RECENT TRENDS AND NOVEL CONCEPTS IN COFACTOR- DEPENDENT BIOTRANSFORMATIONS

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1 RECENT TRENDS AND NOVEL CONCEPTS IN COFACTOR- DEPENDENT BIOTRANSFORMATIONS S. Kara, J.H. Schrittwieser, F. Hollmann, M.B. Ansorge-Schumacher Applied Mikrobiology Biotechnology, 2014, Nadja Kleisch

2 1. Seminar Nadja Kleisch Inhalt Einleitung Biokatalysatoren Cofaktoren Cofaktor-Regeneration Relevanz Ergebnisse Besondere Cosubstrate Ganzzellsysteme Kaskaden-Reaktionssysteme Nicht natürliche Cofaktoren Zusammenfassung

3 1. Seminar Nadja Kleisch Einleitung

4 1. Seminar Nadja Kleisch Biokatalysatoren Biomoleküle wie Enzyme, die biochemische Reaktionen beschleunigen, indem sie die Aktivierungsenergie der Reaktionen herabsetzen gehen unverändert aus den Reaktionen hervor können viele Reaktionszyklen hintereinander katalysieren Einsatz zu Biosynthese sowohl im akademischen als auch im industriellen Bereich Vorteile: milden Reaktionsbedingungen hohe Reinheit enantioselektiv, stereoselektiv und regioselektiv

5 1. Seminar Nadja Kleisch Biokatalysatoren Seitenketten der Aminosäuren sind nicht dazu geeignet Elektronenaustauschreaktionen zu katalysieren Cofaktoren: verschiedene Moleküle und Molekülgruppen, die für die Funktion von bestimmten Enzymen unerlässlich sind solche katalysieren insbesondere Redoxreaktionen alle Reaktionen die der Energiegewinnung dienen Redoxreaktionen: ein Stoff A, der Elektronen abgibt (Reduktionsmittel, Donator) reagiert mit einem Stoff B, der diese Elektronen aufnimmt (Oxidationsmittel, Akzeptor) [11]

6 1. Seminar Nadja Kleisch Cofaktoren Stoffname Funktionstyp ATP - liefert durch Abspaltung eines Phosphats Energie - überträgt Phosphat an das Substrat (Phosphatdonator) ADP nimmt Phosphat vom Substrat entgegen (Phosphatakzeptor) NAD + NADP + Elektronen- und Protonenakzeptor, Oxidationsmittel FAD NADH NADPH Elektronen- und Protonendonator, Reduktionsmittel FADH 2 Flavin umkehrbar oxidier- und reduzierbar Bsp.: NAD-abhängigen Dehydrogenasen Alkoholdehydrogenase (ADH) [7] [12}

7 1. Seminar Nadja Kleisch Cofaktor-Regeneration Cofaktoren werden in stöchiometrische Mengen benötigt sehr teuer geeignete Regenerationsverfahren total turnover number TTN gibt an wie viel Mol. Produkt pro Mol. Cofaktor hergestellt werden technische Anwendung größer 10 3 Möglichkeiten: a) gekoppelte Substratprozesse b) gekoppelte Enzymprozesse c) Ganzzellsysteme bspw. immobilisierte Alcaligenes eutrophus Zellen katalysieren Reduktion von oxidiertem NAD + mit molekularem Wasserstoff d) elektrochemische Methoden Einsatz von Mediatoren z.b. Methylviologen synthetische Verbindung, die als Elektronenakzeptor des Photosystems I der Photosynthese fungieren und O 2 reduzieren

8 1. Seminar Nadja Kleisch Cofaktor-Regeneration gekoppelte Substratprozesse: gleiches Enzym billiges Cosubstrat kostengünstiger Alkohol GG auf Produktseite schieben Cosubstrat im großem Überschuss - schädigenden Einfluss, Enzyminhibierung gekoppelte Enzymprozesse: [5] zwei unterschiedliche Enzyme Bsp. Formiatdehydrogenase GG auf Produktseite schieben Kohlendioxid ausgasen oder zu Kohlensäure abreagieren + hoher Umsatz ist möglich [5]

