Molekulargenetische Grundlagen der Zystischen Fibrose

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1 Monatsschr Kinderheilkd : Springer-Verlag 2001 Zystische Fibrose S. Gallati Molekulare Humangenetik, Medizinische Universitätskinderklinik, Inselspital, Universität Bern Molekulargenetische Grundlagen der Zystischen Fibrose Zusammenfassung Die Zystische Fibrose (CF) wird durch mehr als 900 verschiedene Mutationen im CFTR- Gen (CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) verursacht. Mittels einer speziellen SSCP/HD-Technik ist es möglich, etwa 97% aller CF-Mutationen molekulargenetisch nachzuweisen. Dies ermöglicht eine zuverlässige Diagnosestellung,Trägererfassung und vorgeburtliche Untersuchungen (pnd) bei Patienten und ihren Familienangehörigen. Die Mechanismen hingegen, die zu einer Dysfunktion des CFTR-Proteins führen, können aufgrund des Defekts in der DNA nicht vorausgesagt werden, sondern müssen für jede einzelne Mutation anhand funktioneller Studien definiert werden.klonierung und Charakterisierung des CFTR-Gens sowie die Identifikation der die Krankheit verursachenden Mutationen und Genotyp-Phänotyp-Assoziationsstudien bieten die Grundlagen für neue diagnostische und prognostische Perspektiven, für einen vertieften Einblick in die Zusammenhänge der Pathogenese sowie für die Entwicklung neuer kausaler Therapieansätze. Schlüsselwörter Zystische Fibrose CFTR-Gen SSCP/HD-Technik Das Fachgebiet der Humangenetik hat sich, insbesondere im molekularen Bereich, zu einer Schlüsseldisziplin in der gesamten Medizin entwickelt. Obwohl auch heute noch der klassische Weg der Erforschung von Erbkrankheiten als erstes über die Erfassung und Beschreibung des Phänotyps und ausgedehnte Stammbaumanalysen führt, beinhaltet der nächste Schritt die Suche nach der molekularen Ursache der Krankheit im Gen und deren Auswirkungen auf Transkript und Genprodukt. Heterogenes Krankheitsbild erschwert die Diagnose. Molekulargenetische Untersuchungen gewinnen im ärztlichen Alltag immer mehr an praktischer Bedeutung, indem aussagekräftige genetische Tests einer klaren Indikationsstellung bedürfen und die daraus hervorgehenden Resultate und Interpretationen den Patienten und ihren Familienangehörigen verständlich und kompetent mitgeteilt werden müssen. Zudem ist es unerlässlich, Möglichkeiten und Grenzen molekulargenetischer Analysen richtig beurteilen zu können. Mit nachfolgendem Artikel soll anhand einer häufigen und sehr komplexen monogenen Erbkrankheit, der Zystischen Fibrose (CF), das Interesse und Verständnis für die molekulare Medizin geweckt und deren Bedeutung aufgezeigt werden. Die Zystische Fibrose oder Mukoviszidose manifestiert sich mit einer enormen Variabilität und überdurchschnittlichen Komplexität, die Wissenschaftler und Kliniker schon seit Jahrzehnten beschäftigt. Im Verlauf der letzten Jahrzehnte haben sich Dank einer verbesserten Diagnostik und Therapie Lebensqualität und Lebenserwartung von Patienten mit CF deutlich verbessert. Sind früher die meisten Betroffenen im Kindesalter verstorben, liegt die mittlere Lebenserwartung heute bei Jahren. Die phänotypische Heterogenität, das Vorkommen milder oder untypischer Krankheitsbilder