Aus dem Institut für Tierzucht (Mariensee) der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) Braunschweig

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1 Aus dem Institut für Tierzucht (Mariensee) der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) Braunschweig Experimentelle Untersuchungen zur Verbesserung der Entwicklungsfähigkeit boviner Oozyten präpuberaler Spender durch In-vitro-Reifung auf Granulosazellmonolayern adulter Tiere I N A U G U R A L D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades einer D O K T O R I N D E R V E T E R I N Ä R M E D I Z I N (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Simona Ponebšek aus Kranj/Slowenien Hannover 2005

2 Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. H. Niemann 1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. H. Niemann 2. Gutachter: Prof. Dr. B. Meinecke Tag der mündlichen Prüfung:

3 Meinen Eltern Liljana und Bojan, meiner Schwester Tatjana und Javier

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5 Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG LITERATUR Oozytenentwicklung Oogenese Oozytenreifung Follikulogenese Kommunikation zwischen Oozyte und Follikelzellen TGF-β Familie Regulation des Follikelwachstums beim Rind Wachstumsdynamik ovarieller Follikel bei Kühen und Kälbern Funktionen der Follikelzellen nach der Ovulation Gewinnung unreifer KOK beim Rind durch OPU Unterschiede in der Entwicklungskapazität von Oozyten aus Kälbern und Kühen Ansätze zur Steigerung der Entwicklungskapazität von präpuberalen bovinen Oozyten Kokultur in der In-vitro-Produktion von Embryonen Expression entwickunglsrelevanter Gene bei bovinen präimplantatorischen Embryonen Growth differentiation factor-9 (GDF-9) Heat shock- Protein 70 (Hsp.70) Glukosetransporter-3 (Glut-3) MATERIAL UND METHODEN Kultivierung der Granulosazellen und Fibroblasten Medien PBS Zellkulturmedien Einfriermedium Gewinnung und Kultivierung der Granulosazellen...38 i

6 Inhaltsverzeichnis Aliquotieren und Einfrieren der Granulosazellen Erstellen der Granulosazellmonolayer Erstellen von Fibroblastenmonolayern Transvaginale Ultraschall geleitete Follikelpunktion oder Ovum pick-up (OPU) Vorbereitung der Versuchstiere Ovum-Pick-Up (OPU) Klassifizierung der Kumulus-Oozyten-Komplexe In-vitro-Produktion boviner Embryonen Medien PBS Phosphate buffered saline TCM air TCM + BSA (Reifungsmedium) Sperm-TALP und Fert-TALP (Fertilisationsmedien) SOF-Medium (Kulturmedium) Reifung der Oozyten Reifung der Oozyten auf Monolayern In-vitro-Befruchtung Aufbereitung der Spermien In-vitro-Kultivierung Einfrieren ungereifter, gereifter Oozyten und Embryonen für RT-PCR Bestimmung der Zellzahlen RT-PCR Analyse Isolierung von mrna aus Oozyten und Embryonen Reverse Transkription (RT) Polymerasekettenreaktion (PCR) Verwendete Primer Analysen der RT-PCR Produkte mit Hilfe der Gelelektrophorese Versuchsaufbau Statistische Auswertung ERGEBNISSE...57 ii

7 Inhaltsverzeichnis 4.1 OPU mit 7-8 Monate alten Kälbern und laktierenden Kühen IVP mit KOK aus 7-8 Monate alten Kälbern und Kühen Zellzahlen in expandierten Blastozysten Messenger RNA-Expression bei ungereiften und gereiften Oozyten von Kälbern und Kühen Messenger RNA-Expression bei 8-16 Zellern und expandierten Blastozysten von Kälbern und Kühen DISKUSSION ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY LITERATURVERZEICHNIS ANHANG, ABBILDUNGEN UND TABELLEN Geräte und Material für OPU Geräte und Material für die In-vitro-Produktion von Embryonen Geräte und Material für Zellkultur Geräte, Lösungen und Material für RT-PCR Zusammensetzung der Medien Zellkulturmedium Einfriermedium PBS - Phosphate buffered saline TCM-air TCM + BSA (Reifungsmedium) Sperm-TALP und Fert-Talp (Fertilisationsmedien) SOF-Medium (Kulturmedium) Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis DANKSAGUNGEN iii

8 Inhaltsverzeichnis iv

9 Einleitung 1 EINLEITUNG Die Technologie der Ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion ermöglicht es, ungereifte Oozyten wiederholt, von lebenden, präpuberalen Rindern zu gewinnen. Durch den Einsatz dieser Technologie in der Zucht kann das Generationsintervall verkürzt und das weibliche Keimzellpotential verstärkt genutzt werden. Von genotypisch wertvollen Tieren können schon vor Erreichen der Zuchtreife Nachkommen erhalten und entsprechend früher auf Leistungen und Eigenschaften geprüft werden. Bereits durchgeführte Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass die Entwicklungskompetenz von Oozyten präpuberaler Rinder (präpuberale Oozyten) deutlich geringer ist als die von adulten Tieren (adulte Oozyten). Morphologische Unterschiede zwischen präpuberalen und adulten Oozyten, niedrigere Befruchtungsund Teilungsraten, niedrigere Blastozystenraten und nach Transfer in Empfängertiere deutlich niedrigere Trächtigkeitsraten deuten auf Veränderungen im Stoffwechsel, Zellwachstum, Zellteilung und Empfindlichkeit gegenüber äußeren Einflüssen, im Vergleich zu Oozyten und Embryonen adulter Tiere hin (DE PAZ et al. 2001; TANEJA et al. 2000; MAJERUS et al. 1999; STEEVES et al. 1999; STEEVES u. GARDENER 1999; PRESICCE et al. 1997; DUBY et al. 1996; REVEL et al. 1995). Ursachen für diese niedrigere Entwicklungskompetenz werden vor allem in der mangelhaften zytoplasmatischen Reifung präpuberaler Oozyten vermutet (DAMIANI et al. 1996) Während ihrer Entwicklung sind Säugetieroozyten von Follikelzellen umgeben. Die Follikelzellen sind untereinander und mit der Oozyte durch Zellfortsätze über Gap junctions verbunden (HYTTEL et al. 1997). Zusammen mit der Follikelflüssigkeit bilden sie die Mikroumgebung für das Wachstum und die Reifung der Oozyte. Diese physiologische Bedeutung der Follikelzellen kann zur Unterstützung der Oozytenreifung in vitro genutzt werden, in dem Granulosazellen als Monolayer in das Reifungsverfahren einbezogen werden (Rind: LUTTERBACH et al. 1987, FUKUI u. ONO, 1989; Ziege: TEOTIA et al. 2001). 1

