Schlussbericht. zum Vorhaben. Verbundvorhaben: SNP-Diagnose züchtungsrelevanter Eigenschaften von Salicaceaen; Teilvorhaben 1

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1 Schlussbericht zum Vorhaben Thema: Zuwendungsempfänger: Förderkennzeichen: Verbundvorhaben: SNP-Diagnose züchtungsrelevanter Eigenschaften von Salicaceaen; Teilvorhaben 1 Nordwestdeutsche Forstliche Versuchsanstalt - Abt. C- Waldgenressourcen 09NR137 bzw Laufzeit: bis Datum der Veröffentlichung: Download des Schlussberichtes (nach Freigabe durch BMELV/FNR) ab unter der Bericht wird auch auf der Seite verlinkt Das diesem Bericht zugrundeliegende Vorhaben wurde aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages mit Mitteln des Bundesministeriums für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BMELV) über die Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.v. (FNR) als Projektträger des BMELV für das Förderprogramm Nachwachsende Rohstoffe unterstützt. Die Verantwortung für den Inhalt dieser Veröffentlichung liegt beim Autor.

2 Schlussbericht FKZ: 09NR137 bzw I. Ziele (Kurze Darstellung) 1. Aufgabenstellung Forstpflanzen zeichnen sich durch Eigenschaften aus, die ihre züchterische Verbesserung im Vergleich zu landwirtschaftlichen Kulturpflanzen erschweren. Längst haben sich neue, auf molekulare Marker basierende Methoden in der Gehölzzüchtung etabliert, die die Effizienz der Züchtungsbemühungen erheblich steigern. Mit sogenannten SNP-Markern können Populus-Genotypen hinsichtlich ihres Wachstums, lokalen Anpassung sowie Eigenschaften der Zellwand bzw. des Holzes durch die Ausnutzung der natürlichen Variation in den Genen, die diese Merkmale kodieren, charakterisiert und optimiert werden (SMART-Breeding). Eine Möglichkeit zur SNP-Diagnose züchtungsrelevanter Eigenschaften ist der sogenannte Gen- Kandidaten Ansatz. Hier werden Gene a priori als mögliche Kandidaten für z. B. Trockentoleranz, Wund-/Krankheitsresistenz, vegetative Bewurzelbarkeit, Biomasseleistung (CO2-Fixierung), Lignifizierung, usw. ausgewählt und die Variation auf die DNA-Ebene in verschiedenen Individuen und Klonen bestimmt. Die Ziele dieses Projekts sind: (1) Evaluierung der Nukleotitdiversität in für die Züchtung relevanten Klonen und Pappel-Hybriden, (2) Aufbau einer SNP Datenbank der Pappel für ca. 20 Kandidaten-Gene für züchtungsrelevante Eigenschaften, (3) vergleichende Analysen von Genen mit höchsten SNP-Polymorphismen zu quantitativen Merkmalen und Prüfung von SNP-Assoziationen (4) Identifikation von SNP-Markern die sowohl in Pappeln als auch Weiden genutzt werden können. (5) Erprobung von Methoden zur SNP-Genotypisierung von Züchtungsprodukten. Die Ziele (1) und (2) wurden in Absprache mit dem Partner im Verbund SNP-Diagnose, dem Thünen- Instiut (vormals vti) in Großhansdorf arbeitsteilig bearbeitet. Das Ziel (3) wurde von jedem Projektpartner mit den ihm verfügbaren Arten und Klonen verfolgt. Die Ziele (4) und (5) wurden in Zusammenarbeit (Werkvertrag) mit der Univ. Marburg (AG Prof. Dr. B. Ziegenhagen) verfolgt. Die dort gewonnenen Daten wurden an der NW-FVA zur Überprüfung möglicher Assoziationen von SNP-Genotypen und Phänotypen von Weiden-Zuchtsorten genutzt. Auf Wunsch des Thünen-Instituts erfolgte durch die NW-FVA auch die Bereitstellung von Kreuzungsprodukten oder von DNA aus Kreuzungsprodukten (siehe Anhang 2_Materialabgabe) Wiss.-tech. Ergebnis, wesentliche Erfahrungen, Vorarbeiten Zur Charakterisierung der Phänotypen konnten umfangreiche Bonituren der früheren Hess. Forstlichen Versuchsanstalt in Hann. Münden sowie quantitative Daten an den im Rahmen der FNR- Züchtungsprojekte Fastwood und Neuzüchtung und Erprobung bisher nicht registrierter Weidenklone und sorten auf Flächen der NW-FVA erhoben oder soweit bereits verfügbar, ausgewertet und genutzt werden.

3 Im Rahmen dieser Auswertungen wurde u.a. geprüft ob ein linearer Zusammenhang zwischen dem Zuwachs als Massenleistung (definiert als zugewachenes Volumen verholzter Triebe) im Saatbeet und auf ein- bzw. zweijähriger Adventivwurzel besteht. Die Überprüfung dieses Zusammenhanges erfolgte mittels eines Vergleiches der Korrelationen der Massenleistung in den untersuchten Entwicklungsstadien. Im Ergebnis zeigte sich, daß kein enger linearer Zusammenhang und damit auch keine Möglichkeit einer einfachen Prognose der Volumenleistung des selektierten und verklonten Sämlings auf ein- oder zweijähriger Adventivwurzel besteht. Somit rechtfertigt sich die aufwendigere Suche nach Assoziationen von genetischen und phänotypischen Merkmalen. Durch Sanger-Sequenzierung konnte die Nukleotiddiversität von zehn der in den Tabellen 1 und 2 des ausführlichen Ergebnisteiles II beschriebenen Kandidatengene (LEAFY, PPO, CAD1-like, GA2Ox; CBF1, TB1, ARF 5.1, phyb2, CLV1 und KNAT1) in Pappeln charakterisiert werden, siehe Tab. 6 (Ergebnisteil II). Bei Weiden gelang trotz aufwendiger Optimierung der PCR mit denselben Primern wie für Pappeln beschrieben nur die Charakterisierung der Nukleotid-Polymorphismen in 5 Kandidatengenen ( PPO, GA2Ox, LEAFY, CLV1 und ARK1). Die Verteilung der SNPs in kodierenden und nichtkodierenden Regionen differierte wie erwartet erheblich zwischen den Kandidatengenen als auch zwischen Weiden und Pappeln. Bei Pappeln konnten in den Genfragmenten aus zehn Kandidatengenen insgesamt 319 SNPs in Exon-Regionen nachgewiesen werden, bei Weiden fanden sich in den Genfragmenten von 5 Kandidatengenen (nur 52 SNPs in Exon-Regionen. Bei Weiden wurden in 4 der 5 Gene 21 nicht-synonyme SNPs identifiziert. Bei Pappeln wurden in 9 der untersuchten Gene 146 nichtsynonme SNPs, die einen Aminosäureaustausch bewirken entdeckt. Lediglich im Leafy-Gen wurden ausschliesslich synonyme SNPs detektiert. Da es jedoch nicht gelang die Gene in ihrer Gesamtlänge zu resequenzieren muß die Existenz nichtentdeckter Nukleotiddiversität berücksichtigt werden. Da die Anzahl der auswertbaren Kandidatengene entsprechend der Zugehörigkeit der Pappeln und ihrer Hybriden zu den Sektionen Aigeiros und Tacamahaca variierte (vgl. Tab. 15 und Tab. 25 im Ergebnisteil II) wurde eine getrennte Auswertung der Assoziationen vorgenommen. Dazu wurden für jedes genotypisierte Individuum die verfügbaren Bonituren oder Meßwerte mit Hilfe des R-basierten Programmpaketes SNPStats als auch mit Hilfe des Internet-basierten Programmes SNPStats mit den SNP-Genotypen verrechnet und die Assoziationen mit den Leistungsmerkmalen getestet (Odds Ratio, Chi-Quadrat-Test). Unter der Annahme verschiedener Erbgänge fanden sich so signifikante Übereinstimmungen für die Merkmale Höhe, BHD, Schafthaltung, Kronenform, Beastungsdichte, Frühjahrsaustrieb, Rostbefall und Befall durch Marssonina bei den Pappeln der Sektion Aigeiros. Bei den Pappeln der Sektion Tacamahaca und den zugeordneten Hybriden fanden sich signifikante Assoziationen zur Höhe, dem BHD, Phototropismus, Vergilbungsdauer, Kronenbreite, Beastungsdichte, Frühjahrsaustrieb, Rostbefall und Herbstabschluß. Durch den Einsatz der KASP-Technologie ( konnte eine Anzahl von 410 S. viminalis aus Populationen an der Elbe sowie 63 Individuen einer Zuchtpopulation genotypisiert werden. Hier zeigten sich u.a. signifikante Assoziationen zweier SNPs des Kandidatengens CLAVATA1 mit den Leistungsmerkmalen Frischgewicht und Anzahl der Seitentriebe, die an dreijährigen Aufwüchsen in einem Feldversuch an 30 Klonen mit je 24 Ramets erhoben worden waren. Der Vergleich der Nukleotiddiversität zwischen Zuchtpopulation und natürlicher Population ergab keinen Hinweis auf eine genetische Einengung durch Züchtung an den untersuchten Genorten. Die kostengünstige KASP-Technologie erwies sich auch als geeignet zur Genotypisierung von frei abgeblühten und selektierten Pappeln des Kreuzungsjahres 2007 deren Leistungsmerkmale im Rahmen von Fastwood II auf bis zu 6 Flächen geprüft werden. Das zur Genotypisierung ebenfalls geeignete TILLING-Verfahren wurde erprobt. Da es Faktoren unterliegt die die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse einschränken wurde auf die Anwendung des Verfahrens bei einer größeren Zuchtpopulation verzichtet. 2

4 Das Projekt SNP-Diagnose diente im Wesentlichen der Verfahrensentwicklung zur Verbesserung von Züchtungsmethoden. Die im Projekt beschriebenen SNP-Marker können sowohl zur Sortenidentifizierung als auch zur Abstammungsrekonstruktion genutzt werden. Sollten sich die beschriebenen Assoziationen z.b. durch Transkriptomanalysen bestätigen könnten die betreffenden SNP-Marker als ein Qualitätsmerkmal bei der Vermarktung von Sorten genutzt werden. Planung und Ablauf des Vorhabens : Kick-off-Meeting des BMELV-Verbundvorhabens in Hann. Münden : Abschluss eines Kooperationsvertrages mit dem Institut für Forstgenetik des Johann Heinrich von Thünen-Institutes, Sieker Landstrasse 2, Großhansdorf : Abschluss eines Weiterleitungs-/Werkvertrages mit Frau Prof. Dr. B. Ziegenhagen, FB Biologie/Fachgebiet Naturschutz der Univ. Marburg : 2. Treffen der Projektpartner in Hann. Münden zur Abstimmung der Projektziele und Festlegung der Kandidatengene : 3. Treffen der Projektpartner in Hann. Münden 21./ :Posterpräsentation beim FastWOOD-Symposium Züchtung und Ertragsleistung schnellwachsender Baumarten im Kurzumtrieb sowie Erstellung eines Beitrags für den Tagungsband (Pfennig et al. 2012) : 4. Treffen der Projektpartner und eingeladener Vertreter der Univ. Dresden (Fr. Linke, Isowood-Projekt) sowie der Expertengruppe Gen. Analysen der Sektion Forstgenetik/ Forstpflanzenzüchtung im DVFFA (H. Liesebach, vti-großhansdorf; B. Fussi, ASP Teisendorf; U. Tröber, Sachsen-Forst, Graupa) im vti Großhansdorf (Gastgeber K.Pfennig und Prof. Dr. M. Fladung) : Änderung des Zuwendungsbescheides/Gesamtfinanzierungsplanes Treffen der Projektpartner und eingeladener Vertreter, s.o., bei der AG Prof. Dr. B. Ziegenhagen an der Univ. Marburg. Gastvortrag durch Fr. Dr. Seifert, Univ. Göttingen Bericht von Dr. Gebhardt an Herrn Dr. F. Oehme 19./ Teilnahme an der 12. Forstwiss. Tagung der TU München/W phan, Posterbeitrag Änderung deszuwendungsbescheides/gesamtfinanzierungsplanes Einreichung einer Projektskizze PEMEF (Fortsetzungsantrag) an die FNR Planmäßiges Ende der halbtägigen Beschäftigung der TA, Fr. Müller 19,/ Int. Agrarholzkongress der FNR, Posterbeitrag 12./ Schlusstreffen der Verbundpartner an der NW-FVA in Hann. Münden Planmäßiges Ende der Beschäftigung von Frau Dr. Hoffmann Übersendung der Verwendungsnachweise und Beleglisten an die FNR Schlußbericht 3

5 2. Stand der Technik Wiss.-Techn. Stand Weltweite Bemühungen der Biomasse-Erzeugung im Kurzumtrieb zeigen die große Bedeutung der züchterischen Verbesserung von Salicaceaen. Das zunehmende Interesse an den genetischen Ressourcen der in der Züchtung genutzten Arten hat auch Untersuchungen zur Genotypisierung, zu Populationsstrukturen und zum Genfluss befördert. Starke genetische Effekte bei der Biomasse- Produktion in Salicaceaen sind in der Literatur vielfach beschrieben [BRADSHAW & STETTLER (1993, 1994), BRADSHAW et al. (1994), NEWCOMBE et al. (1996), RÖNNBERG-WÄSTLJUNG & GULLBERG (1999), FREWEN et al. (2000) RÖNNBERG-WÄSTLJUNG et al. (2005, 2006)]. In Europa arbeitet seit 2008 eine englische und schwedische Arbeitsgruppe im Projekt Brednet (zusammen ca. 0,91 Mio ) intensiv an der Nutzung molekularer Genetik für die Weidenzüchtung. Im EU-Projekt EnergyPoplar ( ) wird intensiv an der genetischen Verbesserung der Schwarzpappel als Rohmaterial für Biokraftstoffe gearbeitet. Des Weiteren werden im EU-Projekt NovelTreeBreeding ( ) neue Züchtungsstrategien bei verschiedenen Baumarten getestet. Schließlich haben sich im EU-Exzellenz-Netzwerk ( ) führende europäische Züchtungsinstitutionen zusammen geschlossen, um auf dem Gebiet der Forstgenetik und Forstpflanzenzüchtung eine wissenschaftliche und technologische Plattform auf europäischer Ebene zu schaffen. In den USA wird in dem US-DOE Projekt (Koordinator Dr. Jerry Tuskan) getestet, inwieweit Pappeln und Weiden in Kurzumtriebsplantagen als energy crops Verwendung finden können. Zudem gelingt es mit den Sequenzierungsverfahren der neuesten Generation nun auch die größten Genome der Waldbäume (Koniferen) zu sequenzieren, siehe FLADUNG et. al. (2013). Neue Verfahren der Genotypisierung wie z.b. die KASP-Technologie der Fa. LGCGENOMICS erlauben in Zukunft eine relativ kostengünstige Genotypisierung von Züchtungsprodukten. Als mögliche Folgen des Klimawandels werden in allen Regionen Deutschlands extreme Witterungsverhältnisse und geringere Niederschlagsmengen während der Vegetationsperiode prognostiziert. Um die Erzeugung von Holz in Zukunft auf möglichst vielen, auch für Landwirtschaft grenzwertigen Standorten sicherzustellen, bedarf es erheblicher züchterischer Bemühungen sowohl bei den sog. schnellwachsenden Baumarten wie Pappeln als auch bei den forstwirtschaftlich genutzten Hauptbaumarten wie Fichte, Buche und Kiefer. Die Identifikation von an Trockenheit angepassten, spätfrost- oder schwermetalltoleranten Sorten nach konventionellen Züchtungsansätzen ist kosten- und vor allem zeitintensiv. Bemühungen, diesen Aufwand zu reduzieren, sollten deshalb auf molekulargenetischer Ebene ansetzen. Die Identifizierung genetischer Marker wie Einzelnukleotidpolymorphismen (engl. Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) in Kandidatengenen, die wichtige Eigenschaften wie Wuchsleistung, Resistenzen gegen Schädlinge und Toleranzen gegen abiotische Faktoren steuern, könnten Aussagen über zu erwartende Merkmalsausprägungen zulassen und den Züchtungsfortschritt deutlich beschleunigen (HEFFNER et al. 2009; FLADUNG & GEBHARDT, 2010). Eine gezielte Selektion von Leistungsträgern wäre dann altersunabhängig sowohl bei Mutterbäumen als auch an Sämlingen oder vegetativen Nachkommen möglich. Allerdings muss bedacht werden, dass die bisher praktizierte Auswahl von Kandidatengenen eher ungerichtet war und damit die Assoziation zu den genannten Eigenschaften bedingt durch Herkunft, Alter und Umwelt variieren kann.. Daher sollten in künftigen und fortführenden Projekten die umfangreichen Sequenzdaten als Grundlage dazu dienen, systematisch und objektspezifisch Kandidatengene auszuwählen um damit die Wahrscheinlichkeit einer Beteiligung dieser Gene an der Ausbildung von züchtungsrelevanten Merkmalen stark zu erhöhen. Da SNP-Assoziationen sich auf der Ebene des Transkriptoms manifestieren ist es möglich die SNP-Genotypen hinsichtlich ihrer Transkriptlevel zu überprüfen und zu unterscheiden. Sollten allele Unterschiede nur in bestimmten Stresssituationen oder Altersstadien zum Tragen kommen besteht über den Vergleich der Transkripte aktiver Gene auch die Möglichkeit der SNP-Detektion. 4

6 Fachliteratur Hauptsächliche Quelle der Fachlitertur war und bleibt das Internet, das u.a. mit Hilfe professioneller Suchdienste (z.b. erschlossen wurde. Ein Literaturverzeichnis der zitierten Publikationen und eine Auflistung der aus dem Projekt heraus erstellten Publikationen findet sich am Ende des ausführlichen Ergebnisteiles, s.u.. 3. Zusammenarbeit mit anderen Stellen Alle Mitarbeiter des Projektes kooperierten eng mit den Projektpartnern und Mitarbeitern des FNR- Projektes FastWOOD. Die Arbeitsgruppe von Frau Prof. Dr. Ziegenhagen an der Univ. Marburg war über einen Werkvertrag zur Bearbeitung von Weiden aus natürlichen und aus Zuchtpopulationen direkt in das Projekt SNP- Diagnose eingebunden. Die Arbeitsgruppe von Frau Prof. Dr. Krabel die an der Universität Dresden das BMBF- Projekt ISOWOOD bearbeitete erhielt Einladungen zu allen Arbeitstreffen und beteiligte sich an dem Informationsaustausch des Kick-off-meetings sowie der Arbeitstreffen

7 Inhaltsverzeichnis für den Schlußbericht Teil II V Seite II. Ergebnisse (Eingehende Darstellung) A.. Untersuchungen an Pappeln und Pappelhybriden Auswahl von Kandidatengenen 7 2. Etablierung und Optimierung der PCR DNA-Extraktion Auswahl und/oder Design der Primer Optimierung der PCR-Bedingungen 8 3. Material Klone der Pappel-Klonsammlung der NW-FVA Erhebung von Merkmalsausprägungen Abgabe von Material an das TI-Großhansdorf Sicherung von Klonen Korrelationen der phänotypischen Merkmale Korrelationen der Volumenleistung frühselektierter Sämlinge/Stecklinge Korrelationen Volumenleistung zu Blattfläche Erprobung des Tilling-Verfahrens Etablierung der Tilling-Methode Einschränkungen des Tilling-Verfahrens DNA-Sequenzierung nach Sanger Vorgehensweise und Primerdesign Sequenzanalyse Ergebnisse der Sequenzanalysen SNP-Genotypisierung (KASP-Technologie) Assoziation der SNP-Daten mit dem Phänotyp/Ertragsmerkmalen Sektion Aigeiros Sektion Tacamahaca Untersuchungen an selektierten Kreuzungsnachkommen aus B. Untersuchungen an Weiden Ergebnisse des Werkvertrages Vergleich zwischen Züchtungsklonen und natürlichen Populationen Assoziation der SNP-Merkmale mit Ertragsmerkmalen 41 C. Mutagenisierung 44 D. Zusammenfassende Diskussion 45 I III. Verwertung 48 IV. Erkenntnisse von Dritten 49 V. Veröffentlichungen/Referencen 50 A. Zitierte Literatur 50 B. Veröffentlichungen aus dem Projekt heraus 52 VI. Danksagung 52 VII. Hinweis zum Anhang 52 6

8 II. Ergebnisse (Eingehende Darstellung) Erzielte Ergebnisse A. Untersuchungen an Pappeln und Pappelhybriden 1. Auswahl von Kandidatengenen Zur Auswahl der Kandidatengene wurden umfangreiche Recherchen der Fachliteratur durchgeführt. Ausgewählt wurden Gene, die für bereits gut charakterisierte Enzyme kodieren oder für Faktoren, die an der Genregulation beteiligt sind und Gegenstand der aktuellen Forschung sind. Besondere Berücksichtigung fanden Gene, die bereits erfolgreich in der Pappel und/oder der Weide untersucht werden konnten. Aus der Vielzahl der Kandidaten wurden schließlich die für die Züchtung vermutlich relevantesten ausgewählt und den Projektpartnern zugeordnet. Aufbauend auf einer Publikation zur genetischen Variabilität in Pappeln (FLADUNG et al. 2009), wurden die Primer für sechs Genorte (LFY, PPO, CAD-like, Ga20ox, Tb1, CBF1), siehe Tabelle 1, direkt aus dieser Arbeit übernommen. In Abstimmung mit den Projektpartnern wurde beschlossen, dass diese Gene von allen Beteiligten in dem jeweils verfügbaren Material untersucht werden sollen. Tab. 1: Sechs Kanditatengene die von allen Projektpartnern in dem jeweils verfügbaren Material untersucht werden sollten und ARK1, das vom Thünen-Institut an Aspen als auch im Rahmen des Werkvertrages mit der Univ. Marburg an Weiden (Kapitel 1.2) untersucht wurde. Gen Genname Funktion Züchtungsziel Literatur LFY* PPO* LEAFY Polyphenol oxidase Blütenmeristem-Identitätsfaktor, fördert die Entwicklung von Blüten statt Trieben, Induktion männlicher Blüten Verteidigungsprotein, Induktion durch Verletzung Blüte, Biomasseleistung Schutz vor Insektenfraß Rottmann et al. (2000) Constabel et al. (2000) CAD1-like* cinnamyl alcohol dehydrogenase-like Protein der Lignin-Biosynthese, Aufbau der Zellwand Holzqualität Lapierre et al (1999) GA20ox* gibberellic acid 20- oxidase Gibberellin-Biosynthese im Xylem, reguliert das Sprosswachstum Längenwachstum Israelsson et al (2005) CBF1* tb1* ARK1 (Poptr_004s02 720) C-repeat binding factor 1 Teosinte Branchedlike-1 Arborknox1 Transkriptionsfaktor, steuert die Reaktionen der Pflanze auf Kälte DNA-bindendes Protein, Wachstumskontrolle des Apikalmeristems der Seitensprosse Serin-/Threonin-Kinase/transmembranes Rezeptorprotein; Zelldifferenzierung, Zellwandkomposition Kältetoleranz Benedict et al. (2006) Verzweigung, Prolepsis Längenwachstum, Lignifizierung Cubas et al. (1999) Groover et al. (2006) Der NW-FVA wurde die Etablierung der PCRs für sechs weitere Gene übertragen. Eine Übersicht über die Funktionen der Gene ist in Tabelle 2 aufgeführt. Da die PCR-Reaktionen bei dem WRKY- Gen und bei Gamma-TIP schwierig und zeitaufwendig zu optimieren waren konnte die Nukleotidvariation dieser Gene in den verfügbaren Klonen entweder nicht ausreichend untersucht oder nicht ausgewertet werden. 7

