Wege zur Überprüfung der Robustheit in der RP-HPLC Dr. Hans Werner Bilke

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1 Wege zur Überprüfung der Robustheit in der RP-HPLC Dr. Hans Werner Bilke SANDOZ GmbH / Novartis Gruppe

2 Robustheitsprüfung von RPLC-Methoden Unzureichende Robustheit ist oftmals Ursache für Probleme in der chromatographischen Praxis (Routineanalytik, Methodentransfer ). In welcher Art und Weise ändert sich die Auflösung, wenn bestimmte Schwankungen in der Einstellung der experimentellen Parameter zugelassen werden sollten? Ohne Robustheitsangaben keine Methodenvalidierung! Validierte RPLC-Methoden müssen sich über viele Jahre in der Praxis bewähren. Eine Revalidierung aufgrund mangelnder Robustheit ist zeitaufwendig und teuer. 2

3 Wege zur Gewinnung von Robustheitsaussagen Robustheitstest mittels systematischer Methodenentwicklung Computergestützte Methodenentwicklung Robustheitstest mittels Versuchsplanung (DoE) Statistische Versuchsplanung Eine gute Praxis ist die systematische Veränderung der wichtigen chromatographischen Parameter und das Messen ihrer Effekte auf die Trennung. Diese Vorgangsweise gilt für beide Wege. 3

4 Robustheitstest mittels systematischer Methodenentwicklung Eine computergestützte Methodenentwicklung durch den Einsatz vom Simulationsprogrammen (z.b. DryLab) kann sehr nützlich sein zur Untersuchung des Einflusses der jeweiligen chromatographischen Parameter auf die Trennung und somit auf die Robustheit der RP-HPLC-Methode Die wichtigsten chromatographischen Parameter sind: % der organischen mobilen Phase B ph der wässrigen mobilen Phase A Säulenofentemperatur Pufferkonzentration oder Ionenstärke der wässrigen mobilen Phase A für eine isokratische Arbeitsweise und zusätzlich Gradientenlaufzeit Gradientensteigung Menge organisches Lösungsmittel in der mobilen Phase am Anfang des Gradienten (%B) Menge organisches Lösungsmittel in der mobilen Phase am Ende des Gradienten (%B) für eine Gradientenarbeitsweise. 4

5 Karte der kritischen Auflösung Genaue Kenntnisse der Peakbewegung erleichtern das Anpassen der RP- HPLC-Methode bei gezielten und aber auch bei zufälligen Veränderungen dieser exerimentellen Parameter und lassen sich ohne zusätzlichen experimentellen Aufwand aus einer sogenannten Karte der kritischen Auflösung gewinnen. Eine solche Karte wird auf Basis weniger chromatographischer Läufe berechnet und stellt die kritische Auflösung als Funktion von zwei experimentellen Parametern (simultan variiert) dar. 6-Läufe zur simultanen Optimierung von ph und Gradientenlaufzeit 4-Läufe zur simultanen Optimierung von Temperatur und Gradientenlaufzeit In der Karte der kritischen Auflösung ist die kritische Auflösung über Farbwerte beschrieben, während an den Achsen die Werte der variierten experimentellen Parameter aufgetragen sind. In dieser Karte lassen sich sofort anhand der Farben die optimalen Parameterwerte für eine maximale Auflösung ablesen. Eine Einschätzung der Methodenrobustheit für ein Variablenpaar ergibt sich aus der Farbänderung am entsprechenden Punkt in der Auflösungskarte. 5

6 Beispiel: Optimierte Trennung einer pharmazeutischen Probe Verwandte Substanzen Neben- und Abbauprodukte Aktive Substanzen Unbekannte Bekannte Aromastoffe 6 Konservierungsmittel Süßstoff time(min) 6

7 Simultane Optimierung von Gradientenlaufzeit und ph ph ph ph Grundläufe n = Anzahl der Peaks ph min [2n (min)] t G 70 min [6n (min)] 7

8 Zweidimensionale Auflösungskarte für Gradientenlaufzeit gegen ph ph Bereiche für robuste Trennungen des kritischen Peakpaares (Rs >2.0) robuster Bereich für schnellen Analysen (ökonomisch) robuster Bereich für Analysen mit der besten Auflösung (aber unökonomisch) R s -Skala Gradientenlaufzeit (min) 8