10 Einleitung Einige der Faktoren, die in der molekularen Regulation zu Erlangung der vollständigen Entwicklungskompetenz von Oozyten beteiligt sind, konnten in den letzten Jahren identifiziert werden. DONG et al. (1996) berichteten bei der Maus über den Growth differentiation Factor-9 (GDF-9), der von der Oozyte synthetisiert wird und auf parakrinem Wege für Differenzierung und Proliferation der Follikelzellen verantwortlich ist. GDF-9 hat auch bedeutenden Einfluss auf die Expansion der Kumuluszellen während der Reifung (ELVIN et al. 1999a). Rinderoozyten synthetisieren GDF-9 vom Primordial- bis zum 8-16 Zellstadium (SENDAI et al. 2001). Die Glukoseversorgung präimplantatorischer Embryonen wird durch Moleküle der Glukosetransporter-Familie gesichert. Bei der Maus wurde die Expression von Glukosetransporter-3 (Glut-3) in expandierten Blastozysten nachgewiesen. Er befindet sich apikal an den Zellen des Trophektoderms und ist für den direkten Transport von Glukose in die Zellen der inneren Zellmasse und das Blastozoel verantwortlich (PANTALEON et al. 1997). Glut-3 mrna Expression ist bei bovinen Embryonen nachgewiesen worden (AUGUSTIN et al. 2001). Heat shock-proteine wirken in eukaryontischen Zellen als Schutzproteine, in der sie bei der Faltung von Proteinen eine Rolle spielen. Heat shock-proteine werden in großen Mengen synthetisiert, wenn die Zellen für kurze Zeit höheren Temperaturen (etwa 42 C) ausgesetzt werden (ALBERTS 1994c). Sie dienen dem Embryo auch als Schutz bei schädlichen Umweltveränderungen, wie Temperaturschwankungen oder suboptimalen Kulturbedingungen. Ihre erhöhte Expression kann ein wichtiger Hinweis für die Empfindlichkeit von Embryonen gegenüber schlechten Umweltbedingungen sein (EALY et al. 1993). Heat shock- Protein 70 (Hsp.70) wird beim Rind in allen präimplantatorischen Stadien exprimiert. In-vivo-expandierte Blastozysten weisen eine geringere Expression von Hsp.70 mrna auf als Embryonen aus der In-vitro-Produktion (WRENZYCKI et al. 1998). In dieser Arbeit sollte der Frage nachgegangen werden, ob Granulosazellen adulter Tiere in der Lage sind, die Entwicklungskompetenz boviner präpuberaler Kumulus- Oozyten-Komlpexe (KOK) zu steigern, um so eine größere Anzahl an entwicklungsfähigen Blastozysten zu erhalten. Es sollte geklärt werden, ob die 2

11 Einleitung Reifung auf den beiden Zellkulturen die mrna-expression von drei entwicklungsrelevanten Genen beeinflusst, die in der frühen Follikelentwicklung und der frühen Embryonalentwicklung großen Einfluss haben. Dafür sollte der relative Gehalt an Transkripten für GDF-9 bei ungereiften und gereiften Oozyten der verschiedenen Reifungsgruppen, mit Hilfe der RT-PCR untersucht werden. Ferner wurden die Expressionsmuster von Glut-3 und Hsp.70 m-rna in 8-16 Zellern und expandierten Blastozysten aus Oozyten der verschiedenen Reifungsgruppen untersucht. Diese Gene wurden bisher noch nicht bei präpuberalen bovinen Oozyten oder präimplantatorischen Embryonen untersucht. Kumulus-Oozyten-Komplexe von laktierenden Kühen wurden in die Untersuchungen mit einbezogen, um mögliche Abweichungen bei Kälberoozyten darstellen zu können. 3

12 Literatur 2 LITERATUR 2.1 Oozytenentwicklung Oogenese Beim weiblichen Säugetier beginnt die Oogenese bereits in der frühen embryonalen Entwicklung mit der Ausbildung der Primordialkeimzellen im Dottersack des Embryos. Aus dem Dottersack gelangen die Keimzellen später in die Gonadenanlagen ventral der Urniere. Durch mehrere mitotische Teilungen entstehen Oogonien. Im Verlauf mehrerer Monate werden durch Proliferation und mitotische Teilungen eine bestimmte Anzahl Oogonien gebildet. Abbildung 1: Schema der Oogenese (nach SCHNORR und KRESSIN 2001) 4

13 Literatur Beim Rind beginnt die Oogonienbildung am 75. Tag der Embryonalentwicklung und endet am 160. Tag (ERICKSON 1966a). Die Oogonien nehmen an Größe zu und werden nun Primäroozyte oder Oozyte I genannt. Bei der Geburt hat der weibliche Säuger bereits eine bestimmte Anzahl von Oozyten 1. Ordnung, die für das reproduktive Leben zur Verfügung stehen. Ihre Anzahl wird von nun an nur noch durch Ovulation oder Atresie reduziert. Beim Rind erreichen die Oogonien die erste meiotische Prophase zwischen Tag 75 und 80 nach der Befruchtung (ERICKSON 1966a). Während dieser Phase wird das genetische Material zwischen den homologen Chromatiden durch Crossing Over ausgetauscht, und es entstehen neue genetische Kombinationen (SCHNORR und KRESSIN 2001). Die meiotische Prophase besteht aus mehreren Stadien, wobei die Oozyten im letzten Stadium, dem Diplotän, während der ersten meiotischen Teilung, arretiert werden. Die arretierten Oozyten sind durch einen großen Nukleus oder Germinal vesicle charakterisiert (BAKER und FRANCHI 1967). Bei der Geburt sind bei Kälbern durchschnittlich ca Oozyten vorhanden, die in der ersten Prophase arretiert bleiben (ERICKSON 1966b). Bevor die Primäroozyten in der Lage sind, die Meiose wieder aufzunehmen, müssen sie an Größe zunehmen. FAIR et al. (1995) haben festgestellt, dass Oozyten erst bei einem Durchmesser von ~ 100 µm die Meiose wieder aufnehmen können. Ab einem Durchmesser von 110 µm können sie, die Meiose bis zum Erreichen der Metaphase II vollenden. In der In-vitro-Produktion von Rinderembryonen erhöhen sich die Teilungs- und Blastozystenraten signifikant, wenn die Oozyten einen Durchmesser von mehr als 120 µm aufweisen (DE LOOS et al. 1989). Die Wachstumsphase der Oozyten geht mit der Differenzierung der Follikelzellen einher. Zwischen Kumuluszellen und Oozyte werden Gap Junctions ausgebildet, um den Transport von Nährstoffen, aber auch Signalmolekülen, mit geringem Molekulargewicht zu ermöglichen (FAIR et al. 1997; HYTTEL et al. 1997). Während dieser Wachstumsphase bilden sich die Zona pellucida und die kortikalen Granula. Die Entstehung dieser Strukturen ist besonders für die reguläre monosperme Befruchtung von großer Bedeutung, in dem sie helfen, Polyspermie zu verhindern (FAIR et al. 1997). 5

14 Literatur Oozytenreifung Die Reifung der Oozyte beginnt mit der Wiederaufnahme der Meiose bis zur Vollendung der Metaphase II. Durch die vollständige Reifung von Zytoplasma und Kern erhält die Säugetieroozyte die Fähigkeit zur Befruchtung und für die frühe Embryonalentwicklung (NIEMANN und MEINECKE 1993). Die Reifung wird in vivo bei geschlechtsreifen Tieren durch den präovulatorischen Gonadotropinimpuls ausgelöst (TSAFRIRI et al. 1976). Um die meiotische Metaphase I erreichen zu können, laufen im Ooplasma mehrere Veränderungen ab. Die Kernmembran wird aufgelöst (Germinal Vesicle Break Down, GVBD) und es folgt die Kondensierung der Chromosomen. Es werden vermehrt Lipide eingelagert, die Mitochondrien verteilen sich gleichmäßig im Zytoplasma und die kortikalen Granula formieren sich am äußeren Rand der Eizelle unterhalb des Oolemms (HYTTEL et al. 1997; KRUIP et al. 1983). Die gepaarten homologen Chromosomen trennen sich und werden zu den entgegen gesetzten Spindelpolen gezogen (Anaphase I). Mit Erreichen der Telophase I teilt sich die Oozyte in zwei haploide Zellen. Die kleinere wird als erster Polkörper abgeschnürt. Die größere, die sekundäre Oozyte verharrt bis zur Befruchtung in der Metaphase II (SCHNORR und KRESSIN 2001). Zum Zeitpunkt der zweiten Arretierung findet in vivo auch die Ovulation statt (HYTTEL et al. 1997). In der Oozyte werden große Mengen RNA synthetisiert. Diese Syntheseleistung nimmt zur Reifung hin immer mehr ab bzw. bis die Oozyte einen Durchmesser von ca. 110 µm erreicht hat (FAIR et al. 1995) und im Stadium der Metaphase II kaum noch nachgewiesen werden kann (MEMILI et al. 1998). Die Oozyte synthetisiert RNA im Wesentlichen für den eigenen Gebrauch, da sie für ihr weiteres Wachstum Proteine benötigt. RNA ist auch für die Reifung und frühe embryonale Entwicklungsprozesse erforderlich (HYTTEL et al. 2001; SIRARD et al. 1989). Die Vorgänge bei der Reifung von Zytoplasma und Kern werden im Wesentlichen von den Zellzyklusregulatoren Maturation Promoting Factor (MPF) und Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) gesteuert (GORDO et al. 2001). MAPK und MPF werden etwa zeitgleich mit dem GVBD aktiviert (WEHREND und MEINECKE 2001). 6