9 Tab. 2: Kanditatengene, deren SNP-Diagnose zunächst an der NW-FVA erfolgte. ARF 5.1 (MP1) phyb2 CLV1 KNAT1 WRKY Krankheitsresistenz, Längenwachstum GAMMA- TIP MONOPTOROS Phytochrom B2 CLAVATA1 Knotted 1-like Homöobox (KNOX) Gen WRKY transcription factor Gamma tonplast intrinsic protein Auxinregulierter Transkriptionsfaktor, Kontrolle der Embryogenese (Wurzel und Hypokotyl), Bildung des Gefäßsystems in Blüten und Blättern Bestandteil des Lichtrezeptor-Systems, Steuerung des Tageslängen-induzierten Triebabschlusses, Vergilbung Rezeptor-Kinase, Regulation des apikalen Sprossmeristems, evtl. Regulation des sekundären Dickenwachstums Transkriptionsfaktor, beeinflusst die Streckung der Sprossachse und die Blattentwicklung Transkriptionsfaktor; beeinflusst die Pathogen-Abwehrreaktionen, biotische Stresstoleranz und das Längenwachstum GA3-reguliertes Aquaporin, Zellwachstum Biomasseleistung Biomasseleistung, Triebabschluss Biomasseleistung, Dickenwachstum Biomasseleistung, Längenwachstum Johnson & Douglas (2007) Ingvarsson et al. (2006) Bush (2008) Rogers & Campbell (2004) Uelker & Somssich (2004), Azaiez et al. (2009) Biomasseleistung Shuang et al. (2011) 2. Etablierung und Optimierung der Polymerasekettenreaktionen (PCR) 2.1. DNA-Extraktion Die Extraktion genomischer DNA erfolgte aus gefriergetrockneten Knospen und Blättern und wurde nach einem modifizierten Protokoll nach Dumolin et al. (1995) durchgeführt. Da Pappeln einen hohen Anteil von Phenolen enthalten, musste das Protokoll jedoch leicht modifiziert werden. Zur Entfernung der Phenole wurden die zerkleinerten Proben über Nacht bei 4 C in Aceton inkubiert. Nachdem das Aceton anschließend vollständig aus den Proben entfernt worden war, erfolgte das herkömmliche Extraktionsverfahren Auswahl und/oder Design der Primer Ausgehend vom 5 -Ende des jeweiligen Gens erfolgte die Auswahl geeigneter Primer zur Amplifikation von DNA-Fragmenten mit einer Länge von ca bp. Primersequenzen für sechs Gene wurden einer Publikation von Fladung et al. (2009) entnommen. Die Primerpaare zur Untersuchung weiterer fünf Kandidatengene (ARF5.1, phyb2, CLV1, KNAT1, WRKY) wurden mit Hilfe der P. trichocarpa- Referenzsequenz entwickelt. Die Sequenzabschnitte wurden öffentlichen Datenbanken (Phytozome v 6.0 und NCBI) entnommen und dienten als Basis für das Primerdesign mit der Software Oligo Optimierung der PCR-Bedingungen Da die DNA-Proben zunächst noch stark mit Sekundärstoffen belastet waren, nahm die Etablierung der PCRs mehr Zeit in Anspruch, als ursprünglich geplant. Die Zugabe von PVP, einem Reagenz, das Phenole entfernt, in die PCR lieferte aber schließlich die gewünschten Fragmente. Leider stellte sich im Austausch mit der Sequenzierungsfirma heraus, dass die Ansätze für die Sequenzanalyse kein PVP enthalten dürfen. Daher wurde das ursprüngliche Protokoll der DNA-Extraktion um einen Arbeitsschritt erweitert und die Proben komplett neu extrahiert (siehe 2.1). Die so gewonnenen Proben konnten dann für weitere PCR-Optimierungen herangezogen werden. Es zeigte sich, dass die PCR-Bedingungen (Annealingtemperatur, Primerkonzentration, etc.) für einige Arten individuell optimiert werden mussten. 8

10 1000 bp bp - Abb. 1: PCR-Produkte, die durch Gelelektrophorese in einem Agarosegel aufgetrennt worden sind. Typisches Beispiel für eine Gradienten-PCR (Temperaturbereich: C, Gen KNAT1, getestet an P. euramericana) zur Ermittlung der idealen Annealing- Temperatur. 3. Material 3.1 Klone der Pappel-Klonsammlung der NW-FVA Zur Identifizierung von SNPs mittels Sequenzanalyse wurde Untersuchungsmaterial aus der umfangreichen Pappel-Klonsammlung der NW-FVA ausgewählt. Diese Auswahl basiert auf einer bereits eingehenden phänotypischen Charakterisierung dieser Klone durch die Mitarbeiter der früheren Hess. Forstlichen Versuchsanstalt und des vormaligen Forschungsinstituts für schnellwachsende Baumarten (Fröhlich und Grosscurth, 1973). Sie beschrieben die Entwicklung von Pappelklonen während der Jugendphase im Kamp sowie unter verschiedenen Standortbedingungen in Deutschland. Parameter, die im Rahmen dieser Untersuchungen erhoben wurden, waren Höhe, Durchmesser, Schafthaltung, Phototropismus, Kronenform, Kronenbreite, Beastungsdichte, Aststärke, Frühjahrsaustrieb, Herbstabschluss, Vergilbungsdauer, Dauer der Vegetationszeit und Rost. Dieses Datenmaterial wurde gesichtet, die in Klonsammlungen noch vorhandenen Klone wurden begutachtet und für spätere DNA-Analysen beprobt. Die Bezeichnungen der Pappelklone sowie ihre Sektionszugehörigkeit sind der Tabelle 3 auf der Seite 6 zu entnehmen. 3.2 Merkmalsausprägungen an Klonen des Zuchtprogramms FastWOOD Zusätzlich zu den Klonen der Pappel-Klonsammlung wurden 70 neue Klone (Kreuzung 2007, freie Abblüte), die im Rahmen des Pappel-Zuchtprogramms FastWOOD herangezogen und zur weiteren Vermehrung im Kamp kultviert wurden, charakterisiert. Dazu wurden an einjährigen Aufwüchse auf einjähriger und zweijähriger Wurzel im Zeitraum von September bis November 2010 umfangreiche Bonituren durchgeführt. Es erfolgte die Aufnahme folgender Merkmale: Blattgröße und anzahl, Höhe, Wurzelhalsdurchmesser, Verzweigung; Blattschäden durch Insekten, Rost, Vergilbung und Herbstabschluss (Anhang 1_Phänotypen/Nov_2010). Die Biomasseleistung der selektierten Nachkommen aus freien Abblüten (2007) wurde im Rahmen einer Bachelorarbeit von Herrn Briebach (Betreuer: Prof. Dr. Merkel und Dr. Gebhardt) erhoben und verrechnet. Im Rahmen dieser Arbeit (Anhang 1_Phänotypen/Briebach) konnte gezeigt werden, dass für die Berechnung des Volumens der oberirdischen verholzten Triebe der Individuen eine einparametrische Schätzfunktion entweder auf Grundlage der gemessenen Trieblängen oder Triebdurchmesser genutzt werden kann, siehe MERKEL et al. (2012). Wie in Abb. 2 gezeigt, übertreffen Klone einzelner Nachkommenschaften das Familienmittel und das Mittel aller Nachkommenschaften 9