sowie grenzwertige bis sogar normale Ergebnisse des Schweißtests können die Diagnose erschweren, die jedoch aus therapeutischen Gründen und für die Familienberatung unerlässlich ist. Nach wie vor existiert noch keine kausale Therapie, und die Entwicklung einer sicheren, wirksamen und effizienten Gentherapie wird noch Jahre dauern [10]. Häufigkeit und Vererbung Die Zystische Fibrose ist die zweithäufigste autosomal-rezessive Erbkrankheit der weißen (kaukasischen) Bevölkerung. Wie viele andere genetische Krankheiten tritt die CF in Abhängigkeit vom ethnischen Ursprung einer Bevölkerungsgruppe mit unterschiedlicher Häufigkeit auf.während in der asiatischen Population nur 1 Kind unter oder in der afrikanisch-amerikanischen Bevölkerung 1 Kind unter erkrankt, Prof. Dr. Sabina Gallati Molekulare Humangenetik, Medizinische Universitätskinderklinik, Inselspital, Universität Bern, CH-3010 Bern, Schweiz, sabina.gallati@insel.ch Monatsschrift Kinderheilkunde

2 Monatsschr Kinderheilkd : Springer-Verlag 2001 S. Gallati Genetics of cystic fibrosis Abstract Cystic Fibrosis (CF) is the second most common autosomal-recessive disorder in Caucasians with an incidence of 1 in 2500 to 1 in 1600 and a carrier frequency of 4 to 5%. More than 900 different disease-causing mutations within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene have been reported so far.the large size of the CFTR gene (250 kb of genomic DNA, 6100 bp of coding sequences) as well as the multiplicity of mutations complicate molecular genetic diagnostics.therefore, a specific and efficient SSCP/HD technique has been established detecting 97% of all CF mutations and enabeling reliable diagnosis, carrier detection and prenatal analyses in patients, family members and partners. However, how the different types of mutations (nonsense, missense, frameshift, splice site mutations, in-frame deletions and insertions) disrupt the protein function is not predictable by the gene defect alone but has to be evaluated for each single mutation by functional investigations. Characterization of the CFTR gene and identification of the pathogenic mutations as well as genotype phenotype association studies offer the basic knowledge for the development of new diagnostic, prognostic and therapeutic perspectives and extensive insight into the pathogenesis of the disease. Keywords Cystic fibrosis CFTR gene SSCP/HD technique Zystische Fibrose liegt in Nordamerika und Europa die Inzidenz zwischen 1:2500 und 1:1600. Heterozygote tragen ein gesundes und ein mutiertes CF-Allel, sind klinisch asymptomatisch und werden als gesunde Träger oder Carrier bezeichnet. In Nordamerika sind etwa 4%, in Nordeuropa 5% der Bevölkerung gesunde Träger einer CF-Mutation, was zur Folge hat, dass bei 1 unter 400 bzw. 1 unter 600 Ehepaaren beide Partner ein gesundes und ein mutiertes CF-Gen besitzen. Diese Paare haben bei jeder Schwangerschaft ein Risiko von 25%, dass ihr Kind an CF erkranken wird. Phänotypisch gesunde Geschwister von CF-Patienten sind mit einer Wahrscheinlichkeit von 2/3 Träger einer CF-Mutation. Gen und Genprodukt Im Jahre 1989 wurde das CF-Gen auf dem langen Arm von Chromosom 7 (7q31.3) entdeckt (Abb. 