1H-NMR in der Weinanalytik Neue Möglichkeiten der Qualitätskontrolle

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1 1H-NMR in der Weinanalytik Neue Möglichkeiten der Qualitätskontrolle Manfred Spraul, Hartmut Schäfer, Eberhard Humpfer, Monika Mörtter, Fang Fang, Birk Schütz (Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Germany) Peter Rinke, Susanne Koswig (SGF International e.v., Nieder-Olm, Germany) Was kann 1H-NMR in Lebensmittel-Analysen leisten? Nontargeted Screening/ Targeted Screening in einem Experiment! Alle konventionellen Lebensmitteltests sind targeted! Was nicht explizit geprüft wird, wird meistens übersehen! Photometrische Analysegeräte Chromatographie Enzymatische Tests. Was 1H-NMR nicht darstellen kann: Spurenanalyse!

2 Was kann die 1H-NMR in der Lebensmittelanalytik leisten? Mittels NMR-Analytik können flüssige, halbfeste und feste Proben untersucht werden. Es ergeben sich Hunderte, oft Tausende von detektierbaren Molekülen (= Signale) Die Mischung dieser detektierten Moleküle ergibt einen hochspezifischen Fingerprint (mittels statistischer Methodik darstellbar) Dieser Fingerprint mit tausenden von Signalen, ist ein eindeutiger multidimensionaler Marker, der für jede Probe eine Aussage bezüglich Herkunft, Qualität, Klassifikation und Konzentration zulässt Dieses sogenannte Non-Targeted Screening, das auch gleichzeitig die Quantifizierung beinhaltet, macht die Entdeckung und Analyse von unerwarteten und unbekannten (!!) Parametern möglich, die eine zielgerichtete Analysemethode nicht finden kann! Darüberhinaus werden auch Abweichungen der Konzentrationen bekannter Substanzen erfasst. JuiceScreener / SGF-Profiling Fruchtsaft-Analytik Nur eine Messung (ca. 15 Minuten) Geringster Präparationsaufwand Targeted Analysis Quantifikation von etwa 30 Verbindungen Non-Targeted Analysis: Authentizität Verfälschungen Fruchtgehalt Qualität Datenbank von etwa Säften PDF Report mit allen Ergebnissen Kategorie: Industrieautomation

3 Minimale Probenpräparation Klare Säfte (z.b. klarer Apfelsaft): Zugabe von 10 % Pufferlösung 10% Puffer ( KH 2 PO 4, D 2 O, NaN 3, TSP ((trimethyl-silyl)propionic acid) 90% Saft Trübe Proben wie z.b. Orangensaft werden 10 min zentrifugiert dann Zugabe von 10 % Pufferlösung Hohe Reproduzierbarkeit 30 Wiederholungen mit Probenpräparation 6 verschiedene Personen haben präpariert gemessen in Automation an 3 verschiedenen 400 MHz Spektrometer alle Spektren im Overlay Höchste Reproduzierbarkeit ermöglicht die Bildung statistischer Modelle

4 Schlussfolgerungen durch Quantifikation Zuckerprofil (Sucrose, Glucose, Fructose) Zuckerung Säureprofil Säuerung (z.b. Zitronensäure in Apfelsaft) Verhältnis Äpfelsäure / Chinasäure in Apfelsaft Reifestatus des Apfels Verhältnis Zitronensäure / Iso-Zitronensäure in Zitronensaft Zugabe Zitronensäure Konzentration Galacturonsäure Enzymatischer Aufschluss in Apfelsaft Konzentration Phlorin in Zitrusfrüchten Pressung der Schalen Konzentration Laktat, Fumarsäure, Ameisensäure, HMF, Gluconsäure Verderbsparameter Detektionen von Fremdfrucht z.b. Birne in Apfel, Citrusfrucht in Apfel, Grapefruit in Orange 1H-NMR Profile von Fruchtsäften Ausschnitt zeigt ca. 15% des NMR Profils Probe passt nicht zum Modell

