Regulation und Funktion von TGF-ß-Signalen in der frühen. Regulation and function of TGF-ß signals during early embryogenesi

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1 Regulation und Funktion von TGF-ß-Signalen in der frühen Regulation and function of TGF-ß signals during early embryogenesi Oelgeschläger, Michael Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik, Freiburg Korrespondierender Autor Zusammenfassung Proteine der transformierenden Wachstumsfaktor-beta-Familie (TGF-ß) regulieren eine Vielzahl von zellulären Prozessen. TGF-ß-Moleküle steuern die Differenzierung von Zellen wie auch deren Proliferation, und Mutationen in Komponenten des TGF-ß-Signalübertragungsweges wurden in verschiedenen Tumoren bereits identifiziert. Zusätzlich sind diese Wachstumsfaktoren von zentraler Bedeutung für frühe embryonale Entwicklungsprozesse. Wissenschaftler am Max-Planck-Institut für Immunbiologie haben mithilfe von Mikroarray-Analysen neue Gene identifiziert, durch die TGF-ß-Aktivitäten in der frühen vermittelt werden. Summary Abstract Proteins of the transforming growth factor-beta (TGF-ß) family regulate a plethora of cellular processes. TGF-ß proteins regulate cellular differentiation as well as proliferation and mutations in the TGF-ß signal transduction pathway have been identified in various tumours. In addition, TGF-ß activity is of central importance for early embryonic development. Scientists at the Max-Planck-Institute of Immunobiology have identified new TGF-ß regulated genes that mediate TGF-ß activities during early embryonic development. Einleitung In der wird eine Vielzahl an Zellarten zeitlich und räumlich koordiniert gebildet. Dabei spielen Wachstumsfaktoren eine zentrale Rolle. Sie werden in den extrazellulären Raum abgegeben und stimulieren durch die Bindung an membranständige Rezeptoren intrazelluläre Signalkaskaden, die Genexpression steuern. Diese signalabhängige Regulation der Genexpression erlaubt die Koordinierung von Zellproliferation, Zellwanderung und Zelldifferenzierung in komplexen Geweben, insbesondere da Zellen unterschiedlich auf das Signal reagieren, je nachdem welche Kombinationen an Rezeptoren und intrazellulären Mediatoren in der Zelle vorliegen. Der TGF-ß-Signalübertragungsweg ist von zentraler Bedeutung für die Determinierung verschiedener Zelltypen in der von Wirbeltieren. Aber auch im erwachsenen Organismus ist eine präzise Steuerung von TGF-ß-Signalen notwendig, besonders weil Mutationen in Komponenten der TGF-ß-Signalkaskade zur Bildung von malignen Tumoren führen [1] Max-Planck-Gesellschaft 1/6

2 Der TGF-ß-Signalübertragungsweg Proteine der TGF-ß-Familie binden an Proteinkomplexe in der Zellmembran, die aus den so genannten Typ IIund Typ I-Rezeptoren bestehen. Die Bindung des TGF-ß-Liganden stimuliert die Aktivierung des Typ I- Rezeptors durch den Typ II-Rezeptor. Der aktivierte Typ I-Rezeptor phosphoryliert und aktiviert intrazelluläre Proteine der SMAD-Familie, die Rezeptor assoziierten Smads (R-Smads). Diese binden nun an Smad-4 und steuern im Zellkern zusammen mit einer Reihe zusätzlicher Transkriptionsfaktoren (TF) spezifische Gentranskription (Abb. 1A). Die TGF-ß-Familie kann dabei in zwei Gruppen eingeteilt werden, die Bone morphogenetic protein-gruppe (BMP) und die Nodal-Gruppe. Die BMP-Gruppe aktiviert mithilfe spezifischer Typ I-Rezeptoren die R-Smads Smad-1, Smad-5 und Smad-8, während die Nodal-Gruppe Smad-2 und Smad-3 aktiviert [2]. Durch die Aktivierung spezifischer Smad-Proteine stimulieren die beiden TGF-ß-Gruppen