9 Beste Trennung bei einem Gradientenanstieg von % MeOH/min und ph 2.5 für die wässrige mobile Phase Simulationslauf kritisches Peakpaar 4, Zeit (min) Realer Laborlauf kritisches Peakpaar 4, Zeit (min) 9

10 Simultane Optimierung von Gradientenlaufzeit und Temperatur 75 C 5 6 Temp. 50 C 4/6 Grundläufe 3 4 n = Anzahl der Peaks 25 C min [2n (min)] t G 70 min [6n (min)] 10

11 Zweidimensionale Auflösungskarte für Gradientenlaufzeit gegen Temperatur Temp.( C) Bereiche für robuste Trennungen des kritischen Peakpaares (Rs >2.0) Robuster Bereich für schnelle Analysen (ökonomischl) Robuster Bereich für Analyse mit bester Auflösung (aber unökonomisch) R s -Skala Gradientenzeit (min) 11

12 Beste Trennung bei einem Gradientenanstieg von % MeOH/min und einer Temperatur von 50 C Simulationslauf Zeit (min) kritisches Peakpaar 4, Realer Laborlauf kritisches Peakpaar 4, Zeit (min)

13 Zweidimensionale Auflösungskarte für Gradientenlaufzeit gegen Temperatur Quantifizierte Darstellung der Ergebnisse der Robustheit, ableitend aus der Karte der kritischen Auflösung (Programm PeakMatch ) Schwankungen der Temperatur und der Gradientenlaufzeit wirken sich in den angegebenen Bereichen kaum auf die Auflösung aus! 13 Die Methode ist robust!

14 Aussagen zur Optimierung und Robustheit mittels einer computergestützten RP-HPLC-Methodenentwicklung Durch Anwendung einer systematischen, rechnergestützten Methodenentwicklung lassen sich ohne zusätzlichen experimentellen Aufwand nicht nur optimale chromatographische Bedingungen für eine beste und/ oder ökonomische Trennung finden sondern es lassen sich auch Aussagen zur Methodenrobustheit gewinnen. Die gewonnen Informationen verschaffen dem HPLC-Anwender eine tiefere Einsicht in seine RP-HPLC-Methode. Sie geben ihm die Möglichkeit, die kritischen Parameter zu erkennen. Sie zeigen ihm die Grenzen der erlaubten Veränderungen bei der Einstellung der chromatographischen Bedingungen auf. 14

15 Robustheitstest mittels Versuchsplanung (DoE) Die statistische Versuchsplanung ist ein strategisches Hilfsmittel bei der Optimierung von Prozessen. Die statistische Versuchsplanung liefert ein empirisches Prozeßmodell für den Zusammenhang zwischen den Einfluß- und Störgrößen im Prozess und den resultierenden Zielgrößen. Hier gibt es eine ausgeprägte Unterscheidung zwischen Zielgrößen (responses) und Einflussgrößen (factors). Statistische Versuchsplanung ohne entsprechende Software zu betreiben ist mühsam, zeitraubend und nicht zeitgemäß. In den letzten Jahren hat es enorme Fortschritte bei den Algorithmen bei der Funktionalität und bei der Bedienbarkeit von Versuchsplanungssoftware gegeben. Es gibt Lösungen, die in allgemeine Statistik-Pakete eingebunden sind, andere sind allein und ausschließlich auf Versuchsplanung ausgerichtet. Einige Pakete richten sich an Anwender ohne große Vorkenntnisse, andere an Spezialisten mit profunden Statistik-Kenntnissen. 15

16 Empirisches Prozeßmodell (dargestellt als Black-Box-Modell nach Wember) 16 Puffer-pH-Wert Temperatur Gradientenlaufzeit % Modifier Flußrate Trennsäule Einflussgrößen x Störgrößen unbekannte + bekannte Prozeß Meßfehler ±σ e e Zielgrößen y Resolution Relative Retention Tailingfaktor Die Zielgröße y ist eine Funktion f() der Einflußgröße(n) x.

