticorps avec leurs antigènes correspondants Les barrettes de test de la microplaque de dosage du SERION ELISA antigen sont recouvertes d'anticorps spécifiques du pathogène d'intérêt Si les antigènes présents dans l'échantillon de sérum du patient sont présents, ils se lient à l'anticorps fixé Un anticorps secondaire, qui a été conjugué avec l'enzyme peroxydase, détecte le complexe immunologique et s'y lie La peroxyde d'hydrogène (H2O2), substrat incolore, et le chromatogène tetraméthylbenzidine (TMB) sont transformés en un produit de couleur bleue L'ajout de la solution d'arrêt change la couleur au jaune L'intensité du signal de ce produit de réaction est proportionnelle à la concentration de l'antigène dans l'échantillon et elle est mesurée par une méthode photométrique Pos: 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/inhalt und Z usammensetzung/c andi da antigen: Inhalt und 1 français 4

48 4 COMPOSANTS DE LA TROUSSE Composants pour l'essai Pièces / Volume Séparez chaque barrette de test de microtitraion, chacun à huit puits uniques recouverts d'anticorps, (au total 96) MTP, 1 cadre Sérum standard STD, Candida albicans antigen dans le sérum humain supplémenté avec du sérum de veau f tal (SVF) ; négatif pour l'ac anti-vih, HBs-Ag (antigène de surface du virus de l'hépatite B) et l'ac anti-vhc; agent de conservation : < 0,1 % azoture de sodium 12 pièces 3 x 3 ml FR Sérum de contrôle négatif NEG, Sérum humain supplémenté avec du sérum de veau f tal (SVF) ; négatif pour l'ac anti-vih, HBs-Ag (antigène de surface du virus de l'hépatite B) et l'ac anti-vhc; agent de conservation : < 0,1 % azoture de sodium Conjugué anti-candida albicans (prêt-à-l emploi) PODCR, Anticorps anti-candida albicans conjugué à la peroxydase de raifort ; stabilisé avec une solution de stabilisation de protéine contenant un détergent ; agent de conservation : 0,1 % ProClin 300 Concentré de solution de lavage (en quantité suffisante pour ml) WASH, Solution de sel tamponné avec du TRIS avec Tween 20 ; 30 fois concentrée ; agent de conservation : < 01 % ProClin 300 Tampon de dilution SAMB, Solution acide sans agent de conservation Solution d'arrêt STOP, Acide sulfurique à 0,5 N Solution de substrat (prêt à l'emploi) TMB, Solution de substrat de peroxyde d hydrogène TMB ; agent de conservation : < 001 % Kathon CG Certificat de contrôle de la qualité avec courbe d'étalonnage et tableau d'évaluation INFO, (quantification des antigènes en U/ml) 2 x 3 ml 13 ml 2 x 25 ml 15 ml 13 ml 13 ml 2 pièces Pos: 9 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/zusätzlich benötigte Materialien/Zusätzlich benötigte 1 français 5

49 5 PRODUITS NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNIS - équipement général de laboratoire - photomètre pour plaques de microtitration avec filtre, longueur d'onde 450 nm, longueur d'onde de référence recommandée 620 nm à 690 nm (par ex 650 nm) - incubateur à 37 C - bloc de chauffage à 100 C - chambre humide - eau distillée - Agrafes (n o de commande VT120) Pos: 10 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/lagerung und Haltbarkeit/Lagerung und 1 français 6

50 Pos: 11 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/ü berschrift: D 1 6 STOCKAGE ET STABILITÉ Réactif Stockage Stabilité Barrettes de microtitration (recouvertes d'anticorps) cachetées après ouverture, entre 2 et 8 C dans sachet en aluminium fermé avec déshydratant Les barrettes non utilisées doivent être stockés à sec dans des sachets en aluminium fermés à l abri de l air voir la date d'expiration; durée minimale de stockage : 4 semaines durée de stockage en cas d'utilisation selon les consignes et stockage : jusqu'à la date d'expiration FR Sérum de contrôle / Sérum standard après ouverture entre 2 et 8 C voir la date d'expiration; 24 mois à partir de la date de fabrication Conjugué solution prête à l'emploi entre 2 et 8 C Évitez les contaminations, par ex, en utilisant des barrettes stériles voir la date d'expiration; 18 mois à partir de la date de fabrication Tampon de dilution cachetées après ouverture entre 2 et 8 C Jetez les solutions troubles Solution de lavage Concentrez après ouverture entre 2 et 8 C dilution de travail à 2 8 C dilution de travail à température ambiante Les bouteilles utilisées pour effectuer la dilution d'utilisation doivent être régulièrement nettoyées Jetez les solutions troubles voir la date d'expiration; 24 mois à partir de la date de fabrication 6 mois voir la date d'expiration; 24 mois à partir de la date de fabrication 2 semaines 1 semaine Substrat TMB solution prête à l'emploi entre 2 et 8 C, stockez à l'abri de la lumière Évitez les contaminations, par ex, en utilisant des barrettes stériles Jetez la solution si elle devient bleue (extinction à 650 nm contre vis à vis de l'eau distillée > 0,2 DO) voir la date d'expiration; 24 mois à partir de la date de fabrication Solution d'arrêt Après ouverture à température ambiante voir la date d'expiration français 7

51 Pos: 12 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/allgemei ne Hinweise ELISA antig 2 7 PRINCIPLE DU TEST SERION ELISA antigen 71 Remarques générales Seuls les réactifs SERION ELISA antigen doivent être utilisés avec les immunoessais SERION ELISA antigen Les composants ne doivent pas être échangés avec des réactifs provenant d'autres fabricants Le sérum standard et contrôle aussi bien que le conjugué des immunoessais SERION ELISA antigen sont définis exclusivement pour la trousse d'analyse devant être utilisée et ne doit pas être utilisé avec d'autres lots Le tampon de dilution, la solution de lavage, le substrat et la solution d'arrêt peuvent être utilisés pour tous les immunoessais SERION ELISA antigen indépendamment du lot ou l'analyse S'ils sont toujours cachetés et stockés selon les consignes, tous les composants du test SERION ELISA antigen peuvent être utilisés jusqu'à la date d'expiration indiquée sur les étiquettes Les réactifs ne doivent pas être utilisés après la date d'expiration La dilution et la modification des réactifs peuvent entraîner une perte de sensibilité Évitez d'exposer les réactifs à une lumière trop forte lors du stockage et l'incubation Les réactifs doivent être bien fermés après utilisation pour éviter l'évaporation et la contamination Pour ouvrir le sachet en aluminium de la plaque de microtitration, veuillez découper le haut du sachet à l'endroit indiqué, pour que vous puissiez fermer le sachet correctement après utilisation Il ne faut pas utiliser les barrettes si le sachet en aluminium est endommagé ou si le sachet, contenant le reste des barrettes et le déshydratant, n'a pas été correctement refermé Utilisez de techniques aseptiques pour le prélèvement des aliquotes dans les tubes de réactif afin d'éviter la contamination Afin d'éviter les faux positifs, il faut s'assurer de ne pas toucher les parois supérieures des puits ou de les éclabousser lors du pipetage du conjugué Il faut faire attention de ne pas mélanger les bouchons des bouteilles et/ou des flacons En particulier, la solution de substrat TMB est sensible aux substances oxydantes et les ions des métaux lourds Elle doit être conservée à l abri de la lumière en tout temps et ouverte seulement dans des conditions de faible luminosité, juste avant l utilisation Cette solution a une couleur bleu-vert pâle Le contact du substrat avec la peau et la solution d arrêt doit être évité Pour assurer la reproductibilité des résultats des tests, il faut bien mélanger les réactifs Agitez les flacons contenant les sérums de control avant de les utiliser, mais également tous les échantillons après dilution (par ex, à l'aide d'un mélangeur vortex) Assurez-vous de pipeter soigneusement et respectez les durées et températures d'incubation S'il existe une différence de temps importante entre le pipetage du premier et du dernier puits de la plaque de microtitration, lors de la distribution des échantillons et des sérums de contrôle, du conjugué ou du substrat, on peut avoir des durées de pré incubation différentes qui influenceront la précision et la reproductibilité des résultats français 8

52 Pos: 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/pr obenver dünnung/candida antigen: 3 Des résultats optimaux ne seront obtenus que si les consignes sont scrupuleusement respectées L'immunoessai SERION ELISA antigen n'est valable que si les critères de validation, spécifiques au lot en question, et figurant sur le certificat de contrôle de la qualité sont respectés Un nombre suffisant de lavage permet d'éviter les tests non spécifiques Il est donc recommandé de soigneusement effectuer la procédure de lavage Tous les puits à fond plat doivent être remplis avec un volume égal de tampon de lavage À la fin de la procédure, assurez-vous que les puits ne contiennent plus de tampon de lavage afin d'éviter les effets de dilutions incontrôlées Évitez de faire des bulles! FR Prenez soin de ne pas endommager l'inscription (pathogène/ag) figurant sur la plaque de microtitration au cours des étapes de lavage et d'aspiration afin d'éviter les confusions Pos: 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/pr obenvor ber eitung und Lagerung/Candida antigen: Probenvorbereitung und Lager Préparation et stockage de l'échantillon Les échantillons lipémique, hémolytique ou ictérique (sérum ou plasma) doivent être analysés avec réserve seulement Les échantillons qui sont à l'évidence contaminés ne doivent pas être analysés Le sérum ou le plasma (EDTA, citrate, héparine) recueillis selon les procédés standard de laboratoire sont des échantillons convenables 721 Préparation des échantillons Avant d'effectuer le test, les échantillons (échantillon patients, standard et contrôle négatif) (V 1 ) doivent être dilués dans le tampon de dilution (V 2 ) comme suit : V 1 + V 2 = 3+1 ajouter 300 µl échantillon de (V 1 ) chacun à 100 µl de tampon de dilution (V 2 ) Après dilution et avant le pipetage dans la plaque de microtitration, les échantillons doivent être bien mélangés pour obtenir une solution homogène Finalement les échantillons doivent être chauffés à 110 C (+/- 5 C) pendant 10 minutes Il est essentiel de respecter l'heure et la température indiquées! Les récipients du réactif standard ne sont pas adaptés à l'étape de thermolyse et nous recommandons l'utilisation d'un récipient de réaction safe-lock ou semblable avec une fermeture vissée L'utilisation d'un bloc chauffant muni d'un thermostat exige le contrôle de la température avec un thermomètre étalonné Il faut prendre en compte la période de préchauffage spécifique à l appareil du bloc de chauffage Si nécessaire, le bloc de chauffage doit être ajusté à la température requise Au cours de la thermolyse, un précipité nuageux blanc se formera et doit être éliminé par centrifugation dans un centrifuge de paillasse pré-refroidi (4 C) à 10,000 g pendant 10 minutes Le surnageant clair peut ensuite être utilisé dans le test Pos: 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/probenl agerung ELISA antig 3 français 9