15 Literatur Abbildung 2: MAPK, MPF, Cyclin B und ihre Rolle bei der Oozytenreifung und Befruchtung beim Säugetier (nach FAN et al und ABRIEU et al. 2001) Auch für die Arretierung in der Metaphase II (Second meiotic arrest) spielen diese beiden Faktoren eine entscheidende Rolle. Die Aufrechterhaltung der M II wird beim Rind durch eine wechselnde MPF-Aktivität reguliert (WU et al. 1997), die wiederum durch MAPK aufrecht gehalten wird (GORDO et al. 2001). MAPK wird durch Phosphorylierung aktiviert. Diese Phosphorylierung wird wiederum durch Protein 7

16 Literatur Kinase C, camp (cyclic Adenosine-Mono-Phosphate) und Protein Phosphatase- Modulatoren reguliert. MPF ist ein Komplex aus den Proteinen p34 cdc2 (Cell-devision Cycle 2) und Cyclin B und kann Oozyten, die sich in der G 2 -Phase des Zellzyklus befinden, in die M- Phase überführen und so die Meiose wieder aufnehmen lassen (NURSE 1990; ALBERTS et al. 1994a; KUBELKA 2000; MEINECKE und KRISCHEK 2003). In bovinen Oozyten reguliert die PI 3-Kinase (Phosphatidylinositol 3-kinase) den Übergang der Oozyte von M I in die M II- Phase (ANAS et al. 2000). Das Protooncogen c-mos aktiviert die MAPK-Kaskade und ist somit ein Schlüsselmolekül für den Reifungsprozess bei Wirbeltieren (GEBAUER und RICHTER 1997; NEBREDA u. HUNT 1993; POSADA et al. 1993; SAGATA et al.1989). Mos, ein Produkt des c- Mos, wird von bovinen Oozyten in der Metaphase II synthetisiert (WU et al. 1997). Abbildung 3: Zellzyklus mit seinen Phasen. G 1, S, G 2 bilden die Interphase und M bildet die Mitosephase (nach NIEMANN und MEINECKE 1993) 8

17 Literatur Durch Injektion von Mos-mRNA in bovine Oozyten wurden GVBD und die Wiederaufnahme der Meiose beschleunigt, was die Existenz eines Mos/MAPK- Pfades vermuten lässt (FISSORE et al. 1996). In vitro Versuche haben gezeigt, das eine Inaktivierung der MAPK, durch Injektion von MAPK-Phosphatase (MKP-1) in die Oozyten, zu einem fehlerhaften Aufbau der MII-Spindel führt (GORDO et al. 2001). Aus humaner Follikelflüssigkeit sowie aus Bullenhoden wurde ein Sterol isoliert, das als FF-MAS (Follicular Fluid Meiosis Activating Sterol) bezeichnet wird (BYSKOV et al. 1995). FF-MAS spielt eine entscheidende Rolle bei der Wiederaufnahme der Meiose. GRØNDAHL et al. (1998) haben gezeigt, dass FF-MAS die Reifung muriner Oozyten in vitro induziert. Auch bei humanen Oozyten förderte FF-MAS ihre Reifung (CAVILLA et al. 2001); ebenso bei Oozyten von Patientinnen, die an PCO (Polycystic Ovaries) litten (GRØNDAHL et al. 2000). Durch Zusatz von FF- MAS im Reifungsmedium für präpuberale Kälberoozyten konnte der Anteil der in die Metaphase II übergegangenen Oozyten erhöht werden. Die weitere Entwicklungsfähigkeit der präpuberalen Kälberoozyten nach der Befruchtung war aber nicht verbessert (DONNAY et al. 2004). Die G 1 - und S- Phase werden während der Fetalentwicklung durchlaufen. In der S- Phase wird die DNA verdoppelt. Wenn die Meiose wieder aufgenommen wird, befinden sich die Oozyten in der G 2 Phase (siehe Abbildung 2). Um die M- Phase zu erreichen und so die Meiose wieder aufzunehmen, muss das p34 Protein aktiviert werden, in dem es sich an Cyclin B anlagert, zu Prä-MPF wird und durch Dephosphorylierung aktiviert wird (MPF). Wenn die Konzentration von MPF sinkt, durchlaufen Oozyten die Ana- und Telophase. Der zweite Anstieg der MPF Konzentration erfolgt zeitgleich mit der Arretierung der Oozyte in der Metaphase II (ANAS et al. 2000). Die meisten Oozyten erreichen diese Entwicklungsstufe nicht, da sie zuvor schon atresieren. Die Oozyten, die zur Ovulation kommen, besitzen einen haploiden Chromosomensatz, haben die Reifung erfolgreich durchlaufen und können nach erfolgreicher Befruchtung die Entwicklung zu einem neuen Individuum fortsetzten. 9

18 Literatur 2.2 Follikulogenese Im bovinen fetalen Ovar beginnt ab dem 90. Trächtigkeitstag die Follikelbildung mit der Ausbildung von Primordialfollikeln (WANDJI et al. 1992). Bereits am 180. Trächtigkeitstag sind auf fetalen Ovarien wachsende Primär- und Sekundärfollikel zu finden und ab dem 220. Trächtigkeitstag sind auch schon einige tertiäre Follikel erkennbar (WANDJI et al. 1992). Bei der Geburt sind schon alle Primordialfollikel ausgebildet, die in dieser Phase, bis zum Eintreten in die Wachstumsphase, jahrelang verharren können. Die verschiedenen Stadien der Follikelentwicklung unterscheiden sich durch spezifische morphologische Merkmale von einander. Die in der meiotischen Prophase I arretierten Primäroozyten, mit einem Durchmesser von ca. 35 µm, sind von einer Lage aus flachen, undifferenzierten Plattenepithelzellen umgeben (SCHNORR und KRESSIN 2001). Die Granulosazellen verändern nun ihre Form und werden kubisch. Proliferation und Differenzierung der Granulosazellen und das Wachstum der Oozyten im Primordialfollikel führen zur Entstehung der Primärfollikel. Die Oozyten der Primärfollikel sind von einer Schicht kubischer Granulosazellen umgeben (BRAW-TAL und YOSSEFI 1997; FAIR et al. 1997). Durch mitotische Teilungen entsteht ein mehrschichtiges, kubisches Granulosazellepithel, das charakteristisch für die Sekundärfollikel ist. Der Durchmesser des Sekundärfollikels beträgt ca. 55 µm, wobei die Oozyte in dieser Phase nicht größer wird. Die Zellfortsätze der Granulosazellen schieben sich in das Oolemm. Am Ende dieser Zellfortsätze bilden sich Gap Junctions (FAIR et al. 1997), die einen Austausch von Molekülen zwischen Oozyten und Granulosazellen ermöglichen. In tertiären Follikeln bildet sich durch Flüssigkeitsansammlung das Antrum. Die Oozyte ist von vielen Schichten Granulosazellen umgeben, die den Kumulus Oophorus bilden. Diese Follikel haben bereits eine Theca interna und Theca externa an der basalen Lamina, und die Oozyte ist bereits vollständig von der Zona pellucida umgeben (BRAW-TAL und YOSSEFI 1997; FAIR et al. 1997). Wenn der tertiäre Follikel einen Durchmesser von mm erreicht hat, wird er als präovulatorischer bzw. Graaf scher Follikel bezeichnet. Die Oozyte hat dann einen Durchmesser von ca. 120µm, die Kumuluszellen sind expandiert und werden auch 10