17 Ziel des Robustheitstests Unbestrittenes Ziel des Robustheitstests mit Hilfe statistischer Versuchsplanung ist es, mit möglichst wenigen Versuchen eine systematische Untersuchung der Zusammenhänge zwischen Zielgröße(n) y und Einflußgröße(xn) x1, x2, xp zu schaffen. Diese Zusammenhänge sind in den meisten Fällen gut durch ein lineares Modell (Plan erster Ordnung) zu beschreiben: y = c Konstante oder y-achsenabschnitt + a1*x1 + a2*x2 + a3*x3 + ap*xp Haupteffekte oder lineare Terme + b12*x1*x2 + b13*x1*x3 + Zweifach-Wechselwirkungen + b23*x2*x3 + b24*x2*x4 + + bp-1p*p-1*xp (insgesamt p*(p-1) Terme) + e Fehler Die Robustheit einer analytischen RP-HPLC-Methode kann durch Ausführung nachfolgender sechs Schritte bestimmt werden: Auswahl der Einflussgrößen (chemische und physikalische) Festsetzung der Nivaus der Einflussgrößen und deren Stufen Auswahl des Modells der Versuchsplanung Durchführung experimenteller Versuche und Messung analytischer Zielgrößen Aufzeigen von Effekten der Einflussgrößen Statistische Analyse und Interpretation der Resultate 17

18 Einflußgrößen Die Einflußgrößen können quantitativ (kontinuierlich einstellbar) oder qualitativ (nicht kontinuierlich einstellbar) sein. Die Einflußgrößen können für den Robustheitstest in zwei Gruppen eingeteilt werden: Methoden-verwandte Einflußgrößen und nicht-methoden-verwandte Einflußgrößen Methoden-verwandte Einflußgrößen umfassen generell quantitative Einflußgrößen ph des Eluenten, Temperatur der Trennsäule, Pufferkonzentration oder Ionenstärke des Eluenten, Menge an organischem Lösungsmittel im Eluenten. Nicht-Methoden-verwandte Einflußgrößen sind häufig qualitative Einflussgrößen wie z. B. die Trennsäulen-Einflußgrößen Charge, Alter, Hersteller. Die für den Robustheitstest auszuwählenden Einflußgrößen sollten gleich jenen sein, die sich in der täglichen Routinearbeit verändern können oder wenn eine RP-HPLC-Methode übertragen wird z.b. in ein anderes Labor oder auf ein anderes Gerät. 18

19 Einflußgrößen Für eine RP-HPLC-Methode sollten nachfolgend aufgeführte Einflußgrößen möglichst immer untersucht werden: ph der Pufferlösung Säulenofentemperatur % organisches Lösungsmittel am Anfang des Gradienten oder isokratische Bedingungen % organisches Lösungsmittel am Ende des Gradienten Steigung des Gradienten, ausgedrückt in Gradientenlaufzeit tg Säule (zwei verschiedene Chargen, benutzte und unbenutzte Säule) Dummy-Faktoren Die Dummy -Faktoren sind scheinbare Variablen und beinhalten die nominalen Parameterwerte der zu testenden RP-HPLC-Methode, d.h. sie verursachen keine Änderung in der Methode. Die geschätzten Effekte der Dummy können verwendet werden als eine Messung des experimentellen Fehlers von einem Effekt. 19

20 Einflußgrößen Zusätzliche Einflußgrößen sind: Konzentration an Zusätzen zur mobilen Phase, z.b. Ionenpaarreagenzien (mm) Flußrate Detektorwellenlänge Das Niveau einer jeden Einflußgröße sollte so gewählt werden, das es die maximale Differenz in den Werten für die Einflußgrößen einschliesst, die in der täglichen Routinearbeit oder bei einer Methodenübertragung auftreten kann. Das Testniveau der Einflußgrößen ist immer abhängig vom Zweck der Methode und sollte immer praxisbezogen sein. Die maximale Differenz der Einflußgrößenwerte ist in Robustheitstudien relativ klein. Ein linearer Zusammenhang der Zielgrößenfunktion y der meisten Einflußgrößen (Faktoren) in den zuprüfenden Intervallen kann als gegeben angenommen werden. Die Wahl von zwei Einstellstufen (two-level-design) für jede einzelne Einflußgröße (low/high level) ist somit vollkommen ausreichend. 20