53 Pos: 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/r eagenzienvorbereitung ELISA Stockage de l'échantillon Les échantillons patients traités ne doivent pas être stockés pendant plus de 24 heures à 2 8 C Les échantillons non traités ne doivent pas être stockés à 2-8 C pendant plus de 7 jours Un stockage prolongé est possible à -20 C Évitez les cycles de congélation et décongélation des échantillons 73 Préparation des réactifs de la trousse Tous les réactifs doivent être à température ambiante avant leur utilisation 731 Barrettes de test pour la microtitration Les barrettes de test pour la microtitration sont emballées dans un sachet en aluminium avec un produit déshydratant Enlevez seulement les puits dont vous avez besoin de la plaque et replacez le reste dans le sachet en aluminium Refermez soigneusement le sachet pour qu'il soit étanche à l'air 732 Sérum de contrôle / Sérum standard Les sérums contrôle et standard doivent être dilués avec le tampon d échantillon et ultérieurement dénaturé Pour chaque cycle de test, indépendamment du nombre de barrettes de test de microtitration devant être utilisé, les sérums de contrôle et standard doivent être mis dans la plaque Le sérum standard doit être mis en double 733 Conjugué (prêt à l'emploi) Il fait éviter de contaminer le conjugué prêt à l'emploi, par ex, en utilisant des embouts stériles 734 Solution de lavage Diluez le concentré de tampon de lavage (V 1 ) 1:30 avec de l'eau distillée jusqu'à un volume final de V 2 Exemple : 735 Substrat TMB (prêt à l'emploi) Concentré de tampon (V 1 ) Volume final (V 2 ) 25 ml 750 ml 1 ml 30 ml Il fait éviter de contaminer le substrat prêt à l'emploi, par ex, en utilisant des embouts stériles Le substrat TMB a une couleur bleu-vert pâle et toute solution qui démontre une coloration forte (densité optique à 650 nm par rapport à l eau distillée >0,2 DO) doit être jetée 736 Solution d'arrêt (prêt à l'emploi) Pos: 17 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/testdurchführung/testablauf/überschrift 2 français 10

54 Pos: 18 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/t establauf/testablauf Candida Pos: 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/testdurchführ ung/c andi da antigen: Manuelle Testdurchführ Aperçu général - Procédure de test SERION ELISA antigen Candida quantitatif Préparation des échantillons, contrôle et sérum standard Dilution de l échantillon (Échantillons patient, contrôle et sérum standard) 300 µl d échantillon µl tampon de dilution FR INCUBATION 10 min / 110 C CENTRIFUGATION 10 min / 10,000 g / 4 C Gardez le surnageant, jetez le culot Ajoutez le surnageant à partir des échantillons (100 µl) INCUBATION 60 min / 37 C chambre humide LAVAGE (5 x 300 µl DIL WASH ) Pipetez la solution conjuguée PODCR (100 µl) INCUBATION 60 min / 37 C chambre humide LAVAGE (5 x 300 µl DIL WASH ) Pipetez la solution de substrat TMB (100 µl) INCUBATION 30 min / 37 C chambre humide Pipetez la solution d'arrêt STOP (100 µl) LISEZ LA DENSITÉ OPTIQUE à 450 nm (réf 650 nm) français 11

55 Pos: 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/automatische T Procédure de test manuel 1 Le prétraitement des échantillons (échantillons patient, standard, sérum de contrôles) tel que décrit 2 Placez le nombre de puits dont vous avez besoin dans le cadre et préparez une feuille de protocole 3 Ajoutez chaque 100 µl de surnageant provenant des standards de sérum (en double), le contrôle négatif et les échantillons patients dans les puits appropriés des bandelettes de microtitration Laissez un puits pour le blanc du substrat, par ex, Candida antigen quantitatif puits A1 puits B1 puits C1 puits D1 Blanc du substrat Contrôle négatif Sérum standard Sérum standard puits E1 Échantillon patient 1 4 Incubation de l'échantillon pendant 60 minutes (+/- 3 min) à 37 C (+/- 1 ) dans une chambre humide 5 Après incubation lavez tous les puits avec une solution de lavage (avec un laveur automatisé ou manuellement) : - aspirez ou agitez la solution d'incubation - remplissez chaque puits avec 300 µl de solution de lavage - aspirez ou agitez le tampon de lavage - refaites le lavage 4 fois (en tout 5 fois!) - séchez la plaque de microtitration en la tapant sur un mouchoir en papier 6 Ajout du conjugué Ajoutez 100 µl de conjugué prêt à l'emploi aux puits appropriés (sauf le blanc du substrat) 7 Incubation du conjugué pendant 60 minutes (+/- 3 min) à 37 C (+/- 1 ) dans une chambre humide 8 Après incubation, lavez tous les puits avec la solution de lavage (voir plus haut) 9 Ajout de substrat Ajoutez 100 µl de solution de substrat TMB prête à l'emploi à chaque puits (y compris le puits pour le blanc de substrat!) 10 Incubation du substrat pendant 30 minutes (+/- 1 min) à 37 C (+/- 1 C) à l abri de la lumière dans une chambre humide 11 Arrêt de la réaction Ajoutez 100 µl de solution d'arrêt à chaque puits Agitez doucement la plaque de microtitration pour mélanger 12 Lecture de la densité optique Lisez la densité optique (DO) dans les 60 minutes à 450 nm par rapport à un blanc de substrat, longueur de référence entre 620 nm et 690 nm (ex 650 nm) français 12

56 Pos: 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/positi vkontrolle / Richtig 2 Pos: 22 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: T ESTAU SWERTUN G Procédure de test automatisée SERION ELISA est compatible avec un traitement sur automate et a été évalué quant à son utilisation avec Immunomat TM et Gemini Le traitement automatique est effectué de façon analogue à l'utilisation manuelle Veuillez noter que dans des conditions de manipulation particulières, il peut s'avérer nécessaire d'adapter les temps d'incubation selon le laboratoire 77 Contrôle positif / Contrôle de la précision FR Pour la vérification périodique du procédé de test, pour satisfaire aux exigences des systèmes de gestion de la qualité internes des laboratoires, nous recommandons l'utilisation des SERION ELISA controls afin de déterminer la précision et la précision des cycles de test du SERION ELISA antigen L'utilisation des SERION ELISA controls est décrite dans les modes d'emploi spécifiques français 13

57 Pos: 23 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estauswertung: Ein- Punkt- Quantifizier 2 Pos: 24 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estg ültig keitskriteri 2 8 ÉVALUATION DU TEST SERION ELISA antigen Candida 81 Quantification en un point selon la méthode 4PL La transformation optimisée des signaux d'extinction en valeurs quantitatives est assurée par les fonctions non linéaires, qui permettent d'ajuster une courbe sigmoïde sans autres transformations des valeurs de DO La détermination des concentrations d'antigènes avec le SERION ELISA antigen est effectuée par le modèle logistique logarithmique à 4 paramètres (4 PL) qui est idéal pour l'ajustement de courbe Il est basé sur la formule : DO = A e D - A B(C - ln Conc) Les paramètres A, B, C et D sont représentatifs de la forme exacte de la courbe : 1 asymptote inférieure paramètre A 2 gradient de la courbe paramètre B 3 point d'inflexion paramètre C 4 asymptote supérieure paramètre D Pour chaque lot, la courbe de référence est évaluée par l'institut Virion\Serion GmbH (Würzburg, Allemagne) dans des cycles d'analyse dans des conditions optimales On épargne ainsi à l'utilisateur le temps qu'il aurait consacré à tracer cette courbe ainsi que les coûts qui y sont liées En ce qui concerne l'évaluation des concentrations d'antigènes, une courbe spécifique au lot ainsi qu'un tableau d'évaluation spécifique au lot sont fournis avec la trousse de test SERION ELISA antigen Le logiciel d'évaluation SERION evaluate et l'outil logiciel basé sur Microsoft Excel SERION activity sont disponibles sur demande Afin de compenser les variations normales du test mais également pour le contrôle du test, un sérum de référence est utilisé dans chaque cycle de test Pour ce sérum de contrôle, une valeur de référence avec une fourchette de validité est déterminée par le contrôle de la qualité du fabricant Dans ces limites, une bonne quantification de la concentration d'antigènes est assurée français 14

58 Pos: 25 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/auswertung: Ü 2 Pos: 26 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/nichtautomatisi erte Auswertung ELISA Critères de validité - Le blanc du substrat doit avoir une DO < 0,25 - Le contrôle négatif doit donner un résultat de test négatif - Avec l'utilisation des tests SERION ELISA antigen la valeur de DO moyenne (après soustraction du blanc du substrat!) du sérum standard doit être dans les limites de la fourchette de validité, qui est indiqué sur le certificat de contrôle de la qualité spécifique au lot - La variation des valeurs de DO du sérum standard ne doit pas dépasser 20 % FR En cas de non respect de ces critères, le test n'est pas valide et doit être refait 83 Calcul SERION ELISA antigen Candida 831 Évaluation non-automatisée Pour l'évaluation du test SERION ELISA antigen, un certificat de contrôle de la qualité lotspécifique avec une courbe d'étalonnage et un tableau d'évalaution sont inclus dans la trousse de test Le blanc du substrat doit être soustrait des valeurs de DO avant l'évaluation Pos: ELISA antigen/gültig Methoden alle 11\mod_ _23doc Dokumente/ELISA Méthode 1 : Évaluation quantitative Pour établir les fourchettes de seuil, multipliez la valeur moyenne du DO standard mesuré avec les données numériques du certificat de contrôle de la qualité (voir les formules des cas spéciaux), par ex : OD = 0,502 x PM(STD) avec limite supérieure OD = 0,352 x PM(STD) avec limite inférieure Si la valeur d'absorbance moyenne mesurée du sérum standard est DO 0,970, la fourchette du seuil est de 0,341 à 0,487 DO français 15

59 Pos: 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/automatische 3 Méthode 2 : Détermination en continue des activités antigéniques avec l'aide de la courbe de référence Les variations entre les tests (déviations de jour en jour et déviations entre laboratoires) sont compensées par multiplication de la valeur mesurée obtenue avec un échantillon de patient avec le facteur de correction F Ce facteur est calculé comme suit : F = valeur de référence de DO (du sérum standard) valeur réelle de DO (du sérum standard) Cette procédure est nécessaire pour ajuster le niveau réel du test de l'utilisateur avec la courbe de référence spécifique au lot Premièrement, les déviations journalières doivent être corrigées en calculant le facteur de correction F 1 La moyenne des deux valeurs de DO du sérum standard doit être calculée et il faut vérifier que cette valeur est dans les limites de la fourchette de validité 2 Calcul du facteur F : la valeur de référence donnée est divisée par la moyenne de l'extinction du sérum standard : F = valeur de référence d'extinction du sérum STD / valeur moyenne d'extinction du sérum STD 3 Toutes les valeurs mesurées pour les échantillons du patient sont multipliées par F 4 Les activités antigéniques en UI/ml ou U/ml peuvent être déterminées à partir de la courbe de référence, avec des valeurs corrigées français 16

60 Pos: 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/quantifizi 2 Pos: 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa 2 Pos: 31 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: Inter pretati on der Évaluation automatique du test avec le logiciel SERION evaluate Après saisi des quatre paramètres et de la valeur de référence du sérum standard, les activités des anticorps sont calculées enligne à partir de cycles de test de SERION ELISA antigen, traités et mesurés, par le logiciel d'évaluation SERION evaluate Si la densité optique du standard est hors des limites de validité, le message suivant apparaîtra Valeurs de référence hors limite pour les groupes suivants : Groupe 1-24 ou Valeurs de référence diffère de plus de 20 % dans les groupes suivants : Groupe 1-24 FR Dans ces cas, le cycle de test n'est pas valide et doit être refait Les paramètres et la valeur de référence doivent être modifiés seulement s'il y a un changement de lot (le tableau d'évaluation contient les paramètres et les valeurs de référence) La saisie correcte des données spécifiques au lot peut être vérifiée la base de l'activité du sérum standard (en UI/ml ou U/ml) attribuée au sérum standard La valeur moyenne calculée des unités doit correspondre à la valeur unitaire indiquée sur le certificat spécifique au lot Une correction automatique des valeurs mesurées est effectuée Dans la version standard, les affichages à la sortie de l'imprimante sont les suivants : Code d'échantillon Valeur de la DO U/ml Évaluation 84 Limites de la quantification Les limites de quantification sont mentionnées sur le certificat de contrôle de la qualité du test SERION ELISA antigen La linéarité de la dilution dans les limites de cette fourchette a été démontrée lors des études d'évaluation complètes Dans le cas où l'échantillon du patient donne un résultat au dessus de la limite supérieure de quantification, l'échantillon peut être testé à une dilution plus élevée L'activité de l'antigène ainsi déterminée doit être multipliée par un facteur de dilution additionnel 85 Fourchette limite La limite de la fourchette du test SERION ELISA antigen Candida est mentionnée sur le certificat de contrôle de la qualité et indique la fourchette pour les résultats limites des tests Les valeurs obtenues, lors de l'analyse de l'échantillon du patient, qui sont en dessous de cette fourchette indiquent un résultat de test négatif; les valeurs qui sont au dessus sont interprétées comme des résultats positifs Dans les cas où les résultats sont des la fourchette limite, une interprétation définitive du résultat n'est pas possible Dans de tels cas, le test doit être refait en parallèle avec un échantillon de suivi prélevé une ou deux semaines plus tard (paire de sérum) français 17

61 Pos: 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: R eferenzber eich gesunder Pr 2 Pos: 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift Leistungsmer Interprétation des résultats Pos: 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estauswertung/candi da antigen/candi da antig en: Interpr etation der Ergebni Les résultats positifs des tests pour les échantillons patients indiquent une fungemie à Candida Les résultats ne peuvent être interprétés qu'en association avec un tableau clinique et d'autres méthodes de détection Un résultat peut être considéré comme positif lorsqu'au moins 2,6 unités sont mesurées dans le test Un tel test indique que l échantillon contient la quantité de mannane qui est associée avec 2,6 ng de la protéine de Candida Cependant, il ne fait pas la distinction entre les organismes vivants et morts, respectivement Les résultats de tests négatifs n'excluent pas une infection aiguë, spécialement si des titres d'anticorps élevés sont présents Dans de tels cas, il se peut que l'antigène soit complètement masqué par les anticorps et même la procédure dénaturante au cours de la préparation de l'échantillon n'est pas suffisante pour permettre la détection de l'antigène En outre, le moment au cours de l'infection auquel l'échantillon est obtenu, un échantillon non adéquat, une piètre préparation de l échantillon ou un mauvais stockage peuvent entraîner un résultat négatif 87 Fourchette de références des personnes en bonne santé Pos: 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estauswertung/candi da antigen/candi da antig en: R efer enzbereich g esunder Des tests dans des échantillons de sérum aléatoires provenant de donneurs de sang, prélevés dans la région du sud de l'allemagne, avec le test SERION ELISA antigen Candida nous donne la distribution suivante Sur les 103 sérums testés avec le test SERION ELISA antigen Candida, 92 (89,3 %) étaient négatifs, six sérums (5,8 %) ont donné un résultat positif et cinq échantillons (4,9 %) étaient limites 9 CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE antigen/leistungsmerkmale/kapitelüberschrift: 8\mod_ _23doc Pos: 36 /Arbeitsanleitungen Sensitivität für alle Dokumente/ELISA und 91 Sensibilité et Spécificité Pos: 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Leistungsmer kmale/candi da antig en/candi da antig en: Sensiti vität und Le test SERION ELISA antigen Candida a été validé par l analyse de 148 échantillons de sérums provenant de donneurs de sang et 93 échantillons provenant de patients, qui ont démontré des signes de candidiose au cours du traitement en soins intensif, en comparaison avec les résultats obtenus avec un test disponible dans le commerce d un fabricant européen important Les sérums classés comme limites n'ont pas été inclus dans le calcul des valeurs de la sensibilité et de la spécificité Caractéristiques de performance Sensibilité Spécificité SERION ELISA antigen Candida > 99,9 % 97,8 % Dans une autre étude, la réactivité croisée avec les espèces Candida guillermondii, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis et Candida tropicalis avec le SERION ELISA antigen Candida a été démontrée afin de garantir un diagnostic de Candida complet français 18

62 Pos: 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift Pr äzisi 2 Pos: 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/allgemeine T exte ELISA 122 Étant donné la similiarité de la mannanne avec l hydroxyéthylamidon (HES), qui est utilisé dans le remplissage du plasma pour le traitement de déficiences circulatoires (hypovolémique, hémorrhagique et choc septique), une réactivité potentielle a été évaluée Cependant, aucune réactivité croisée avec HES n était mesurable avec le test SERION ELISA antigen Candida 92 Reproductibilité Pos: 39 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Leistungsmer kmale/candi da antig en/candi da antig en: Pr La reproductibilité entre les essais a été déterminée en analysant des sérums ayant réactivités différentes, 20 fois dans un même test La reproductibilité inter- essais a été déterminée en analysant des sérums ayant réactivités différentes, lors de 10 tests indépendants FR Écart type Coefficient de Variation (CV %) = x 100 Valeur moyenne SERION ELISA antigen Candida : Échantillon Valeur moyenne (DO) Intra-essai (CV %) Valeur moyenne (DO) Inter-essai (CV %) négatif 0,223 9,6 0,225 7,3 limite 0,507 2,4 0,476 5,3 positive 1,413 2,5 1,356 2,7 positive 2,851 2,0 2,442 8,1 français 19

63 Pos: 41 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/liter atur /Kapi tel überschrift: MESURES DE SÉCURITÉ 101 Mises en garde Le SERION ELISA antigen est conçu pour être utilisé par un personnel compétent qui est familier avec les bonnes pratiques de laboratoire Tous les réactifs de la trousse et les spécimens humains doivent être manipulés avec précaution, en usant des bonnes pratiques de laboratoire - Cette trousse contient des composants du sang humain Même si tous les sérums de contrôle et de seuil sont négatifs pour l'anticorps anti-vih, HBs-Ag (Antigène de surface du virus de l'hépatite B) et l'anticorps anti-vhc, ils doivent être considérés comme potentiellement infectieux - Ne pas pipeter à la bouche - Il ne faut pas fumer, consommer de la nourriture ou des boissons dans les endroits où les réactifs de la trousse ou les échantillons sont manipulés - Utilisez des gants jetables et portez un sarreau et des lunettes de protection lors de la manipulation des réactifs de la trousse ou des échantillons Lavez-vous bien les mains après la manipulation - Les échantillons de patient et autres produits potentiellement infectieux doivent être décontaminés après le cycle de test - Les réactifs doivent être stockés dans un endroit sûr et doivent être inaccessibles pour les personnes non autorisées, comme des enfants 102 Élimination Veuillez respecter les dispositions légales pertinentes! français 20

64 === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt === 11 RÉFÉRENCES Pos: 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Liter atur/c andida antigen: [1] Fegeler, W (1992) Möglichkeiten einer differenzierten Candida-Serologie Pilzdialog 4, 61-2 [2] Fegeler, W, Kipp, F (2004) Candida- und Aspergillus-Antikörper-ELISA Erwartungs-werte positiver Antikörpernachweise aus Seren der klinischmykologischen Routine-diagnostik Mycoses 47, 41 7 [3] Fukazawa, Y (1989) Antigenic structure of Candida albicans Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts Immunol Serol 47, [4] Jones, JM (1990) Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis Clin Microbiol Rev 3, [5] Matthews, RC, Burnie, JP, Tabaqchali, S (1987) Isolation of Immunodominant Antigens from Sera of Patient with Systemic Candidiasis and Characterization of Serological Response to Candida albicans J Clin Microbiol 25, [6] Müllensiefen, M, Ringelmann, R (1991) Labor-Diagnostik systemischer Candidosen Lab med 15, [7] Repentigny, L (1989) Serological Techniques for Diagnosis of Fungal Infections Eur J Clin Microbio Infec 8, [8] Robert Koch-Institut (2008) Epidemiologisches Bulletin 29 [9] Ruhnke, M, Rosseau, S, Graf, B (2004) Invasive Pilzinfektionen auf der Intensivstationen Arzneimitteltherapie 22, [10] Rüchel, R, Debusmann, F (2008) Serologie in der Diagnostik von Mykosen Chemother J 17, [11] Sendid, B, Poirot, JL, Tabouret, M, Bonnin, A, Caillot, D, Camus, D, Poulain, D (2002) Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species Med Microbiol 51, [12] Sendid, B et al (2006) Candidaemia and antifungal therapy in a French University Hospital: rough trends over a decade and possible links Infect Dis 6, 80 [13] Tietz, H-J, Tausch, I (1993) Differenzierte Candidaserologie auf dem Prüfstand Pilzdialog 4, 55-6 FR [14] Walsh, TJ et al (1991) Detection of Circulating Candida Enolase by Immunoassay in Patients with Cancer and Invasive Candidiasis New Engl J Med 324, [15] Werle, E, Kappe, R, Fiehn, W, Sonntag, H-G (1994) Nachweis von Anti- Candida-Antikörpern der Klassen IgM, IgG und IgA mittels Enymimmunoassays in sequentiellen Serumproben hospitalisierter Patienten Mycoses 36, 71-8 [16] Zöller, L, Krämer, I, Kappe, R, Sonntag, HG (1991) Enzyme Immuno Assay for Invasive Candida Infections: Reactivity of somatic Antigens of Candida albicans J Clin Microbiol 29, français 21

65

66 SERION ELISA antigen Candida INDICE 1 CAMPO DI APPLICAZIONE 2 RILEVANZA DIAGNOSTICA 3 SERION ELISA antigen - PRINCIPIO DEL TEST 4 COMPONENTI DEL KIT 5 MATERIALI NECESSARI, MA NON FORNITI 6 CONSERVAZIONE E STABILITÀ 7 PROCEDURA PER IL TEST SERION ELISA antigen 71 Considerazioni generali 72 Preparazione e conservazione dei campioni 73 Preparazione dei reagenti del kit 74 Schema riassuntivo della procedura ra 75 Procedura di analisi manuale 76 Procedura automatica 77 Controllo positivo / controllo di accuratezza IT 8 VALUTAZIONE DEL TES 81 Quantificazione a singolo punto con il metodo 4PL 82 Criteri di validità 83 Calcolo SERION ELISA antigen Candida 84 Limiti di quantificazione 85 Zona grigia 86 Interpretazione dei risultati 87 Valori di riferimento negli individui sani 9 CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE 91 Sensibilità e specificità 92 Riproducibilità 10 MISURE DI SICUREZZA 101 Avvertenze 102 Smaltimento 11 BIBLIOGRAFIA versione attuale nr: V 112/09-1 versione precedente: --

67 Pos: 1 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/allgemei ne Texte ELISA antigen/einl eitung " Enzymimmunoassay" C andi da SERION ELISA antigen Candida Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione dell antigene Candida per uso diagnostico in vitro Pos: 2 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/bestellnummer n/c andida antigen: Bestell SERION ELISA antigen Candida N di ordinazione: ESR200 Pos: antigen/allgemeine 8\mod_ _33doc 3 /Arbeitsanleitungen Texte antigen/kapitelüberschrift 1 für alle Dokumente/ELISA 1 CAMPO DI APPLICAZIONE Pos: 4 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/anwendungsbereich/c andi da antigen: SERION ELISA antigen Candida è un dosaggio immunoenzimatico quantitativo e qualitativo per la determinazione nel siero umano o plasma dell antigene Candida Il dosaggio è indicato per la diagnosi della candidosi sistemica antigen/allgemeine Bedeutung" Pos: 5 8\mod_ _33doc Texte ELISA antigen/kapitelüberschrift alle 1 Dokumente/ELISA "Diagnostische 2 RILEVANZA DIAGNOSTICA Pos: 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/di agnostische Bedeutung/Candida antigen: Diag nostische albicans è un lievito ubiquitario appartenente, come tutte le specie di Candida, alla famiglia dei miceti lievitiformi Le varianti morfologiche dei miceti lievitiformi comprendono i lieviti, che causano principalmente infezioni superficiali, e i cosiddetti pseudomiceli Gli elementi germinali e lo sviluppo di pseudomiceli si osservano soprattutto in caso di micosi invasiva La Candida produce e secerne diversi enzimi distruttivi che consentono al microrganismo patogeno facoltativo di attraversare le barriere mucose e le barriere dei vasi sanguigni Candida ssp si trasmette soprattutto attraverso il contatto tra soggetto e soggetto e la principale via di ingresso nell organismo è la cavità orale Le alterazioni delle proprietà fungistatiche della pelle, che sono mediate dal ph leggermente acido e dalla flora batterica antagonista, possono favorire una candidiasi cutanea superficiale La micosi sistemica è dovuta alla colonizzazione delle mucose, in particolare del tratto gastrointestinale Candida ssp aderisce agli epiteli di svariate mucose grazie alle proteine di adesione e ad altre strutture della superficie cellulare Lo schema seguente riporta le fasi ipotetiche che possono causare infezioni disseminate in caso di gravi patologie concomitanti Non è possibile una descrizione precisa delle varie fasi (Fig 1) italiano 2

68 Colonizzazione del tratto naso-faringeo Passaggio nel lume gastrico Passaggio nel lume intestinale Ingresso nella circolazione ematica Passaggio nel sistema linfatico Persorpzione delle cellule di Candida Invasione di organi multipli IT Figura 1: Progressione dell infezione da Candida La candidiasi può essere suddivisa in due categorie principali, le cui caratteristiche sono riportate nella tabella seguente superficiale Infezioni da Candida micosi profonda (invasiva) localizzazione cute, mucosa organi principali immunocompetenza dell ospite fattori di rischio progressione clinica + +,-/- gravidanza diabete AIDS disfunzione cutanea scarsa igiene orale innocua nella maggior parte dei casi, nessun pericolo di vita chemioterapia immunosoppressione iatrogena catetere venoso centrale radioterapia ustioni di grado elevato interventi chirurgici potenzialmente fatale nella maggior parte dei casi terapia terapia efficace l efficacia della terapia dipende dallo stadio dell infezione Tabella 1: Caratteristiche dell infezione da Candida italiano 3

69 La diagnosi sierologica delle candidiasi è particolarmente difficile: da un lato, una colonizzazione transitoria dei lieviti può indurre una risposta anticorpale, mentre dall altro lato una micosi sistemica da Candida in pazienti immunosoppressi può comportare solo variazioni minime dell attività anticorpale Queste situazioni rendono necessaria un interpretazione critica dei risultati sierologici Inoltre, non sempre le infezioni sistemiche da Candida causano sintomi tipici Attualmente, i risultati di test differenti per il rilevamento degli anticorpi anti-candida non sono né equivalenti, né tanto meno intercambiabili La specificità degli anticorpi rilevati dipende in misura significativa dal tipo di test (ELISA o emoagglutinazione, HAT) o dalla preparazione antigenica utilizzata Con il test HAT, gli anticorpi IgM sono più facilmente rilevabili delle IgG grazie alle maggiori proprietà agglutinanti delle molecole IgM Con il test HAT si rilevano soprattutto gli anticorpi diretti contro antigeni della parete cellulare dei miceti lievitiformi; ciò complica ulteriormente l interpretazione dei dati sierologici, ma consente anche una differenziazione Le variazioni delle concentrazioni anticorpali possono essere rilevabili con il test ELISA, ma non con HAT; è quindi opportuno combinare i due metodi, ad esempio in caso di attività anticorpale IgM decrescente e contemporanea attività IgG crescente Attualmente non esiste alcun metodo singolo che consenta una diagnosi sierologica definitiva della candidiasi La sorveglianza dei pazienti a rischio e il controllo della terapia richiedono l impiego di metodi diversi, comprendenti la sierologia e la determinazione antigenica Il test SERION ELISA antigen Candida è particolarmente utile in questi casi, perché consente di determinare un antigene specifico di Candida nei campioni dei pazienti antigen/testprinzip/testprinzip Pos: 1 ELISA ELISA für 8\mod_ _33doc alle 3 SERION ELISA antigen - PRINCIPIO DEL TEST Il test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) è un immunodosaggio particolarmente indicato per la determinazione degli anticorpi nel campo della sierologia infettiva La reazione si basa sull interazione specifica degli anticorpi con gli antigeni corrispondenti Le strisce reattive della piastra per microtitolazione del test SERION ELISA antigen sono rivestite con anticorpi specifici diretti contro l agente patogeno di interesse Se il campione del paziente contiene l antigene, questo si lega agli anticorpi fissati sulle strisce Un anticorpo secondario, coniugato con l enzima perossidasi, rileva e lega gli immunocomplessi Il substrato incolore perossido di idrogeno (H 2 O 2 ) e il cromogeno tetrametilbenzidina (TMB) vengono convertiti in una sostanza di colore blu L aggiunta della soluzione di arresto fa virare il colore verso il giallo L intensità di segnale del prodotto della reazione è proporzionale alla concentrazione dell antigene nel campione e viene misurata con metodo fotometrico Pos: 8 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Inhalt und Zusammensetzung/Candida antigen: Inhalt und 1 italiano 4

70 4 COMPONENTI DEL KIT Componenti del test Pezzi / volume Strisce reattive per microtitolazione separabili, ciascuna con otto pozzetti singoli rivestiti da anticorpo, (in totale 96) MTP, 1 telaio 12 pezzi Siero standard STD, antigene Candida albicans in siero umano supplementato con siero fetale bovino (FCS); negativo per anti-hiv Ab, HBs-Ag (antigene di superficie del virus dell epatite B) e anti-hcv Ab; conservante: sodio azide < 0,1% 3 x 3 ml IT Siero di controllo negativo NEG, siero umano supplementato con siero fetale bovino (FCS); negativo per anti-hiv Ab, HBs-Ag (antigene di superficie del virus dell epatite B) e anti-hcv Ab; conservante: sodio azide < 0,1% 2 x 3 ml Coniugato anti-candida albicans (pronto per l uso) PODCR, anticorpi anti-candida albicans coniugati con perossidasi di rafano, stabilizzati con soluzione stabilizzante per proteine contenente un detergente; conservanti: ProClin % 13 ml Soluzione di lavaggio concentrata (sufficiente per 1500 ml) WASH, soluzione salina in tampone TRIS con Tween 20; concentrato 30x; conservante: ProClin 300 < 0,1 % 2 x 25 ml Tampone di diluizione SAMB, soluzione acida senza conservanti 15 ml Soluzione di arresto STOP, 0,5 N acido solforico 13 ml Soluzione substrato TMB (pronta per l uso) TMB, soluzione substrato TMB-perossido di idrogeno, conservante: Kathon CG < 0,01% 13 ml Certificato di controllo qualità con curva standard e tabella interpretativa INFO, (quantificazione dell antigene in U/ml) 2 pezzi Pos: 9 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/zusätzlich benötigte Materialien/Zusätzlich benötigte 1 italiano 5

71 5 MATERIALI NECESSARI, MA NON FORNITI - normale equipaggiamento di laboratorio - fotometro per piastre da microtitolazione con filtro, lunghezza d onda 450 nm, lunghezza d onda di riferimento consigliata 620 nm nm (ad es 650 nm) - incubatore a 37 C - blocco termico 110 C - camera umida - acqua distillata - Click-Clips (n di ordinazione VT120) Pos: 10 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/lagerung und Haltbarkeit/Lagerung und 1 italiano 6

72 Pos: 11 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/ü berschrift: D 1 6 CONSERVAZIONE E STABILITÀ Reagente Conservazione Stabilità Strisce per microtitolazione (rivestite con anticorpi) non aperto dopo l apertura a 2 8 C nella busta di alluminio chiusa, con essiccante Le strisce non utilizzate devono essere conservate all asciutto e a tenuta d aria nella sacca di alluminio chiusa vedere data di scadenza; validità minima: 4 settimane; validità in caso di uso e conservazione corretti fino alla data di scadenza Sieri di controllo / sieri standard dopo l apertura, a 2 8 C vedere data di scadenza; 24 mesi dalla data di produzione IT Coniugato soluzione pronta per l uso a 2-8 C Tampone di diluizione non aperto Evitare le contaminazioni, ad es utilizzando puntali sterili dopo l apertura, a 2 8 C Eliminare le soluzioni torbide Soluzione di lavaggio Concentrata dopo l apertura a 2 8 C alla diluizione di lavoro a 2 8 C alla diluizione di lavoro a temperatura ambiente I flaconi usati per le diluizioni di lavoro devono essere lavati regolarmente Eliminare le soluzioni torbide vedere data di scadenza; 18 mesi dalla data di produzione vedere data di scadenza; 24 mesi dalla data di produzione 6 mesi vedere data di scadenza; 24 mesi dalla data di produzione 2 settimane; 1 settimana Substrato TMB soluzione pronta per l uso a 2-8 C, al riparo dalla luce Evitare le contaminazioni, ad es utilizzando puntali sterili Eliminare la soluzione se vira verso il blu (estinzione a 650 nm contro acqua distillata > 0,2 OD) vedere data di scadenza; 24 mesi dalla data di produzione Soluzione di arresto Dopo l apertura, a temperatura ambiente vedere data di scadenza italiano 7

73 7 PROCEDURA PER IL TEST SERION ELISA antigen Pos: 12 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/allgemei ne Hinweise ELISA antig Considerazioni generali Utilizzare esclusivamente i reagenti SERION ELISA antigen con gli immunodosaggi SERION ELISA antigen I componenti non devono essere sostituiti con reagenti di altri produttori I sieri standard, i sieri di controllo e il coniugato degli immunodosaggi SERION ELISA antigen sono destinati esclusivamente all uso con il kit corrispondente e non devono essere utilizzati con altri lotti Il tampone di diluizione, la soluzione di lavaggio, il substrato e la soluzione di arresto possono essere utilizzati con tutti gli immunodosaggi SERION ELISA antigen, indipendentemente dal numero di lotto e dal test Finché sono chiusi e conservati correttamente, tutti i componenti dei test SERION ELISA antigen possono essere utilizzati fino alla data di scadenza riportata sulle etichette I reagenti non devono essere utilizzati dopo la data di scadenza La diluizione o qualsiasi modifica apportata ai reagenti può comportare una perdita di sensibilità Non esporre i reagenti alla luce intensa durante la conservazione e l incubazione Dopo l uso, i reagenti devono essere chiusi saldamente per evitare l evaporazione e la contaminazione Per aprire la busta di alluminio della piastra per microtitolazione, tagliare solo l estremità del lato appositamente contrassegnato, per poter richiudere correttamente la busta Non utilizzare le strisce se la busta di alluminio risulta danneggiata o se la busta contenente le strisce rimanenti e l agente essiccante non è stata richiusa correttamente Per evitare contaminazioni, utilizzare tecniche asettiche per prelevare aliquote dalle provette dei reagenti Per evitare risultati falsamente positivi, prestare attenzione a non toccare o bagnare con la pipetta la parte superiore delle pareti dei pozzetti quando si dispensa il coniugato Prestare attenzione a non scambiare i tappi dei flaconi e/o dei flaconcini In particolare, la soluzione substrato TMB è sensibile alle sostanze ossidanti e agli ioni dei metalli pesanti Deve sempre essere conservata al riparo dalla luce e aperta solo in un ambiente poco illuminato immediatamente prima dell uso La soluzione ha un colore bluverde chiaro Evitare il contatto cutaneo con il substrato e la soluzione di arresto Per ottenere risultati riproducibili, mescolare con cura i reagenti Prima dell uso, agitare i contenitori dei sieri di controllo e tutti i campioni dopo la diluizione (ad es utilizzando un vortex) Pipettare con attenzione e attenersi ai tempi e alle temperature di incubazione indicati Se, quando si dispensano i campioni e i sieri di controllo, il coniugato o il substrato, trascorre un arco di tempo significativo tra la pipettata nel primo pozzetto e la pipettata nell'ultimo italiano 8