9 1. Seminar Nadja Kleisch Relevanz in den letzten Jahren konnten einige Regenerationsverfahren etabliert werden Forschungsziel: Suche nach leistungsfähigeren, günstigeren und umweltfreundlicheren Regenerationssystemen Zusammenfassung der neusten Methoden in diesem Bereich: besondere Cosubstrate Ganzzellsysteme Kaskaden-Reaktionssysteme nicht natürliche Cofaktoren

10 1. Seminar Nadja Kleisch Methoden

11 1. Seminar Nadja Kleisch Besondere Cosubstrate Einsatz von thermodynamisch stabileren Coprodukten 1,4-Butandiol als smart cosubstrat Enone als Cosubstrat Verwendung von Enoat-Reduktase, ermöglich eine NADPH-unabhängige Reduktion von C=C Bindungen in Enonen (enthält C=O und C=C Bindung) Alternative Bereitstellung von Aminogruppen bei der Transaminierung Einsatz einer ω-transaminase, hat PLP als Cofaktor der selbstregenerierend ist es entsteht Keton und Aminosäure als Produkt um GG auf Produktseite zu verschieben Tautomerisierung des Ketons Cosubstrate als organische Phase Einsatz eines Zweiphasensystems zur Herstellung organischer Produkte Verwendung von Cosubstrat Octyl-Formiat und Coprodukt, sie sind hydrophob genug um eine nicht mischbare Phase im Wasser zu bilden

12 1. Seminar Nadja Kleisch Einsatz von thermodynamisch stabileren Coprodukten Oxidation von sekundären Alkoholen mittels ADH: zur Produktion von Ketonen erfordert ein NAD(P) + Regeneration Verwendung von Cosubstrat Keton (z.b. Aceton) im Überschuss nach Kroutil et. al: Verwendung von Chloraceton, statt Aceton durch Wasserstoffbrückenbindung ist aktivierte Keton stabiler keine Rückreaktion weniger Cosubstrat weniger Abfall [6]

13 1. Seminar Nadja Kleisch ,4-Butandiol als smart cosubstrat in situ Regeneration von reduzierten Nicotinamid-Cofaktoren, benötigt große Menge an Elektronen Donoren (z.b. EtOH) negativ: viel Abfall, Enzyminhibierung Alternativ: 1,4-Butandiol Bsp.: zusammen mit ADH/Enoat Reduktase oder Monoaysgenase zur der Reduktion von C=C oder C=O Doppelbindung [6] 1.4 Butandiol γ-butyrolactone thermodynamisch stabil keine Rückreaktion Bedarf an Cosubstrat geringer

14 1. Seminar Nadja Kleisch Biotransformation mittels Ganzzellsysteme Vorteile: Cofaktor-Regeneration findet innerhalb der Zelle statt keine externe Enzymproduktion und Aufreinigung Schutz der Enzyme mechanischer Stress organische Lösungsmittel Nachteil: spezifische Aktivität und Selektivität nicht so hoch Zellen produzieren Nebenprodukte Metabolic Engineering

15 1. Seminar Nadja Kleisch Designer Zellen Ausschalten von unnötige Stoffwechselwegen z.b. Produktion von Nebenprodukte Überexpression der benötigten Enzyme Bsp: E. coli Überexpression der Carbonyl-Reduktase aus Candida parapsilasis Verwendung im rein organischem System organische Phase Verhältnis 30:70 Acetophenon Isopropanol 1-Phenylethanol Aceton [6]

16 1. Seminar Nadja Kleisch Kaskaden-Reaktionssystem klassische Regenerationsmethoden produzieren große Mengen an Coprodukt wertlos, Abfall Lösung: a) Produktion von wertvollen Coprodukten (parallel) b) Verwendung von zwei Enzymen mit unterschiedlichem Cofaktorverbrauch deren Einsatz aus synthetischer Sicht sinnvoll ist (linear) Produkt wird in zwei Stufen aufgebaut kein Nebenprodukt Enzym 1 Enzym 2 A B C

17 1. Seminar Nadja Kleisch Lineares Kaskadensystem Bsp: Transformation von racematischem Lactat in L-Alanin Zwischenprodukts Pyruvat + kein Abfall/Nebenprodukt D und L Lactat-Dehydrogenase zur Pyruvat-Produktion Alanin-Dehydrogenase zur L-Alanin-Produktion Lactat Pyruvat L-Alanin [6]