19 Literatur als Kumulus oophorus bezeichnet. Die Expansion der Kumulszellen wird durch die Sekretion der Hyaluronsäure induziert, die wiederum durch den präovulatorischen Gonadotropinimpuls ausgelöst wird (EPPIG 2001). In dieser Phase wird die Meiose wieder aufgenommen und erst in der Metaphase II der zweiten Meiose arretiert (HYTTEL et al. 1986) Kommunikation zwischen Oozyte und Follikelzellen Die Kommunikation zwischen Oozyten und Follikelzellen erfolgt in beide Richtungen (EL-FOULY et al. 1970; NEKOLA und NALBANDOV 1971). Ein komplexes Zusammenspiel ist für die Entwicklung der Oozyte und der Follikelzellen wichtig und zwar vom Entstehen primordialer Follikel bis zur Ovulation (siehe Abbildung 4). Abbildung 4: Beidseitige Kommunikation von Oozyte und Follikelzelle (modifiziert nach EPPIG 2001) Die Mechanismen, die die Follikelbildung induzieren, sind kaum bekannt. Ein bedeutender Faktor scheint der ooozytenspezifische Factor In The Germline, Alpha (Figlα) zu sein, dessen mrna bereits bei 13 Tage alten Mäuseembryonen nachgewiesen wurde. Bei der Maus koordiniert Figlα die Expression einiger 11

20 Literatur Strukturgene für Komponenten der Zona pellucida (LIANG et al. 1997) und scheint auch mit für den Beginn der Follikelbildung verantwortlich zu sein. Figlα Knock-out Mäuse bilden auf ihren Ovarien keine Primordialfollikel und sind steril (SOYAL et al. 2000). Ein anderer, ebenfalls von Oozyten synthetisierter Faktor, der Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9) aus der Transforming Growth Factor-Familie (TGF-β) ist bei der Maus mit für die Entwicklung der Follikel vom Primärfollikelstadium an verantwortlich. Er wird von allen Säugetieroozyten, auch von humanen Eizellen synthetisiert (McGRATH et al. 1995; LAITINEN et al. 1998; AALTONEN et al. 1999; BODENSTEINER et al. 1999) TGF-β Familie Die TGF-β Familie umfasst eine große Anzahl extrazellulärer Faktoren, die beim Säugetier in vielen Geweben und Organen weit reichenden Einfluss ausüben. Die meisten der über 35 Mitglieder regulieren die Fertilität (KNIGHT und GLISTER 2001; CHANG et al. 2002; KNIGHT und GLISTER 2003). GDF-9, vermutlich zusammen mit GDF-9B, auch Bone-Morphogenetic Factor-15 (BMP-15) genannt, steuert im Ovar die Follikelbildung bis hin zur Ovulation und Befruchtung. Mit der Antrumbildung beginnen sich die Granulosazellen in wandständige Granulosazellen und Kumuluszellen zu differenzieren, was im Wesentlichen von der Oozyte gesteuert wird (LI et al. 2000). Die Kumuluszellen sind mit der Oozyte und untereinander durch Gap Junctions verbunden (HYTTEL et al. 1997) so dass Moleküle mit geringem Molekulargewicht wie Ionen, Nährstoffe und Aminosäuren ausgetauscht werden können, die für das Oozytenwachstum- und Entwicklung wichtig sind (SIMON et al. 1997). Größere Moleküle werden mittels Endozytose transportiert. Die wandständigen Granulosazellen, die vermutlich nur über die Follikelflüssigkeit Kontakt zur Oozyte haben, besitzen eine niedrige Proliferationsrate, höhere Stroidsynthesekapazität und höhere Expression von LH- Rezeptoren (RICHARDS et al. 1976). 12

21 Literatur Die Oozyte beeinflusst Follikelentwicklung und Differenzierung der Follikelzellen durch parakrine Botenstoffe. Drei wichtige Botenstoffe sind GDF-9, BMP15 und BMP-6. Sie werden bei Nagern in Primärfollikeln und bei Wiederkäuern in Primordialfolliken exprimiert (McGRATH et al 1995; JAATINEN et al 1999; BODENSTEINER et al. 1999; ELVIN et al. 1999a; KNIGHT und GLISTER 2003). Rinderoozyten synthetisieren GDF-9 vom Primordialstadium bis nach der Befruchtung und bis hin zur Aktivierung des embryonalen Genoms (SENDAI et al. 2001). GDF-9 knock-out Mäuse sind auf Grund gestörter früher Follikelentwicklung, unfruchtbar (DONG et al. 1996). Die arretierten Follikel besitzen morphologisch abnorme Granulosazellen und keine Thecazellschichten (ELVIN et al. 1999b). Die Oozyten wachsen schneller, sind größer und haben strukturelle Defekte (CARABATSOS et al.1998). Der Knockout der Gene BMP-15 und BMP-6 hatte nur geringe oder keine Auswirkungen (SOLLOWAY et al.1998). Abbildung 5: GDF-9 und seine vielfältige Rolle im Säugetierovar (modifiziert nach ELVIN 1999) Abkürzungen: : hoch reguliert, : herunter reguliert, upa: Urokinase Plasminogen Activator, GDF-9: Growth Differentiation Factor-9, HAS 2: Hyaluransynthase 2, StAR: Steroidogenic Acute Regulator Protein, COX2: Cyclooxigenase 2, LH: luteinisierendes Hormon 13

22 Literatur Bei der Maus bewirkt GDF-9 im Graaf schen Follikel durch Induktion von Hyaluransynthase 2 (HAS2) und gleichzeitiger Herunterregulierung des Urokinase Plasminogen Activator (upa) während der Reifung die Produktion von Hyaluronsäure angereicherter extrazellulärer Matrix (ELVIN et al. 1999a). Der präovulatorische Gonadotropinimpuls bewirkt die Sekretion von Hyaluronsäure in die Zellzwischenräume, die sich vergrößern, bis die Kumuluszellen in klebriger, dickflüssiger Matrix eingebettet sind (CHEN et al. 1993). Über die Expression von Steroidogenic Acute Regulator Protein (StAR) und der Stimulierung von Cyclooxigenase 2 (COX-2) wird die Produktion von Progesteron und Prostaglandin erhöht. Zudem wird über diesen parakrinen Signalweg die Expression von LH- Rezeptoren mrna herunter reguliert (ELVIN et al. 2000; EPPIG et al. 1997) (siehe Abbildung 5). In den humanen Granulosa- und Thecazellen inhibiert GDF-9 die camp induzierte Steroidhormonproduktion und die Expression von Genen, die für die Steroidhormonproduktion wichtig sind (YAMAMOTO 2002) Regulation des Follikelwachstums beim Rind Das Follikelwachstum ist ein komplexer Prozess, der sowohl hormonellen aber auch systemischen extraovariellen und lokalen intraovariellen Steuerungen unterworfen ist. Während der verschiedenen Phasen der Follikulogenese sind vor allem die intraovariellen Faktoren von großer Bedeutung. Einige Faktoren, wie GDF-9, BMP-15 und BMP-6 werden von der Oozyte während der gesamten Follikelentwicklung bis über die Ovulation hinaus synthetisiert. Sie fördern die Entwicklung des Follikels über das Primordial- und Primärstadium hinaus und stimulieren Proliferation und Differenzierung der Granulosazellen. TGF-β beeinflusst vom Primärfollikelstadium an die Granulosa- und Thecazellproliferation und ihre Differenzierung und unterdrückt die Produktion von Androgenen in den Thecazellen. Aktivin stimuliert die Granulosazellproliferation in präantralen und frühen antralen Follikeln. FSH-Rezeptoren und die FSH induzierte Aromatase- Aktivität werden gesteigert und fördern die Oozytenreifung. Follistatin verringert die Aktivität von Aktivin und fördert vermutlich die Luteinisierung bzw. Atresie großer 14

