B-Zellen und Antikörper

Transkript

1 Seminar Modellstudiengang (Blut und Immunologie) Donnerstag 8. November :15-14:45 / 15:15-16:45 B-Zellen und Antikörper Albrecht Bufe

2 T und B Zellen zirkulieren unablässig durch sekundäre lymphatische Organe HE V Blutversorgung

3 T und B Zellen zirkulieren unablässig durch sekundäre lymphatische Organe B Zelle Blutversorgung

4 T und B Zellen zirkulieren unablässig durch sekundäre lymphatische Organe T Zelle

5 Antigen Immunisierung Haut / Schleimhaut Dendritische Zelle (APZ)

6 T Zellen finden Antigen auf Dendritschen Zellen Immunologische Synapse Aktiviert T Zelle

7 Aktivierte B Zellen und T Zellen ziehen sich gegenseitig an

8 Aktivierte B Zellen und T Zellen ziehen sich gegenseitig an

9 Aktivierte B Zellen und T Zellen ziehen sich gegenseitig an Immunologische Synapse Aktiviert B Zelle!

10 Aktivierte B Zellen und T Zellen ziehen sich gegenseitig an

11 T Zellen verlassen den Lympknoten als Effektorzellen

12 T Zellen verlassen den Lympknoten als Effektorzellen

13 Aktivierte B Zellen proliferieren und differenzieren in Plasma Zellen

14 Aktivierte B Zellen proliferieren und differenzieren in Plasma Zellen

15 Aktivierte B Zellen proliferieren und differenzieren in Plasma Zellen

16 Aktivierte B Zellen proliferieren und differenzieren in Plasma Zellen

17 Aktivierte B Zellen proliferieren und differenzieren in Plasma Zellen

18 B-Zellentwicklung Haut / Schleimhaut Lymphknoten B-Zelle Knochenmark IgM

19 Knochenmark B-Zellentwicklung Antigen-unabhängig Stammzelle Frühe Pro-B-Zelle Späte Pro-B-Zelle Große Prä-B-Zelle Kleine Prä-B-Zelle Prä-B-Rezeptor Knochenmark Blutbahn, Lymphknoten, Gewebe Antigen-abhängig Unreife B-Zelle Reife naive B-Zelle Lymphoblast B-Gedächniszelle Plasmazelle IgM IgG IgM IgM IgD IgG

20 Stammzelle Cell adhesion molecules CAMs VLA-4 VCAM-1 Integrine Stromazelle (Knochenmark, Leber)

21 Frühe Pro-B-Zelle Kit SCF Stem Cell Factor Stromazelle (Knochenmark, Leber)

22 Späte Pro-B-Zelle IL-7 Stromazelle (Knochenmark, Leber)

23 Prä-B-Zelle IL-7 CAMs Stromazelle (Knochenmark, Leber)

24 Unreife-B-Zelle Blut IgM Stromazelle (Knochenmark) Autoantigene

25 Klonale Selektion Unreife B-Zellen Autoantigene Beseitigung (Apoptose) unreifer B-Zellen, die mit SELBST-Antigenen reagieren, durch klonale Selektion Membran IgM Reife naive B-Zellen Fremdantigen Fremdantigen

26 Keimbahn L V J C L V J C V-J-Verknüpfung L V J C Primäre RNA AAA L V J C mrna AAA Keimbahn V L C L L = leader V = variable J = joining C = constant

27 Keimbahn L V D J C L V D J C D-J-Verknüpfung L V DJ C VDJ-Verknüpfung L V DJ C Primäre RNA AAA L V D J C mrna AAA Keimbahn D = diversity

28 Genomische Organisation der Antikörpergene Leichte l-kette L l 1 V l 1 L l V l -29 J l 1 C l 1 J l C l - 4 Leichte k-kette L k 1 V k 1 L k V k -40 J k 1-5 C k Schwere Kette L H 1 V H 1 L H V H -51 D H 1-27 J H 1-6 C µ

29 Spezifische Erkennungssequenzen als Rekombinantionssignale L V J C ACAAAAACC GGTTTTTTGT TGTTTTTTGG CCAAAAACA

30 Rekombination Gleich Orientierung Unterschiedlich Heptamere ERKENNUNGS- SEQUENZEN Nonamere

31 Heptamer Nonamer Spaltung des Einzelstranges durch RAG-1,RAG-2 Komplex (Rekombination aktivierende Gene) Nonamer Heptamer Spaltung des komplementären Stranges Haarnadel bildung Haarnadel bildung Bildung der Signalverknüpfungssequenz

32 P-Nucleotide durch Endonukleasespaltung der Haarnadeln Anfügen der N-Nukleotide durch terminale DNA-Transferase Paarung der Stränge Exonuklease, DNA-Synthese und Ligation (Verknüpfungssequenz)