sehr unterschiedliche Prozesse. In der frühen sind Nodal-Proteine vor allem für die Bildung des Mesoderms notwendig, aus dem ein Großteil der inneren Organe entsteht. BMP-Signale hemmen die Bildung von Nervengewebe und stimulieren die Bildung von Epidermis (Haut) und ventralem Mesoderm, aus dem z.b. Nieren und Blut hervorgehen (Abb. 1B) Die TGF-Signalkaskade (A) TGF-ß-Proteine binden an Transm em brankom plexe, die Sm ad-proteine innerhalb der Zelle phosphorylieren und dadurch aktivieren. Sm ads bilden Kom plexe m it Sm ad-4 und steuern m it zusätzlichen Transkriptionsfaktoren (TF) spezifische Genexpression. (B) Rezeptorkom plexe, an die BMPs binden, aktivieren Sm ad-1, Sm ad-5 und Sm ad -8 und stim ulieren die Bildung von Haut, Blut und Nierengewebe, während die Bildung von Nervengewebe gehem m t wird. Nodal-Signale aktivieren Sm ad- 2 und -3, die für die Bildung des Mesoderm s und der Etablierung der Links-rechts-Asym m etrie notwendig sind. Die Regulation der Genexpression durch TGF-ß-Signale ist sehr Dosis-abhängig. Bereits kleine Variationen in der BMP- oder Nodal-Konzentration stimulieren die Bildung verschiedener embryonaler Gewebe. Daher gibt es eine Vielzahl an Mechanismen, durch die TGF-ß-Signale innerhalb und außerhalb der Zelle reguliert werden. Von besonderem Interesse ist die Regulation von BMP-Signalen im extrazellulären Raum. Genetische Studien im Fischembryo und funktionelle wie auch biochemische Analysen im Froschembryo haben ein sehr komplexes Netzwerk aus Protein-Protein-Wechselwirkungen identifiziert, durch die die Bindung von BMPs an BMP- Rezeptorkomplexe reguliert wird, einschließlich des BMP-Antagonisten Chordin, Metalloproteinasen der Tolloid- Familie, sowie Twisted Gastrulation und Sizzled [2, 3]. Der BMP-Antagonist Chordin bindet BMPs und hemmt 2008 Max-Planck-Gesellschaft 2/6

3 dadurch die Interaktion von BMPs mit Rezeptorkomplexen. Diese Hemmung ist reversibel, da Tolloid Chordin spalten und BMP wieder freisetzen kann. Twisted gastrulation stimuliert die Bindung von Chordin an BMP wie auch die Spaltung von Chordin durch Tolloid, während Sizzled die proteolytische Spaltung von Chordin durch Tolloid hemmt. Verschiedene Komponenten dieses Netzwerks wurden in Mensch, Maus und Frosch, aber auch in Fliege und Seeanemone gefunden. Dabei stellte man fest, dass trotz der Unterschiede in den sich bildenden Strukturen zumindest einige Proteine dieses regulatorischen Netzwerkes vergleichbare Funktionen ausüben [4, 5, 6]. Während der frühen Embryogenese wird Chordin im Frosch, wie auch im Fisch oder der Maus, lokal sezerniert und generiert dadurch einen BMP-Signalgradienten. Dieser Gradient wird im Embryo auf verschiedene Weise interpretiert. Zum einen werden Zelltypen konzentrationsabhängig determiniert. Zum anderen steuert der Gradient gerichtete Zellbewegungen [7], durch die aus dem kugelförmigen Ei ein länglicher Embryo geformt wird (Abb. 2). Der BMP-Signalgradient (A) Durch lokale Sezernierung von Antagonisten wird im Em bryo ein BMP-Signalgradient etabliert, durch den verschiedene Gewebe im Ektoderm (blau) und Mesoderm (grün) determ iniert werden. (B) Einige Stunden später wandern Zellen entlang des BMP-Gradienten von der Bauch- zur Rückenseite und form en aus einem kugelförm igen Ei einen länglichen Em bryo. Identifizierung von BMP-Zielgenen Der südafrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis wird häufig für die Analyse von Signalkaskaden und deren Wechselwirkung mit bekannten oder neuen Proteinen eingesetzt. Die Froscheier sind sehr groß (1.5 mm im Durchmesser) und ermöglichen eine Vielzahl embryologischer Manipulationen. Zusätzlich legt ein Weibchen über 2000 Eier am Tag, die eine fast unerschöpfliche Quelle für die Isolation von DNA, RNA oder Proteinen darstellen. Durch Mikroinjektion von frühen Froschembryonen mit synthetischer mrna oder chemischer Behandlung, z.b. mit Lithiumchlorid, können Signale stimuliert oder gehemmt werden und ausreichende Mengen an RNA aus verschiedenen embryonalen Stadien isoliert werden, die eine vergleichende Analyse mithilfe von Mikroarray-Chips erlauben. Die Arbeitsgruppe um Michael Oelgeschläger hat eine Reihe von neuen Genen identifiziert, die durch BMP-Signale transkriptional reguliert werden und verschiedene BMP-Aktivitäten im frühen Froschembryo vermitteln. Dafür wurde RNA aus frühen Froschembryonen isoliert, in denen BMP- Aktivität durch Mikroinjektion synthetischer mrna oder chemischer Behandlung entweder stimuliert oder gehemmt worden war und mithilfe von Mikroarray-Analysen verglichen. Die Expression der isolierten Gene korrelierte dabei sehr gut mit BMP-Aktivität. Vor allem in frühen Embryonalstadien wird der BMP-Signalgradient durch die Expression dieser Gene deutlich sichtbar. BMP-Signalgradienten determinieren während der Gastrulation, in der Mesoderm in den Embryo einwandert, die dorsal-ventrale (Rücken-Bauch) Körperachse. In der dorsalen oder Rückenseite des Embryos wird während der Neurulation die Neuralplatte gebildet, aus der das zentrale Nervensystem hervorgeht. Da in der Neuralplatte kaum BMP-Aktivität nachzuweisen ist, werden in diesem Bereich vor allem Gene transkribiert, deren Expression durch BMP- Signale gehemmt wird, während Transkripte BMP-aktivierter Gene von der Neuralplatte ausgeschlossen sind. (Abb. 3) Max-Planck-Gesellschaft 3/6

4 Expression BMP-regulierter Gene Die Expression von Genen, die durch BMP-Signale stim uliert werden, ist von der Rückseite während der Neurulation ausgeschlossen (A, B), wo ausschließlich Gene exprim iert werden, die durch BMP-Signale gehem m t werden (C, D). Die Expression von xtspan-1 während der Gastrulation m acht den BMP-Signalgradienten sichtbar (E). LiCl-Behandlung hem m t BMP-Aktivität, sodass xtspan-1-m RNA nun gleichm äßig im ganzen Em bryo nachweisbar ist (F). Die roten Gradienten stellen die BMP- Aktivität für die jeweiligen em bryonalen Stadien schem atisch dar. Eines der Gene, die durch BMP-Signale in ihrer Expression gehemmt werden, kodiert für ein Transmembranprotein, xtspan-1. Durch Mikroinjektion synthetischer mrna konnte gezeigt werden, dass xtspan-1 Zelladhäsion und Zellmigration reguliert [8]. Dies wurde unter anderem durch sogenannte Reaggrations-Assays nachgewiesen. Dafür wurde ein Aggregat aus unbehandelten embryonalen Zellen und xtspan-1 injizierten Zellen, die zusätzlich einen fluoreszierenden Marker exprimierten, hergestellt. Die xtspan- 1-positiven Zellen mischten sich nicht mit den unbehandelten Zellen, sondern sammelten sich an der Oberfläche des Aggregats an. Dieser Effekt konnte durch Ko-Injektion von mrnas, die für Zelladhäsionsproteine der Cadherin-Familie kodierten, aufgehoben werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine Hemmung der Zelladhäsion durch xtspan-1 hin, die unter anderem durch reduzierte Cadherin-Aktivität in den xtspan-1 exprimierenden Zellen erklärt werden kann. Zusätzlich wurde mithilfe von Morpholino-Oligomeren, die spezifisch die Proteinsynthese von endogenem xtspan-1 hemmen, nachgewiesen, dass xtspan-1 für die Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen notwendig ist (Abb. 4) Max-Planck-Gesellschaft 4/6

5 xtspan-1 hemmt Zelladhäsion und stimuliert die Bildung von Nervenzellen. (A) Die xtspan-1 exprim ierenden Zellen m ischen sich nicht m it norm alen ektoderm alen Zellen. Stattdessen akkum ulieren sie auf der Oberfläche des Aggregats, was auf eine reduzierte Zelladhäsion hinweist. (B) Dieser Effekt kann durch Ko-Expression von Cadherinen aufgehoben werden. Zusätzlich verhindert die Hem m ung der Proteinsynthese von endogenem xtspan-1 die Bildung von differenzierten Nervenzellen (C; N-tubulin) als auch neuronalen Vorläuferzellen (D; xdelta-1). Die injizierten Zellen auf der rechten Seite sind grün gefärbt, da sie zusätzlich ß- Galaktosidase exprim ieren. Tspan-1 hem m t Zelladhäsion wie auch Zellm igration und stim uliert Neuralinduktion; zwei BMPabhängige Prozesse. Dieses Protein ist also an den oben beschriebenen BMP-abhängigen Prozessen beteiligt und stellt eines der ersten BMP-regulierten Gene dar, das sowohl Zellbewegungen als auch die Differenzierung von Nervenzellen regulieren kann. Ausblick Diese Arbeiten haben zur Identifizierung einer Vielzahl neuer BMP-regulierter Gene geführt, einschließlich Tspan-1, das an der Regulation von Zellbewegungen und der Differenzierung von Nervenzellen beteiligt ist. Die weitere Analyse dieser Gene wird unser Verständnis für die molekularen Mechanismen, durch die BMP- Signale eine Vielzahl an biologischen Aktivitäten in der Embryogenese wie auch im adulten Organismus steuern, weiter vertiefen. Die überraschend ausgeprägte Ähnlichkeit von BMP-Aktivitäten in verschiedenen Wirbeltierarten lässt erwarten, dass homologe Gene in Säugetieren, einschließlich des Menschen, vergleichbare Funktionen ausüben. Originalveröffentlichungen Nach Erweiterungen suchenbilderweiterungchanneltickerdateilistehtml- ErweiterungJobtickerKalendererweiterungLinkerweiterungMPG.PuRe-ReferenzMitarbeiter (Employee Editor)PersonenerweiterungPublikationserweiterungTeaser mit BildTextblockerweiterungVeranstaltungstickererweiterungVideoerweiterungVideolistenerweiterungYouTube- Erweiterung 2008 Max-Planck-Gesellschaft 5/6

6 [1] P. M. Siegel, J. Massague: Cytostatic and apoptotic actions of TGF- beta in hom eostasis and cancer. Nature Reviews Cancer 3, (2003). [2] Y. Yamamoto, M. Oelgeschläger: Regulation of bone m orphogenetic proteins in early em bryonic developm ent. Naturwissenschaften 91, (2004). [3] E. M. De Robertis: Spem ann's organizer and self- regulation in am phibian em bryos. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, (2006). [4] M. Oelgeschläger, H. Kuroda, B. Reversade, E. M. De Robertis: Chrodin is required for the Spem ann organizer transplantation phenom enon in Xenopus em bryos. Developmental Cell 4, (2003). [5] M. Oelgeschläger, B. Reversade, J. Larrain, S. Little, M. C. Mullins, E. M. De Robertis: The pro- BMP activity of Twisted gastrulation is independent of BMP binding. Development 130, (2004). [6] M. Oelgeschläger, U. Tran, K. Grubisic, E. M. De Robertis: Identification of a second Xenopus twisted gastrulation gene. International Journal of Developmental Biology 48, (2004). [7] D. C. Myers, D. S. Sepich, L. Solnica-Krezel: Convergence and extension in vertebrate gastrulae: cell m ovem ents aaacording to or in search of identity? Trends in Genetics 18, (2002). [8] Y. Yamamoto, K. Grubisic, M. Oelgeschläger: Xenopus Tetraspanin- 1 regulates gastrulation m ovem ents and neural differentiation in the early Xenopus em bryo. Differentiation 75, (2007) Max-Planck-Gesellschaft 6/6