23 Literatur antraler Follikel. Inhibin vermehrt die LH- induzierte Androgenproduktion in großen antralen Follikeln (KNIGHT und GLISTER 2003) (siehe Abbildung 6). Abbildung 6: Abgestimmtes Zusammenwirken von extra- und intraovariellen Faktoren im Follikel (nach Knight und GLISTER 2001) Die hormonelle Regulierung der Follikelentwicklung und das Wachstum der Oozyten werden vor allem durch die Gonadotropine LH (luteinisierendes Hormon) und FSH (Follikel stimulierendes Hormon) bestimmt. LH und FSH sind Glykoproteine und werden im Hypophysenvorderlappen (Adenohypophyse) gebildet. Ihre Freisetzung erfolgt durch die Ausschüttung des Neurohormons GnRH (Gonadotropin Releasing Hormon), das aus dem Hypothalamus stammt (WALTERS und SCHALLENBERGER 1984). 15

24 Literatur Im dominanten Follikel stimuliert LH die Reifung der Oozyte und Ovulation (DIELEMAN et al. 2002). Im Follikel stimuliert LH die Synthese von Androstendion in den Thecazellen (GINTHER et al. 2001). FSH fördert die Entwicklung vom primären zum präovulatorischen Follikel und stimuliert die Östrogensynthese durch die Aktivität des Enzyms Cytochrome P450 Aromatase in den Granulosazellen (YING 1988) Wachstumsdynamik ovarieller Follikel bei Kühen und Kälbern Auf Grund einer periodischen Ausschüttung von FSH, beim Rind verläuft das Wachstum der Follikel wellenförmig in zwei bis drei Wachstumswellen pro Zyklus (PIERSON und GINTHER 1988, SAVIO et al. 1988). Die Anzahl der Follikelwellen während des Zyklus wird durch die sich ändernden Konzentrationen von Inhibin A und FSH während ovulatorischer und anovulatorischer Wellen bestimmt (PARKER et al. 2003). Jede Follikelwelle verläuft in drei Phasen: 1.) Rekrutierung, 2.) Selektion und 3.) Dominanz. In der ersten Phase wird aus einem Pool gonadotropinreaktiver ovarieller Follikel eine kleine Kohorte mit Follikeln im Durchmesser von ca. 3mm rekrutiert (GINTHER et al. 1996). Die Follikel dieser Kohorte werden einer Selektion unterworfen, bei der ein dominanter Follikel weiter wächst, während die anderen Follikel der Kohorte atresieren (DRIANCOURT 2001). Dieses wellenartige Follikelwachstum läuft kontinuierlich ab; auch bei präpuberalen und trächtigen Rindern kommt es zur Bildung anovulatorischer Follikelwellen (ROCHE und BOLAND 1991). Die Selektion des dominanten Follikels wird unter anderem über die Granulosa- und Thecazellen gesteuert. In den Granulosazellen der gonadotropinreaktiven Follikel wird vermehrt mrna für LH- Rezeptoren und Aromatase synthetisiert (BAO et al. 1997) und Theca-interna-Zellen bilden LH- Rezeptoren aus. Es wurde mrna für FSH-Rezeptoren in den Granuloszellschichten primärer Follikel festgestellt (BAO und GRAVERICK 1998). Die Zahl der FSH- Rezeptoren erhöht sich erst in den folgenden Follikelstadien durch Proliferation der Granulosazellen. Wenn nach einer periodischen Ausschüttung von FSH die Follikel eine Größe von ca. 8,5 mm erreichen, wird der dominante Follikel aus der Kohorte 16

25 Literatur selektiert (GINTHER et al. 1997). Wenn der FSH Spiegel im Blut auf basale Konzentrationen abfällt hat das zur Folge, dass die untergeordneten Follikel nicht mehr genug FSH binden können. Sie stellen ihr Wachstum ein und atresieren (ADAMS et al. 1992). Im zukünftigen dominanten Follikel stimuliert die basale Ausschüttung von LH in den Thecazellen die Synthese von Androgenen, die in den Granulosazellen, stimuliert durch Bildung von basalem FSH, zu Östrogenen aromatisiert werden (siehe Abbildung 7). Abbildung 7: Östrogensynthese in Granulosazellen (nach ENGELHARDT und BREVES 2000) Die hohe Östrogenkonzentration führt zu Bildung von Blutgefäßen in der Theca interna. Der Follikel kann so indirekt mehr FSH an sich binden. Durch die erhöhte Bildung von Östrogenen und Inhibin wird die FSH Konzentration gesenkt und es kann keine neue Rekrutierung mehr stattfinden (DRIANCOURT 2001, EVANS et al. 1997). In der präovulatorischen Phase induziert Östrogen die Bildung von LH Rezeptoren an den Granulosazellen (BAO et al. 1997, BERGFELT et al. 2000). 17

26 Literatur Der Follikel kann das präovulatorische LH binden und eine Reihe von Enzymsystemen aktivieren, die für die Luteinisierung der Granulosa- und Thecazellen nötig sind. Bei Kälbern wurden die ersten antralen Follikel schon im Alter von 2 Wochen festgestellt (RAWLINGS et al. 2003). Durch Ultraschalluntersuchungen stellten ADAMS et al. (1994) bei 8 Monate alten, präpuberalen Kälbern ein wellenartiges Follikelwachstum, ähnlich wie bei Kühen, fest. Langzeitbeobachtungen an Kälbern ergaben regelmäßige Follikelwellen nach vorausgehenden FSH-Impulsen. Anzahl und Größe der Follikel waren mit denen von Kühen vergleichbar (EVANS et al. 1994), wobei sich der Durchmesser der Follikel mit dem Alter vergrößerte (RAWLINGS et al. 2003). Bei präpuberalen Kälbern handelt es sich um anovulatorische Follikelwellen, die erst mit Erreichen der Pubertät ovulatorisch werden. DRIANCOURT et al. (2001) haben in Follikeln von Kälbern eine geringere Aromatase Aktivität der Granulosazellen und folglich auch eine geringere Östrogensynthese festgestellt. Die Achse Hypothalamus-Hypophyse-Ovar ist beim juvenilen Kalb bereits in das Follikelwachstum integriert; allerdings kommt es durch fehlende Östradiol- Rezeptoren an den GnRH-Neuronen zu einer negativen Rückkopplung beim Freisetzen von LH (DAY et al. 1987; SHIVERS et al. 1983). Erst die vermehrte Freisetzung von LH führt in den antralen Follikeln zur Östrogensynthese, präovulatorischen LH- Impuls und ersten Ovulation im Alter von Wochen (RAWLINGS et al. 2003). Durch die verstärkte GnRH- Synthese und Sekretion wird letztendlich die Hypophysen-Gonadenachse aktiviert, was zum Erreichen der Pubertät und damit zur Geschlechtsreife führt (EBLING 2005) Funktionen der Follikelzellen nach der Ovulation Nach der Ovulation formen sich die wandständigen Granulosazellen zu großen, die Thecazellen zu kleinen Luteinzellen um. Sie bilden das Drüsengewebe des Corpus luteum und synthetisieren das Steroidhormon Progesteron (NISWENDER und NETT 1994; NISWENDER 2002). Kumulus- Oozyten Komplexe (KOK) werden unmittelbar nach der Ovulation von Infundibulum tubae aufgenommen und durch den Zilienschlag des Eileiterepithels 18