33 Regulation in der frühen B-Zellentwicklung Die Expression der Enzyme, die an der Rekombination der IG-Gene beteiligt sind, ist entwicklungsabhängig programmiert Die Rekombination der IG-Gene ist eng mit deren Transkription koordiniert Die Rekombination der IG-Gene verändert die Aktivität ihrer Promotoren

34 Entstehung der Antikörpervielfalt 1) Kombinatorische Vielfalt: Die einzelnen Gensegmente für die Domänen liegen in mehreren Kopien vor, die alle miteinander kombiniert werden können. Schwere Kette: 51 V H -Segmente 27 D H -Segmente 51 x 27 x 6 = J H -Segmente Leichte Kette k: 40 V L -Segmente 5 x 40 = J L -Segmente Leichte Kette l: 29 V L -Segmente 4 x 29 = J L -Segmente 316 leichte Ketten x 8262 schwere Ketten = 2,5 x ) Junktionale Vielfalt: Beim Aneinanderfügen der verschiedenen Segmente werden weitere Nukleotide eingefügt. 2/ 3 dieser eingefügten Nukleotide machen das Antikörpermolekül funktionslos (Leserasterverschiebung). 3) Somatische Hypermutation: Während der Reifung der B-Zellen in den sekundären lymphatischen Organen werden bereits funktionsfähige Antikörper verändert. In den hypervariablen Schleifen treten Mutationen auf. Antikörper, die besser an ihr Antigen binden, werden selektiert (Affinitätsreifung)

35 Immunglobulinvielfalt Element Immunglobuline -Rezeptoren H k l V-Segmente ~ 70 D-Segmente ~ D-Segmente, in drei Rastern gelesen selten - oft - J-Segmente Verknüftungen mit N- und P- Nukleotiden 2 (1) 2 1 Anzahl der V-Genpaare Verknüpfungsvielfalt ~ ~ Gesamtvielfalt ~ ~ 10 16

36 B-Zellentwicklung abhängig von der Genrekombination Stammzelle Frühe Pro-B-Zelle Späte Pro-B-Zelle Große Prä-B-Zelle Kleine Prä-B-Zelle Prä-B-Rezeptor Keimbahn D-J Umordnung VDJ-Umordnung Leichte Kette - VJ Umordnung Auf beiden Chromosomen - + Auf dem 1. Chromosom Auf dem 2. Chromosom - + Rec. K-Gen 1. Chromosom Rec. K-Gen 2. Chromosom + Unreife-B-Zelle Rec. l-gen 1. Chromosom Rec. l-gen 2. Chromosom - + IgM

37 B-Zellentwicklung abhängig von der Genrekombination Stammzelle Frühe Pro-B-Zelle Späte Pro-B-Zelle Große Prä-B-Zelle Kleine Prä-B-Zelle Prä-B-Rezeptor Keimbahn D-J Umordnung VDJ-Umordnung Leichte Kette - VJ Umordnung Auf beiden Chromosomen - + Auf dem 1. Chromosom Auf dem 2. Chromosom - + Rec. K-Gen 1. Chromosom Rec. K-Gen 2. Chromosom + Unreife-B-Zelle Das Erscheinen der Immunglobulinrezeptoren auf der Zelloberfläche entscheidet über Weiterentwicklung der B-Zelle Rec. l-gen 1. Chromosom Rec. l-gen 2. Chromosom - + IgM

38 B-Zellentwicklung Haut / Schleimhaut Lymphknoten Reife naive B-Zelle Knochenmark IgM

39 Aktivierte B Zellen und T Zellen ziehen sich gegenseitig an

40 Aktivierte B Zellen und T Zellen ziehen sich gegenseitig an Immunologische Synapse Aktiviert B Zelle!

41 B Zellen benötigen VIER SIGNALE um aktiviert zu werden CD40 IL-4 CD40L Aktivierte T Zelle

42 Aktivierte B Zellen entwickeln sich zu Plasmazellen und Gedächtniszellen Immunologische Synapse Aktiviert B Zelle! B-Gedächniszelle Lymphoblast IgG IgM Plasmazelle IgG

43 Antikörperstruktur und -funktion

44 V L C L V H C H 2 C H 4 Variable Regionen C H 1 Konstante Regionen Disulfidbrücken Antigenbindungsstelle

45 Antikörper- Spaltung pfc C H 3 Pepsin C H 2 Papain F(ab ) 2 C H 1 Fc Fc = Fragment crystallizable Fab Fab Fab = Fragment antigen binding

46 Die 3D-Struktur, die von den hypervariablen Schleifen gebildet wird, bestimmt, welche Antigene gebunden werden können.

47 Peptid CDRs complementary determining regions

48 Physikalische Kräfte zwischen Antikörper und Antigen Anziehungen zwischen entgegengesetzten Ladungen Elektronegative Atome (N, O) teilen sich ein Wasserstoffatom Fluktuationen in den Elektronenwolken um Moleküle herum polarisieren benachbarte Atome entgegengesetzt Hydrophobe Gruppen stoßen Wasser ab und neigen dazu, sich zusammenzuballen, um Wassermoleküle zu verdrängen; an der Anziehung sind auch van-der Waals- Kräfte beteiligt.

49 Präzipitations- (Heidelberger-) kurve Äquivalenz Antikörperüberschuss Antigenüberschuss

50 Affinität und Avidität von Antikörpern Monovalentes Antigen Multivalentes Antigen Assoziation Dissoziation Assoziation Dissoziation

51 Bestimmung der Affinität Kein AK Niedrig Konz. AK Hoch Konz. AK Affinität ist die Bindungsstärke zwischen Ak und Ag, definiert als die Steigung des Verhältnisses von r zu r/c r/c Ka = Steigung = Assoziationskonstante (monovalentes Ag) r = Mol gebundenes Ag pro Mol Ak Ka = Steigung bei x = 1 = mittlere Assoziationskonstante (multivalentes Ag) 1 2 r c = Konz. an freiem Ag

52 IgM J (junction) - Kette C H 4 C H 3 C H 2 J-Kette Disulfidbrücken C H 1 Hinge-Region (Gelenk)

53 Antikörpergene der konstanten Region Schwere Kette J H 1-6 C µ C d C g 3 C g1 wc e C 1 C g2 C g4 C e C 2 Konstante Region Isotypswitch Lymphoblast B-Zelle Plasmazelle IgM IgG IgA IgE IgG

54 Isotyp-switch Schwere Kette J H 1-6 C µ C d C g 3 C g1 wc e C 1 C g2 C g4 C e C 2 Konstante Region Spezifische DNA-Sequenzen (switch-region) regulieren die Rekombination Der Isotyp-switch wird durch Transkriptionsfaktoren (Switch-factors) induziert Der Isotyp-switch findet im Lymphknoten (Keimzentrum) statt Er erfordert ein spezifisches Milieu aus Zytokinen, die ihrerseits die Switchfaktoren aktivieren

55 Isotypswitch Schwere Kette J H 1-6 C µ C d C g 3 C g1 wc e C 1 C g2 C g4 C e C 2 IFN-g IL-4 IL-5 TGF- = induziert = steigert Synthese = hemmt

56 IgG IgG1 C H 3 Hinge-Region (Gelenk) IgG2 C H 2 C H 1 IgG3 IgG4

57 Isotypswitch Schwere Kette J H 1-6 C µ C d C g 3 C g1 wc e C 1 C g2 C g4 C e C 2 IFN-g IL-5 TGF- IL-4 = induziert = steigert Synthese = hemmt

58 IgA Polymerisierung mit J-Kette nur in der Schleimhaut (für Transport durch Epithelzellen erforderlich) C H 3 C H 2 C H 1 J-Kette Disulfidbrücken

59 Isotypswitch Schwere Kette J H 1-6 C µ C d C g 3 C g1 wc e C 1 C g2 C g4 C e C 2 IFN-g IL-5 TGF- IL-4 = induziert = steigert Synthese = hemmt

60 IgE Mastzelle, Basophile Zelle C H 4 C H 3 C H 2 C H 1 Hinge-Region (Gelenk)

61 Verteilung von Antikörpern Verteilung IgM IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA IgE Transport durch Epithel Transport durch Placenta Diffusion in extravaskuläre Bereiche +/ Serumspiegel (mg/ml) 1, ,5 2,1 3x10-5

62 Neutralisation: Antigen wird vom Antikörper abgefangen, z.b. als Toxin an der Bindung zu einem entsprechenden Rezeptor gehindert und schließlich entfernt (Phagozytose und Abbau) Opsonierung: Zumeist größerer Antigene wird von Antikörpern eingehüllt. So wird durch Antikörperrezeptoren vermittelte Phagozytose (z.b. Makrophagen) verstärkt. Sensibilisierung für tödliche Angriffe von NK-Zellen: Antikörper (IgG) binden an Antigene und an NK-Zellen, NK-Zellen setzen tödliche Granula frei

63 Sensibilisierung von Mastzellen: IgE Antikörper binden über den hochaffinen IgE-Rezeptor an Mastzellen. Antigen kann Mastzellen aktivieren, die ihrerseits Granula freisetzen und eine Abwehrreaktion auslösen. Aktivierung von Komplement: Antikörper (zumeist IgM) binden Antigen und gleichzeitig Komplement im Serum. Das Komplement löst eine Kaskade von verschiedenen Abwehrreaktionen aus.

64 Effektorfunktionen der Antikörper Funktion IgM IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA IgE Neutralisierung Opsonierung Sensibilisierung für tödliche Angriffe von NK-Zellen Sensibilisierung von Mastzellen Aktivierung des Komplementsystems

65 Opsonierung: Zumeist größerer Antigene wird von Antikörpern eingehüllt. So wird durch Antikörperrezeptoren vermittelte Phagozytose (z.b. Makrophagen) verstärkt. Rezeptor vermittelte Aktivitäten Sensibilisierung für tödliche Angriffe von NK-Zellen: Antikörper (IgG) binden an Antigene und an NK-Zellen, NK-Zellen setzen tödliche Granula frei

66 Rezeptoren der Antikörper Rezeptor Struktur Fcg-RI (CD64) Fcg-RII-A (CD32) Fcg-RII-B2 Fcg-RII-B1 Fcg-RIII (CD16) Fce-RI g g g g Bindung Reihenfolge der Affinität IgG 10 8 M -1 IgG1 IgG3=IgG4 IgG2 IgG 2x10 6 M -1 IgG1 IgG3=IgG4 IgG2 IgG 2x10 6 M -1 IgG1 IgG3=IgG4 IgG2 IgG 2x10 6 M -1 IgG1 IgG3=IgG4 IgG2 IgG 5x10 5 M -1 IgG1=IgG3 IgE M -1 Zelltyp Monozyten Makrophagen Neutrophile Eosinophile Makrophagen Neutrophile Eosinophile Blutplättchen Makrophagen Neutrophile Eosinophile Basophile Blutplättchen Langerhanszellen B-Zellen Basophile NK-Zellen Monozyten Makrophagen Neutrophile Eosinophile Langerhanszellen Mastzellen Eosinophile Basophile Auswirkung der Bindung Aufnahme Aufnahme Freisetzung Von Granula (Eosinopile) Aufnahme Freisetzung Von Granula (Eosinopile) Unterdrückung der Stimulation, keine Aufnahme Induktion des Tötens (NK-Zellen) Freisetzung von Granula

67 Affinitärreifung

68 B Zellen benötigen VIER SIGNALE um aktiviert zu werden CD40 IL-4 CD40L Aktivierte T Zelle

69 B Zell Differenzierung Keimzentrum Memory B Zelle Langlebig Entdifferenzierte Plasma Zelle Knochenmark Langlebige PZ Hochaffine Plasma Zelle

70 Struktur eines Lymphknoten Keimzentrum T Zone Follikel Medulla

71 Antigen-spezifische Interaktionen im Lymphknoten Dendritische Zelle naïve T Zelle B Zelle FOLLIKEL T T T ZONE Dendritische Zelle Aktivierte T Zelle Plasma Zellen MEDULLA Plasmablasten Keimzentrum Hypermutation Affinitätsreifung

72 Somatische Hypermutation (Affinitätsreifung) Antigenbindungsstelle complementary determining regions (CDRs) CDR1 CDR3 CDR3 Antikörper 1 Antikörper 2 Antikörper 3 AS AS AS

73 Ig V-Gen- Hypermutation and Selektion in Keimzentren Nicht Selektion Apoptose Zentrozyten Zentroblasten Helle Zone T FOLLIKEL MANTEL ZZ T ZB ZZ T ZZ FDC + Antigen ZZ ZB Ig-V-Gen- Hypermutation ZB Dunkle Zone T ZZ PZ T mb Selektion Differenzierung

74 Der besondere Fall der FDCs im Keimzentrum

75 Struktur eines Lymphknoten Keimzentrum T Zone Follikel Medulla

76 Das weitere Schicksal der reifen naiven B-Zelle? Im Follikel befinden sich die Folikulär dendritischen Zellen (FDC). Einige der B-Zellen werden zu den FDCs gelockt und bilden dort ein Keimzentrum.

77 Folikulär dendritische Zelle FDCs sind keine dendritischen Zellen (tragen keine MHC- Moleküle, stimulieren also keine T-Zellen) Sie bilden ein Netz in den Primärfollikeln. Sie binden Immunkomplexen aus Antikörpern und Antigenen über Fc-Rezeptoren. Sie locken B-Zellen durch Freisetzung des Chemoattrackents BLC (B-Zell-Chemokine) in die Keimzentren. Zu dieser Zeit findet die somatische Hypermutation statt. Die im Keimzentrum in Affinität gereiften B-Zellen versuchen die löslichen Antikörper aus den Immunkomplexen herauszudrängen. Wenn es gelingt, erhalten Sie weiter Antigenstimulation als Überlebenssignal. Jetzt bilden sich Plasma- und Memoryzellen, die vermutlich sehr lange leben.

78 Fc-Rezeptor Zentrozyt

79 Fc-Rezeptor Hohe Affinität