1a) und charakterisiert [3, 6, 7]. Es erstreckt sich über Basenpaare (bp) genomischer DNA, wobei die kodierenden Sequenzen in 27 Exons unterteilt sind (Abb. 1b). Das ausgereifte Transkript (mrna) enthält nur noch 2,6% (6500 bp) der gesamten Gensequenzen (Abb.1c) und kodiert für das aus 1480 Aminosäuren (AS) zusammengesetzte Genprodukt. Das CF-Gen ist für die Produktion eines Proteins (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) verantwortlich, das Chloridionen durch die apikale Membran verschiedener Epithelien,hauptsächlich aber des Respirations- und Verdauungstraktes,transportiert. Das CFTR-Protein besteht aus 2 Transmembranregionen (TM1, TM2) mit je 6 hydrophoben Segmenten (Loops), 2 Nukleotidbindungsfalten NBF1 und NBF2, die ATP binden, und einer Regulatoroder R-Domäne, die die beiden symmetrischen Teile des Genprodukts (TM1, NBF1 TM2,NBF2) verknüpfen (Abb.1d). Die R-Domäne ist durch zahlreiche geladene Seitenketten charakterisiert und funktioniert als Pforte. In phosphoryliertem Zustand öffnet sich der Kanal und ermöglicht den Chloridionentransport, bei fehlender Phosphorylierung wird der Ionenfluss blockiert. Mutationen des CF-Gens Mehr als 900 verschiedene, über das ganze Gen verteilte Mutationen wurden bisher dem Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium ( on.ca/cftr/) gemeldet, wobei nur wenige eine Häufigkeit von 1 2% erreichen. Die meisten Abweichungen von der normalen Basensequenz sind Punktmutationen oder Minimutationen, die nur ein bzw. einige wenige Nukleotide betreffen. Punktmutationen sind durch den Austausch einer Base (Substitution) definiert, der jedoch unterschiedliche Konsequenzen hat. Missense-Mutationen verursachen im Genprodukt den Austausch einer Aminosäure gegen eine andere, Nonsense-Mutationen dagegen verwandeln durch die Basensubstitution ein Aminosäurekodon in ein Stoppkodon, sodass die Translation frühzeitig abgebrochen wird. Spleißstellenmutationen erzeugen oder zerstören Spleißerkennungssequenzen, sodass ein verkürztes oder verlängertes Transkript entsteht. Frameshift-Mutationen verursachen durch Verlust oder Einschieben einer oder mehrerer Basen das Verschieben des Leserasters, was ebenfalls in einem verfrühten Translationsabbruch resultiert. Im CF-Gen kommen sämtliche Formen von Punktmutationen, Minideletionen und Insertionen sowie einige wenige größere Deletionen vor, die sich über mehrere Exons erstrecken. Missense- Mutationen werden etwa in 40%, Nonsense-Mutationen in 18%, Spleißstellenmutationen ebenfalls in 18%, Frameshift- Mutationen in 22% und andere Mutationen wie Promotormutationen, Inframe- Deletionen oder große Deletionen in etwa 2% der CF-Chromosomen nachgewiesen. Die weltweit häufigste CF-Mutation ist die so genannte F508, eine 3 Basenpaare umfassende Inframe-Deletion ( ) in Exon 10, welche den Verlust der 508. Aminosäure, ein Phenylalanin (F), verursacht. In Tabelle 1 sind die 24 weltweit am häufigsten nachgewiesenen Mutationen und ihre Verteilung auf einzelne Länder Europas dargestellt. Ein Screening für diese 24 Mutationen erfasst in Deutschland, der Schweiz, in Großbritannien, in Frankreich, Belgien, den Niederlanden und in Tschechien/Slovakei mehr als 80% aller mutierten Gene in CF-Patienten. Je östlicher und/oder südlicher die Länder in Europa gelegen sind, umso seltener kommen diese 24 Mutationen vor und umso wichtiger ist es für diese Populationen, dass noch nach anderen Mutationen gesucht wird. 216 Monatsschrift Kinderheilkunde

3 Abb. 1a d Molekulare Grundlagen der Zystischen Fibrose: vom Chromosom (a) über das Gen (b) und das Transkript (c) bis zum Chloridkanal (d) Molekulargenetischer Mutationsnachweis Untersuchungen auf Genebene, so genannte DNA-Analysen, bieten sehr präzise und mehrheitlich eindeutige Resultate, deren Bedeutung und Richtigkeit jedoch damit steht und fällt, ob die zur Verfügung stehenden technischen Möglichkeiten korrekt eingesetzt und die erhaltenen Informationen richtig verstanden und interpretiert werden. Folgende Gründe machen eine Mutationsanalytik für viele genetische Erkrankungen, insbesondere aber für die Zystische Fibrose, unerlässlich: Der klinische Verlauf ist häufig sehr heterogen, z. T. hervorgerufen durch die vielen verschiedenen Krankheit verursachenden Mutationen, zusätzlich aber auch durch den genetischen Background und Umweltfaktoren, was eine eindeutige Diagnosestellung erschwert (Tabelle 2). Bei rezessiven Erbkrankheiten sind Träger einer Mutation asymptomatisch, da ein intaktes Gen für die volle Funktionsfähigkeit des Genproduktes ausreicht, sodass sie nur auf Genebene identifiziert werden können. Paare, bei denen beide Träger einer Mutation sind, haben ein Risiko von 25%, ein krankes Kind zu bekommen. Die Frage, ob ein erwartetes Kind erkranken wird oder nicht, lässt sich nur anhand einer vorgeburtlichen molekulargenetischen Untersuchung eindeutig beantworten. Mutationsanalysen sind schon bei Neugeborenen, ja sogar bei Frühgeborenen durchführbar, und zwar nicht nur aus Blut,sondern z.b.auch aus Mundschleimhaut- oder Nasenepithelzellen, was einen rechtzeitigen Therapiebeginn und damit verbunden eine verbesserte Lebensqualität ermöglicht. In Österreich wird, im Gegensatz zu Deutschland, bereits ein Neugeborenenscreening durchgeführt. Die Wahl der Methode für einen molekulargenetischen Mutationsnachweis hängt von den genetischen Mechanismen einer Krankheit sowie von der zur Verfügung stehenden Information über das Gen und dessen Sequenzen ab. Je mehr Mutationen im CF-Gen detektiert wurden, umso mehr drängte sich die Entwicklung von Methoden auf, die routinemäßig so rasch und einfach wie möglich ein sensitives und zuverlässiges Mutationsscreening erlauben.von mehreren Firmen entwickelte Kits erfüllen zwar den Anspruch des raschen und relativ kostengünstigen Nachweises, doch ist die Zahl der detektierbaren Mutationen auf die weltweit häufigsten beschränkt, was Ländern mit einer anderen Mutationsverteilung wenig Nutzen bringt und generell den Anteil erfassbarer CF-Chromosomen nicht erhöht. In den letzten Jahren wurden verschiedenste Methoden wie z. B. die Dena- Monatsschrift Kinderheilkunde

4 Zystische Fibrose Tabelle 1 Verteilung der weltweit 24 häufigsten Mutationen innerhalb Europas mit Angabe der Anzahl detektierter Chromosomen mit der entsprechenden Mutation und der relativen Frequenzen in Klammer. Die Anzahl untersuchter Chromosomen ist unter dem Namen jedes Landes angegeben,n.u.nicht untersucht, aus Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium, Juli 1999, Land Deutsch- Österreich Schweiz Schweden, UK und Belgien Nieder- Frankreich Spanien Portugal Italien Griechen- Tschechien Bulgarien land Dänemark Irland lande land und Slovakei Mutation G85E 0 (0,0) n. u. 2 (0,22) 0 (0,0) 15 (0,19) 0 (0,0) n. u. 11 (0,2) 8 (0,56) n. u. 3 (0,11) n. u. 1 (0,16) 1 (0,4) R117H 4 (0,13) 1 (0,16) 1 (0,11) 3 (0,27) 46 (0,57) 0 (0,0) 1 (0,1) 6 (0,13) 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) n. u. 1 (0,16) 0 (0,0) 621+1G:T 1 (0,03) 2 (0,3) 3 (0,34) 6 (0,54) 79 (0,98) 0 (0,0) 0 (0,0) 5 (0,1) 3 (0,21) 1 (0,35) 9 (0,3) 19 (5,8) 1 (0,16) 0 (0,0) 711+1G:T 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (0,01) 0 (0,0) n. u. 14 (0,3) 13 (0,9) n. u. n. u. n. u. n. u. 0 (0,0) 1078delT 6 (0,2) n. u. 2 (0,22) 1 (0,09) 7 (0,09) 0 (0,0) n. u. 12 (0,3) 1 (0,07) n. u. 1 (0,04) n. u. n. u. 0 (0,0) R334W 2 (0,06) 0 (0,0) 4 (0,45) 2 (0,18) 1 (0,01) 0 (0,0) 0 (0,0) 12 (0,3) 14 (1,0) 2 (0,7) 1 (0,04) 2 (0,6) 1 (0,16) 0 (0,0) R347P 36 (1,2) 2 (0,3) 5 (0,56) 1 (0,09) 9 (0,15) 0 (0,0) 1 (0,1) 7 (0,15) 0 (0,0) n. u. 10 (0,4) 0 (0,0) 6 (0,95) 5 (2,0) A455E 1 (0,03) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (0,2) 31 (3,0) 1 (0,02) 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) 0 (0,0) I507 4 (0,13) 0 (0,0) 1 (0,11) 0 (0,0) 20 (0,25) 2 (0,2) 1 (0,1) 28 (0,6) 5 (0,36) n. u. 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) F (71) 419 (66) 589 (66) 788 (70) 5719 (71) 734 (75) 804 (77) 3222 (69) 735 (52) 128 (45) 1290 (49) 173 (53) 336 (66) 137 (54) G:A 15 (0,49) 1 (0,16) 29 (3,2) 0 (0,0) 35 (0,44) 15 (1,5) 16 (1,5) 62 (1,3) 1 (0,07) 0 (0,0) 41 (1,6) 0 (0,0) 2 (0,32) 0 (0,0) G542X 43 (1,4) 10 (1,6) 14 (1,6) 7 (0,63) 155 (1,9) 35 (3,6) 19 (1,8) 152 (3,2) 93 (6,6) 5 (1,7) 75 (2,9) 15 (4,6) 21 (3,3) 12 (4,8) S549N 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) 0 (0,0) 9 (0,11) 0 (0,0) 0 (0,0) 9 (0,19) 0 (0,0) n. u. 2 (0,08) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) G551D 38 (1,2) 9 (1,4) 0 (0,0) 3 (0,27) 232 (2,9) 0 (0,0) 1 (0,1) 31 (0,7) 5 (0,36) 0 (0,0) 2 (0,08) 1 (0,3) 20 (3,2) 0 (0,0) R553X 62 (2,0) 3 (0,5) 44 (4,9) 2 (0,18) 35 (0,44) 8 (0,8) 12 (1,1) 27 (0,58) 1 (0,07) 0 (0,0) 11 (0,4) 0 (0,0) 7 (1,1) 0 (0,0) R560T 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) 0 (0,0) 35 (0,44) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) n. u. 0 (0,0) 0 (0,0) G:A 1 (0,03) n. u. 1 (0,11) 0 (0,0) 30 (0,37) 0 (0,0) n. u. 2 (0,04) n. u. n. u. 0 (0,0) n. u. 10 (1,6) 0 (0,0) 2184delA 2 (0,06) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (0,01) 1 (0,1) n. u. 8 (0,17) 5 (0,36) n. u. n. u. n. u. n. u. 2 (0,8) G:A 9 (0,3) n. u. 2 (0,22) 1 (0,09) 2 (0,02) 0 (0,0) n. u. 11 (0,2) 7 (0,5) n. u. n. u. n. u. 1 (0,16) 2 (0,8) R1162X 2 (0,06) 9 (1,4) 6 (0,67) 0 (0,0) 3 (0,04) 1 (0,1) 12 (1,1) 18 (0,38) 24 (1,7) 1 (0,35) 25 (1,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 3659delC 4 (0,13) 1 (0,16) 0 (0,0) 4 (0,36) 12 (0,15) 1 (0,1) 2 (0,19) 15 (0,32) n. u. n. u. 0 (0,0) n. u. n. u. 0 (0,0) kbC:T 16 (0,52) 0 (0,0) 5 (0,56) 0 (0,0) 5 (0,06) 0 (0,0) n. u. 2 (0,04) 0 (0,0) n. u. 1 (0,04) n. u. 5 (0,8) 2 (0,8) W1282X 5 (0,16) 1 (0,16) 17 (1,9) 2 (0,18) 19 (0,24) 10 (1,0) 7 (0,7) 62 (1,3) 8 (0,56) n. u. 18 (0,7) 4 (1,2) 5 (0,8) 2 (0,8) N1303K 40 (1,3) 3 (0,5) 19 (2,1) 8 (0,71) 39 (0,49) 27 (2,7) 9 (0,9) 71 (1,5) 28 (2,0) 1 (0,35) 89 (3,4) 10 (3,1) 20 (3,2) 16 (6,3) Detektionsrate [%] 80,16 72,64 83,27 73,59 80,77 85,3 87,69 81,02 67,32 48,45 60,09 68,6 82,07 70, Monatsschrift Kinderheilkunde

5 Tabelle 2 Wissenswertes für den Auftraggeber einer molekulargenetischen Untersuchung des CFTR-Gens Bedeutung Symptome Zeitraum Indikationen für eine Mekoniumileus bei Neugeborenen molekulargenetische Untersuchung Grenzwertiger oder positiver Schweißtest Chronisch-rezidivierende Pneumonien und Bronchitiden Unklare Lungenfunktionsstörungen Emphysem Gedeihstörung Pankreasinsuffizienz, chronische Pankreatitis unklarer Ätiologie Fertilitätsstörung, Azoospermie oder hochgradige Oligospermie Bestimmung des Trägerstatus bei Verwandten von CF-Patienten Pränataldiagnose bei nachgewiesener Heterozygotie der Eltern Mutationsscreening bei Partnern/Partnerinnen von nachgewiesenen Mutationsträgern Untersuchungsmaterial 3 5 ml EDTA-Blut (DNA-Analyse) Mundschleimhautzellen bei Neu- und Frühgeborenen (DNA) Mundschleimhautzellen und/oder Nasenbrushing für Transkriptanalyse (RNA) Dauer der Analysen Patienten mit Verdacht auf CF 1 6 Wochen Trägererfassung bei bekannten Mutationen 3 5 Tage Pränataldiagnose bei bekannten Mutationen 2 Tage Mutationsscreening des ganzen Gens 4 6 Wochen turing-gradient-gelelektrophorese (DGGE), die Heteroduplex(HD)-Analyse und die Single-strand-conformation-polymorphism(SSCP)-Analyse zum Nachweis von Punktmutationen entwickelt. Eigene Modifikationen haben zur Entwicklung eines Mutationsscreeningprotokolls geführt, das auf einer Kombination von SSCP- und HD-Analytik basiert und das Erfassen von mehr als 97% aller in den untersuchten Sequenzen eines Gens vorkommenden Punktmutationen, Minideletionen und -insertionen unabhängig von Ort,Art oder Häufigkeit der Mutationen ermöglicht [4]. Aufgrund der Verteilung und Frequenzen der CF-Mutationen wurde eine Strategie für ein Totalscreening entwickelt (Abb. 2), die es erlaubt, in 6 10 Tagen alle 27 Exons (inklusive Exon-Intron-Übergänge), die Introns 11 und 19 sowie die Promotorregion des CF-Gens auf Abweichungen von der Normalsequenz zu untersuchen. Jede Variante wird direkt sequenziert, um die betreffende Mutation oder den eventuellen Polymorphismus zu charakterisieren.abbildung 3 zeigt ein Beispiel eines SSCP-/HD-Bandenmusters von 13 CF-Mutationen (3 Missense, 4 Nonsense, 2 Inframe-Deletionen, 3 Frameshift, 1 Spleißstelle) in 5 verschiedenen Exons des Gens. Sind bei einem Patienten/einer Patientin beide Krankheit verursachenden Mutationen identifiziert, ist in der betreffenden Familie bezüglich dieser beiden Mutationen eine 100% sichere Trägererfassung und Pränataldiagnostik (PnD) möglich. Die Durchführung der Analysen erfolgt in diesen Fällen aus Gründen der Qualitätskontrolle [2] immer in 2 unabhängigen PCR-Ansätzen der entsprechenden Exons, um Laborfehler (Probenverwechslung, Kontamination) möglichst auszuschließen. Für die Trägererfassung werden immer amplifizierte DNA einer gesunden Kontrolle und des Indexpatienten mit der zu analysierenden DNA aufs Gel aufgetragen, um anhand des Bandenmustervergleichs festzustellen, ob die betreffende Person eine Mutation trägt oder nicht. Es ist empfehlenswert, Partner oder Partnerinnen gesunder Mutationsträger und von CF-Patienten ebenfalls mit oben genanntem Totalscreening zu untersuchen.falls keine Mutation gefunden wird, reduziert sich das Risiko des Paares, ein Abb. 2 Totalscreeningstrategie für direkten Mutationsnachweis in den 27 Exons des CF-Gens Monatsschrift Kinderheilkunde

6 Zystische Fibrose Abb. 3 Silbergefärbtes Polyacrylamidgel mit PCR-Produkten von Exon 7, 10, 11, 19 und 20 des CF- Gens. Mutationsnachweis mittels SSCP/HD: BW Reagenzienblindwert; Exon 7: 1 R347P/ ; 2 R334 W/ ; delT/ ; 4 gesunde Kontrolle; Exon 10: 1 und 6 gesunde Kontrollen; 2 I507/ ; 3 F508/Q525X; 4 F508/ F508; 5 F508/ ; Exon 11: 1 und G:A/ ; 2 R553X/ ; 3 G542X/ ; 5 gesunde Kontrolle; Exon 19: 1 S1235R/ ; 2 R1162X/ ; 3 gesunde Kontrolle; Exon 20: 1 W1282X/ ; insT/ ; 3 gesunde Kontrolle Kind mit CF zu bekommen, von 1,25% auf weniger als 0,001%. Bei Pränataldiagnosen muss in 2 weiteren Analysen mittels Mikrosatelliten geprüft werden, ob das Choriongewebe nicht mit mütterlicher DNA kontaminiert ist. Um eine zuverlässige Auswertung zu ermöglichen und Verwechslungen auszuschließen, werden immer amplifizierte DNA einer gesunden Kontrolle, des Indexpatienten sowie der Eltern des Föten mit der zu analysierenden DNA aufs Gel aufgetragen. Anhand des Bandenmustervergleichs lässt sich feststellen, ob das erwartete Kind krank (2 Mutationen) oder gesund (eine oder keine Mutation) sein wird [8]. Mutationsklassifizierung Abb. 4 CF-Mutationen und ihre Mechanismen: Einteilung in 6 Klassen (a f) und ihre funktionellen Auswirkungen auf das CFTR-Protein Pathogene Mutationen im CF-Gen können die Menge des CFTR-Proteins reduzieren, den Transport des Genprodukts zur Plasmamembran verhindern oder die Funktion des Chloridkanals beeinflussen. Von den mehr als 900 bisher entdeckten CF-Mutationen sind vorläufig nur wenige auf funktioneller Ebene charakterisiert worden. Dies erschwert eine Prognose bezüglich ihrer Auswirkung auf das Protein, da sich aufgrund der DNA-Veränderung allein nicht zuverlässig definieren lässt, wie die Funktion des CFTR beeinträchtigt oder gestört wird. 220 Monatsschrift Kinderheilkunde

7 Sechs verschiedene Mechanismen werden heute diskutiert, um zu erklären, wie CF-Mutationen den CFTR-abhängigen Chloridtransport durch die Epithelzellen beeinflussen [5].Nonsense-,Spleißstellen- und Frameshift-Mutationen werden der Klasse I zugeordnet. Sie lassen meistens instabile, in ihrer Länge reduzierte Transkripte entstehen, die zu einer defekten Proteinsynthese führen. Von den Klasse-I-Mutationen wird erwartet, dass sie wenig bis kein intaktes Protein produzieren und einen vollständigen Funktionsverlust des CFTR zur Folge haben (Abb. 4a). Die Klasse II beinhaltet Mutationen, die den Ausreifungsprozess des Proteins verhindern oder beeinträchtigen, sodass wiederum wenig bis kein funktionsfähiges CFTR die apikale Membran der Epithelzellen erreicht (Abb. 4b). Die F508- Deletion sowie viele verschiedene Missense-Mutationen bewirken eine nicht korrekte Faltung des Proteins und verhindern, dass es seine native Konformation einnehmen kann. Um die Auswirkungen dieser Klasse-II-Mutationen korrigieren zu können, müsste das falsche Falten verhindert werden, was in vitro und in vivo mittels verschiedenster pharmakologischer Therapieansätzen versucht wird [11]. Mutationen der Klasse III und IV produzieren vollständig ausgereifte Proteine, die zwar an die Plasmamembran gelangen, aber entweder einen nicht bzw. schlecht aktivierbaren Chloridkanal darstellen (Abb. 4c) oder einen gestörten Ionendurchfluss zeigen (Abb. 4d). Klasse V (Abb. 4e) beinhaltet Mutationen, die die Menge an intaktem Transkript und Protein variabel reduzieren. Das heißt, es wird sowohl normales funktionsfähiges wie auch mutiertes Protein produziert, wobei das Verhältnis zwischen intaktem und mutiertem CFTR maßgebend für den Phänotyp verantwortlich ist. Zur Klasse V gehören Mutationen, die eine alternative Spleißstelle in einem Intron kreieren. Zu dieser Gruppe gehört eine polyvariante Mutante in Intron 8, kurz vor dem Übergang zu Exon 9 des CFTR-Gens. Sie liegt in Form eines TG-Repeats, gefolgt von einem T-Repeat, vor, die beide in der Anzahl ihrer Repeats variieren und in Abhängigkeit von ihrer Länge in einem variablen Anteil der CFTR-mRNA- Transkripte den Verlust von Exon 9 verursachen, was wiederum, basierend auf der Ratio CFTR+Exon 9 versus CFTR- Exon 9, den klinischen Verlauf beeinflusst [1]. Der Klasse VI (Abb. 4f) werden Mutationen zugeordnet, die sich auf die Regulation anderer Kanäle auswirken. Das CFTR-Protein ist ein positiver Regulator der outwardly rectified chloride channels (ORCC) und ein negativer Regulator der epithelial sodium channels (ENaC) [9]. Unterschiedliche Mechanismen, verursacht durch mehrere hundert verschiedene Mutationen, führen zu einer Dysfunktion des CFTR-Proteins. Aufgrund des DNA-Defekts lässt sich die Auswirkung auf die Funktion des Proteins nicht voraussagen. Eine Zuordnung der Mutationen zu einer bestimmten Klasse darf nicht ohne vorhergegangene funktionelle Studien vorgenommen werden. Zusätzlich muss beachtet werden, dass eine Mutation u. U. mehr als einer Klasse angehören kann. Literatur 1. Cuppens H, Lin W, Jaspers M, Costes B,Teng H, Vankeerberghen A, Jorissen M, Droogmans G, Reynaert I, Goossens M, Nilius B, Cassiman JJ (1998) Polyvariant mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator genes. J Clin Invest 101: Dequeker E, Cuppens H, Dodge J, Estivill X, Goossens M, Pignatti PF, Scheffer H, Schwartz M, Schwarz M,Tümmler B, Cassiman J-J (2000) Recommendations for quality improvement in genetic testing for cystic fibrosis. Eur J Hum Genet [Suppl 2] 8:S2 S24 3. Kerem BS, Rommans JM, Buchanam JA, Markiewicz D, Cox TK, Chakravarti A, Buchwald M,Tsu LC (1989) Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science 245: Liechti-Gallati S, Schneider V, Neeser D, Kraemer R (1999) Two buffer PAGE systembased SSCP/HD analysis: a general protocol for rapid and sensitive mutation screening in cystic fibrosis and any other human genetic disease. 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