27 Literatur zum Ort der Befruchtung, der Ampulla tubae weitertransportiert (SCHUMMER und VOLLMERHAUS 1995). Auf diesem Weg wird der Kumulus oophorus durch Reibung an den Zilien des Eileiters und unter Einwirkung von Enzymen, vor allem der Hyaluronidase, von der Oozyte entfernt. Beim Rind geschieht das 3-10 Stunden nach der Ovulation (LORTON und FIRST 1979; HYTTEL 1988). Vermutlich erleichtert der Kumulus oophorus die Weiterleitung des KOK im Infundibulum. Beim Hamster kommt es zur Adhäsion der extrazelluären Kumulusmatrix und der Zilien des Infundibulums (LAM et al. 2000). Für eine erfolgreiche Befruchtung in vivo und in vitro ist der Verbund von Kumuluszellen mit den Oozyten bedeutsam. Beim Hamster sind Oozyten ohne Kumuluszellen, nicht oder nur zu einem geringeren Maße befruchtungsfähig (MOORE und BEDFORD 1978). Die Entfernung der Kumuluszellen vor der In-vitro- Befruchtung beim Rind war mit einem geringeren Anteil von Spermienpenetration verbunden (ZHANG et al. 1995, THANGE 2003). Vermutlich erfüllen die Kumuluszellen vielschichtige Aufgaben während der In-vivo- und In-vitro-Befruchtung, in dem sie als Selektionsfilter für die Spermien dienen. Sie bilden eine für die Kapazitation und Penetration der Spermien, günstige Umgebung (THANGE 2002; VAN SOOM et al. 2002). 2.3 Gewinnung unreifer KOK beim Rind durch OPU Die ultraschall geleitete, transvaginale Follikelpunktion oder Ovum-Pick-Up (OPU) wurde ursprünglich im humanmedizinischen Bereich bei Fertilitätspatientinnen eingesetzt, um unreife Eizellen für die In-vitro-Fertilisierung zu gewinnen. Diese minimal invasive In-vivo-Technik wurde modifiziert und erstmals von PIETERSE et al. (1988) bei Kühen eingesetzt. Sie kann auch bei anderen Nutztierarten (Pferden: (BRÜCK et al.1997; Büffel: BONI et al. 1996) und Wildtierarten (Lama: BROGLIATTI et al. 2000; Zebra: MEINTJES et al. 1997) erfolgreich angewendet werden (siehe Tabelle 1). OPU kann beim Rind, bei 2 wöchentlichen Sitzungen über mehrere Monate durchgeführt werden, ohne dass Schäden am Tier entstehen, die eine weitere Zuchtverwendung beeinträchtigen (RICK 1996; BAGE et al. 2003). CHASTANT- 19

28 Literatur MAILLARD et al. (2003) stellten fest, dass die Punktion selbst keinen größeren Stress als routinemäßige tierärztliche Eingriffe wie rektale Untersuchungen oder das Setzen einer Epiduralanästhesie für die Tiere darstellt. OPU hat auch keine negativen Auswirkungen auf die Milchleistung und den Immunstatus der Tiere. Tabelle 1: Effizienz der ultraschall geleiteten, transvaginalen Follikelpunktion bei einigen Nutz- und Wildtierarten Tierart MW KOK/Tier/Sitzung Teilungsrate Blastozystenrate Autor Pferd (Equus caballus) Büffel (Bubalus bubalis) Büffel (Bubalus bubalis) Büffel (Bubalus bubalis) Ziege (Capra aegagrus) Addax Antilope (Addax nasomaculus) 2,4 k.a. k.a. BRÜCK et al.1996 k.a. 38% 15% KITIYANANT et al ,5 40,1 15,6% GALLI et al ,7 k.a. 16,7% BONI et al ,3** k.a % GRAFF et al k.a. 83% 0 ASA et al Lama (Lama glama) 3,1* 9,0** k.a. k.a. BROGLIATTI et al Zebra (Equus burchelli) 6,6 38% 16% MEINTJES et al.1997 MW = Mittelwert, k.a. = keine Angaben, * nicht stimuliert, ** mit FSH stimuliert Histologisch stellten CHASTANT-MAILLARD et al. (2003) blutgefüllte Follikel 4 Tage nach der letzten Punktion fest. 30 Tage nach der letzten Punktion waren kaum noch Veränderungen festzustellen, außer geringfügige Fibrinbildung im Ovargewebe. Technische Einflussfaktoren wie Nadellänge, Nadelanschliff, Vakuum, Häufigkeit der Punktion und Punktionsdauer können die Effizienz beträchtlich beeinflussen (PIETERSE et al. 1988; BOLS et al. 1995; BUNGARTZ und NIEMANN 1994; SIMON et al. 1993). 20

29 Literatur Abbildung 8: OPU beim Kalb mit Detailansicht der Punktion 21

30 Literatur Ebenso können tierindividuelle Faktoren wie Alter, Reproduktionsstatus und Rasse der punktierten Tiere die Punktionsergebnisse beeinflussen. Von Färsen konnten mit OPU weniger Oozyten und weniger Blastozysten erhalten werden als von adulten Kühen (KRUIP et al.1993, RICK et al. 1996, KIESSLING 2000). BUNGARTZ et al. (1995) gewannen eine signifikant höhere Anzahl von Oozyten und Blastozysten von Kühen, die sich 6-20 Wochen nach der Kalbung befanden als von Kühen, die vor mehr als 20 Wochen abgekalbt hatten. Eine OPU Grundausstattung besteht aus einem Ultraschallgerät mit Bildschirm, einem Träger für Ultraschallkopf und Punktionsnadel, einem Spülsystem mit Schläuchen und Auffangröhrchen, einer Vakuumpumpe und einem Wasserbad. Trotz dieses beträchtlichen technischen Aufwands wird OPU häufig in der Praxis in Verbindung mit der In-vitro-Produktion von Embryonen (IVP), als Alternative oder Ergänzung zu MOET eingesetzt (TERBECK-HASENPUSCH et al. 2005; ROSCHLAU et al. 2005). OPU kann vielseitig erfolgreich angewendet werden, um zum Beispiel In-vitro- Fertilisation (IVF) taugliche KOK von älteren Tieren (KLOSSOK 1997), von Tieren während des ersten Drittels der Trächtigkeit (EICKELMANN 1999), Tieren kurz nach dem Abkalben (KNIEP 2000) oder von so genannten Problemtieren (LOONEY et al. 1994; ROSCHLAU 1997) zu gewinnen. OPU kann auch bei präpuberalen Tieren ab dem Alter von 5-6 Monaten eingesetzt werden, ohne die weitere Entwicklung der Tiere negativ zu beeinflussen. Im Institut für Tierzucht in Mariensee wurde das Punktionsgerät für Kälber modifiziert (RICK et al. 1996; WIEKING 2001; OROPEZA et al. 2004). Um die Anzahl und Qualität der gewonnen KOK, besonders von präpuberalen Tieren zu erhöhen, sollten die Ovarien der Tiere durch Gonadotropingabe stimuliert werden (ARMSTRONG et al. 1994; DUBY et al. 1996; PRESICCE et al. 1997; WIEKING 2001). 22

31 Literatur 2.4 Unterschiede in der Entwicklungskapazität von Oozyten aus Kälbern und Kühen Das Follikelwachstum beginnt beim Rind bereits während der Fetalentwicklung; die ersten antralen Follikel werden im Alter von 2 Wochen beobachtet (RAWLINGS 2003). Wellenartiges Follikelwachstum tritt bereits bei präpuberalen Rindern auf (PIERSON und GINTHER 1988; SAVIO et al. 1988; ADAMS et al. 1994). Untersuchungen einiger Forschergruppen haben jedoch gezeigt, dass aus Follikeln präpuberaler Rinder gewonnene Oozyten eine schlechtere Entwicklungskompetenz besitzen als Oozyten erwachsener Tiere (DAMIANI et al. 1996; REVEL et al. 1995; PRESICCE et al. 1997). Es wurden niedrigere Teilungs- und Blastozystenraten erzielt (siehe Tabelle 2). Eine mögliche Ursache ist, dass Oozyten präpuberaler Tiere nicht fähig sind, die zytoplasmatische Reifung vollständig zu durchlaufen. SALAMONE et al. (2001) haben die Aktivität von MPF, MAPK und IP 3 R (Inositol1, 4, 5-Triphosphat Rezeptor) in Oozyten von Kälbern analysiert. Diese war signifikant niedriger als in adulten Oozyten. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten bei Oozyten von Kälbern morphologische Unterschiede im Vergleich zu Oozyten von Kühen. Eine verspätete und ungleichmäßige Verteilung der Zellorganellen wie Mitochondrien, Lipidtröpfchen und kortikale Granula deutet auf eine mangelhafte zytoplasmatische Reifung hin (DAMIANI et al. 1996). Die geringere Anzahl an Mitochondrien zeigt einen niedrigeren Energiestoffwechsel bei Kälberoozyten an; in vitro wurde bei Oozyten aus Kälbern eine geringere Verstoffwechslung von Glutamin und Pyruvat in den ersten Stunden nach der Befruchtung festgestellt als bei Oozyten von Kühen (DE PAZ et al. 2001; STEEVES und GARDENER 1999). Die Stoffwechselaktivität erreichte bei Oozyten von 3-4 Monate alten Kälbern erst nach 24 Stunden Reifung das Niveau der Oozyten erwachsener Rinder (STEEVES und GARDNER 1999; GANDOLFI et al. 1998). Bei Embryonen von 5-7 Monate alten Kälbern stellten STEEVES et al. (1999) eine im Vergleich zu Embryonen von Kühen um die Hälfte niedrigere Glukoseaufnahme fest. OROPEZA et al. (2004) vermutete, dass der Insulin-like Growth Factor (IGF-I) die Aufnahme von Glukose in die Zellen von 23

32 Literatur Embryonen präpuberaler Tiere während der Kompaktierung und der Blastozystenbildung positiv beeinflusst. Es gibt aber auch Anhaltspunkte für eine unvollständige Kernreifung von Kälberooyzten. Im Nukleolus unreifer Kälberoozyten wurden zwei dichte, ovale Strukturen festgestellt, die von Fibrillen umgeben waren. Ungereifte Oozyten von Kühen besitzen dagegen nur eine solche Struktur (DAMIANI et al. 1996), was als ein Zeichen gewertet wird, dass die Oozyte die RNA- und Proteinsynthese abgeschlossen hat (FAIR et al. 1996). KATHIR et al. (1998) fanden nach 20 Stunden in vitro Kultur eine signifikant verzögertes Erreichen der Metaphase II in Kälberooyzten. Tabelle 2: Entwicklungskapazität von Oozyten aus Kälbern und Kühen im Hinblick auf Teilungs- und Blastozystenraten Alter der Kälber Teilungsrate Blastozystenrate Autor 7,5 Monate v. Geburt, fetal 36,7% k.a.* CHOHAN (2004) 2-3 Monate 41-42% 10-11% TANEJA et al. (2000) 3 Monate 85,0% 73% REVEL et al. (1995) 5 Monate 24,0% 0 PRESICCE et al. (1997) 6 Monate k. A. 5,5% RICK (1996) 6 Monate 58,0% 12,2% KUWER (1998) 7 Monate 49,0% 5,0% PRESICCE et al. (1997) 7 Monate 33,8% 0 LOONEY et al. (1995) 7 Monate 63,4% 18,9% LOONEY et al. (1995) 9 Monate 88,0% 11,0% PRESICCE et al. (1997) 11 Monate 88,0% 48,0% PRESICCE et al. (1997) Kühe 73,3% 31,6% LOONEY et al.(1995) Kühe 87% 79,0% REVEL et al. (1995) Kühe k.a. 33,0% DAMIANI et al.(1996) *k.a.: keine Angaben Nach intraovarieller Applikation von IGF-I bei präpuberalen Kälbern erreichten die mrna- Expression der Gene eif1a (Eukaryontic Translation Initiation Factor-1A), 24

33 Literatur UBF (Upstream Binding Factor) und Glut-1 (Glukosetransporter-1), in präimplantatorischen Embryonen auf ein ähnliches Niveau erhöht wie das bei Embryonen aus erwachsenen Kühen, was auf eine wichtige Rolle von IGF-I bei der Erlangung vollständiger Entwicklungskapazität hindeutet (OROPEZA et al. 2004). Die Reifungskompetenz präpuberaler boviner Oozyten hängt auch mit ihrem Durchmesser zusammen (FAIR 2003). FAIR et al. (1995) stellten fest, dass bovine Oozyten erst von einem Durchmesser ab 110 µm fähig sind, die Meiose fortzusetzen. Oozyten von Kälbern sind kleiner (113,3-119,7 µm) als die von Kühen ( µm) (DUBY et al. 1996, GANDOLFI et al. 1998). Kälberooyzten die weniger als 110 µm Durchmesser aufwiesen, erreichten nicht die Metaphase II, während Oozyten mit einem Durchmesser von µm zu 30%, und Oozyten mit mehr als 120 µm Durchmesser zu 55% die Metaphase II erreichten (MAJERUS et al. 1999). Die Follikelflüssigkeit von Kühen beinhaltet mehr Proteine, weist eine höhere Aromatase- Aktivität und einen höheren Gehalt an Östradiol auf, als die von 3 Monate alten Kälbern (DRIANCOURT et al. 2001). Zu ähnlichen Ergebnissen sind auch Untersuchungen bei anderen Nutztierarten gekommen. Bei Oozyten von 6-8 Wochen alten Lämmern wurden Unterschiede im Stoffwechsel zu solchen von erwachsenen Schafen gefunden. Der Metabolismus von Glutamin war bei Lämmern signifikant niedriger. In Glukose- und Pyruvatstoffwechsel wurden jedoch keine Unterschiede festgestellt (O BRIEN et al. 1996). Von Oozyten präpuberaler Schweine wurden niedrigere Teilungs-und Blastozystenaten erhalten als von erwachsenen Sauen (IKEDA und TAKAHASHI 2003). 2.5 Ansätze zur Steigerung der Entwicklungskapazität von präpuberalen bovinen Oozyten Um Anzahl und Entwicklungskapazität präpuberaler boviner Oozyten zu steigern, wurden in der Vergangenheit verschiedene Untersuchungen durchgeführt. Präpuberale Tiere können hormonell durch eine i.m. Applikation von Gonadotropinen stimuliert werden (KUWER 1997; PRESICCE et al. 1997; FRY et al. 1998). KUWER (1997) erhielt nach intramuskulärer Applikation von hcg (humanes Choriongonadotropin) und FSH vor Anwendung von OPU eine signifikant größere 25