11 sowohl auf Sämlings- (Abb. 2A) als auch auf Adventivwurzel erheblich (Abb. 2 B ). Auffällige Höchstwerte zeigten einige Nachkommen der Familienmutter 12 (P. maximowiczii, Baum 63) A. B. Abb. 2: A. Volumenleistung von Nachkommen aus freier Abblüte (Familien 1-21) auf Sämlingswurzel B. Volumenleistung von Nachkommen aus freier Abblüte (Familien 1-21) auf Adventivwurzel Artzugehörigkeit der Familienmütter: , P x canadensis (grün), 2 bis 7 und 16, P. trichocarpa (blau); 9 bis 14, P. maximowiczii (rot); 15, P. nigra x maximowiczii (magenta); 18 bis 21, P. deltoides (grau); 10

12 Sechzig Klone aus freier Abblüte 2007 mit bester Höhenwuchsleistung werden im Rahmen des Verbundvorhabens FASTWOOD II auf 6 Flächen in der BRD angebaut. Um die dort gemessenen phänotypischen Daten mit SNP-Daten korrelieren zu können wurden diese Klone mit Hilfe der KASP- Technologie, siehe Kapitel 7, an diversen Genorten genotypisiert. Aufgrund von Umstrukturierungen auf den Flächen war es in Einzelfällen nötig, von einzelnen Klonen zur weiteren Erhaltung Steckhölzer zu schneiden (15 Steckhölzer pro Klon). Diese wurden dann im Frühjahr 2011 im Kamp kultiviert. Eine letzte Erhebung phänotypischer Merkmale erfolgte im Frühjahr (siehe Anhang 1_Phänotypen/März2013) 3.3 Abgabe von Material an das TI Großhansdorf Ein Schwerpunkt der Kollegen vom TI Großhansdorf liegt in Untersuchungen der Effekte von Genvarianten in Kreuzungsnachkommen und deren Eltern. Deshalb wurden schon am gefriergetrocknete Blattproben von 31 verwendeten Kreuzungseltern (Fastwood-Kreuzungen 2007 und 2009) verschiedener Pappelarten dem TI Großhansdorf zur Verfügung gestellt. Um auch phänotypische Merkmale bewerten zu können wurde die im Rahmen des FastWOOD- Projektes durchgeführte Vermehrung und Absteckung der Kreuzungseltern unterstützt. Vermehrungsgut wurde im Spätsommer 2011 als Grünstecklinge von bewurzelten Blühreisern gewonnen. In einigen Fällen war es nötig, eine weitere Vermehrung des Materials im Frühjahr 2012 vorzunehmen. Aus einer Auswahl von 27 Nachkommenschaften die 2009 erzeugt wurden konnten dem TI Großhandorf im September 2011 DNA-Proben und im Frühjahr 2013 auch Steckhölzer (Ramets) einer größeren Nachkommenschaft zur weiteren phänotypischen Charakterisierung zur Verfügung gestellt werden. Das abgegebene Material ist in Anhang 2_ Materialabgabe aufgelistet. 3.4 Sicherung von Klonen mit auffälligen Merkmalsausprägungen und Klonen aus älteren Zuchtprogrammen Aufgrund der begrenzten Arbeitskapazitäten und aus organisatorischen Gründen war es 2010 nicht möglich, mehr als 70 Klone in die Untersuchungen mit einzubeziehen. Zur weiteren Kultur wurden aus den FastWOOD-Kreuzungen von 2007 (freie Abblüte) und 2009 (gerichtete Kreuzungen) Klone mit interessanten Merkmalsausprägungen ausgewählt Die von Fröhlich & Grosscurth (1973) beschriebenen Klone, siehe Tabelle 3, werden mit erheblichem Aufwand seit Jahrzehnten in Klonsammlungen, die der NW-FVA zugeeignet sind, erhalten. 11

13 . Tabelle 3: Phänotypisch eingehend charakterisierte Pappelklone (Fröhlich und Grosscurth, 1973), die durch die NW-FVA mit Hilfe der Sequenzanalyse untersucht wurden. Sektion Aigeiros Kreuzungsgruppe Klon/Sorte Sektion Populus L. Kreuzungsgruppe Klon/Sorte P. euramericana Allenstein' P. canescens (ca-typ) Ing 14 P. euramericana Baden 161 (1) P. canescens (ca-typ) Ing 7 P. euramericana Baden 553 P. canescens (ca-typ) Ing 9b P. euramericana Bietigheim' (Baden 513) P. canescens (cc-typ) Ingolstadt 3a' P. euramericana Blanc du Poitou' P. canescens (cc-typ) Schleswig 1' P. euramericana Blanquillo de Bucos' P. canescens (cc-typ) Schl 2 P. euramericana Brabantica' P. tremula P. tremuloides -triploid- Astria' P. euramericana Dolomiten' P. tremula Bs 12 P. euramericana Drömling' P. tremula Bs 4 P. euramericana Eckhof' P. tremula Bs 5 P. euramericana Flachslanden' P. tremula Bs 9 P. euramericana Forndorf' P. tremula Norw 2 P. euramericana Gelrica' P. tremula Norw 3 P. euramericana Grandis' P. euramericana Harff' Sektion Tacamahaca Kreuzungsgruppe Klon/Sorte P. euramericana Heidemij' P. cathayana 306/52 P. euramericana I 154 Casale P. maximowiczii 121/66 P. euramericana I 214_Casale' P. maximowiczii 124/66 P. euramericana I 262 Casale P. maximowiczii 126/66 P. euramericana I 45/51_Casale P. maximowiczii 14/65 P. euramericana I 455 Casale P. maximowiczii 146/65 P. euramericana I 476 Casale P. maximowiczii 127/66 P. euramericana I 488 Casale P. maximowiczii 15/65 P. euramericana I 92/40_Casale P. maximowiczii 16/65 P. euramericana Jacometti 78 B' P. maximowiczii 76/65 P. euramericana Karolina-Carolin di C. P. szechuanica 275/49 P. euramericana Kastenwört' P. trichocarpa Blom P. euramericana Lampertheim' P. trichocarpa Brühl 2' P. euramericana Leipzig' P. trichocarpa Brühl 8' P. euramericana Lingenfeld' P. trichocarpa ML-Schwester P. euramericana Lloydii P. trichocarpa Muhle Larsen' P. euramericana Löns' P. trichocarpa Scott-Pauley' P. euramericana Marilandica' P. trichocarpa Weser 4 P. euramericana Ostia' P. trichocarpa Weser 6 P. euramericana Regenerata Kew' P. trichocarpa Weser 8 P. euramericana Robusta' P. trichocarpa 603/52 P. euramericana Selys' P. trichocarpa 604/52 P. euramericana Serotina' P. trichocarpa 605/52(1) P. euramericana Spreewald' P. trichocarpa 605/52(2) P. euramericana Steckby' P. trichocarpa 612/52 P. euramericana Tardif de Champagne' P. trichocarpa 609/52 (2) P. euramericana Virg. De Frignicourt' P. trichocarpa 607/52 P. euramericana Virg. De Nancy' P. trichocarpa 613/52 P. euramericana Zürich 03/1 P. trichocarpa 622/52 P. nigra Italica' P. trichocarpa 623/52 P. nigra Plantierensis' P. trichocarpa 624/52 P. nigra Pyramidalis' P. max. trichocarpa P. 'Androscoggin' P. nigra Vereecken' P. nigra Vert de Garonne' Intersektionelle Hybriden Kreuzungsgruppe Klon/Sorte P. deltoides Hoosac river, Massachu. P. angulata trichocarpa P. x generosa P. deltoides Marquette' P. max. berolinensis Oxford' P. deltoides 73/53(3) P. max. P. nigra var.plantierensis Rochester' P. deltoides 9/54(1) P. maximowiczii berolinensis Geneva' P. maximowiczii trichocarpa Hybride 275' P. nigra laurifolia Rumford' P. deltoides trichocarpa Barn P. trichocarpa deltoides Rap 4. Korrelationen der phänotypischen Merkmale 4.1 Korrelationen der Volumenleistung von Sämlingen und Stecklingen die entsprechend des phänotypischen Merkmals Höhe frühselektiert wurden. 12

14 A. B. Abb. 3. Korrelationen der Volumenleistungen der Aufwüchse auf Sämlingswurzel und der Volumenleistung einjähriger Aufwüchse der Stecklinge (verklont) mit A.. 2jähriger Adventivwurzel (rho.pearson =0,3971, rho.spearman =0,3694, Adj. R 2 =0,1553) (nach der 1. Selektion im Saatbeet, N=356) und A.. 1jähriger Adventivwurzel (rho.pearson =0,3908; rho.spearman =0,3695, Adj. R 2 =0,1387) (nach der 2. Selektion anhand der Leistung der Stecklinge mit 1jh. Adventivwurzel, N=61); Rot markiert sind die Werte der Nachkommen der Fam. 12 (Mutter: P. maximowiczii ); Innerhalb der 1. und 3. Quantile finden sich 50 % aller Werte. 13

15 Im Rahmen der Bachelorarbeit von Herrn Briebach (Anhang1_Phänotypen/Briebach), siehe auch Briebach et al. (2012b) konnte gezeigt werden, daß zwischen der Höhenwuchsleistung von Nachkommen verschiedenster Familien auf Sämlingswurzel (freie Abblüte 2007) gemessen am Sämling in der zweiten Vegetationsperiode und der Höhenwuchsleistung von einjährigen Aufwüchsen auf ein- (Abb. 3A) oder zweijähriger Adventivwurzel (Abb. 3B) keine enge Korrelation besteht. Somit ist nachgewiesen, dass es nicht ausreicht Zuchtsorten nur anhand der Höhenwuchsleistungen im Saatbeet zu selektieren. 4.2 Korrelationen der Merkmale Blattfläche und Volumenleistung. Auffällig war auch die schwache Korrelation (Pearson 0,2874, Bestimmtheitsmaß: 0,0826) der Merkmale Blattfläche und verholztes Volumen der einjährigen Aufwüchse auf zweijähriger Adventivwurzel, siehe Abb. 4 an den selektierten Nachkommen aus freier Abblüte Korrelation Blattfläche/Volumenleistung mittl. Blattfläche [qcm] y = 0,8035x ,5 R 2 = 0, mittl. Volumen [ccm] Abb. 4: Korrelation der mittl. Blattfläche (3 Blätter/Ramet, aus 60 cm Höhe) zum mittl. Volumen einjähriger Aufwüchse von 61 selektierten und klonierten Nachkommen (N=605) aus freier Abblüte auf zweijähriger Adventivwurzel (Standort Weserkamp, 2011). 14

16 5. Erprobung des Tilling-Verfahrens 5.1 Etablierung der TILLING Methode zur Detektion von SNPs Das TILLING-Verfahren beruht auf einer Hybridisierung von markierter, veränderter DNA mit einer Referenz-DNA. Strukturelle Veränderungen während der Hybridisierung, die aufgrund der Sequenzunterschiede auftreten, werden durch ein bestimmtes Enzym (Nuklease) erkannt. Dies hat zur Folge, dass das Enzym die DNA an diesen Stellen zerschneidet. Auf diese Weise entstehen Fragmente, die später über ein PAA-Gel am Licor-Sequenzierer detektiert werden können (COLBERT et al., 2001). Das TILLING-Verfahren erlaubt theoretisch das schnelle Screenen mutierter Klone bei großem Probenumfang. Für die genaue Identifizierung der Mutation muß jedoch eine Sequenzanalyse erfolgen. Für die PCR empfiehlt sich nach Literaturangaben die Verwendung einer Hotstart DNA-Polymerase mit Korrekturlesefunktion. Ablesefehler der Polymerase sollten somit während der PCR korrigiert werden. Außerdem sollte die Entstehung unspezifischer Nebenprodukte verhindert werden. Als System zur Identifizierung von Punktmutationen wurde auf das Surveyor Mutation Detection Kit zurückgegriffen, welches alle notwendigen Komponenten für die Enzymbehandlung enthält. Unter Verwendung von Test-DNA gelang die Etablierung des Verfahrens. Zur Auswertung wurde die Software GELBuddy verwendet Einschränkungen des Tilling-Verfahrens Die Trennung von DNA-Fragmenten in Platten-Sequenzern unterliegt Faktoren, die ihre Reproduzierbarkeit stark einschränken können. So entscheidet die Probenkonzentration, die Art der Probenauftragung, die manuell erfolgt als auch die beschränkte Länge der Platten über die Qualität der Trennung. Wenn eine hohe Anzahl von SNP s innerhalb eines PCR-Fragmentes vorliegt wird es zunehmend schwieriger die verdauten Produkte/SNPs zu identifizieren. Wiederholt kommt es deshalb zu verfahrensbedingten Einschränkungen der Auswertbarkeit vorhandener SNPs. Aufgrund dieser Einschränkungen, des vorliegenden breiten Artenspektrums und der beim 4. Arbeitstreffen von den Kollegen des BMBF-Projektes Isowood beschriebenen negativen Erfahrungen wurde deshalb das Vorhaben EcoTilling als Identifizierungsmethode für SNPs in den Pappelgenotypen anzuwenden nicht weiter verfolgt 6. DNA-Sequenzierung nach Sanger 6.1 Vorgehensweise und Primerdesign Für die DNA-Sequenzierungen nach Sanger (Kettenabbruch) wurden Proben an die Fa. GATC in Konstanz versandt. Diese konservative Methode erlaubt die Sequenzierung beider DNA-Stränge in 5 /3 - und in 3 /5 -Richtung sodaß die vorhandenen Nukleotidvariationen mit größerer Sicherheit detektiert werden können.zur Amplifikation der PCR-Fragmente wurde teilweise auf bereits publizierte Primer zurückgegriffen (Fladung et al., 2009; siehe Tabelle 4). Diese waren so entworfen worden, dass sie auch für die nachfolgende Sequenzierungsreaktion benutzt werden konnten. Einige dieser Primer erfüllten jedoch nicht die Voraussetzungen, die durch die Sequenzierungsfirma GATC Biotech gefordert werden. An dieser Stelle wurden neue Sequenzierungsprimer entworfen und erfolgreich eingesetzt (Tabelle 4). Das Fragment des Gens tb1 wurde mittlerweile ebenfalls sequenziert und ist für weitere Auswertungen verfügbar. Für vier Genfragmente der Gene CLV1, KNAT1, MP1 und phyb2 wurden sowohl PCR-Primer als auch Sequenzierungs-Primer entworfen (Tabelle 5). 15