21 Einflußgrößen Zusätzliche Einflußgrößen sind: Konzentration an Zusätzen zur mobilen Phase, z.b. Ionenpaarreagenzien (mm) Flußrate Detektorwellenlänge Das Niveau einer jeden Einflußgröße sollte so gewählt werden, das es die maximale Differenz in den Werten für die Einflußgrößen einschliesst, die in der täglichen Routinearbeit oder bei einer Methodenübertragung auftreten kann. Das Testniveau der Einflußgrößen ist immer abhängig vom Zweck der Methode und sollte immer praxisbezogen sein. Die maximale Differenz der Einflußgrößenwerte ist in Robustheitstudien relativ klein. Ein linearer Zusammenhang der Zielgrößenfunktion y der meisten Einflußgrößen (Faktoren) in den zuprüfenden Intervallen kann als gegeben angenommen werden. Die Wahl von zwei Einstellstufen (two-level-design) für jede einzelne Einflußgröße (low/high level) ist somit vollkommen ausreichend. 21

22 Einflußgrößen (Einstellbereiche) Einstellbereiche für den Test auf Robustheit ph der Pufferlösung: nominal ± 0.1 Einheiten nominal ± 0.2 Einheiten nominal ± 0.2 Einheiten nominal ± 0.2 Einheiten nominal ± 0.2 Einheiten nominal ± 0.3 Einheiten nominal ± 0.5 Einheiten Säulenofentemperatur: nominal ± 10 % rel. nominal ± 14 % rel. nominal ± 5 % rel. nominal ± 10 % rel. nominal ± 17 % rel. nominal ± 17 % rel. nominal ± 7 % rel. 22

23 Einflußgrößen (Einstellbereiche) Einstellbereiche für den Test auf Robustheit Pufferkonzentration: nominal ± 10 % rel. nominal ± 10 % rel. nominal ± 10 % rel. nominal ± 7 % rel. nominal ± 10 % rel. nominal ± 20 % rel. Konzentration an Zusätzen (u.a. Ionenpaarbildner): nominal ± 10 % rel. nominal ± 8 % rel. 23

24 Einflußgrößen (Einstellbereiche) Einstellbereiche für den Test auf Robustheit % organisches Lösungsmittel am Anfang des Gradienten oder isokratische Bedingungen: nominal ± 10 % rel. nominal ± 10 % rel. nominal ± 7 % rel. nominal ± 4 % rel. nominal ± 3 % rel. % organisches Lösungsmittel am Ende des Gradienten: nominal ± 10 % rel. nominal ± 4 % rel. Gradientensteigung, ausgedrückt in Gradientenzeit tg: nominal ± 10 % rel. nominal ± 5 % rel. 24

25 Einflußgrößen (Einstellbereiche) Einstellbereiche für den Test auf Robustheit Flußrate: nominal ± 0.1 ml/min nominal ± 0.1 ml/min nominal ± 0.1 ml/min nominal ± 0.1 ml/min und 0.2 ml/min nominal ± 0.05 ml/min Detektorwellenlänge: nominal ± 3 nm nominal ± 2 nm und 3 nm nominal ± 5 nm nominal ± 5 nm nominal ± 1 nm 25

26 Versuchspläne Verschiedene Typen der statistischen Versuchsplanung (DoE) können für den Robustheitstest einer HPLC-Methode verwendet werden Aber nur einige sind wirklich in Form von teilfaktoriellen Versuchsplänen und Plackett-Burman-Versuchsplänen praktikabel. Für faktorielle Versuchspläne (factorial designs) in Form von vollfaktoriellen Versuchsplänen (full factorial designs) spricht, dass mit solchen Versuchsplänen Regressionsmodelle mit Haupteffekten und Wechselwirkungen behandelt werden können. Dieser Typ von Versuchsplan, im dem alle möglichen Kombinationen der Einflußgrößen auf meist 2 Stufen (jeweils auf oberer und unterer Stufe) miteinander varriiert werden, wird in den meisten Fällen nur bei der Wahl von wenigen Einflußgrößen (z.b. 2 oder 3) eingesetzt; da die Anzahl der Ecken im (hochdimensionalen) Quader exponentiell mit der Anzahl der Einflussgrössen wächst. So ergeben z.b. 7 Einflußgrößen bereits 27 = 128 Versuche. Eine Reduzierung der Anzahl notwendiger Versuchsläufe, auch mit der Möglichkeit der Wahl einer größeren Anzahl von Einflussgrößen (z.b. 11) erreicht man mit teilfaktoriellen Versuchsplänen (fractional factorial 26 designs), die aus den vollfaktoriellen Plänen abgeleitet werden.

27 Versuchspläne Eckpunkte des Versuchsplanungsbereichs in Abhängigkeit von der Anzahl der Einflußgrößen 27

28 Versuchspläne 28

29 Versuchspläne Man kann mit solchen Versuchsplänen erster Ordnung nur Regressions modelle mit Haupteffekten untersuchen und muss voraussetzen, dass es keine Wechselwirkungen gibt. Die wichtigste Alternative zu den teilfaktoriellen Versuchsplänen sind Plackett-Burman-Versuchspläne Mit den Plackett-Burman-Versuchsplänen sind nun Versuchspläne gegeben, die ähnliche Eigenschaften wie die voll- und teilfaktorierten Versuchspläne zeigen, aber auch für alle Vielfache von 4 (12, 20, 24, 28, ), die keine Zweierpotenzen sind, konstruierbar sind. Als Nachteil erweist sich wiederum, wie bei den teilfaktoriellen Versuchsplänen, daß nur Haupteffekten schätzbar sind. Eine Vermischung zwischen Haupteffekten und Wechselwirkungen ist nicht so einfach zu ermitteln, da wenigsten eine Zweifachwechselwirkung mit einer Hauptwirkung vermengt ist und es somit in der Praxis zu Fehlinterpretationen kommen kann 29

30 Beispiel: Versuchsplanung zur Robustheit der RP-HPLC Versuchsplan-Typ : Plackett-Burmann Zahl der Einflußgrößen: 5 Zahl der Zielgröße: 1 (Auflösung des kritischen Peakpaares) Zahl der Versuche: 12 (+ 3 Dummi ) Einflußgröße Einheit untere Stufe obere Stufe Nominalwert (-1) (+1) 0 ph [ph Einheit] Temperatur [ C] Steigung (tg) [min] Modifier Konz. [% MeOH] Flußrate [ml/min]

31 Experimentelle Läufe (randomisiert) Plackett-Burman-Versuchsplan Versuch ph -Wert Temperatur Steigung (tg) Konz. Mod. Flußrate [ph Einheit] [ C] [min] [% MeOH] [ml/min] 1 2,6 47,5 31,65 4,5 1,1 2 2,4 52,5 34,65 4,5 1,1 3 2,4 52,5 31,35 5,5 0,9 4 2,6 47,5 34,65 4,5 0,9 5 2, ,4 47,5 34,65 5,5 0,9 7 2,6 47,5 31,35 5,5 1,1 8 2,4 47,5 34,65 5,5 1,1 9 2,4 47,5 31,35 4,5 0,9 10 2,4 52,5 31,35 4,5 1,1 11 2, ,6 52,5 34,65 5,5 1,1 13 2,6 52,5 31,35 5,5 0,9 14 2,6 52,5 34,65 4,5 0,9 15 2,

32 Analysenresultate und graphische Auswertung Graphische Auswertung der Daten mittels Paretodiagramm und Darstellung der Haupteffekte Das Paretodiagramm zeigt die wesentlichen Einflußgrößen für die Zielgröße (Auflösung des kritischen Peakpaares). Die Stärke der Effekte kann im Paretodiagramm gut beurteilt werden. Der wesentliche Einfluß auf die Zielgröße erfolgt meist durch die Wirkung dieser einzelnen Einflußgrößen. Deshalb nennt man diese Effekte der Einflußgrößen auch Haupteffekte. Die Darstellung der Haupteffekte gibt die Stärke und die Richtung, also die Wirkung, der Einflußgrößen für die Zielgröße wieder und beschreibt so einen geradlinigen Zusammenhang zwischen Ziel- und Einflußgröße. 32

33 Analysenresultate für die Trennung der aktiven Substanzen Plackett-Burmanph-Versuchsplan (randomisiert) und Analysenresultate Versuch ph -Wert Temperatur Steigung (tg) Konz. Mod. Flußrate [ph Einheit] [ C] [min] [% MeOH] [ml/min] kritische Auflösung R s für die Trennung der aktiven Substanzen [Peak 11-12] 1 2,6 47,5 31,65 4,5 1,1 2 2,4 52,5 34,65 4,5 1,1 3 2,4 52,5 31,35 5,5 0,9 4 2,6 47,5 34,65 4,5 0,9 5 2, ,4 47,5 34,65 5,5 0,9 7 2,6 47,5 31,35 5,5 1,1 8 2,4 47,5 34,65 5,5 1,1 9 2,4 47,5 31,35 4,5 0,9 10 2,4 52,5 31,35 4,5 1,1 11 2, ,6 52,5 34,65 5,5 1,1 13 2,6 52,5 31,35 5,5 0,9 14 2,6 52,5 34,65 4,5 0,9 15 2, ,0 3,0 2,7 2,9 3,0 3,0 2,8 3,2 2,7 2,8 3,0 3,0 2,8 3,0 2,9 33

34 Graphische Auswertung der Daten für die Trennung der aktiven Substanzen Paretodiagramm nur die Einflußgrößen E und H haben einen signifikant von Null verschiedenen Effekt E:Slope_tG H:Flowrate Standardized Pareto Chart for Resolution C:Temperature nicht signifikant von Null verschiedene Einflußgrößen (C, F, B) F:Conc. Modifier B:pH value Signifikanzlinie Standardized effect Haupteffekte Main Effects Plot for Resolution Resolution 3,12 3,08 3,04 3 2,96 2,92 2,88 2,84 2,8 ph value Slope_tG Flowrate Temperature Conc. Modifier 34

35 Chromatogramm bei schlechtester Kombination der Einflußgrößen auf die Trennung der aktiven Substanzen Laborlauf ph-wert 2.6 (2.5) Temperatur 52.5 C (50) Steigung (tg) min (33) Modifier Konz. 4.5 % MeOH (5) Flußrate 0.9 ml/min (1.0) kritisches Peakpaar 11,12 Auflösung Rs = Zeit (min) Zeit (min) 35

36 Analysenresultate für die Trennung der aktiven- und verwandten Substanzen Plackett-Burman-Versuchsplan (randomisiert) und Analysenresultate Versuch ph -Wert Temperatur Steigung (tg) Konz. Mod. Flußrate [ph Einheit] [ C] [min] [% MeOH] [ml/min] kritische Auflösung R s für die Trennung der aktiven und verwandten Substanzen [Peak 12-13] 1 2,6 47,5 31,65 4,5 1,1 2 2,4 52,5 34,65 4,5 1,1 3 2,4 52,5 31,35 5,5 0,9 4 2,6 47,5 34,65 4,5 0,9 5 2, ,4 47,5 34,65 5,5 0,9 7 2,6 47,5 31,35 5,5 1,1 8 2,4 47,5 34,65 5,5 1,1 9 2,4 47,5 31,35 4,5 0,9 10 2,4 52,5 31,35 4,5 1,1 11 2, ,6 52,5 34,65 5,5 1,1 13 2,6 52,5 31,35 5,5 0,9 14 2,6 52,5 34,65 4,5 0,9 15 2, ,7 1,7 1,7 1,8 1,8 1,8 1,7 2,0 1,7 1,6 1,8 1,7 1,8 1,9 1,8 36

37 Graphische Auswertung der Daten für die Trennung der aktivenund verwandten Substanzen Paretodiagramm nicht signifikant von Null verschiedene Einflußgrößen (E, C, H, F, B) E:Slope_tG C:Temperature H:Flowrate F:Conc. Modifier Standardized Pareto Chart for Resolution B:pH value Signifikanzlinie 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4 Standardized effect Haupteffekte Main Effects Plot for Resolution Resolution 1,84 1,82 1,8 1,78 1,76 1,74 1,72 1,7 ph value Slope_tG Flowrate Temperature Conc. Modifier 37

38 Chromatogramm bei schlechtester Kombination der Einflußgrößen auf die Trennung der aktiven und verwandten Substanzen Laborlauf ph-wert 2.6 (2.5) Temperatur 52.5 C (50) Steigung (tg) min (33) Modifier Konz. 4.5 % MeOH (5) Flussrate 1.1 ml/min (1.0) 12 kritisches Peakpaar 12,13 Auflösung Rs = Zeit (min) Zeit (min) 38

39 Analysenresultate für die Trennung der verwandten Substanzen Plackett-Burman-Versuchsplan (randomisiert) und Analysenresultate Versuch ph -Wert Temperatur Steigung (tg) Konz. Mod. Flußrate [ph Einheit] [ C] [min] [% MeOH] [ml/min] kritische Auflösung R s für die Trennung der verwandten Substanzen [Peak 4-5] 1 2,6 47,5 31,65 4,5 1,1 2 2,4 52,5 34,65 4,5 1,1 3 2,4 52,5 31,35 5,5 0,9 4 2,6 47,5 34,65 4,5 0,9 5 2, ,4 47,5 34,65 5,5 0,9 7 2,6 47,5 31,35 5,5 1,1 8 2,4 47,5 34,65 5,5 1,1 9 2,4 47,5 31,35 4,5 0,9 10 2,4 52,5 31,35 4,5 1,1 11 2, ,6 52,5 34,65 5,5 1,1 13 2,6 52,5 31,35 5,5 0,9 14 2,6 52,5 34,65 4,5 0,9 15 2, ,7 1,7 1,7 1,8 1,8 1,8 1,7 2,0 1,7 1,6 1,8 1,7 1,8 1,9 1,8 39

40 Graphische Auswertung der Daten für die Trennung der verwandten Substanzen Paretodiagramm nur die Einflußgrößen B und H haben einen signifikant von Null verschiedenen Effekt B:pH value H:Flowrate Standardized Pareto Chart for Resolution C:Temperature nicht signifikant von Null verschiedene Einflußgrößen (C, F, E) F:Conc. Modifier E:Slope_tG Signifikanzlinie Standardized effect Haupteffekte Main Effects Plot for Resolution Resolution 2,8 2,7 2,6 2,5 2,4 2,3 2,2 2,1 ph value Slope_tG Flowrate Temperature Conc. Modifier 40

41 Chromatogramm bei schlechtester Kombination der Einflußgrößen auf die Trennung der verwandten Substanzen kritisches Peakpaar 4,5 Auflösung Rs = 1.6 Laborlauf ph-wert 2.6 (2.5) Temperatur 52.5 C (50) Steigung (tg) min (33) Modifier Konz. 4.5% MeOH (5) Flussrate 1.1 ml/min (1.0) Zeit (min) Zeit (min) 41

42 RP-HPLC-Methodenentwicklung und Test auf Robustheit Zusammenfassung Die Entwicklung einer RP-HPLC-Methode für ein neues pharmazeutisches Produkt ist ebenso wie die Entwicklung der Arzneimittelformulierung eine Kette von Optimierungsproblemen. Für die RPLC-Methodenentwicklung ist das vielfach bewährte Software- Werkzeug DryLab 2000 eingesetzt worden. Die Anwendung dieses Software-Werkzeuges in der RPLC-Methodenentwicklung erlaubt effizient Lösungen zu finden, auch unerwartete, und hilft, robuste Arbeitsbedingungen schneller zu erarbeiten. Nach Beendigung der Modellierungsphase, wenn es darum geht, sowohl die Selektivität und/oder die Spezifität als auch die robuste Trennung des kritischen Peakpaares im Arbeitspunkt zu bestätigen, ist zum Test auf Robustheit der entwickelten RPLC-Methode auf Methoden der statistischen Versuchsplanung (Plackett-Burman-Versuchsplan) zurückgegriffen worden. 42