74 Pos: 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/pr obenver dünnung/candida antigen: 3 pozzetto della piastra da microtitolazione, possono derivarne tempi di pre-incubazione differenti, con conseguenti effetti sulla precisione e sulla riproducibilità dei risultati Solo attenendosi scrupolosamente alle istruzioni è possibile ottenere risultati ottimali L immunodosaggio SERION ELISA antigen è valido solo se vengono rispettati i criteri di validazione specifici per ogni lotto, riportati nel certificato di controllo qualità Un lavaggio corretto consente di evitare risultati non specifici Pertanto, la procedura di lavaggio deve essere effettuata con cura Riempire tutti i pozzetti a fondo piatto con volumi uguali di tampone di lavaggio Al termine di questa procedura, assicurarsi che non rimangano residui del tampone di lavaggio nei pozzetti, per evitare effetti di diluizione incontrollabili Evitare la formazione di schiuma! Per evitare confusioni, prestare attenzione a non danneggiare la scritta (agente patogeno / AG) sulle strisce reattive per microtitolazione durante le procedure di lavaggio e aspirazione IT Pos: 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/pr obenvor ber eitung und Lagerung/Candida antigen: Probenvorbereitung und Lager Preparazione e conservazione dei campioni I campioni lipemici, emolitici o itterici (siero o plasma) devono sempre essere analizzati con cautela Campioni contaminati non devono essere analizzati Sono campioni idonei i campioni di siero o plasma (EDTA, citrato, eparina) prelevati secondo le metodiche standard di laboratorio 721 Preparazione dei campioni Prima dell analisi, i campioni (campioni dei pazienti, standard e controlli negativi) (V 1 ) devono essere diluiti nel tampone di diluizione (V 2 ) nel modo seguente: V 1 + V 2 = 3+1 aggiungere 300 µl di campione (V 1 ) a ogni 100 µl di tampone di diluizione (V 2 ) Dopo la diluizione e prima di dispensare i campioni nella piastra per microtitolazione, i campioni devono essere miscelati con cura per ottenere una soluzione omogenea Infine, i campioni devono essere riscaldati a 110 C (+/- 5 C) per 10 minuti È essenziale attenersi alle temperature e ai tempi indicati! I contenitori standard per reagenti non sono indicati per la termolisi; si consiglia l uso di contenitori safe-lock o di contenitori simili con tappo a vite Se si utilizza un blocco termico, la temperatura deve essere controllata con un termometro calibrato Tenere in considerazione la fase di preriscaldamento specifica del blocco termico utilizzato Se necessario, il blocco termico deve essere regolato sulla temperatura richiesta Durante la termolisi si formerà un precipitato bianco torbido, che deve essere rimosso tramite centrifugazione a g per 10 minuti in una centrifuga da banco refrigerata (4 C) Il sovranatante limpid può quindi essere utilizzato nel test Pos: 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/probenl agerung ELISA antig 3 italiano 9

75 Pos: 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/r eagenzienvorbereitung ELISA Pos: 17 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/t establauf/überschrift T Conservazione dei campioni I campioni trattati non devono essere conservati per più di 24 ore a 2 8 C I campioni non trattati non devono essere conservati per più di 7 giorni a 2-8 C Per una conservazione più lunga, congelare i campioni a 20 C Evitare di congelare e scongelare ripetutamente i campioni 73 Preparazione dei reagenti del kit Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente prima dell uso 731 Strisce reattive per microtitolazione Le strisce reattive per microtitolazione inserite in un telaio sono confezionate in una sacca di alluminio con un agente essiccante Prelevare dal telaio i pozzetti non necessari e riporli nella sacca di alluminio Chiudere la sacca con cura per garantire la chiusura ermetica 732 Sieri di controllo / sieri standard I sieri di controllo e i sieri standard devono essere diluiti con tampone per campioni e quindi denaturati I sieri di controllo e i sieri standard devono essere inclusi in ogni analisi, indipendentemente dal numero di strisce reattive per microtitolazione utilizzate I sieri standard devono essere analizzati in duplicato 733 Coniugato (pronto per l uso) Evitare una contaminazione del coniugato pronto per l uso, ad es utilizzando puntali sterili 734 Soluzione di lavaggio Diluire il tampone di lavaggio concentrato (V 1 ) 1:30 con acqua distillata, per un volume finale V 2 Esempio: Tampone concentrato (V 1 ) Volume finale(v 2 ) 25 ml 750 ml 1 ml 30 ml 735 Substrato TMB (pronto per l uso) Evitare una contaminazione della soluzione substrato pronta per l uso, ad es utilizzando puntali sterili Il substrato TMB è di colore blu-verde chiaro e le soluzioni con colorazione intensa (estinzione a 650 nm contro acqua distillata >0,2 OD) devono essere eliminate 736 Soluzione di arresto (pronta per l uso) italiano 10

76 Pos: 18 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/t establauf/testablauf Candida Pos: 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/testdurchführ ung/c andi da antigen: Manuelle Testdurchführ Schema riassuntivo della procedura ra SERION ELISA antigen Candida analisi quantitativa Preparazione dei campioni e dei sieri di controllo e standard Diluizione del campione (campioni dei pazienti, sieri di controllo e standard 300 µl di campione µl di tampone di diluizione INCUBARE 10 min / 110 C CENTRIFUGARE 10 min / g / 4 C IT Trattenere il sovranatante, eliminare il pellet Aggiungere il sovranatante dei campioni (100 µl) INCUBARE 60 min / 37 C in camera umida LAVARE (5 x 300 µl DIL WASH ) Dispensare la soluzione di coniugato PODCR (100 µl) INCUBARE 60 min / 37 C in camera umida LAVARE (5 x 300 µl DIL WASH ) Dispensare la soluzione di substrato TMB (100 µl) INCUBARE 30 min / 37 C in camera umida Dispensare la soluzione di arresto STOP (100 µl) LEGGERE L ESTINZIONE a 450 nm (rif 650 nm) italiano 11

77 Pos: 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/automatische T Procedura di analisi manuale 1 Pretrattamento dei campioni (campioni dei pazienti, sieri standard e di controllo) come descritto 2 Collocare la quantità necessaria di pozzetti nel telaio e preparare un foglio protocollo 3 Aggiungere 100 µl dei sovranatanti del siero standard (in duplicato), del controllo negativo e dei campioni dei pazienti ai pozzetti corrispondenti delle strisce reattive per microtitolazione Lasciare un pozzetto vuoto per il bianco substrato, ad es Candida antigen analisi quantitativa pozzetto A1 bianco substrato pozzetto B1 controllo negativo pozzetto C1 siero standard pozzetto D1 siero standard pozzetto E1 Campione paziente 1 4 Incubare i campioni per 60 minuti (+/- 3 min) a 37 C (+/- 1 C) in camera umida 5 Dopo l incubazione, lavare tutti i pozzetti con la soluzione di lavaggio (con dispositivo automatico o manualmente): - aspirare o rimuovere per capovolgimento la soluzione di incubazione - riempire ogni pozzetto con 300 µl di soluzione di lavaggio - aspirare o rimuovere per capovolgimento la soluzione di lavaggio - ripetere il lavaggio 4 volte (per un totale di 5 volte!) -asciugare battendo leggermente la piastra da microtitolazione su un foglio assorbente 6 Aggiunta del coniugato Aggiungere 100 µl di coniugato pronto per l uso nei pozzetti corrispondenti (escluso il bianco substrato) 7 Incubare il coniugato per 60 minuti (+/- 3 min) a 37 C (+/- 1 C) in camera umida 8 Dopo l incubazione, lavare tutti i pozzetti con la soluzione di lavaggio (vedere sopra) 9 Aggiunta del substrato Aggiungere 100 µl di soluzione substrato TMB pronta per l uso a ogni pozzetto (compreso il pozzetto del bianco substrato!) 10 Incubare il substrato per 30 minuti (+/- 1 min) a 37 C (+/- 1 C) in camera umida Tenere al riparo dalla luce! 11 Arresto della reazione Aggiungere 100 µl di soluzione di arresto a ciascun pozzetto e agitare dolcemente la piastra per microtitolazione per mescolare 12 Leggere l estinzione Leggere la densità ottica (OD) entro 60 minuti a 450 nm contro il bianco substrato; lunghezza d onda di riferimento tra 620 nm e 690 nm (ad es 650 nm) italiano 12

78 Pos: 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/positi vkontrolle / Richtig 2 Pos: 22 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: T ESTAU SWERTUN G Procedura automatica I test SERION ELISA possono essere analizzati con apparecchi automatici e validati sia con Immunomat TM e Gemini L analisi automatica viene effettuata analogamente alla procedura manuale Si prega di notare che, in particolari condizioni di lavoro, possono essere necessarie modifiche interne di laboratorio ai tempi di incubazione 77 Controllo positivo / controllo di accuratezza Per la verifica periodica del metodo di analisi, in conformità ai requisiti dei sistemi di gestione qualità interni al laboratorio, raccomandiamo l uso dei controlli SERION ELISA controls per determinare la precisione e l affidabilità delle analisi effettuate con SERION ELISA antigen L uso dei SERION ELISA controls è descritto nei manuali di istruzioni specifici IT italiano 13

79 Pos: 23 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estauswertung: Ein- Punkt- Quantifizier 2 Pos: 24 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estg ültig keitskriteri 2 8 VALUTAZIONE DEL TES SERION ELISA antigen Candida 81 Quantificazione a singolo punto con il metodo 4PL Una corrispondenza ottimale dei segnali di estinzione con i valori quantitativi è data dalle funzioni non lineari, che consentono di correlare le curve sigmoidali direttamente, senza ulteriore trasformazione, ai valori OD La determinazione della concentrazione antigeni con il SERION ELISA antigen viene effettuata con il modello logistic-log a 4 parametri (4 PL), ideale per una corrispondenza esatta della curva Il modello si basa sulla formula seguente: OD = A e D - A B(C - ln Conc) I parametri A, B, C e D rappresentano l'andamento esatto della curva: 1 asintoto inferiore parametro A 2 pendenza della curva parametro B 3 punto di flesso parametro C 4 asintoto superiore parametro D L Istituto Virion\Serion GmbH (Würzburg, Germania) determina le curve standard per ciascun lotto in test ripetuti e in condizioni ottimali Non è quindi necessaria una lunga e dispendiosa costruzione della curva standard da parte dell utilizzatore Per la determinazione delle concentrazioni antigeni, una curva standard e una tabella di valutazione specifiche per il lotto sono allegate a ogni kit SERION ELISA antigen Il software di valutazione SERION evaluate e il software basato su Microsoft Excel SERION activity sono disponibili su richiesta Per compensare le normali oscillazioni e per valutare il test di controllo, in ogni test viene utilizzato un siero standard Il controllo qualità del produttore determina il valore di riferimento e l ambito di validità del siero di controllo All interno di tale ambito si garantisce la quantificazione corretta della concentrazione antigeni italiano 14