34 Literatur Anzahl an IVF tauglichen Oozyten als von Kontrolltieren ohne Behandlung. PRESICCE et al. (1997) konnten mit ecg (equines Choriongonadotropin) und FSH Applikationen den Anteil an Morulae und Blastozysten aus Oozyten von 5 Monate alten Kälbern auf ~10% steigern. Bei unstimulierten Tieren wurden keine Morulae und Blastozysten erhalten. Nach Superovulation mit FSH, hcg oder GnRH wurden mehr Follikel bei den mit GnRH stimulierten Tieren gefunden (FRY et al. 1998). Die Anzahl erhaltener Oozyten nach OPU war ähnlich wie bei unstimulierten Kälbern. Die intraovarielle Injektion von Gonadotropinen (WIEKING 2001) oder Wachstumsfaktoren (OROPEZA 2004) ist eine technisch aufwendigere Methode, um Follikelwachstum, Oozytenanzahl und Qualität bei juvenilen Kälbern zu stimulieren. WIEKING (2001) konnte mit 1,25 mg bzw. 2,5 mg intraovariell (i.o.) verabreichtem FSH Anzahl und Qualität Oozyten im Vergleich zu unstimulierten Kälbern steigern. Es konnten auch Kälber nach Transfer von in vitro erzeugten Embryonen aus Kälberoozyten produziert werden. Nach i.o. Injektionen des Wachstumsfaktors IGF-I und 60 mg FSH i.m. erhielt OROPEZA (2004) von Kälbern im Alter zwischen 6-7 Monaten mehr Blastozysten als von Kontrolltieren. Bei den älteren Tieren von 9-11 Monaten waren die Blastozystenraten ähnlich denen bei Kühen. Die Anzahl von Follikeln und Oozyten waren bei allen Altersgruppen ähnlich. PALMA et al. (2001) versuchten durch Zugabe von FSH und Oestradiol-17β in das Reifungsmedium, die Entwicklungskompetenz von Kälberoozyten zu erhöhen. Höhere Konzentrationen von Oestradiol-17β hatten aber niedrigere Blastozystenraten zur Folge. Höhere Konzentrationen von FSH dagegen verbesserten die Entwicklungsfähigkeit der Kälberoozyten. Eine in vivo Kultur in Kanincheneileitern erhöhte die Entwicklungskapazität präpuberaler Ziegenoozyten nicht im Vergleich zur In vitro Kultur mit oder ohne Eileiterzellen (IZQUIERDO et al. 2002). Weder der Zusatz von fetalem Kälberserum noch Follikelflüssigkeit aus Follikeln präpuberaler Kälber oder erwachsenen Kühen im Reifungsmedium erhöhte die Entwicklungsfähigkeit von KOKs aus Kühen und Kälbern. Dagegen waren die Entwicklungsraten der KOKs von Kühen erhöht (KHATIR et al. 1997). 26

35 Literatur Die bei Oozyten adulter Rinder erfolgreiche Prämaturation durch reversible Meioseinhibitoren wie Butyrolactone-I (BL-I) und Roscovitine (Rosco) hatte bei Oozyten von 6-9 Monate alten Kälbern einen negativen Einfluss auf ihre Entwicklungskompetenz (DONNAY et al. 2004; PAVLOK et al. 2000). Durch Zusatz von FF-MAS in das Reifungsmedium konnte die Kernreifung präpuberaler Kälberoozyten stimuliert werden. Auf die Verbesserung ihrer Entwicklungskompetenz nach der Befruchtung hatte FF-MAS jedoch keinen positiven Effekt, was zeigte, dass die Folgen einer mangelhaften zytoplasmatischen Reifung durch eine erfolgreiche Kernreifung nicht aufgehoben werden konnten. Die Stimulierung der Glutathion-Synthese (GSH) durch den Zusatz von Cystein und Cystamin ins Reifungsmedium (DE MATOS et al. 2000) konnte die zytoplasmatische Reifung und nachfolgende Entwicklungsfähigkeit juveniler Kälberoozyten verbessern (DONNAY et al. 2004). 2.6 Kokultur in der In-vitro-Produktion von Embryonen Um die Effizienz der In-vitro-Produktion von Embryonen zu steigern wurden in der Vergangenheit Eileiterzellen und Follikelzellen in verschiedenen IVP-Schritten mit verwendet. ROMAR et al. (2001) gelang es, durch Kultivierung porziner KOK für 4 Stunden auf porzinen Oviduktepithelzellen und Verkürzung der IVF-Phase auf 6 Stunden, die Polyspermierate zu senken. Durch den Einsatz porziner Granulosazellen in verschiedenen Reifungssystemen konnte die Kernreifung porziner Oozyten aber nicht gesteigert werden. Bovine Granulosazellen allein, aber auch die Zugabe von EGF und FSH, steigerten die Kernreifung der porzinen Oozyten (SOMMER 1991). Epithelzellen aus den Eileitern präpuberaler und erwachsener Ziegen wurden in der Ko-Kultur eingesetzt, um die Entwicklungskompetenz präpuberaler Ziegenoozyten zu steigern (IZQUIERDO et al. 2002). Die Blastozystenraten waren in beiden Versuchsgruppen aber ähnlich. MOGAS et al. (1997) setzten Granulosazellmonolayer aus Follikeln präpuberaler und adulter Ziegen während der Reifung und Embryokultur von Ziegenoozyten bzw. Zygoten ein. Sie stellten eine signifikant höhere Maturations-, Teilungs- und Blastozystenrate bei der Gruppe fest, die auf 27

36 Literatur Granulosazellmonolayern von FSH behandelten, juvenilen bzw. adulten Ziegen stammten, im Vergleich zu den unbehandelten juvenilen bzw. adulten Tieren. Ähnliche Ergebnisse, im Hinblick auf Befruchtung, Teilung und Blastozystenzahlen, erreichten TEOTIA et al. (2001) nach Reifung von Ziegenoozyten auf Granulosazellmonolayern. Die Granulosazellen stammten aus kleinen ( 4mm) oder großen ( 4mm) Follikeln. Das Reifungsmedium wurde Stunden vor der Reifung auf den Monolayer verbracht. Im Bereich der In-vitro-Produktion beim Rind gibt es nur wenige Untersuchungen, in denen Granulosazellen verwendet wurden, um das Entwicklungspotential von präpuberalen Oozyten zu erhöhen. REVEL et al. (1995) verwendeten bovine Granulosazellmonolayer für die Reifung von Oozyten 3 Monate alter Kälber nach der Schlachtung. Die Blastozysten- und Trächtigkeitsraten (9-11% und 1/23 Übertragungen) waren jedoch deutlich niedriger als bei Kühen (20% Blastozystenraten und 38% Trächtigkeitsrate). Der Einfluss verschiedener Zusätze wie fetal calf serum (FCS), oestrous cow serum (ECS) mit entweder FSH, LH, Oestradiol oder Granulosazellen, in unterschiedlichen Schritten der IVP auf adulte bovine Oozyten wurde von FUKUI und ONO (1989) untersucht. Die höchsten Blastozystenraten wurden nach Kokultur mit Granulosazellen erhalten (FUKUI und ONO 1989). Mit Zusatz von Progesteron im Kulturmedium konnte im Vergleich zu einem Granulosazellmonolayer keine höheren Befruchtungsraten von adulten bovinen Oozyten erzielt werden (THANGE et al. 2001). Die Anzahl polysperm befruchteter Oozyten war jedoch signifikant höher. 2.7 Expression entwickunglsrelevanter Gene bei bovinen präimplantatorischen Embryonen Die Genexpression in eukaryontischen Zellen beginnt mit der Produktion einer RNA- Kopie eines bestimmten Abschnittes der DNA-Dopplelhelix eines Gens, der Transkription. Bei der anschließenden Translation werden die Basensequenzen der RNA in die Aminosäurensequenzen der Proteine übersetzt. 28