17 Tabelle 4: PCR-Primer zur Amplifikation von Fragmenten in Kandidatengenen. Die bereits publizierten Primer (*Fladung et al., 2009) dienten in den meisten Fällen gleichzeitig auch als Sequenzierungsprimer. Primerbezeichnung Primersequenz 5'-3' publiziert* clv1_for GCTGGTTAACTTCTTCCTCTCT clv1_rev CGAAAGATCCAGGAATACAAG kn1-like_2_for CCCTCTCTAACACACCAGAATAC kn1-like_2_rev TCACGGTACTTCACTAGCATGT ARF5_1_2_for GGGGTTTGAGTTGTTGAGGTA ARF5_1_2_rev TGGGAATCTGTGAAGTAGCTGA phyb2_for TCCCCACTACGCTATACTATACTAA phyb2_rev GCTCGTCCTCATGAAACTTAT lfy_for TGTAAGGCCAAGGGAGCTATG lfy_rev TTGCTGTACTGGCTCCTCAGA ppo_for AAAGATCATAGACTTCAGACC ppo_rev AGTATACCTTAGCCTTCTATT CAD-like_for TGGGTAGCCTTGAAACAG CAD-like_2_rev ACTTCATGGCTATAGATC tb1_for CTAACCATACCATGATTG tb1_rev ATTGCTCACTAATGAGTC GA20ox_for ATAGATTGCATCAAAACC GA20ox_rev CGAACTCAGCGAAATCTT cbf1_for TGCTGACAAGCAAGAATC cbf1_rev TAACTACTCCACAACGAC Tabelle 5: Primer, die zur Sequenzierung der PCR-Produkte entworfen wurden. Primerbezeichnung SEQ_clv_2_for SEQ_clv1_rev SEQ_kn1-like_for SEQ_kn1-li_2_rev SEQ_ARF5.1_for SEQ_ARF5.1_rev SEQ_phyB2_for SEQ_phyB2_rev lfy_seq_for lfy_seq_rev SEQ_CAD_rev SEQ_tb1_rev Primersequenz 5'-3' CTTGCCACACTACTCCTC GGTGGAATCTTTCCTGTG TCCCAGGACATGACTCT CGAATTGTCCCTTGAAG TTCTATTGAGGTGCTCTG AACGGCCACCTATACATG TTTCGGTCACTCTCCAC CCGGTAAGCTCTCTCAC AGAGGAGTTGTTTCAAGC ACCAGCATGAGCTCAAAG CATGGCTATAGATCACACC TTCGTCCCTCTCTTGTC : Für das Kandidatengen Gamma-TIP misslang die Konstruktion hinreichend brauchbarer Primer. 6.2 Sequenz-Analyse Die DNA-Sequenzen lagen in der Regel bereits wenige Tage nach Versand digital vor und wurden durch die Firma GATC zum Download zur Verfügung gestellt. Die Bearbeitung und Auswertung der Sequenzen erfolgte mit der Software CodonCode Aligner. Alle erhaltenen Sequenzen wurden zunächst durch Betrachtung der Rohdaten (Elektropherogramme) visuell beurteilt und editiert. Dabei wurden jeweils in Abhängigkeit von der Qualität der vorliegenden Sequenz undeutliche Bereiche entfernt, Sequenzierungsartefakte identifiziert und falsch benannte Basen korrigiert. Wenn Individuen 16

18 heterozygote Mutationen aufwiesen, wurden diese Basen durch Abkürzungen des Nucleotide ambiguity code entsprechend gekennzeichnet. Zur Verifizierung wurde darauf geachtet, beide Stränge der PCR-Produkte zu sequenzieren, siehe Abb. 5. Dies erleichterte die Identifizierung von Sequenzierungsartefakten und erhöhte gleichzeitig die Aussagekraft der vorliegenden Informationen. Abb. 5: Beispiel für den Abgleich von Sequenzen, die mit dem forward- und reverse-primer gewonnen wurden (Probe: P. trichocarpa, 605/52(1), Fragment des CLV1-Gens). Jedes Floureszenzsignal symbolisiert eine Base, die aufgrund der Farbe identifiziert werden kann. Proben, die in Bezug auf eine bestimmte Base einen heterozygoten Genotyp aufweisen, zeigen an dieser Stelle zwei Signale unterschiedlicher Farbe (siehe Pfeil, R=A/G) Schließlich konnte jeder Probe eine einzige Sequenz zugeordnet werden, die sogenannte consensus- Sequenz. Im nächsten Schritt wurden alle consensus-sequenzen mit einer Referenzsequenz verglichen. Als Referenz diente das vollständig sequenzierte Genom des P. trichocarpa-klons cv. Nisqually 1. Diese Sequenzinformationen sind in der öffentlichen Datenbank NCBI hinterlegt und jederzeit verfügbar. Außerdem erfolgte stichprobenartig eine Überprüfung der Sequenzen mittels des Nucleotide Basic Local Alignment Search Tools (BLAST)- einer Funktion, mit der in der NCBI-Datenbank die P. trichocarpa-sequenzen mit der höchsten Ähnlichkeit zur Ausgangs-sequenz ermittelt werden können. Dies diente der Überprüfung, ob auch wirklich der gewünschte Genabschnitt in der PCR amplifiziert worden ist. Schließlich konnte mit Hilfe der Software nach Mutationen (SNPs, Indels und Mikrosatelliten) gesucht werden. Parallel dazu erfolgte dann auch die Überprüfung der Mutationen auf Synonymität. Dabei wurde ermittelt, ob Basenaustausche in kodierenden DNA-Regionen (Exons) einen Aminosäureaustausch herbeiführen. Aus dieser Überprüfung lässt sich dann später ableiten, ob der Austausch einer Aminosäure möglicherweise die Funktion des daraus resultierenden Proteins beeinflussen könnte. Abbildung 6 zeigt den Vergleich von consensus-sequenzen mit der Referenzsequenz von P. trichocarpa, beispielhaft dargestellt an einem Ausschnitt des CLV1-Gens. 17

19 Abb. 6: Vergleich von consensus-sequenzen mit der Referenzsequenz von P. trichocarpa, beispielhaft dargestellt an einem Ausschnitt des CLV1-Gens. Blau markierte Basen kennzeichnen einen homozygoten Basenaustausch, rosa markierte Basen einen heterozygoten Genotyp. 6.3 Ergebnisse der Sanger-Sequenzanalysen Entsprechend der oben beschriebenen Vorgehensweise wurden die Sequenzen aller Gene/ Genfragmente ausgewertet. Die in Tabelle 6 dargestellten Ergebnisse geben einen Überblick über die Variabilität in den untersuchten Kandidatengenen und Genfragmenten. Zu berücksichtigen ist dabei, dass die Anzahl der SNPs unter Berücksichtigung mehrerer Arten sowie Hybriden zustande gekommen ist, siehe auch Tabelle 7. Sie gibt noch keinerlei Auskunft über die innerartlichen Variabilitäten. Bisher konnten jeweils in Abhängigkeit von der amplifizierten Region sowohl in Exons als auch in Introns SNPs identifiziert werden. Einige der Exon-SNPs gehen mit Aminosäureaustauschen einher- einer Veränderung, die möglicherweise Folgen für die Proteinfunktion haben könnte. Insertionen bzw. Deletionen (Indels) sind vergleichsweise seltene Ereignisse und konnten bisher hauptsächlich in Intronregionen identifiziert werden. Indels in Exonregionen waren selten und meist individuell auf einzelne Klone beschränkt. In der Regel handelte es sich dabei um die Abwesenheit von nur einer Base. Ob sich daraus Konsequenzen auf Proteinebene ergeben, bleibt in der Folge zu prüfen. Die Ergebnisse der Sequenzanalysen im FASTA-Format finden sich im Anhang (Anhang 3_SangerSequenzen). 18

20 Tabelle 6: Überblick über identifizierte Sequenzvariationen in Kandidatengenen/Genfragmenten, Gen LG PCR- Fragment laut db [bp] Aligned [bp] Bereich ab Start bis SNPs Gesamt Singletons multiallelische SNPs SNPs in Exons Aminosäureaustausche nichtsyn. SNPs in Introns SNPs in 5'-UTR Indels NRs Proben [n] LFY PPO CAD-L GA20ox CBF TB ARF (-157) PHYB (-42) CLV (-106) KNAT (-219) Summe Legende: LG, likage group (Kopplungsgruppe; NR, nukleotid repeats (einschließlich Mikrosatelliten), UTR, nicht translatierte Region