5 Überprüfung von Authentizität Apfelsäfte von 24 chinesischen Firmen Aktuell gemessene Probe 3D-Projektion von 23-dimensionalem Modell Vollkommene Trennung im 23-dimensionalen Fruchtgehalt in Rotfrucht-Püree Rotfrüchte und 1H-NMR Rotfrüchte sind hochpreissig, daher gibt es ein höheres Verfälschungspotential Einige der Rotfruchtpürees/-säfte auf dem Markt sind verfälscht (NMR Ergebnisse!) Verfälschung als Verdünnung bis zu 50% Wie wird verfälscht/vertuscht: 1) Zusatz von Zucker 2) Um Zucker-/Formol-Verhältnis einzustellen muss auch mindestens eine Aminosäure zugegeben werden

6 Fruchtgehalt in Rotfrucht-Püree Spektren sind auf Gesamt-Zucker normiert Untergrund spiegelt den Fruchtanteil wider Rote Probe scheint nicht 100% Fruchtgehalt zu haben (vermutlich Zuckerzusatz) Dies wurde bei dieser Probe durch konventionelle Analytik bestätigt Fallstudie: Rotfrucht-Püree, Fruchtgehalt konventionell

7 Automatische Erzeugung eines PDF Reports Klassifikation Verifikation Fruchtgehalt Quantifikation Mischungen Wein-Screening

8 Weinanalysen und Anforderungen Wein mit 1H-NMR: Ersatz konventioneller, zielgerichteter Weinanalytik (aktuell ~ 30 Verbindungen mittels 1H-NMR quantifizierbar) Bestimmung der Traubensorte Mischung von verschiedenen Rebsorten (Zumischung von 15% fremder Rebsorte in Deutschland erlaubt) Geographische Herkunft bestimmter Regionen Firmenproduktprofil (1H-NMR Fingerprint) Einfluss des Gebietes Spürt jede Art von Abweichungen auf Protonen-Spektrum eines Weins malic acid succinic acid acetic acid lactic acid glucose alanine sorbic acid glycerol 13 C-satellites EtOH 18% of total spectrum tartaric acid methanol 2,3-butandiol acetaldehyde shikimic acid acetoine Weitere Verbindungen: HMF, trigonelline, sucrose, fructose, citric acid, fumaric acid, proline,

9 Durch 1H-NMR identifizierbare Substanzen in Wein 1,2 Propandiol Ethanol P Coutaric Acid 4mg/l 2 Phenylethanol 50mg/l Ethylacetate Peonidin 3 Glucosid mg/l 2,3 butandiol <7,5mg/l Ethylene Clycol Petunidin 3 Glucosid 3 methyl butanol Fructose Phenylalanine Acetaldehyde Fumaric Acid Phenylethlyalcohol Acetic Acid Gallic Acid 2mg/l Proline mg/l Acetoine Gamma aminobutyric Acid Pyridoxic Acid Addition of Tannin (Statistics) Gamma Butyrolactone < 5mg/l Pyrogallol Adenine Glucose Raffinose Alanine mg/l Glycerol Saccharose mg/l Arabinose Histidine Salicylic acid Benzoic Acid HMF Shikimic Acid Caffeic Acid Imidazoleaceticacid (to be verified) Sorbic Acid Caftaric Acid 48mg/l Isoferulic Acid Sorbite Catechin 75mg/l Lactic Acid mg/l Succinic Acid mg/l Chips (Statistics) Malic Acid Tartaric Acid Choline Mannose (to be verified) Trigonelline Citric Acid Malvin 3 Glucosid mg/l Tyramine Delphinidin 3 Glucosid mg/l Methanol Xanthine Epicatechin 85mg/l N Acetyltryptophan (to be verified) Xylose. Unterscheidung von Rebsorten (NTS) Riesling, Weißburgunder Shikimic acid Zusammenarbeit mit CVUA Karlsruhe