80 Pos: 25 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/auswertung: Ü 2 Pos: 26 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/nichtautomatisi erte Auswertung ELISA Criteri di validità - Il bianco substrato deve essere < 0,25 OD - Il controllo negativo deve fornire un risultato negativo - Con i test quantitativi SERION ELISA antigen, il valore OD medio (dopo sottrazione del bianco substrato!) del siero standard deve essere compreso nel range di validità, riportato nel certificato di controllo qualità specifico per ogni lotto - Le oscillazioni dei valori OD del siero standard non devono superare il 20% Se questi criteri non sono soddisfatti, il test non è valido e deve essere ripetuto 83 Calcolo SERION ELISA antigen Candida IT 831 Valutazione non automatica Per la valutazione del test SERION ELISA antigen, il kit contiene un certificato di controllo qualità specifico per ogni lotto, comprendente una curva standard e una tabella di valutazione Il bianco substrato deve essere sottratto da tutti i valori OD prima della valutazione antigen/testauswertung/testauswertung 11\mod_ _33doc Pos: 27 /Arbeitsanleitungen Methoden alle Dokumente/ELISA Metodo 1: determinazione qualitativa Per fissare gli ambiti di cut-off, moltiplicare il valore medio di OD dello standard con i numeri riportati nel certificato di controllo qualità (vedere le formule per determinazioni particolari), ad es: OD = 0,502 x MW(STD) con cut-off superiore OD = 0,352 x MW(STD) con cut-off inferiore Se il valore di assorbanza medio del siero standard è 0,970 OD, il range del cut-off è compreso tra 0,341 e 0,487 OD italiano 15

81 Pos: 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/automatische 3 Metodo 2: determinazione continua dell attività antigenica tramite la curva standard Le cosiddette variazioni intersaggio (oscillazioni che possono verificarsi di giorno in giorno e di laboratorio in laboratorio) vengono compensate moltiplicando il valore misurato nel campione del paziente con il fattore di correzione F Il fattore di correzione è calcolato nel modo seguente: F = valore OD di riferimento (del siero standard) valore OD attuale (del siero standard) Questa procedura è necessaria per correlare il livello attuale del test effettuato dall utilizzatore alla curva standard specifica per il lotto Innanzitutto, le deviazioni giornaliere devono essere corrette con il calcolo del fattore di correzione F 1 Calcolare la media dei due valori OD del siero standard e verificare che rientrino nel range di validità prestabilito 2 Calcolo del fattore F: il valore di riferimento viene diviso per la media di estinzione del siero standard: F = valore di riferimento estinzione siero STD / valore medio estinzione siero STD 3 Tutti i valori determinati con i campioni dei pazienti vengono moltiplicati per F 4 Le attività antigeniche espresse in UI/ml o U/ml possono essere determinate tramite la curva standard con i valori corretti italiano 16

82 Pos: 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/quantifizi 2 Pos: 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa 2 Pos: 31 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: Inter pretati on der Valutazione automatica del test con il software SERION evaluate Inserendo i quattro parametri e il valore di riferimento del siero standard, le attività antigeniche vengono calcolate online dal software di valutazione SERION evaluate in base alle analisi effettuate e misurate con SERION ELISA antigen Se la densità ottica dello standard non è compresa nel range di validità, apparirà il seguente messaggio (in lingua inglese) Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24 oppure Standard value differ more than 20 % in following groups: Group 1-24 In questi casi, l analisi non è valida e deve essere ripetuta I parametri e il valore di riferimento devono essere modificati solo in occasione del cambio di lotto (la tabella di valutazione riporta i parametri e i valori di riferimento) L inserimento corretto dei dati specifici per il lotto può essere controllato in base all attività (in UI/ml o U/ml) assegnata al siero standard Il valore medio calcolato in unità deve corrispondere al valore in unità riportato nel certificato specifico del lotto Viene effettuata una correzione automatica dei valori misurati Nella versione standard, la stampa riporta quanto segue: IT Codice campione Valore OD U/ml Valutazione 84 Limiti di quantificazione I limiti di quantificazione sono specificati nel certificato di controllo qualità del test SERION ELISA antigen La linearità della diluizione in questo range è stata dimostrata in ampi studi di validazione Qualora un campione di un paziente fornisca un risultato superiore al limite di quantificazione superiore, può essere analizzato a una diluizione maggiore L attività antigenica così determinata deve essere moltiplicata per il fattore di diluizione addizionale 85 Zona grigia La zona grigia del test SERION ELISA antigen Candida è specificata nel certificato di controllo qualità e indica i valori del test della zona grigia I valori dei campioni dei pazienti inferiori a tale zona grigia indicano un risultato negativo, mentre i valori superiori alla zona grigia sono considerati positivi Se i risultati sono compresi nella zona grigia, non è possibile un interpretazione definitiva dei dati In questi casi, ripetere il test in parallelo con un nuovo campione prelevato dopo una o due settimane (coppia di sieri) italiano 17

83 Pos: 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: R eferenzber eich gesunder Pr 2 Pos: 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift Leistungsmer 1 Pos: 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift: Sensiti vi tät und Interpretazione dei risultati Pos: 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estauswertung/candi da antigen/candi da antig en: Interpr etation der Ergebni Un risultato positivo nei campioni dei pazienti è indice di fungemia da Candida L interpretazione dei risultati deve sempre tenere conto del quadro clinico e dei risultati ottenuti con altri metodi diagnostici Un risultato è da considerarsi positivo se sono state misurate almeno 2,6 unità Ciò significa che il campione contiene la quantità di mannano corrispondente a 2,6 ng di proteina di Candida Non è tuttavia possibile discriminare, rispettivamente, tra microrganismi vivi o morti Un risultato negativo non esclude un infezione acuta, soprattutto in presenza di titoli anticorpali elevati In tal caso è possibile che l antigene sia completamente mascherato dagli anticorpi e che neanche la fase di denaturazione compresa nella preparazione dei campioni consenta di rilevare l antigene Inoltre, altri fattori come il momento del prelievo del campione durante l infezione, un campione non idoneo, la preparazione o conservazione scorretta del campione possono essere responsabili di risultati negativi 87 Valori di riferimento negli individui sani Pos: 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estauswertung/candi da antigen/candi da antig en: R efer enzbereich g esunder L analisi di sieri di donatori di sangue scelti a caso, provenienti dalla Germania meridionale, con il test SERION ELISA antigen Candida ha fornito i seguenti risultati Su 103 sieri analizzati con il test SERION ELISA antigen Candida, 92 (89,3 %) sono risultati negativi, sei sieri (5,8 %) sono risultati positivi e cinque campioni (4,9 %) sono risultati all interno della zona grigia 9 CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE 91 Sensibilità e specificità Pos: 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Leistungsmer kmale/candi da antig en/candi da antig en: Sensiti vität und Il test SERION ELISA antigen Candida è stato convalidato tramite l analisi di 148 campioni di siero di donatori di sangue e 93 campioni di pazienti con segni di candidiasi in corso di terapia intensiva e il successivo confronto dei risultati ottenuti con un dosaggio disponibile in commercio di uno dei principali produttori europei I sieri con risultati compresi nella zona grigia non sono stati inclusi nei valori di sensibilità e specificità Caratteristiche di prestazione Sensibilità Specificità SERION ELISA antigen Candida > 99,9 % 97,8 % In un altro studio interno è stata dimostrata la reattività crociata con le specie Candida guillermondii, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis e Candida tropicalis nel test SERION ELISA antigen Candida, per una diagnosi di Candida completa italiano 18

84 Pos: 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift Pr äzisi 2 Pos: 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/allgemeine T exte ELISA 122 Inoltre, è stata determinata la potenziale reattività crociata dovuta alle analogie tra mannano e idrossietilamido (HES), utilizzato nei sostituti plasmatici per il trattamento dell insufficienza circolatoria (shock ipovolemico, emorragico e settico) Tuttavia, con il test SERION ELISA antigen Candida non è stata misurata alcuna reazione crociata con HES 92 Riproducibilità Pos: 39 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Leistungsmer kmale/candi da antig en/candi da antig en: Pr La riproducibilità intrasaggio è stata determinata analizzando per 20 volte in una sessione di analisi sieri con reattività differente La riproducibilità intersaggio è stata determinata analizzando sieri con reattività differente in 10 sessioni di analisi indipendenti Deviazione standard Coefficiente di variazione (CV %) = x 100 Valore medio IT SERION ELISA antigen Candida Campione Valore medio Intrasaggio Valore medio Intersaggio (OD) (CV %) (OD) (CV %) negativo 0,223 9,6 0,225 7,3 zona grigia 0,507 2,4 0,476 5,3 positivo 1,413 2,5 1,356 2,7 positivo 2,851 2,0 2,442 8,1 italiano 19

85 Pos: 41 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/liter atur /Kapi tel überschrift: MISURE DI SICUREZZA 101 Avvertenze Il SERION ELISA antigen deve essere utilizzato da personale qualificato che abbia familiarità con la buona pratica di laboratorio Maneggiare con attenzione tutti i reagenti del kit e i campioni di origine umana, secondo le regole della buona pratica di laboratorio - Questo kit contiene emoderivati di origine umana Benché tutti i sieri di controllo e cut-off siano risultati negativi per gli anticorpi anti-hiv, per HbsAg (antigene di superficie del virus dell epatite B) e per gli anticorpi anti-hcv, devono essere considerati potenzialmente infetti - Non pipettare con la bocca - Non fumare, mangiare o bere nelle aree dove vengono maneggiati i campioni o i reagenti del kit - Indossare guanti monouso, camici da laboratorio e occhiali di protezione quando si lavora con i reagenti del kit o con i campioni Al termine, lavarsi accuratamente le mani - Decontaminare i campioni dei pazienti e gli altri materiali potenzialmente infetti dopo l esecuzione del test - Conservare i reagenti in luogo sicuro e inaccessibile alle persone non autorizzate, ad es ai bambini 102 Smaltimento Rispettare le disposizioni di legge vigenti! italiano 20

86 === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt === 11 BIBLIOGRAFIA Pos: 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Liter atur/c andida antigen: [1] Fegeler, W (1992) Möglichkeiten einer differenzierten Candida-Serologie Pilzdialog 4, 61-2 [2] Fegeler, W, Kipp, F (2004) Candida- und Aspergillus-Antikörper-ELISA Erwartungs-werte positiver Antikörpernachweise aus Seren der klinischmykologischen Routine-diagnostik Mycoses 47, 41 7 [3] Fukazawa, Y (1989) Antigenic structure of Candida albicans Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts Immunol Serol 47, [4] Jones, JM (1990) Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis Clin Microbiol Rev 3, [5] Matthews, RC, Burnie, JP, Tabaqchali, S (1987) Isolation of Immunodominant Antigens from Sera of Patient with Systemic Candidiasis and Characterization of Serological Response to Candida albicans J Clin Microbiol 25, [6] Müllensiefen, M, Ringelmann, R (1991) Labor-Diagnostik systemischer Candidosen Lab med 15, [7] Repentigny, L (1989) Serological Techniques for Diagnosis of Fungal Infections Eur J Clin Microbio Infec 8, [8] Robert Koch-Institut (2008) Epidemiologisches Bulletin 29 [9] Ruhnke, M, Rosseau, S, Graf, B (2004) Invasive Pilzinfektionen auf der Intensivstationen Arzneimitteltherapie 22, [10] Rüchel, R, Debusmann, F (2008) Serologie in der Diagnostik von Mykosen Chemother J 17, [11] Sendid, B, Poirot, JL, Tabouret, M, Bonnin, A, Caillot, D, Camus, D, Poulain, D (2002) Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species Med Microbiol 51, [12] Sendid, B et al (2006) Candidaemia and antifungal therapy in a French University Hospital: rough trends over a decade and possible links Infect Dis 6, 80 [13] Tietz, H-J, Tausch, I (1993) Differenzierte Candidaserologie auf dem Prüfstand Pilzdialog 4, 55-6 IT [14] Walsh, TJ et al (1991) Detection of Circulating Candida Enolase by Immunoassay in Patients with Cancer and Invasive Candidiasis New Engl J Med 324, [15] Werle, E, Kappe, R, Fiehn, W, Sonntag, H-G (1994) Nachweis von Anti- Candida-Antikörpern der Klassen IgM, IgG und IgA mittels Enymimmunoassays in sequentiellen Serumproben hospitalisierter Patienten Mycoses 36, 71-8 [16] Zöller, L, Krämer, I, Kappe, R, Sonntag, HG (1991) Enzyme Immuno Assay for Invasive Candida Infections: Reactivity of somatic Antigens of Candida albicans J Clin Microbiol 29, italiano 21

87

88 SERION ELISA antigen Candida SERION ELISA antigen SERION ELISA antigen / RU PL SERION ELISA antigen Candida V: V 112/09-1 : --

89 Pos: 1 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/allgemei ne Texte ELISA antigen/einl eitung " Enzymimmunoassay" C andi da SERION ELISA antigen Candida in vitro Pos: 2 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/bestellnummer n/c andida antigen: Bestell SERION ELISA antigen Candida : ESR200 antigen/allgemeine 8\mod_ _78doc Pos: 3 /Arbeitsanleitungen Texte antigen/kapitelüberschrift 1 für alle Dokumente/ELISA 1 Pos: 4 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/anwendungsbereich/c andi da antigen: - SERION ELISA antigen Candida Candida antigen/allgemeine Bedeutung" Pos: 5 8\mod_ _78doc Texte ELISA antigen/kapitelüberschrift alle 1 Dokumente/ELISA "Diagnostische 2 Pos: 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/di agnostische Bedeutung/Candida antigen: Diag nostische (Candida albicans),,,,,,,, -,, ph,, - ( 1) - - 1: russian 2

90 () (), ( 1), (), + +, -/-, RU 1:,,,,, russian 3

91 Pos: 7 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/t estprinzi p/t estprinzi p ELISA 1 Pos: 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für nur ei n D okument/inhalt und Z usammensetzung/c andi da antigen: Inhalt und 1,,, (ELISA HAT) HAT IgM -, IgG, ELISA - SERION ELISA antigen Candida 3 SERION ELISA antigen ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), ELISA SERION ELISA antigen,,,,, - russian 4

92 Pos: 9 /Arbeitsanl eitung en ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/z usätzlich benötigte M ateriali en/zusätzlich benötigte M ateri /, 8, 12 ( 96) MTP, 1 STD, Candida albicans (FKS); anti-hiv-ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus- Surfacntigen) anti-hcv-ak; : < 0,1 % ; NEG, (FKS);; anti-hiv-ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) anti-hcv-ak; : < 0,1 % ; Candida albicans ( ) PODCR, Candida albicans,, : 0,1 % ProClin 300 ( 1500 ) WASH, TRIS- 20 (Tween 20); 30- : < 0,1 % ProClin 300 SAMB, - STOP, 0,5 N TMB- ( ) TMB, TM- ; : <0,01 % CG INFO, ( /) 3 x 3 2 x x ml 2 RU russian 5

93 Pos: 10 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/lager ung und H altbarkeit/lagerung und H altbar , 450, (, 650 ) - 37 C C ( VT120) russian 6

94 6 ( ) / 2 8 C 2 8 C 2 8 C 2 8 C 2 8 C 2 8 C! 2 8 C, ( 650 > 0,2) ; : 4 : ; 24 ; 18 ; 24 6 ; 24 2 ; 1 24 RU russian 7

95 Pos: 12 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/allgemei ne Hinweise ELISA antig 2 - Pos: 11 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/testdurchführung/überschrift: 1 7 SERION ELISA antigen 71 SERION ELISA antigen, SERION ELISA antigen, SERION ELISA antigen - -,, - SERION ELISA antigen SERION ELISA antigen ( ),,,, -!,, (, Vortex) russian 8

96 Pos: 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/pr obenvor ber eitung und Lagerung/Candida antigen: Probenvorbereitung und Lager 2 Pos: 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/pr obenver dünnung/candida antigen: 3,, SERION ELISA antigen,,,! RU SERION ELISA antigen, 72,, ( ), (EDTA, Citrat, Heparin) russian 9

97 Pos: 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/probenl agerung ELISA antig 3 Pos: 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/r eagenzienvorbereitung ELISA , (, ) (V 1 ) (V 2 ): V 1 + V 2 = (V 1 ) 100 (V 2 ) (, Vortex) 110 C (+/- 5 C) 10! ; 110 C (+/- 5 C) C C C - 20 C russian 10

98 73 731, 732 /, 733 ( ) RU, 734 (V 1 ) 1:30 (V 2 ) : (V 1 ) (V 2 ) TMB- ( ), - -, ( 650 > 0,2 OD ), ( ) Pos: 17 /Arbeitsanleitungen ELISA antigen/gültig für alle Dokumente/ELISA antigen/testdurchführung/testablauf/überschrift 2 russian 11

99 Pos: 18 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/t establauf/testablauf Candida Pos: 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estdurchführung/testdurchführ ung/c andi da antigen: Manuelle Testdurchführ SERION ELISA antigen Candida, (, ) / 110 C 10 / g / 4 C, Pos: 26 /Arbeitsanleitungen/Gültig für alle ( 100 ) 60 / 37 C (5 x 300 DIL WASH ) PODCR (100 ) 60 / 37 C (5 x 300 DIL WASH ) TMB (100 ) 30 / 37 C - STOP (100 ) 450 ( 650 ) russian 12

100 75 1 (,, ) ( ), () : Candida antigen A1 B1 C1 D1 () E1 1 RU 4 60 (+/- 3 ) 37 C (+/-1 C) 5 ( ): ( 5 ) ( ) 7 60 (+/-3 ) 37 C (+/- 1 C) 8 ( ) ( ) (+/-1 ) 37 C (+/- 1 C), ,, , ( 650 ) Pos: 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/automatische T 2 russian 13

101 Pos: 22 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: T ESTAU SWERTUN G SERION ELISA TM Gemini, Pos: 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testdurchführ ung/positi vkontrolle / Richtig / SERION ELISA control, russian 14

102 Pos: 23 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estauswertung: Ein- Punkt- Quantifizier 2 Pos: 24 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estg ültig keitskriteri 2 8 SERION ELISA antigen Candida 81 4PL, OD SERION ELISA antigen 4 (4PL), : OD = A e D - A B(C - ln Konz) RU A, B, C D 1 A 2 B 3 C 4 D \Serion () SERION ELISA antigen SERION evaluate, Microsoft Excel SERION activity,, russian 15

103 Pos: 25 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/auswertung: Ü 2 Pos: 26 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/nichtautomatisi erte Auswertung ELISA OD < 0, SERION ELISA antigen OD,,, - OD 20%, 83 SERION ELISA antigen Candida 831 SERION ELISA antigen, () Pos: 27 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/t estauswertung 1: Cut-off OD OD, ( ), : OD = 0,502 x MW(STD) Cut-off OD = 0,352 x MW(STD) Cut-off,, 0,970,, Cut-off 0,341 0,487 russian 16

104 Pos: 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/automatische 3 2: Pos: 39 /Ar bei tsanl eitungen/gültig für alle Dokumente/Testauswertung/T estauswertung: M ethode 2 (für alle T ,, F: F = OD ( ) OD ( ), RU 1, 2 F: : F = / 3 "F" 4 / / russian 17

105 Pos: 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/quantifizi 2 Pos: 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa SERION evaluate 4 SERION ELISA antigen SERION evaluate,, : Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24 bzw Standard value differ more than 20 % in following groups: Group 1-24 : 1-24 ; / 20% : 1-24 ( ) ( / /), : OD / 84 SERION ELISA antigen, russian 18

106 Pos: 31 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: Inter pretati on der 2 Pos: 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/testauswertung/kapitelüberschrift: R eferenzber eich gesunder Pr 2 Pos: 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift Leistungsmer SERION ELISA antigen Candida ; ( ), - ( ) 86 Pos: 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estauswertung/candi da antigen/candi da antig en: Interpr etation der Ergebni 2,6,, 2,6, RU,,,, 87 Pos: 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/T estauswertung/candi da antigen/candi da antig en: R efer enzbereich g esunder SERION ELISA antigen Candida : (89,3 %) SERION ELISA antigen Candida, (5,8 %), (4,9 %) russian 19

107 Pos: 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift: Sensiti vi tät und 2 Pos: 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Leistungsmer kmale/candi da antig en/candi da antig en: Sensiti vität und Pos: 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/leistungsmer kmal e/kapitelüberschrift Pr äzisi Serion ELISA antigen Candida ,, SERION ELISA antigen Candida > 99,9 % 97,8 % Candida guillermondii, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis Candida tropicalis SERION ELISA antigen Candida; (HES), (, ) Serion ELISA antigen Candida russian 20

108 Pos: 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/allgemeine T exte ELISA Pos: 39 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Leistungsmer kmale/candi da antig en/candi da antig en: Pr (n = 20) 10 (VK %) = x 100 SERION ELISA antigen Candida: (OD) (VK %) (OD) (VK %) 0,223 9,6 0,225 7,3 0,507 2,4 0,476 5,3 1,413 2,5 1,356 2,7 2,851 2,0 2,442 8,1 RU russian 21

109 Pos: 41 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für alle D okumente/elisa antigen/liter atur /Kapi tel überschrift: SERION ELISA antigen, : - anti-hiv-ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) anti-hcv-ak,, - -,,, -,, - -, 102,,! russian 22

110 === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt === 11 Pos: 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA antigen/gültig für nur ein Dokument/Liter atur/c andida antigen: [1] Fegeler, W (1992) Möglichkeiten einer differenzierten Candida-Serologie Pilzdialog 4, 61-2 [2] Fegeler, W, Kipp, F (2004) Candida- und Aspergillus-Antikörper-ELISA Erwartungs-werte positiver Antikörpernachweise aus Seren der klinischmykologischen Routine-diagnostik Mycoses 47, 41 7 [3] Fukazawa, Y (1989) Antigenic structure of Candida albicans Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts Immunol Serol 47, [4] Jones, JM (1990) Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis Clin Microbiol Rev 3, [5] Matthews, RC, Burnie, JP, Tabaqchali, S (1987) Isolation of Immunodominant Antigens from Sera of Patient with Systemic Candidiasis and Characterization of Serological Response to Candida albicans J Clin Microbiol 25, [6] Müllensiefen, M, Ringelmann, R (1991) Labor-Diagnostik systemischer Candidosen Lab med 15, [7] Repentigny, L (1989) Serological Techniques for Diagnosis of Fungal Infections Eur J Clin Microbio Infec 8, [8] Robert Koch-Institut (2008) Epidemiologisches Bulletin 29 [9] Ruhnke, M, Rosseau, S, Graf, B (2004) Invasive Pilzinfektionen auf der Intensivstationen Arzneimitteltherapie 22, [10] Rüchel, R, Debusmann, F (2008) Serologie in der Diagnostik von Mykosen Chemother J 17, [11] Sendid, B, Poirot, JL, Tabouret, M, Bonnin, A, Caillot, D, Camus, D, Poulain, D (2002) Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species Med Microbiol 51, [12] Sendid, B et al (2006) Candidaemia and antifungal therapy in a French University Hospital: rough trends over a decade and possible links Infect Dis 6, 80 [13] Tietz, H-J, Tausch, I (1993) Differenzierte Candidaserologie auf dem Prüfstand Pilzdialog 4, 55-6 RU [14] Walsh, TJ et al (1991) Detection of Circulating Candida Enolase by Immunoassay in Patients with Cancer and Invasive Candidiasis New Engl J Med 324, [15] Werle, E, Kappe, R, Fiehn, W, Sonntag, H-G (1994) Nachweis von Anti- Candida-Antikörpern der Klassen IgM, IgG und IgA mittels Enymimmunoassays in sequentiellen Serumproben hospitalisierter Patienten Mycoses 36, 71-8 [16] Zöller, L, Krämer, I, Kappe, R, Sonntag, HG (1991) Enzyme Immuno Assay for Invasive Candida Infections: Reactivity of somatic Antigens of Candida albicans J Clin Microbiol 29, russian 23

111 SERION ELISA antigen (V 12/09-1) Symbole auf den Etiketten/ symbols on labels/ symboles et étiquettes/ simboli sulle etichette/ /símbolos sobre las etiquetas/ µ / símbolos nos rótulos / Symboly na títcích / symboler på etiketter/ symboler på etiketterna/ Symbole na etykietach/ symboly na oznaení/ Simboli na oznakah/ symbol på etiketter 96 Hersteller/ Manufacturer/ Fabricant/ Produttore/ / Fabricante/ / Fabricante/ Výrobce/ Fremstiller/ Tillverkare/ Producent/ Výrobca/ Izdelovalec/ Produsent Ausreichend für 96 Tests/ sufficient for 96 tests/ suffisant pour 96 tests/ sufficiente per 96 test/ 96 / suficiente para 96 pruebas/ 96 µ/ suficiente para 96 ensaios/ staí na 96 test/ nok til 96 test/ tillräckligt för 96 tester/ Wystarcza na 96 testów/ postauje na 96 testov/ Zadostuje za 96 testov/ Tilstrekkelig til 96 tester 2 C LOT REF 8 C Charge/ lot/ lot / lotto/ lote/ / lote/ ar e/ lot/ lot/ seria/ ar a/ serija/ lot /lot Referenz oder Bestellnummer/ reference or order number/ numéro de référence ou de commande/ numero di riferimento o ordinazione/ / referencia o número de pedido/ µ / referência ou número para encomenda/ reference nebo íslo objednávky/ reference eller bestillingsnummer/ referens eller beställningsnummer/ Numer referencyjny lub numer zamówienia / referenné íslo alebo íslo objednávky/ referenna ali katalo ka tevilka/ Referanse eller ordrenummer Lagern zwischen 2 und 8 Grad Celsius/ store between 2 and 8 degree celsius/ entre 2 et 8 degré celsius/ conservare a temperatura compresa tra 2 e 8 gradi centigradi/ 2 8 / conservar entre 2 y 8 grados celsius/ µ 2 8 µ / Armazenar entre 2º e 8º Celsius/ uchovávejte pi teplot 2 a 8 C/ opbevares mellem 2 og 8 grader celsius/ förvara vid 2 till 8 grader Celsius/ Przechowywa w temp pomidzy 2 a 8 stopni Celsjusza/ skladova pri teplote 2 a 8 stupov Celzia/ Shranjujte pri temperaturi od 2 do 8 C/ Oppbevares mellom 2 og 8 grader Celsiu CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79 EG/ CE marking according to IVD guideline 98/79 EC/ Étiquetage CE selon les directives DIV/ marcatura CE in conformità alla direttiva IVD 98/79 EC/ IVD 98/79 /marca CE según la directiva IVD 98/79 CE/ µ CE µ µ IVD 98/79 E/ Marcação CE de acordo com a Directiva 98/79/ znaení CE podle smrnice IVD 98/79/ES/ CE-mærkning iht IVD-retningslinje 98/79/EF/ CE-märkning enligt riktlinjerna för IVD i direktiv 98/79/EC/ Oznakowanie CE zgodne z wytycznymi dot diagnostyki in vitro 98/79 EC/ oznaenie CE poda smernice IVD 98/79/ES/ oznaka CE, skladna s smernico IVD 98/79/ES/ CE-merking i henhold til IVD-retningslinjer 98/79/EØF 0197 CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79 EG gemäß Anhang II, Liste B/ CE marking according to IVD guideline 98/79 EC according to annex II, list B/ Étiquetage CE selon les directives DIV 98/79 CE selon l'annexe II, liste B/ marcatura CE in conformità alla direttiva IVD 98/79 EC secondo l allegato II, elenco B/ IVD 98/79, II, / marca CE según la directiva IVD 98/79 CE de acuerdo con el anexo II, lista B/ µ CE µ µ IVD 98/79 E, µ µ µ, / Marcação CE de acordo com a Directiva 98/79/ CE relativo aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro, segundo a lista B do anexo II/ znaení CE podle smrnice IVD 98/79/ ES podle píloh II, seznamu B/ CE-mærkning iht IVD-retningslinje 98/79 /EF iflg anneks II, liste B/ CE-märkning enligt riktlinjerna för IVD i direktiv 98/79/EC, bilaga II, lista B/ Oznakowanie CE zgodne z wytycznymi dot diagnostyki in vitro 98/79 EC, zgodnie z aneksem II, lista B/ oznaenie CE poda smernice IVD 98/79 ES v znení dodatku II, zoznam B/ oznaka CE, skladna s smernico IVD 98/79/ES in seznamom B v Dodatku II/ CE-merking i henhold til IVD-retningslinjer 98/79/EØF, tillegg II, liste B MTP Verfallsdatum/ expiry date/ date d'expiration/ data di scadenza/ / fecha de caducidad/ µµ / data de validade/ datum exspirace/ udløbsdato/ förfallodatum/ data upywu wanoci/ dátum exspirácie/ datum izteka roka uporabnosti/ utløpsdatp Mikrotiterplatte (brechbare Streifen)/ microtiter plate (breakable strips)/ plaque de microtitration (bandelettes détachables)/ piastra per microtitolazione (strisce separabili)/ ( ) /placa de microtitulación (tiras rompibles)/ µ (µ )/ placa de microtitulação (tiras quebráveis)/ mikrotitraní deska (rozlomitelné prou ky)/ mikrotiterplade (afbrækkelige strimler)/ mikrotiterplatta (brytbara strips)/ Pytka mikrotitracyjna (paski do odrywania)/ mikrotitraná platnika (rozlomitené prú ky)/ vsebnik za mikrotitriranje (z razdelki, ki jih je mogoe odlomiti)/ Mikrotiterplate (avbrytbare strips)

112 AK STD NEG PODCR SAMB Antikörper/ antibodies/ Anticorps/ anticorpi/ / anticuerpos/ µ/ anticorpos/ protilátky/ antistoffer/ antikroppar/ Przeciwciaa/ protilátky/ protitelesa/ Antistoffer Standardserum/ standard serum/ Sérum standard/ siero standard/ /suero patrón/ / soro padrão/ standardní sérum/ standardserum/ standardserum/ Surowica standardowa/ tandardné sérum/ standardni serum/ Standardserum Negativkontrolle/ negative control/ Contrôle négatif/ controllo negativo/ /control negativo/ / controlo negativo/ negativní kontrola/ negativ kontrol/ negativ kontroll/ Kontrola negatywna/ negatívna kontrola/ negativna kontrola/ Negativ kontroll Peroxidase Konjugat (gebrauchsfertig)/ peroxidase conjugate (ready-to-use)/ conjugué peroxydase (prêt à l'emploi)/ coniugato con perossidasi (pronto per l uso)/ ( )/ conjugado de peroxidasa (listo para usar)/ (µ )/ conjugado com peroxidase (pronto a utilizar)/ konjugát peroxidázy (pipravený k pou ití)/ peroxidasekonjugat (klar til brug)/ peroxidaskonjugat (bruksfärdigt)/ Koniugat peroksydazy (gotowy do uycia)/ konjugát peroxidázy (pripravený na pou itie)/ konjugat peroksidaze (pripravljena za uporabo)/ Peroksidasekonjugat (bruksklart) Probenpuffer/ buffer of specimens/ tampon pour échantillons/ tampone per campioni/ /solución amortiguadora de muestras/ µ µ µ/ tampão para espécimes/ pufr vzork/ prøvebuffer/ provbuffert/ Bufor próbek/ vzorkový pufor/ pufer za vzorce/ Prøvebuffer WASH Waschlösungskonzentrat/ washing solution concentrate/ concentré de solution de lavage / soluzione di lavaggio concentrata / /concentrado de solución de lavado/ µµ / concentrado de solução de lavagem/ koncentrát promývacího roztoku/ vaskeopløsningskoncentrat/ tvättlösningskoncentrat/ Stony roztwór do pukania/ koncentrát premývacieho roztoku/ koncentrat za raztopino za izpiranje/ Vaskeløsningskonsentrat TMB STOP CERT INFO RTU CONC DIL AQUA IVD TMB Substratlösung/ TMB substrate solution/ solution de substrat TMB/ soluzione substrato TMB/ /solución sustrato TMB/ µ µ / solução do substrato TMB/ roztok substrátu TMB/ TMB-substratopløsning/ TMB-substratlösning/ Roztwór TMB substrat/ substrátový roztok TMB/ raztopina substrata TMB/ TMB-substratløsning Stopplösung/ stopping solution/ solution d'arrêt/ soluzione di arresto/-/ solución de parada/ µ / solução de paragem/ zastavovací roztok/ stopopløsning/ stopplösning/ roztwór zatrzymujcy reakcj/ ukonovací roztok/ raztopina za ustavitev reakcije/ stoppeløsning Zertifikat/ certificate/ certificat/ certificato/ /certificado/ / certificado/ certifikát/ certifikat/ certifikat/ Certyfikat/ certifikát/ certifikat/ Sertifikat Gebrauchsanweisung, Zertifikat (Standardkurve und Auswertetabelle), CD/ instructions, certificate (standard curve and evaluation table), CD/ instructions, certificat (courbe de référence et tableau d'évaluation), CD/ istruzioni per l uso, certificato (curva standard e tabella interpretativa), CD/, ( ), /instrucciones, certificado (curva patrón y tabla de evaluación), CD/, ( µ µ), CD/ instruções, certificado (curva padrão e tabela de avaliação), CD/ (standardní kivka a vyhodnocovací tabulka), CD/ brugsanvisning, certifikat (standardkurve og evalueringstabel), CD/ instruktioner, certifikat (standardkurva och utvärderingstabell), CD/ Instrukcje, certyfikat (krzywa standardowa i tabela do okrelania wyników/ CD/ pokyny, certifikát ( tandardná krivka a hodnotiaca tabuka), disk CD/ navodila, certifikat (standardna krivulja in ocenjevalna tabela), CD/ Instruksjoner, sertifikat (standardkurve og evalueringstabell), CD gebrauchsfertig/ ready-to-use/ prêt à l'emploi/ pronto per l'uso/ /listo para usar/ µ / pronto a utilizar/ pipravený k pou ití/ klar til brug/ bruksfärdig/ gotowy do uycia/ pripravené na pou itie/ pripravljen za uporabo/ klar til bruk Konzentrat/ concentrate/ concentré/ concentrato/ / concentrado/ µµ/ concentrado/ koncentrát/ koncentrat/ koncentrat/ Koncentrat/ koncentrát/ koncentrat/ Konsentrat verdünnen oder lösen in/ dilute or disolve in/ diluez ou dissoudre dans/ diluire o sciogliere in/ /diluir o disolver en/ / diluir ou dissolver em/ naete nebo rozpuste v/ fortynd eller opløs i/ späd eller lös i/ Rozcieczy lub rozpuci w/ rozriedi alebo rozpusti v/ razredite ali raztopite v/ Fortynnes eller løses opp i destilliertes Wasser/ aqua detillata/ eau distillée/ acqua distillata/ /agua destilada/ µ / água destilada/ destilovaná voda/ destilleret vand/ destillerat vatten/ woda destylowana/ destilovaná voda/ destilirana voda/ Destillert vann In-vitro Diagnostik Anwendung/ in-vitro diagnostic use/ utilisation en diagnostic in-vitro/ uso diagnostico in vitro/ - /uso diagnóstico in-vitro/,

113 200 Candida in-vitro/ para diagnóstico in vitro/ diagnostické pou ití in-vitro/ til in-vitro diagnostik/ in vitrodiagnostisk användning/ do diagnostyki in vitro/ diagnostické pou itie in-vitro/ uporaba pri diagnostiki in vitro/ In vitro-diagnostisk bruk