21 Tabelle 7: Artspektrum der ausgewerteten Sequenzen Tacamahaca Aigeiros Leuce MP1 PhyB2 CLV1 KNAT1 LFY CAD-LIKE GA20ox CBF1 P. deltoides P. nigra P. x euramericana P. trichocarpa P. maximowiczii P. simonii P. koreana P. szechuanica P. cathayana Hybriden P. tremula P. x canescens SNP-Genotypisierung (KASP-Technologie) Die detektierten SNPs wurden zur Genotypisierung mit einem FRET-basierten System (FRET, fluorescence resonant energy transfer) auf der sog. KASP-Plattform (KBioscience, LGC Genomics) vorbereitet. Diese patentiertetechnik erlaubt eine biallele Erfassung von SNP s und InDels an spezifischen Loci über ein breites Spektrum von genomischen DNA-Proben.Neben der SNP-Position müssen auch jeweils 50 Nachbarpositionen auf dem DNA-Strang bekannt sein. Von KBioscience wird dann geprüft, welche der detektierten SNPs/ InDels sich für dieses Real-Time-PCR-basierte, allelspezifische Verfahren (Endpunktgenotypisierung) eignen. Nach erfolgreichem Design der Genotypisierungs-Assays und einem Test an einer Stichprobe, konnte eine Genotypisierung an 13 SNP-Positionen dreier Kandidatengene (CLV1, CBF1, PHYB2) bei zunächst 57 Individuen (92 Proben mit Wiederholungen) zweifach selektierter Pappeln der Kreuzungen 2007 durchgeführt werden. Es wurden 1248 Datenpunkte detektiert. In Abbildung 7 ist das Verfahren der KASP-Technologie der Fa. LGC Genomics zur Erstellung allelspezifischer Primer beschrieben: 20

22 Abb. 7: Verfahren der KASP-Technologie der Fa. LGC-Genomics in 4 Schritten. ( 8. Assoziation der SNP-Daten mit dem Phänotyp/Ertragsmerkmalen 8.1 Sektion Aigeiros Mit Unterstützung des Bioinformatikers unseres Hauses, Herrn Dr. Egbert Schönfelder, wurde die Anwendung R-basierter Programme erprobt. R ist eine Programmiersprache und freie Software- Umgebung zur statistischen Datenanalyse. Hier sind bereits passende Packages zur SNP-Analyse verfügbar (SNPassoc für SNP-Assoziationsanalysen und HaploStats zur Analyse von Haplotypen). Mit den genannten Programmen ist es u.a. möglich, aus der Gesamtheit der erfassten SNPs Haplotypen für die Assoziation von Merkmalsausprägungen zu extrahieren. In der folgenden Abbildung 8 werden am Beispiel des Kandidatengens CLAVATA1 der untersuchten Pappeln der Sektion Aigeiros signifikante Assoziationen der SNP s mit der Zielgröße Höhe d.h. die signifikanten p-werte bei nominalem Level (gepunktete Linie) und nach Bonferroni-Korrektur (gestrichelte Linie), unter Verwendung der Funktion WGassociation (whole genome association) dargestellt. 21

23 Abb. 8: Ergebnis der whole genome -Assoziation für Pappeln der Sektion Aigeiros und des Kandidatengens CLAVATA1 in Bezug auf das Zielmerkmal Höhe. Dargestellt sind statistisch signifikante Assoziationen auf nominalem Level (gepunktete Linie) und nach der Bonferroni-Korrektur (gestrichelte Linie). In Abbildung 9 wird die Assoziation mit dem Zielmerkmals Frühjahrsaustrieb dargestellt. Hier zeigen sich einige SNPs nur unter der Annahme eines codominanten Erbgangs als signifikant wenn die Bonferroni-Korrenktur, die die Anzahl der Prüfeinheiten berücksichtigt, vorgenommen wird. Die nichtsynonmen SNP s CLV 737 A>G (Gln>Arg) und CLV 766A>G (Ser>Arg) waren jedoch nur innerhalb der Art P. nigra variabel. 22

24 Abb. 9: Ergebnis der whole genome -Assoziation für Pappeln der Sektion Aigeiros und des Kandidatengens CLAVATA1 in Bezug auf das Zielmerkmal Frühjahrsaustrieb.. Dargestellt sind statistisch signifikante Assoziationen auf nominalem Level (gepunktete Linie) und nach der Bonferroni-Korrektur (gestrichelte Linie). Insgesamt wurden in allen 42 untersuchten Pappeln der Sektion Aigeiros 35 SNPs des Kandidatengens CLAVATA 1 analysiert. Die weitere Analyse mit Haplostats zeigte die Kopplung verschiedener SNP s, siehe Abb. 10 und eine Markierung (Sternchen) für die SNP s mit stärkstem Effekt. Die für das Merkmal Höhe signifikanten SNPs CLV299G>C und CLV306A>T erwiesen sich so als vollständig gekoppelt. 23

25 Abb. 10: Ergebnis der Clusteranalyse aller SNP s des Kandidatengens CLAVATA 1 von Pappeln der Sektion Aigeiros mit dem R-Programm SNPclust. (Packet haplo.stats) Um die quantitativen Effekte für das Merkmal Höhe darzustellen erfolgte eine Verrechnung der Daten mit dem Internet-basierten Programm SNPStats. So zeigte der SNP CLV 299G>C, der eine nichtsynonyme Änderung darstellt und den Austausch von Serin mit Threonin bewirkt, die in Tab. 8 beschriebenen signifikanten positiven (Rot) oder negativen (Grün) Effekte (Erhöhung resp. Minderung des Boniturwertes). Tab. 8: Ergebnisse der Analyse der Assoziation des SNP s CLV 299 G>C mit dem Zielmerkmal Höhe in der Gruppe Aigeiros 24

26 Berücksichtigt werden jeweils 5 verschiedene Erbgänge (dominant, codominant, rezessiv, überdominant und log-additiv) und es wird erkennbar, dass für einige SNPs signifikante Assoziationen sowohl bei codominantem als auch bei rezessivem oder überdominantem Erbgang gegeben sind.das beste Model kann mit Hilfe eines likelihood ratio tests ermitelt werden. Das mit dem geringsten AIC- Wert (AKAIKE, 1974) von 46,8 bzw. BIC-Wert (Bayesian information criterion) von 53,7 ausgezeichnete codominante Modell ist mit höchster Wahrscheinlichkeit das zutreffende Modell des Erbgangs. Der von SCHWARZ (1978) eingeführte BIC-Wert verschärft den AIC-Wert in Abhängigkeit von der Stichprobengröße und der Anzahl zusätzlicher Parameter. Der SNP LFY 558G>C erwies sich innerhalb der Arten P. deltoides und P. xcanadensis als variabel und war bei allen möglichen Erbgängen signifikant assoziiert mit Beastungsdichte, siehe Tab. 9. Tab. 9: Signifikante Assoziation des SNPs LFY 558G>C mit Beastungsdichte Von 34 analysierten SNPs des Kanditatengens PPO zeigten 15 SNPs signifikante Assoziation. Acht dieser SNPs bewirken einen Aminosäureaustausch wie z.b. PPO 969G>A den Austausch von Arginin gegen Lysin bewirkt Dieser SNP war signifikant assoziiert mit der Anfälligkeit gegen Marssonina.. Im Gegesatz dazu zeigt ein SNP des Kanditatengens Phytochrom B2 PHYB2 231A>G zwar eine signifikante Assoziation mit dem Frühjahrsaustrieb, bewirkt jedoch keinen Aminosäureaustausch. Auffällig waren auch signifikante Assoziationen desselben SNPs PHYB2 231A>G der sich innerhalb der Arten P. nigra und P. x canadensis als variabel erwies, mit Rostanfälligkeit, siehe Tabelle 10. Tab. 10: Signifikante Assosziation des SNPs PHYB2 231A>G mit Rostanfälligkeit der Arten P. nigra und P. x canadensis Auch die SNPs Ga20ox 370C>T und Ga20ox 447A>G zeigten bei enger Kopplung in der Sektion Aigeiros eine signifikante Assoziation mit dem BHD, siehe Tab. 11, bewirken jedoch keinen Aminosäureaustausch. 25