43 Literatur L.R. Snyder, J.J. Kirkland and J.L. Glajch, Practical HPLC Method Development 2nd ed., Wiley-Interscience, New York, 1997 I. Molnar, J. Chromatogr. A, 965 (2002) 175 C.Horvath, W. Melander, I. Molnar, Anal. Chem., 49 (1976) J.A. Lewis, J.W. Dolan, L.R. Snyder, I. Molnar, J. Chromatogr., 592 (1992) 197. H.W. Bilke, C. Gernet, I. Molnar, J. Chromatogr., 729 (1996) 189. T. Jupille, in DryLab 2000 Plus Automation Toolkit, 2002 H.-J. Rieger, I. Molnar, LaborPraxis, 3 (2003) 40 J.W. Dolan, LC GC Europe, 5 (2003) 252 Y. Vander Heyden and D.L. Massart; M. Mulholland, in: M.M.W.B. Hendrics, J.H. de Boer, A.K. Smilde (Eds.), Robustness of Analytical Chemical Methods and Pharmaceutical Technolo-gical Products, Data Handling in Science and Technology, Elsevier, Amsterdam, 1996, Ch. 3 and Ch. 5 E.J. Klein, S.L. Rivera, A Review of Criteria Functions and Response Surface Methodology for the Optimization of Analytical Scale HPLC Seperations, Marcel Dekker Inc., 2000, I. Jimidar, Lecture presented at the workshop: Computer-assisted RPLC-Method Develop-ment, Darmstadt, Nov R. Romero, D. Gazquez, M. Sanchez-Vinas, L. Cuadros Rodriguez, and M.G. Bagur, LCGC North America, 20 (2002) E. Hund, Y. Vander Heyden, M. Haustein, D.L. Massart and J. Smeyers-Verbeke, J. Chro-matogr. A, 874 (2000)

44 Y. Vander Heyden, K. Luypaert, C. Hartmann, D.L. Massart, J. Hoogmartens and J. de Beer, Anal. Chim. Acta 312 (1995) Y. Vander Heyden, A. Bourgeois and D.L. Massart, Anal. Chim. Acta 347 (1997) L.M.B.C. Alvares-Ribeiro, A.A.S.C. Machado, Anal. Chim. Acta 355 (1997) M. Jimidar, N. Niemeijer, R. Peetres and J. Hoogmartens, J. Pharm. Biomed. Anal. 18 (1998) J.A. Van Leeuwen, L.M.C. Buydens, B.G.M. Vandeginste, G. Kateman, P.J. Schoenmakers, M. Mulholland, Chemometrics and Intelligent Laboratory systems,10 (1991) M. Mulholland and J. Waterhouse, J. Chromatogr., 395 (1987) M. Mulholland and J. Waterhouse, Chromatographia 25 (1988) J.A. Van Leeuwen, L.M.C. Buydens, B.G.M. Vandeginste, G. Kateman, P.J. Schoenmakers, M. Mulholland, Chemometrics and Intelligent Laboratory systems,11 (1991) H.W. Bilke, Lecture presented at the workshop: Computer-assisted RPLC-Method Development, Darmstadt, Nov H.W. Bilke, Lecture presented at the Novia HPLC 2003, Mannheim, Nov Z.Yongxin, J, Augustinjs, E.Roets and J. Hoogmartens, Pharmeuropa, 9, (1997). D. Song, E.Roets and J. Hoogmartens, Pharmeuropa, 11, (1999). R. Ragonese, M. Mulholland and J. Kalman, J. Chromatogr.A, 870 (2000) Y. Vander Heyden, M. Jimidar, E. Hund, N. Niemeijer, R. Peetres, J. Smeyers-Verbeke, D.L. Massart and J. Hoogmartens, J. Chromatogr.A, 845 (1999) R.B. Waters and A. Dovletoglou, J. Liquid Chromatogr., 18 (2003) J.A. van Leeuwen, B.G.M. Vandeginste, G. Kateman, M. Mulholland and A. Cleland, Anal. Chim. Acta 228 (1990)

45 Y. Vander Heyden and D.L. Massart, in: M.M.W.B. Hendrics, J.H. de Boer, A.K. Smilde (Eds.), Robustness of Analytical Chemical Methods and Pharmaceutical Technolo-gical Products, Data Handling in Science and Technology, Elsevier, Amsterdam, 1996, pp M. Jimidar, M.S. Khots, T.P, Hamoir, D.L. Massart, Quim. Anal. 12 (1993) E. Morgan, Chemometrics Experimental Design, Analytical Chemistry by Open Learning, Wiley, Chichester, 1991, pp R.L: Plackett and J.P. Burman, Biometrika, 33 (1946) C. Krüll, LaborPraxis, 11 (2003) S. Johne, Praxishandbuch STATGRAPHICS, Teil 3/1: Statistische Versuchsplanung Teil 1, (2002)