18 Nicht natürliche Cofaktoren Cofaktoren spielen wichtige Rolle bei vielen Redoxreaktionen teuer zu produzieren empfindlich gegenüber Hydrolyse NAD(P)H-Analoga: relativ kostengünstig Produktion vom reaktivem Teil des NAD(P)H synthetische NAD(P)H-Analoga, unterschiedlicher Komplexität Problem: 1. Seminar Nadja Kleisch synthetische Cofaktoren können aufgrund der strukturellen Änderung keine Bindung mit dem Enzym eingehen viele Reaktion nicht katalysierbar Anwendung: Reduktion von prothetischen Gruppen wie Flavin Bsp.: synthetischer Cofaktor 1 a kann bis zu 40 mal schneller als das normale NADH den Cofaktor FAD regenerieren

19 19 Flavin-Analoga: Flavin-Analoga haben verschiedene Substituenten am Isoalloxazin-Ring Verwendungsmöglichkeiten bei der Oxidationen in der Organokatalyse großen Einfluss auf katalytische Aktivität der Enzyme [6] Bsp.: Massay and Coworkers haben Desaturase Aktivität auf old yellow enzyme aus der Hefe übertragen unter Einsatz des synthetischen Cofaktors 8-cyano-8-demethyl-FMN Desaturase- Aktivität ist die Fähigkeit Elektronen von einem Molekül auf ein anderes übertragen können und dabei das Substrat entsättigen Übertragung von Elektronen OYE [6] u. [10] [2]

20 1. Seminar Nadja Kleisch Zusammenfassung Biokatalysatoren benötigen zum katalysieren von Redoxreaktionen Cofaktoren in stöchiometrischer Menge Produktion der Cofaktoren ist teuer Regenerationsysteme klassisch: a) gekoppelte Substratprozesse (ein Enzym, ADH, Coprodukt) b) gekoppelte Enzymprozesse (zweites Enzym z.b. Formiatdehydrogenase) Verbesserung durch: besondere Cosubstrate Ganzzellsysteme Kaskaden-Reaktionssysteme nicht natürliche Cofaktoren Chloraceton, 1,4 Butandiol Designerzellen L-Alanin-Produktion Cofaktoranaloga Ziel: leistungsfähigere, günstigere und umweltfreundlichere Regenerationssysteme

21 1. Seminar Nadja Kleisch Literatur und Quellen [1] U. Kragl, W. Kruse, W. Hummel, C. Wandrey; Enzyme engineering aspects of biocatalysis: Cofactor regeneration as example Biotechnology and Bioengineering, Vol. 52, 2, , 1996 [2] (zuletzt überprüft am ) [3] (zuletzt überprüft am ) [4] Braun, Matthias, Olav Teichert, and Axel Zweck Biokatalyse in Der Industriellen Produktion. Zukünftige Technologien 57: [5] Hildebrand, Falk Prozessentwicklung Zur Enzymatischen Synthese Chiraler Alkohole Unter Elektrochemischer Cofaktorregenerierung. Dissertation. [6] Kara, Selin, Joerg H. Schrittwieser, Frank Hollmann, and Marion B. Ansorge-Schumacher Recent Trends and Novel Concepts in Cofactor-Dependent Biotransformations. Applied Microbiology and Biotechnology 98: [7] Kofaktoren Teil I. Uni Marburg: [8] Meah, Y, and V Massey Old Yellow Enzyme: Stepwise Reduction of Nitro-Olefins and Catalysis of Aci-Nitro Tautomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97: [9] Schroer, Kirsten, Von Der Fakultät Mathematik, and Informatik Naturwissenschaften Ganzzellbiotransformationen Mit Rekombinanten Escherichia Coli Zur Synthese Chiraler Alkohole. Naturwissenschaften. [10] Xu, D, R M Kohli, and V Massey The Role of Threonine 37 in Flavin Reactivity of the Old Yellow Enzyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96(March): [11] [12]

22 1. Seminar Nadja Kleisch Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!