10 Unterscheidung von Rebsorten Based on 100 Wines from Baden (Rhine Valley) Problems Within the Group of 100 Cleaning Agent left Dr. Godelmann CVUA Karlsruhe White wine Added to Red wine 19 Unterscheidung von Rebsorten All wine samples (n >13) Bucketing: [ ],'buckets',500,'null', [ ; ; ; ] P = bbio_data_classify_mc(); P.EXPL_VARIANCE = 99.5; P.LOGTRAFO = true; P.LOGPARAMETER = 0.4; P.CROSSVALID_SETS = 8; P.MONTECARLO_RUNS = 10; P.KRUSKAL = 50;

11 Jahrgänge (DLR NW: ausschließlich Riesling) Alle aus Rheinland-Pfalz Ausbau: Herstellerunterscheidung

12 Mischverhältnis-Analyse: Riesling vs. Weiß-/Grauburgunder No. Ratio Bucketing: [ ],'buckets',700,'null', [ ; ; ] P = bbio_data_classify_mc(); P.EXPL_VARIANCE = 99.5; P.LOGTRAFO = true; P.LOGPARAMETER = 0.4; P.CROSSVALID_SETS = 8; P.MONTECARLO_RUNS = 100; P.KRUSKAL = 100; Identifizierung von Brunello ( Toskana ) Sangiovese is a red wine grape variety Brunello di Montalcino (100% Sangiovese, at least 3 years aged on oak) Rosso di Montalcino (100% Sangiovese, 6 months in oak) Pilot Study: Characterization of Brunello Determination of Vintage / Aging Detection of addition of other grape varieties (e.g. Merlot)

13 Identifizierung von Brunello 19 Wine-Samples were measured with standardized Wine-Screening NMR- Method (16 authentic sangiovese, 3 market samples) Spectral Analyses show fingerprints for vintages of Brunello and differences between Brunello and Merlot Merlot Brunello Spectral Pattern: Shikimic Acid Visualization of JRES-Experiment PCA Scores-Plot shows differentiation Brunello Jahrgangsunterscheidung 2006 Brunello 2007 Brunello 2008 Brunello 2009 Brunello 2005 Brunello (Bottle) 2006/7 Rosso (Bottle) 2005 Brunello (Market) Merlot (Toscana, Market) gallic acid Different vintages show different NMR-fingerprints with a larger database it could be possible to create a vintage-model for Brunello fumaric acid pyrogallol shikimic acid 2009 Brunello Figure shows 12% of complete spectral range

14 Vinifikation: Barrique vs. Chips Or? n (Barrique)= 50, n(with chips) = 14 outlier: Wuerzburg-Wine-118-A13 27 Kooperation LGL Würzburg Ergebnisbericht (automatisch erstellt)

15 Zusammenfassung der Wein-Machbarkeitsstudien 1) Quantifizierung - Aktuell etwa 60 Substanzen identifiziert, von denen in der ersten WeinScreener-Generation Verwendung finden werden (etwa weitere Substanzen werden geprüft) 2) Nontargeted Screening (Machbarkeitsstudie jeweils positiv) - Herkunftsnachweis - Jahrgangsbestimmung - Rebsortenbestimmung - Mischungsverhältnis - Unterscheidung Barrique - / Chipausbau - Abweichungen/Verfälschungen Danksagung: DLR Neustadt Rheinland Pfalz: - Arbeitsgruppe Herr Prof. Dr. Fischer Universität Koblenz-Landau -Frau Bansbach CVUA Karlsruhe: - Arbeitsgruppe Herr Dr. Godelmann SGF Niederolm: -Herr Dr. Rinke -Frau Dr. Koswig LGL Würzburg: -Arbeitsgruppe Herr Dr. Wachter, Herr Dr. Christoph 30

16 Kontaktdaten und Homepage Informationen zum Fruchtsaft- und Weinscreening, sowie weiterer Entwicklungen: Dr. Markus Link ; Außerdem können Sie auf unserer Homepage mit uns in Kontakt treten: