Versuch Kurztitel Betreuer/in Institut Ebene/Raum Tel. Genth Toxikologie Seminarraum Vergiftungen. Seifert Pharmakologie Seminarraum 2805

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1 1 Laborpraktikum Pharmakologie und Toxikologie (2016) M.Sc. Biochemie / M.Sc. Analytik / M.Sc. Wirk- und Naturstoffchemie / M.Sc. Material- und Nanochemie Termin: ganztägig ab 09:00 Uhr Beginn: Seminarraum des Zentrums Pharmakologie und Toxikologie (I6 / Ebene 3) Voraussetzung: Vorbereitung auf das Thema und die Versuchsdurchführung anhand der Vorlesung und des Skripts ( Versuch Kurztitel Betreuer/in Institut Ebene/Raum Tel. Seminar Seminar Behandlung von Vergiftungen Praktische Pharmakologie Genth Toxikologie Seminarraum 9168 Seifert Pharmakologie Seminarraum 2805 VP1 fmlf-bindung Schneider Pharmakologie I6/03/ VP2 Reaktive Sauerstoffspezies Wolter Pharmakologie I6/03/ VP3 Intrazelluläres Calcium Schirmer Pharmakologie I6/03/ Neumann VP4 Seminar Metabolomics Kaever Pharmakologie I6/03/ Massenspektrometrie VP5 PCLS Sewald Fraunhofer ITEM Nikolai- Fuchs-Str VT1 VT2 Glucosylierende Toxine Toxikologische Materialprüfung Genth Toxikologie I6/03/ Gerhard Genth Toxikologie I6/03/ VT3 C3 Exoenzyme Rohrbeck Toxikologie I6/03/ van Elsner VT4 Neuromuskuläre Rummel Toxikologie I6/03/ Verbindung VT5 Proteinanalyse / MS Schröder Pich Toxikologie I6/03/

2 2 Teilnehmer Matrikel- Nr. Nachname Vorname MHH/LUH Gruppe Arampatzis Anthimos MHH (BC) 1 Burbano De Sebastian MHH (BC) sebastian.bdl.c@gmail.com Lara Carrillo Rodrigo Dirschauer Ariane ariane.dirschauer@gmx.de MHH (BC) 1 Jan.Eberhage@stud.mhhannover.de MHH (BC) Eberhage Jan Hermann Hermann.J.Huette@stud.mhhannover.de MHH (BC) Hütte Jan Frederike.Nordmeier@stud.m MHH (BC) Nordmeier Frederike h-hannover.de Weber Mareike Mareike.Weber@stud.mhhannover.de MHH (BC) Zhou Xiaoyi x.zhou@outlook.de MHH (BC) Schweitzer Theresa theresa_schweitzer@web.de LUH (A) Wichert Nina nina.wichert@web.de LUH (A) Wilhelm Martina martina.wi@gmx.net LUH (A) Zahnow Martin martin.zahnow@freenet.de LUH (A) Zailskas Saskia saskia.zailskas@gmx.de LUH (MN) Liu Bin @126.com LUH (WN) Messner Lorn LUH (WN) 3 lornmessner@yahoo.de Sebastian Pelster Christopher christopher.pelster@gmail.com LUH (WN) Scheunert Mara-Carina mara.scheunert@web.de LUH (WN) Schneider Annika annikaschneider@gmx.net LUH (WN) Weitzenberg Merle merle@weitzen-berg.de LUH (WN) 3 Alle Teilnehmergruppen müssen Gruppenprotokolle (außer Seminare und VP4) in ausgedruckter Form als Leistungsnachweis erstellen. Letzter Abgabetermin bei dem jeweiligen Versuchsbetreuer ist der Koordination: Prof. Kaever / Prof. Genth (Tel / 9168) Kaever.Volkhard@MH-Hannover.de / Genth.Harald@MH- Hannover.de

3 3 Ablaufplan Beginn Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Montag, Begrüßung / Einführung Behandlung von Vergiftungen / Asthma Dienstag, VP5 VP2+VP3 VP1+VP VP5 VP2+VP3 VP1+VP4 Mittwoch, VP1+VP4 VP5 VP2+VP VP1+VP4 VP5 VP2+VP3 Donnerstag, VP2+VP3 VP1+VP4 VP VP2+VP3 VP1+VP4 VP5 Freitag, Literaturseminar für alle Gruppen (Seminarraum) Montag, VT4 VT1 VT VT5 VT1+VT2 VT3 Dienstag, Exkursion Bayer Mittwoch, VT5 VT4 VT VT5 VT1+VT2 Donnerstag, VT3 VT5 VT VT3 VT5 Freitag, VT1 VT3 VT VT1+VT2 VT3 Montag, Dienstag, Mittwoch, Donnerstag, Freitag, Feiertag Modulabschlussprüfungen nach Plan

4 4 Allgemeines 1) Es gibt kein zentrales Kurslabor. Laboratorien Einführung und Literaturseminar: Seminarraum Zentrum Pharmakologie und Toxikologie (I6 / Ebene 3) Pharmakologie: I6 / Ebene 3 (vorderer Bereich) Toxikologie: I6 / Ebene 3 (hinterer Bereich) ITEM Nikolai-Fuchs-Str. 1 2) Die Vorbereitung der Studierenden anhand des Skripts sollte zu Beginn des jeweiligen Versuchs kurz überprüft werden. 3) Zu jedem Thema sollte ein Seminar stattfinden. 4) Hilfreich für die Studierenden hinsichtlich ihrer weiteren Planung (Großversuch / Masterarbeit / Promotion) ist ein kurzer Abriss über die Forschungsschwerpunkte der jeweiligen Arbeitsgruppe. 5) Die Versuchsauswertung sollte mit den Studierenden am Versuchstag abgeschlossen werden (z.b. Kopien der Originalmesswerte). 6) Die Protokolle sollen zeitnah erstellt und beim jeweiligen Versuchsleiter abgegeben werden. Sicherheit im Labor Zu Beginn des Praktikums wird eine Unterweisung bezüglich Gefahrstoffverordnung, Biostoffverordnung, Entsorgung von Sonderabfällen, Brandschutz und allgemeiner Laborsicherheit durchgeführt werden (Prof. Kaever). Weiterhin gibt es ein Seminar zur Behandlung von Vergiftungen (Prof. Genth). In einigen Versuchen wird mit humanem Blut umgegangen. Damit kann ein generelles Infektionsrisiko nicht völlig ausgeschlossen werden. Zudem werden in einigen Versuchen gentechnisch veränderte Zellen verwendet. Es gilt daher: Es sind Kittel und eventuell Schutzhandschuhe zu tragen. Essen, Trinken und Rauchen sind im Labor streng verboten. Das Pipettieren mit dem Mund ist untersagt. Verschüttetes Material wird mit Papiertüchern und bereitgestellter Desinfektionslösung entfernt. Die Abfallentsorgung erfolgt nach den Vorgaben der Versuchsbetreuer.

5 5 Kurzanleitung Protokolle (Detaillierte Informationen erhalten Sie vom jeweiligen Versuchsleiter) In diesem Teil des Moduls Pharmakologie und Toxikologie stellt das schriftliche Protokoll die Studienleistung dar. Deshalb werden von jedem Teilnehmer Protokolle verlangt (Gruppenprotokolle). Die Anerkennung des Protokolls obliegt dem jeweiligen Versuchsleiter. Die akzeptierten Protokolle müssen ausgedruckt und eigenhändig unterschrieben vorliegen. Die Protokolle sollten in kompakter Form alle relevanten Informationen enthalten und zeigen, dass der Versuch verstanden wurde. Korrektes Zitieren nicht vergessen! Einleitung Hier sollen kurz die Ziele des Versuchs beschrieben werden. Durchführung Wichtig ist die Auflistung von Abänderungen im Vergleich zu der Vorschrift und nicht copy & paste des Skripts. Ergebnisse Kurze Beschreibung der Ergebnisse am besten anhand geeigneter Tabellen und/oder Abbildungen. Informative Legenden nicht vergessen! Diskussion Hier soll eine Wertung der Ergebnisse erfolgen. Unerwartete Ergebnisse müssen kommentiert werden (Fehlerdiskussion). Bei einzelnen Versuchen sollen Fragen aus dem Skript beantwortet werden. Anhang Grundsätzlich Anfügung der Originaldaten.

6 6 VP1: Bestimmung von Rezeptordichte (B max ) und Bindungskonstante (K D ) für den Formylpeptid-Rezeptor 1 auf Neutrophilen Granulozyten A) Theoretischer Hintergrund: 1. Der Formylpeptidrezeptor FPR1 FPR1 gehört zur Familie der Formylpeptid-Rezeptoren, die beim Menschen drei Subtypen (FPR1, 2 und 3) umfasst. FPR1 ist ein G i -gekoppelter Rezeptor (GPCR), der hauptsächlich auf myeloiden Zellen (neutrophile Granulozyten und Monozyten) exprimiert wird. Die Rolle von FPR1 in anderen Zelltypen, wie z.b. Augenlinsenepithel oder Fibroblasten ist noch nicht vollständig geklärt. FPR1 wird durch N-formylierte Peptide aktiviert, wie sie besonders von Bakterien (z.b. E. coli) produziert werden. Stimulation von FPR1 führt zu einem Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration und zu einer gerichteten Wanderung (Chemotaxis) von neutrophilen Granulozyten entlang des Formylpeptid-Konzentrationsgradienten. So gelangen die Zellen an den Ort der Infektion, wo sie Bakterien phagozytieren können. In Gegenwart höherer Formylpeptid-Konzentration, also in unmittelbarer Nähe der Bakterien, bewirkt FPR1 eine Degranulation der neutrophilen Granulozyten mit Freisetzung bakterizider Faktoren. Formylpeptide stimulieren auch die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS, z.b. Superoxidanionen) durch Neutrophile, was zur Abtötung phagozytierter Krankheitserreger führt ( oxidative burst ). FPR1 ist somit wichtig für die unmittelbare Beseitigung und Abtötung von Krankheitserregern durch neutrophile Granulozyten. Im folgenden Praktikumsversuch werden wir neutrophile Granulozyten isolieren und die Anzahl von FPR1 Rezeptormolekülen pro Zelle (B max ) bestimmen. Darüber hinaus wird die Dissoziationskonstante (K D -Wert) des Fluoreszein-markierten Peptids fnlfnyk-fl (N steht hier für Norleucin und Fl für Fluoreszein) in einem Sättigungs-Bindungsversuch bestimmt werden. 2. Die Messtechnik der Durchflusszytometrie Die Zellen werden in einem Probenstrom (ähnlich wie in Abb. 1 dargestellt) durch eine Messzelle transportiert und passieren einen oder mehrere Laserstrahlen, deren Licht von der Zelloberfläche gestreut wird. Gleichzeitig werden zellassoziierte Fluoreszenzfarbstoffe angeregt und emittieren ein Fluoreszenzsignal. Das in engem Winkel gestreute Vorwärtsstreulicht (engl. forward scatter, FSC) ist abhängig von der Zellgröße. Das zur Seite gestreute Seitwärtsstreulicht (engl. sideward scatter, SSC) wird durch die morphologischen Eigenschaften der Zelle beeinflusst (Granularität, Beschaffenheit der Zellmembran). 1

7 7 Abb. 1: Schematische Darstellung der Messzelle eines Durchflusszytometers Das Fluoreszenzsignal erscheint im gleichen Winkel wie das SSC-Signal, kann von diesem aber aufgrund der längeren Wellenlänge optisch abgetrennt und gesondert gemessen werden. Die Fluoreszenzemission kann sowohl durch zelleigene Substanzen (Autofluoreszenz) verursacht werden, als auch durch fluoreszenzmarkierte Moleküle, die im Verlauf des Experiments zugesetzt werden. Im Praktikum werden wir die Emission (~530 nm) eines Fluoreszein-markierten Liganden nach Anregung mit 488 nm quantifizieren. 3. Prinzip der Kalibrierung mit Fluoreszenzbeads Um das Fluoreszenzsignal in die Anzahl der pro Zelle gebundenen Ligandmoleküle umzurechnen, muss eine Kalibriergerade erstellt werden. Hierfür werden Beads mit einer definierten Anzahl an Fluoreszein-Molekülen auf ihrer Oberfläche mit den gleichen Geräteeinstellungen vermessen, wie die Zellen, an die der Fluoreszenzligand gebunden hat. Mittels dieser Kalibriergerade kann das Fluoreszenzsignal in einen MESF -Wert umgerechnet werden (MESF = molecular equivalents of soluble fluorescein). Dieser Wert gibt an, wie viele freie Fluoreszein-Moleküle in Lösung die gleiche Signalintensität ergeben würden. Allerdings befindet sich das Fluoreszein in unserem Versuch nicht frei in Lösung, sondern kovalent an den Peptidliganden gebunden, was zu einer Änderung der Fluoreszenzeigenschaften (quenching) führt. Deshalb muss der MESF-Wert mit dem Korrekturfaktor 1.22 (in der Literatur beschrieben) multipliziert werden, um die Anzahl an Fluoreszein-markierten Molekülen zu erhalten, die tatsächlich an die Zelle gebunden haben. Da es pro FPR1 Molekül nur eine fnlfnyk-fl-bindungsstelle gibt, entspricht der korrigierte Wert dann der Anzahl der besetzen FPR1 Rezeptoren. Diese Kalibrierung wird im Praktikumsversuch nicht durchgeführt. Wir werden stattdessen auf eine frühere Kalibriergerade zurückgreifen. 2

8 8 4. Praktikumsversuch: Bestimmung des B max - und des K i -Wertes. Fluoreszenzsignal 90 Totale Bindung 80 Spezifische Bindung 70 Nichtspezifische Bindung K d c(fnlfnyk-fl) [nm] Abb. 2: Totale Bindung (rot), nichtspezifische Bindung (schwarz), spezifische Bindung (blau) von fnlfnyk-fl an FPR1 von FPR1-transfizierten HEK-293 Zellen Abb. 2 zeigt ein Sättigungsexperiment mit dem Fluoreszenzliganden fnlfnyk-fl. Die totale Bindung (rot) setzt sich aus nichtspezifischer Bindung an die Zellmembran und spezifischer (verdrängbarer) Bindung an den Rezeptor zusammen. Die nichtspezifische Bindung (schwarz) bleibt übrig, wenn der Fluoreszenzligand mit einem >100- fachen Überschuss von nichtmarkiertem Liganden verdrängt wird. Subtraktion der nichtspezifischen von der totalen Bindung ergibt die spezifische Rezeptorbindung (blau). Der K d -Wert (in Abb. 2 rot eingetragen) entspricht der Konzentration an Fluoreszenzligand, bei der 50% der Rezeptoren besetzt sind. Dieser Wert soll im Praktikum mit einer kompletten Sättigungskurve (ähnlich wie in Abb. 2) bestimmt werden. Wir werden auch den sog. B max -Wert ermitteln, also das Maximalsignal, das der Besetzung aller verfügbaren Rezeptoren entspricht (in Abb. 2 blau eingetragen). Mit Hilfe einer Kalibriergerade werden wir den entsprechenden B max Fluoreszenzwert in die Rezeptorzahl pro Zelle umrechnen. 5. Rechenaufgabe: Berechnung des K i -Wertes aus einem Kompetitionsexperiment A n z a h l F lu o r e s z e n z lig a n d - b e s e tz te r R e z e p to r e n /Z e lle V e r d r ä n g u n g v o n fn L F N Y K -F l v o m F P R 1 a u f N e u tr o p h ile n G r a n u lo z y te n IC 5 0 ~ 5 0 n M lo g c (fm L F ) Abb. 3: Verdrängung von fnlfnyk-fl (3 nm) durch fmlf am FPR1. Ordinate: Anzahl an spezifisch gebundenen fnlfnyk-fl-molekülen; Abszisse: Logarithmus der fmlf-konzentration. Abb. 3 zeigt eine sogenannte Kompetitionskurve. Hier wurden 3 nm des Fluoreszenzliganden fnlfnyk-fl mit steigenden Konzentrationen von fmlf verdrängt. Die fmlf-konzentration, bei der 50% des Fluoreszenzliganden verdrängt werden, wird als IC 50 - Wert bezeichnet (in Abb. 3 rot eingetragen). Dieser Wert ist abhängig von der Konzentration des eingesetzten Fluoreszenzliganden. Je mehr fnlfnyk-fl verdrängt werden muss, desto höher ist der IC 50 -Wert. 3

9 9 IC 50 -Werte aus Versuchen mit verschiedenen Fluoreszenzligand-Konzentrationen lassen sich deshalb nur schwer miteinander vergleichen. Um dieses Problem zu lösen, kann der Einfluss der Fluoreszenzligand-Konzentration mit Hilfe der Cheng-Prusoff-Gleichung herausgerechnet werden: K i IC50 [ L] 1 K d K i: IC 50: gesuchte Bindungskonstante von fmlf fmlf-konzentration, bei der die Hälfte des Fluoreszenzliganden verdrängt wurde (hier ca. 50 nm; in Abb. 3 rot dargestellt). [L]: eingesetzte fnlfnyk-fl - Konzentration (3 nm in Abb. 3) K d: Bindungskonstante des Fluoreszenzliganden fnlfnyk-fl am FPR1 (im Praktikumsversuch bestimmt) Die Cheng-Prusoff-Gleichung erlaubt die Umwandlung eines IC 50 -Wertes in einen konstanten Fluoreszenzligand-unabhängigen K i -Wert. Der K i -Wert bezeichnet die Menge an fmlf, die nötig wäre, um die Hälfte der FPR1 Rezeptoren (in Abwesenheit eines konkurrierenden Liganden) zu besetzen. Der K i -Wert ist eine Konstante und erlaubt es, verschiedene Messungen zu vergleichen, auch wenn unterschiedliche Fluoreszenzligand-Konzentrationen eingesetzt wurden. Rechenaufgabe im Praktikum: Errechnen Sie aus dem IC 50 -Wert der Kompetitionskurve in Abb. 3 den K i -Wert von fmlf. Verwenden Sie dazu in der Cheng-Prusoff-Gleichung den K D -Wert von fnlfnyk-fl, den Sie im Praktikumsversuch ermittelt haben. 4

10 10 B) Praktische Durchführung des Versuchs: Alle Arbeiten mit dem Fluoreszenzliganden bei gedämpftem Licht ausführen. 1. Vorbereitung der Neutrophilen Granulozyten Neutrophile Granulozyten wie im Versuch Produktion reaktiver Sauerstoffspezies durch neutrophile Granulozyten isolieren, in PBS-Puffer + 0.1% BSA (= Puffer ) zu einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen/ml aufnehmen und auf Eis stellen (Zellbedarf: 3 Mio Zellen). 2. Herstellung der Verdünnungsreihen 2.1 Fluoreszenzligand fnlfnyk-fl Lösung Volumen (fnlfnyk-lsg.) Vol. Puffer Konz. Final Stammlsg. in Probe F0 5 µl (1 mm Stammlsg.) 495 µl 10 µm --- F1 4 µl von F0 496 µl 80 nm 20 nm F2 200 µl von F1 200 µl 40 nm 10 nm F3 200 µl von F2 200 µl 20 nm 5 nm F4 200 µl von F3 300 µl 8 nm 2 nm F5 200 µl von F4 200 µl 4 nm 1 nm F6 200 µl von F5 200 µl 2 nm 0.5 nm F7 200 µl von F6 800 µl 0.4 nm 0.1 nm 2.2 Verdünnung für nichtspezifische Bindung (Überschuss fmlf) Lösung Volumen (fmlf-lsg.) Vol. Puffer N 4 µl (10 mm Stammlösung in DMSO) Konz. Stammlsg. Final in Probe 996 µl 40 µm 10 µm 3. Mischen der Proben und Start der Bindungsreaktion Pipettieren nach folgendem Schema in 96-well Platte pipettiert (grau = leere wells) A 40 µl Puffer + 40 µl F1 40 µl N + 40 µl F1 B 40 µl Puffer + 40 µl F2 40 µl N + 40 µl F2 C 40 µl Puffer + 40 µl F3 40 µl N + 40 µl F3 D 40 µl Puffer + 40 µl F4 40 µl N + 40 µl F4 E 40 µl Puffer + 40 µl F5 40 µl N + 40 µl F5 F 40 µl Puffer + 40 µl F6 40 µl N + 40 µl F6 G 40 µl Puffer + 40 µl F7 40 µl N + 40 µl F7 H 80 µl Puffer 40 µl N + 40 µl Puffer Abschließende Zugabe von 80 µl Zellsuspension startet die Bindungsreaktion. Die Proben werden unter Lichtschutz und Eiskühlung für 45 min inkubiert und während dieser Zeit 1-5

11 11 2-mal kurz gemischt. Nach Abschluss der Inkubationszeit werden die Proben am Durchflusszytometer gemessen. C) Auswertung der Daten Rohdaten für totale und nichtspezifische Bindung in Prism-Tabelle eingeben Von den Werten für die totale Bindung die Mittelwerte der zugehörigen nichtspezifischen Bindung subtrahieren spezifische Bindung. Nichtlineare Regression durchführen und aus der Kurve für die spezifische Bindung den K D - sowie B max -Wert bestimmen. Zahlenwert für B max mit Hilfe einer Kalibriergerade in Rezeptorzahl/Zelle umrechnen (siehe Excel-Tabelle in Abb. 4). Gemessene Fl-1 Fluoreszenzintensitäten der Beads Herstellerangabe Probenname Gemessene Fl-1 Fluoreszenzintensitäten der Proben (Median) Errechnete MESF = molecular equivalents of soluble fluorescein Errechnete Kalibrierkurve Abb. 4: Excel-Sheet vom Kalibrierbead-Hersteller zur Berechnung der molecular equivalents of soluble fluorescein (MESF) 6

12 12 In den Abschnitt Sample der Excel-Tabelle den errechneten B max eintragen. Der Wert aus der Spalte MESF/ABC wird mit dem Korrekturfaktor 1.22 [Biochemistry 30: (1991)] multipliziert, um den Einfluss des fnlfnyk- Molekülteils auf den Fluorophor zu korrigieren. Das Ergebnis ist die Anzahl der pro Zelle gebundenen Fluoreszein- bzw. Fluoreszenzligand-Moleküle. [Anhang: Wie wurde die Kalibriergerade in Abb. 4 ermittelt?] FSS/SSC settings so wählen, dass die Neutrophilen Granulozyten optimal dargestellt werden können. Kalibrierbeads gut schütteln. Je 500 µl Puffer in zwei FACS-Röhrchen vorlegen. Ein Röhrchen wird mit blank, das andere mit FITC beschriftet. In das blank Röhrchen wird ein Tropfen der blank-beads, in das FITC -Röhrchen ein Tropfen der FITC-beads gegeben. Beide Lösungen werden am FACS mit mittlerer Flussrate ( events/s) vermessen. Einzelbeads gaten (siehe Abb. 4). FITC-Kanal settings so wählen, dass der blank -peak ganz links (aber noch vollständig sichtbar) im Histogramm erscheint und die FITC -peaks rechts nicht abgeschnitten zu werden (siehe Abb. 5). Blank und FITC -Probe je einmal vermessen (5000 beads für blank und für FITC ) Abb. 4: FSC/SSC Streulichtdiagramm mit der ausgewählten Einzelbead- Population. blank FITC Abb. 5: Histogramme im Fluoreszein-Kanal (links: blank beads); rechts: Mischung von fünf Populationen Fluoreszein-gekoppelter Beads mit definierter Anzahl an Fluoreszein-Einheiten pro Bead. Die Fluoreszenzintensitäten (Median) der Bead-Populationen werden zusammen mit dem vom Bead-Hersteller angegebenen MESF-Wert in die Excel-Tabelle (Abb. 4) eingetragen automatische Generierung der Kalibriergerade durch das Excel-Datenblatt. 7

13 13 Hinweise zur Abfassung des Protokolls: Einleitung: Kurze Einführung zu Formylpeptiden, neutrophilen Granulozyten und FPR1-vermittelter Signaltransduktion Kurze Einführung in die Funktionsweise des Durchflusszytometers, Messung unter Gleichgewichtsbedingungen Kurze Beschreibung des durchgeführten Praktikumsversuchs; Definition von totaler, nichtspezifischer und spezifischer Bindung Versuchsdurchführung: Besonderheiten/Unterschiede zum Skript? Beschreibung der Vorgehensweise, um totale, nichtspezifische und spezifische Bindung zu ermitteln (falls nicht in der Einleitung besprochen) Darstellung der Ergebnisse Wertetabelle und Graph Diskussion entsprechen B max und K D aus dem Sättigungsversuch mit fnlfnyk-fl und der errechnete K i -Wert den erwarteten Werten? Weshalb rechnet man IC 50 -Werte in K i -Werte um? Weshalb ist die Multiplikation mit einem Korrekturfaktor für die Errechnung der Rezeptordichte notwendig? Gab es unerwartete Ergebnisse? Falls ja - wie könnten diese erklärt werden? Welche Vor- und Nachteile besitzen Fluoreszenz- und Radioliganden? 8

14 14 VP2: Produktion reaktiver Sauerstoffspezies durch neutrophile Granulozyten Hemmung durch 2 -adrenerge Rezeptorliganden Hintergrund Bei der Pathophysiologie des Asthma Bronchiale spielen unterschiedliche Zelltypen eine Rolle. Dabei sind die Beiträge von Mastzellen, Lymphozyten und eosinophilen Granulozyten gut untersucht. Neben diesen Zellen des Immunsystems sind aber auch neutrophile Granulozyten (Neutrophile), insbesondere bei der Entstehung von schwereren Asthmaanfällen, involviert. Ein Mediator, den aktivierte Neutrophile produzieren, ist das O 2. Molekül, eine reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Diese sind nützlich in der Abwehr von fungialen und bakteriellen Infektionen, können aber, im Falle der aus dem Gleichgewicht geratenen Immunantwort, beim Asthma zur Verschlimmerung des Krankheitsbildes führen. Abb. 1: Signalschema zur Aktivierung der ROS Produktion in neutrophilen Granulozyten: Das Peptid fmlf (N-Formyl-L-methionyl-L-leucyl-L phenylalanin) aktiviert über den Formylpeptid Rezeptor (FPR) und einen Gi-gekoppelten Mechanismus die NOX Oxidase, welche die Reduktion von Sauerstoff zur reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) O 2.- katalysiert. Wird der 2 -adrenerge Rezeptor ( 2 AR) aktiviert, so führt dies zu einem Anstieg des intrazellulären camp und darüber zu einer Hemmung der Oxidase. PIP2: Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat, PLC: Phospholipase C, DAG: Diacylglycerin, PKC: Proteinkinase C, AC 9: Adenylylzyklase 9 Zur Therapie von Asthma Bronchiale werden Liganden am 2 -adrenergen Rezeptor eingesetzt. Kurzfristig führt dies zur Dilatation der Gefäßmuskulatur und erleichtert das Atmen bei akuten Asthmaanfällen ( Reliever ). Gleichzeitig können aber auch über vorhandene 2 -adrenerge Rezeptoren inflammatorische Prozesse der Immunzellen gehemmt werden, z.b. die ROS-Produktion von neutrophilen Granulozyten (siehe Abb. 1). Literatur Monteseirín, J. Neutrophils and asthma J Investig Allergol Clin Immunol, 2009, 19, Barnes, P. J. New molecular targets for the treatment of neutrophilic diseases J Allergy Clin Immunol, 2007, 119,

15 15 Methode Isolation neutrophiler Granulozyten aus humanem Vollblut Für den Versuch werden 9 ml Vollblut benötigt, die mit 25 ml PBS verdünnt werden. Das Blut wird vorsichtig in ein 50 ml Röhrchen pipettiert, in das 15 ml Ficoll vorgelegt wurden. Dazu den Auslauf der Pipettierhilfe langsam stellen und das Röhrchen fast waagerecht halten. Wichtig ist, dass sich Blut und Ficoll nicht durchmischen, sondern eine saubere Trennlinie entsteht. 30 bei RT mit 430 g ohne Bremse zentrifugieren. Mit einer Pipette wird die milchige Leukozytenbande, dann das Plasma und anschließend das Ficoll bis knapp vor das Erythrozytensediment abgenommen. Es dürfen keine Leukozyten in die untere Granulo- bzw. Erythrozytenschicht gelangen. Zu der roten Granulo- und Erythrozytenschicht werden 18 ml kaltes bidest H 2 O gegeben und sanft 1 zur Lyse der Erythrozyten geschwenkt. Dann werden 2 ml 10 x PBS zur Äquilibrierung dazugegeben. Die Lyse darf nicht zu lange dauern, denn es sollen nur die Erythrozyten entfernt, nicht aber die Granulozyten geschädigt werden. Die Lysate werden 10 mit 400 g (mit Bremse) bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und zum Pellet werden nochmals 9 ml kaltes bidest H 2 O gegeben, um die restlichen Erythrozyten zu zerstören. 30 schwenken, dann 1 ml 10x PBS dazugegeben. Nochmal zentrifugieren wie oben beschrieben, anschließend den Überstand vorsichtig abpipettieren und die Granulozyten in 5 ml PBS waschen und für 5 bei 600 g zentrifugieren. Überstand gründlich entfernen. Reste des Puffers können mit einer blauen Eppendorfspitze abgenommen werden, und dabei kann auch noch vorhandenes Hämoglobin, das über dem weißen Zellpellet steht, abgenommen werden. Die Zellen werden in 1 ml PBS aufgenommen und gezählt;

16 16 10 µl der Zellen werden 1:10 mit PBS vorverdünnt, ein Aliquot (20 µl) mit 20 µl Trypanblau-Gebrauchslsg. versetzt und mit einer Zählkammer gezählt. Dann die Zellen auf die benötigte Zellzahl von 1x10 6 Zellen/mL einstellen und bei 4 C auf Eis lagern. Ficoll: Biocoll Separating Solution von Biochrom Dichte 1,077 g/ml, Cat. No. L6115 PBS (10x): Dulbecco s PBS without Ca&Mg PAA Laboratories GmbH, Cat.No. H Messung der ROS-Produktion von Neutrophilen Der Assay wird in einer 96 well-platte mit Dreifach-Werten in einem Gesamtvolumen von 200 µl durchgeführt. Gemessen wird am Biotek Plattenleser Synergy 4 bei 37 C (Aufheizphase beachten). Konzentrationsreihen der 2 AR Agonisten ansetzten, jeweils das 20x der finalen Konzentration. Pro Wert werden 3x10 µl Ligandenlösung benötigt. (+ Volumen für die nächste Verdünnungsstufe) Fenoterol 10 mm Stammlsg. in H 2 O 10 µl 20 µm = 1 µm final 10 µl 2 µm = 100 nm 10 µl 200 nm = 10 nm 10 µl 20 nm = 1 nm 10 µl 2 nm = 100 pm 10 µl 200 pm = 10 pm S-Salbutamol 10 mm Stammlsg. in H 2 O 10 µl 6 mm = 300 µm final 10 µl 2 mm = 100 µm 10 µl 200 µm = 10 µm 10 µl 20 µm = 1 µm 10 µl 2 µm = 100 nm 10 µl 200 nm = 10 nm

17 17 (R)-Isoproterenol 10 mm Stammlsg. in H 2 O 10 µl 20 µm = 1 µm final 10 µl 2 µm = 100 nm 10 µl 200 nm = 10 nm 10 µl 20 nm = 1 nm 10 µl 2 nm = 100 pm 10 µl 200 pm = 10 pm Ligandenlösung lt. Pipettierplan in die Platte vorlegen. (Konzentration ansteigend!) Außerdem in Reihe A 1 9 je 20 µl PBS vorlegen = unstimulierte Kontrollen Reihe B 1-9 je 10 µl PBS vorlegen = stimulierte Kontrollen (fmlp) fmlp 20 µl fmlp Stammlg. 1 mm in Dimethylformamid, daraus entsprechende Menge 20 µm Lösung herstellen Mastermix ansetzen, es werden 80 µl/200 µl eingesetzt = 2,5 x der finalen Konzentration Erst zuletzt - unmittelbar vor Gebrauch - frisch ansetzen. Benötigt werden 7 ml Lösung (72 Proben + Sicherheitsvolumen) 6 µl Cytochalasin B (1 mg/ml in DMSO) (sehr giftig) in 1ml PBS verdünnen 0,3 µg/ml (final im Assay) 1000µl CaCl 2 20 mm in H 2 O = 2,5 mm (1 : 8) = 1 mm final 1000 µl Cytochrom C 2 mm in PBS = 250 µm (1 : 8) = 100 µm final ad 8 ml mit PBS auffüllen Jeweils 80 µl mit der Multipette in die Platte geben. Anschließend 100 µl der gezählten Zellen dazugeben (Multipette) = (1x10 5 Zellen/well final) Dann am vorgeheizten Platten-Reader: 3 Vorinkubation (Programm Marina PraktikumO2 Solveig) bei 37 C Start der Kinetik mit 10 µl 20 µm fmlp = 1 µm final Zu allen Proben, außer Reihe A 1-9 Die Zunahme der Absorption (Reduktion von Cytochrom C) wird 30 lang bei 550 nm gemessen.

18 18 Pipettierschema A Kontrolle 1* (unstimuliert) Kontrolle 1* (unstimuliert) Kontrolle 1* (unstimuliert) B Kontrolle (fmlp stimuliert) Kontrolle (fmlp stimuliert) Kontrolle (fmlp stimuliert) C Fenoterol 10 pm Salbutamol 10 nm (R)-Isoproterenol 10 pm D Fenoterol 100 pm Salbutamol 100 nm (R)-Isoproterenol 100 pm E Fenoterol 1 nm Salbutamol 1 µm (R)-Isoproterenol 1 nm F Fenoterol 10 nm Salbutamol 10 µm (R)-Isoproterenol 10 nm G Fenoterol 100 nm Salbutamol 100 µm (R)-Isoproterenol 100 nm H Fenoterol 1 µm Salbutamol 300 µm (R)-Isoproterenol 1 µm Abbildung 2 2 adrenerge Rezeptor Agonisten: Salbutamol und (R)-Isoproterenol (SIGMA) 96-Well Platte, Nunclon Surface von NUNC (R)-Isoproterenol-Bitartrat I270) von Sigma Fenoterol F1016 von, Sigma (S)-Salbutamol S5013 von Sigma

19 19 Auswertung In GraphPad Prism kann mit den Daten der kompletten Kinetik gerechnet werden (inkl. Fehlerrechnung). Da letztlich die Werte zu Beginn (t=0) und des Plateaus (t=30) die gesamte Produktion von ROS widerspiegeln, kann ein Teil der Auswertung mit einem Tabellenkalkulationsprogramm durchgeführt werden. <A 550,xn >= [<A 550,xn >(t=30) - <A 550,Kontrolle 1 >(t=30)] - [<A 550,xn >(t=0) - <A 550,Kontrolle 1 >(t=0)] Formel 1 Berechnung von A550: Nach Abzug des Hintergrundes werden die Differenzen der Absorptionen bei 550 nm zu den Zeitpunkten t=0 und t=30 gebildet. Eine Quantifizierung der entstandenen ROS im 96-Well Format ist schwierig und findet nicht statt. Es wird normalisiert: Inhibition der ROS Produktion / % von 1 µm (R)-Iso = 100% -(<A 550,xn >-<A 550,H7-9 >)/(<A 550,B1-9 >-<A 550,H7-9 >)*100% Formel 2 Normalisierung auf (R)-Isoproterenol: Nach der Normalisierung auf den A 550 -Wert von 1 µm (R)-Isoproterenol werden die Werte in Prozente der maximalen Inhibition transformiert. In GraphPad PRISM oder einem anderen Programm mit Kurvenanpassung (R, etc.) werden die normalisierten Werte den jeweiligen log(c Ligand ) zugeordnet und als Graph dargestellt. Über nicht-lineare Regression erhält man die Dosis- Wirkungskurven. % der max. Inhibition von 1 µm (R)-ISO A B (S)-Salbutamol (R)-Salbutamol (R)-Isoproterenol log(c ligand /M) log(c ligand /M) Vorteile von PRISM: - von den Rohdaten bis zum Ergebnis in einer Datei - einmal erstellte Analyse kann bei gleich strukturierten Rohdaten wiederverwendet werden - Fehlerrechnung, Statistik und Kurvenanpassung inklusive - einfache Möglichkeit ansprechende Graphen zu generieren

20 20 VP3: Calcium-Assay mit neutrophilen Granulozyten Messung der Änderung der intrazellulären Calciumkonzentration durch Aktivierung des Formylpeptid-Rezeptors FPR1 in humanen neutrophilen Granulozyten 1. Einführung und Zielsetzung 1.1 Neutrophile Granulozyten (PMNs) Neutrophile Granulozyten sind Bestandteil der unspezifischen angeborenen Immunantwort. Aufgrund der mehrlappigen Struktur ihres Kerns werden sie auch als polymorphkernige neutrophile Leukozyten (PMNs) bezeichnet. Sie werden im Knochenmark gebildet und zirkulieren in der Blutbahn. Im Falle einer Infektion wandern die PMNs in einem Vorgang, der auch als Extravasation bezeichnet wird, aus der Blutbahn in das infizierte Gewebe aus. Dort bewegen sie sich zum Infektionsort und phagozytieren als professionelle Fresszellen die Krankheitserreger. Außerdem können sie in einem Vorgang der als oxidative burst bezeichnet wird, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) freisetzen, die zur Abtötung von Krankheitserregern führen. Die ROS-Bildung durch PMNs wird in einem separaten Praktikumsversuch behandelt. PMNs haben eine sehr kurze Lebensdauer von 1 bis 4 Tagen und versterben i.d.r. im Gewebe nach Ausüben ihrer anti-infektiösen Funktionen. Tote PMNs sind Hauptbestandteil des Eiters. Die PMNs werden an einen Infektionsort durch verschiedene sog. chemotaktische Substanzen gelockt. Als Chemotaxis bezeichnet man das Phänomen, dass Zellen sich aktiv in dem Konzentrationsgradienten einer chemotaktisch wirkenden Substanz gerichtet bewegen. Diese Bewegung kann sowohl in positiver Richtung, also in Richtung steigender Konzentration (Chemoattraktanzien), als auch in negativer Richtung (Chemorepellanzien) erfolgen. Von zentraler Bedeutung für die positive Chemotaxis von PMNs sind N-formylierte Peptide, die Bestandteil der Zellwand vieler Bakterien sind. Bei einer Infektion werden diese Peptide am Infektionsort freigesetzt und diffundieren ins Gewebe. Diese sogenannten Formylpeptide stimulieren die Chemotaxis von PMNs über den Formylpeptid-Rezeptor 1, der auch kurz als FPR1 bezeichnet wird. 1.2 Der Formylpeptid-Rezeptor FPR1 FPR1 gehört zur Familie der Formylpeptid-Rezeptoren, die beim Menschen drei Subtypen umfasst. FPR1 ist ein G α,i -gekoppelter Rezeptor (GPCR), der hauptsächlich auf myeloiden Zellen (PMNs und Monozyten) exprimiert wird. Die Rolle von FPR1 in anderen Zelltypen, wie z.b. Augenlinsenepithel oder Fibroblasten ist noch nicht vollständig geklärt. Die Stimulation von FPR1 führt zu einem Anstieg der intrazellulären Calcium- Konzentration und zur oben beschriebenen Chemotaxis. In Gegenwart höherer Formylpeptid-Konzentration, also in unmittelbarer Nähe der Infektion, bewirkt FPR1 eine Degranulation der PMNs mit Freisetzung bakterizider Faktoren. Formylpeptide stimulieren auch die Produktion von ROS durch PMNs. FPR1 ist somit wichtig für die unmittelbare Beseitigung und Abtötung von Krankheitserregern durch PMNs. Im folgenden Praktikumsversuch werden wir PMNs isolieren und ein FPR1- vermitteltes Calciumsignal mit dem intrazellulären Calcium-Indikator Fura-2 (Abbildung 1) bestimmen. Die Stimulation des Rezeptors erfolgt mit dem formylierten Tripeptid fmlf (N-Formylmethionyl-Leucyl-Phenylalanin), z. T. auch als fmlp

21 21 bezeichnet. Dieses Peptid hat auch eine pathophysiologische Bedeutung, da es z. B. von E. coli freigesetzt werden kann. Abb. 1: Struktur des Calcium-Indikators Fura-2 bzw. des zellwandpermeablen Fura-2-AM 1.3 Bestimmung der intrazellulären Calciumkonzentration mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fura-2-AM Wird ein Molekül mit Licht einer bestimmten Wellenlänge bestrahlt, können Elektronen aus ihrem Grundzustand in einen angeregten Zustand versetzt werden. Für die Rückkehr in den Grundzustand kann das Molekül die aufgenommene Energie entweder durch strahlungslose Inaktivierung (Zusammenstöße benachbarter Moleküle unter Abgabe von Wärme), Phosphoreszenz oder durch Fluoreszenz abgeben. Die Elektronenübergänge, die bei Absorption und Emission von Licht auftreten, werden in einem Jablonski-Diagramm dargestellt (Abbildung 2). Abb.2 Jablonski Termschema Das Ausmaß der Aktivierung der PMNs lässt sich anhand der Veränderung der intrazellulären Calciumkonzentration bestimmen. Als Detektionsreagenz wird der Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 eingesetzt, der mit Calcium Chelatkomplexe bildet. Durch Maskierung der polaren Carboxylgruppen des Fura-2 mit Acetoxymethylgruppen zu Acetoxymethylestern (AM) kann der Fluoreszenzfarbstoff

22 22 durch Diffusion in die Zelle eindringen. Zelleigene Esterasen reaktivieren durch Spaltung der Ester das Fura-2. Gleichzeitig wird aufgrund der Ladungen ein Austreten aus den Zellen verhindert. In Abhängigkeit von der Calciumkonzentration ändert sich das Exzitationsmaximum von Fura-2 bei konstanter Emissionswellenlänge von 508 nm. In Abwesenheit von Calcium wird das Exzitationsmaximum bei 380 nm gemessen. Bei Anwesenheit von Calcium verschiebt sich das Maximum auf 340 nm. Der isosbestische Punkt, also die Wellenlänge, bei der die Fluoreszenz unabhängig von der Calciumkonzentration ist, liegt bei 360 nm (Abbildung 3). Abb.3 Exzitationsspektrum von Fura-2 Um von der Fluoreszenzintensität auf die Calciumkonzentration schließen zu können, wird folgende Formel angewendet: Ca 2 nm K D F Fmin F F K D = Dissoziationskonstante, F = OD 340nm, F min = F EGTA, F max = F Triton max 1.4 Ziel des Versuchs In diesem Versuch soll die Änderung der intrazellulären Calciumkonzentration in PMNs mit der Fura-2-AM Methode nach Stimulation mit steigenden Konzentrationen des Formylpeptids fmlf bestimmt werden. Außerdem werden wir untersuchen, wie dieses Calciumsignal mechanistisch entsteht, wozu wir Thapsigargin benutzen, eine Substanz, die spezifisch die Ca 2+ -ATPase im endo- bzw. sarkoplasmatischen Retikulum (ER/SR) hemmt und so den Rücktransport des zytosolischen Calciums in ER/SR hemmt. Wir werden die Fluoreszenz in Küvetten messen und dann in der Auswertung und Abschlussbesprechung die Vor- und Nachteile von küvettenbasierten und plattenleserbasierten Messungen diskutieren.

23 23 2. Durchführung des Versuchs und Auswertung 2.1 Vorbereitung der Liganden Aus einer 1140 μm Stammlösung von fmlf in Calcium-Puffer wird durch 11,4- fache Verdünnung eine 100 μm Lösung hergestellt (10 µl µl Puffer). In einer Reihe von 1:10 Verdünnungen mit Calcium-Puffer werden folgende Konzentrationen hergestellt (jeweils 10 µl + 90 µl Puffer): aus 100 μm Lösung: 10 μm, 1 µm, 100 nm. aus 10 μm Lösung: 3 μm (33 µl + 77 µl Puffer), 500 nm (5 µl + 95 µl Puffer). Thapsigargin 100 μm: wird durch Betreuer bereitgestellt Triton 15 % und EGTA 600 mm: wird durch Betreuer bereitgestellt 2.2 Vorbereitung der Zellen 1 x 10 7 Zellen werden bei 131 g für 5 Minuten zentrifugiert. Zellpellet in 1.25 ml Calcium-Puffer aufnehmen ( 8 x 10 6 Z/ml) und 5 μl Fura-2-AM (1 mm) hinzugeben (Fura-2-Endkonzentration: 4 μm) 10 Minuten im Brutschrank inkubieren 1.25 ml Calcium-Puffer dazugeben ( 4 x 10 6 Z/ml) und weitere 30 Minuten im Brutschrank inkubieren 22.5 ml Puffer dazugeben und bei 131 g für 5 Minuten zentrifugieren Pellet in 20 ml Puffer aufnehmen ( Z/ml) Je 2 ml Zellsuspension in insgesamt 6 Küvetten vorlegen ( Zellzahl pro Probe: 1 x 10 6 Z), bei 1 Probe 20 µl Thapsigargin (1 µm final) zugeben. Die übrigen Zellen bei Raumtemperatur im Dunkeln bis zur Messung aufbewahren 2.3 Messungen am Fluorimeter fmlf-konzentrations-wirkungs-kurve (4 Messungen): Magnet-Rührfisch in die Küvette geben 20 μl CaCl 2 -Lösung (100 mm) zur Küvette dazugeben und Messung starten warten, bis Basislinie stabil ist (nach ca. 2-3 min) 20 μl der Stimulus-Lösung dazugeben (= 1:100 Verdünnung von fmlf, finale fmlf-konzentration ist also nur 1/100 der Stammlösung; finale Konzentrationen: 0 nm (Pufferkontrolle), 1 nm, 10 nm, 100 nm, 1 µm Signal etwa zwei Minuten lang verfolgen (bis Maximum überschritten ist)!!gilt nur für die erste und siebte Messung: 70 μl Triton-Lösung dazugegeben ~ 2 min messen (Maximalsignal F max stellt sich ein) 43 μl EGTA dazugeben ~ 2 min messen (Minimalsignal F min stellt sich ein) Messung beenden Thapsigargin-Effekt (2 Messungen): Nach Abschluss der fmlf-konzentrations-wirkungs-kurve wird der Effekt von Thapsigargin auf das fmlf-induzierte Calciumsignal untersucht. Die Messung verläuft im Prinzip genauso wie bei der fmlf-konzentrations-wirkungs-kurve, nur dass KEIN CaCl 2 vor der Messung in beiden Proben (1x ohne Thapsigargin, 1x mit Thapsigargin) zugegeben wird. Nach 2-3 min Basislinie wird das fmlf zugegeben (20 μl einer aus der Konz.-Wirkungskurve bestimmten Konzentration) und das Signal bestimmt.

24 Auswertung Generell: Die Berechnung von F max und F min lässt sich zwar mit der GraphPad Prism Software durchführen, ist aber ziemlich zeitaufwändig. Aus diesem Grund werden wir nach jeder einzelnen Messung mit dem Cursor manuell die entsprechenden Werte aus der Kurve ablesen und in eine Tabelle eintragen (Tabellenformular wird vom Betreuer zur Verfügung gestellt). Konzentrations-Effekt-Kurve: Die intrazellulären Calciumkonzentrationen werden gemäß der Formel aus 1.3 berechnet. Die beiden Werte für F max und F min werden aus der ersten und siebten Messung abgelesen und gemittelt. Für jede Messung werden die Basislinie (F basal ) und das maximale, nach Zugabe des Stimulus induzierte Signal (F fmlf ) bestimmt. Der K D -Wert von Fura-2 ist 224 nm. Die F basal - und die F fmlf -Werte der einzelnen Messungen werden mit obiger Formel in Calciumkonzentrationen (Ca basal und Ca fmlf ) umgerechnet. Für jede Messung wird die Differenz Ca fmlf - Ca basal errechnet In der GraphPad Prism Software werden die errechneten Ca 2+ - Konzentrationsdifferenzen in Abhängigkeit vom Logarithmus der eingesetzten fmlf Konzentrationen dargestellt. Der EC 50 -Wert wird durch einen sigmoidalen Kurvenfit berechnet. Thapsigargin-Effekt: Die Messkurven von des zugehörigen fmlf Wertes und der beiden Thapsigargin Proben werden in einem Diagramm zusammen aufgetragen. 2.5 Zu beantwortende Fragen Wie hoch ist der EC 50 -Wert von fmlf am FPR1 Formylpeptid-Rezeptor humaner PMNs? Was lässt sich über den mechanistischen Hintergrund des gemessenen Calciumssignal aus dem Thapsigargin-Versuch ableiten? Kommt das Calcium, das durch fmlf freigesetzt wird, aus internen Speichern oder von extrazellulär? Was sind die Vor- und Nachteile von Fluoreszenzmessungen in der Küvette? Gab es unerwartete Ergebnisse? Welche Erklärungen gibt es dafür?

25 25 VP4: Metabolomics / Massenspektrometrie (Seminar) In Rahmen eines Seminars in kleinen Gruppen sollen Grundkenntnisse der Metabolomics sowie der HPLC-gekoppelten, quantitativen Massenspektrometrie vermittelt werden. Es findet zusätzlich eine kurze Laborführung statt. Begleitmaterial: 1) Metabolomics: What s that and how to do it 2) Wishart DS (2016) Emerging applications of metabolomics in drug discovery and precision medicine. Nat Rev Drug Discov 15: Folgende Fragen sollen zusätzlich im Seminar angesprochen werden: A) Welche Vor- bzw. Nachteile bietet die LC-MS/MS-Technik? B) Welche anderen analytischen Methoden hätten Sie zur Quantifizierung des second messengers camp einsetzen können?

26 26 VP5: PCLS Precision-Cut Lung Slices Theoretischer Hintergrund Allergisches Asthma Allergisches Asthma ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung der Atemwege, an der ca. 4% der Weltbevölkerung leidet. Dies entspricht etwa 300 Millionen Asthmapatienten. Die meisten dieser Patienten entwickeln die Erkrankung in der frühen Kindheit. Die Inzidenz der Asthmaerkrankungen ist hierbei in der Regel besonders hoch in industrialisierten Ländern und vergleichsweise gering in Entwicklungsländern. Momentan zeichnet sich jedoch ein dramatischer Zuwachs an Asthmaerkrankungen in Entwicklungsländern ab. Asthma ist durch reversible Hypersensitivität definiert: Die klinischen Symptome beinhalten Atemlosigkeit, Engegefühl in der Brust sowie Husten. Auf zellulärer Ebene treten Mucus- Überproduktion sowie eine Einwanderung von eosinophilen Granulozyten und Lymphozyten wie T- Helfer Zellen (besonders Subtyp 2) auf. Diese Zusammenhänge führen schließlich zu den pathophysiologischen Phänomenen der Atemwegsobstruktion, Atemwegshyperreagibilität und zur Remodellierung der Atemwege. Trotz intensiver Forschung bleiben die genauen Mechanismen der Pathogenese unklar, sodass weder präventive noch heilende Medikamente vorliegen. Das momentane therapeutische Ziel der Behandlung ist ein Kontrollieren der Erkrankung durch Verminderung der Symptome. Um die noch unklaren Mechanismen aufzudecken, werden neue und innovative Forschungsansätze verfolgt. Sensibilisierung von Atemwegen Die Sensibilisierung des Organismus gegen ein bestimmtes Allergen ist ein essentieller Teil in der Entstehung einer allergischen Reaktion von Atemwegen. Eine Sensibilisierung findet nach Erst- Exposition mit einem Allergen statt. In der Lunge (auch die Haut wird diskutiert) wird das Allergen dabei durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) wie Dendritische Zellen (DCs) aufgenommen und prozessiert. Diese DCs werden aktiviert und wandern zu den Lymphknoten. Während dieser Wanderung reifen die DCs und präsentieren das Allergen über MHC II (Haupthistokompatibilitätskomplex II) Moleküle CD4 + T-Zellen. Die noch naiven T-Zellen differenzieren durch diesen Stimulus zu Th2 Zellen und beginnen mit der Sekretion spezieller Wachstumszytokine und pro-allergischen Zytokinen wie IL-4 und IL-13. Diese Zytokine führen neben anderen Faktoren zur Aktivierung von Allergen-spezifischen B-Zellen, zur Differenzierung dieser B- Zellen zu Plasmazellen und zur Produktion von IgE. Das sekretierte IgE bindet mit hoher Affinität an Rezeptoren auf Mastzellen und sensibilisiert diese somit gegen das entsprechende Allergen. Abb. 1: Sensibilisierung eines Atemwegs gegen ein Allergen

27 27 Im Labor kann eine passive Sensibilisierung durch Inkubation von Lungengewebe mit Serum von allergischen Spendern erreicht werden. Im Zuge einer zweiten Exposition des Allergens können frühe allergische Reaktionen induziert werden. Dies geschieht durch Bindung des entsprechenden Allergens an das IgE auf den Mastzellen. Die dadurch entstandene Kreuzvernetzung führt zur Aktivierung der Mastzellen und anschließender Degranulation. Letzteres bewirkt in Nagern die Ausschüttung von Serotonin und Histamin, welche wiederum für die frühen allergischen Reaktionen in Krankheiten wie Asthma verantwortlich sind. Die resultierenden Symptome sind eine Kontraktion der glatten Muskelzellen der Atemwege (Bronchokonstriktion), eine erhöhte Mucus-Sekretion sowie eine Stimulation der sensorischen Nerven in Nase, Haut und Atemwegen. Dies führt wiederum zu den klinisch relevanten Symptomen, wie weiter oben beschrieben. Precision-Cut Lung Slices (PCLS) Bei PCLS handelt es sich um ein ex vivo Modell, welches viele Zellen des respiratorischen Traktes in ihrer einzigartigen Mikroanatomie und Umgebung widerspiegelt. In einem solchen organotypischen ex vivo Modell vereinen sich viele Vorteile von in vivo und in vitro Techniken. Die Methodik nutzt ein sogenanntes Krumdieck-Mikrotom, mit dessen Hilfe das Lungengewebe in µm dicke Scheiben geschnitten wird. Diese Lungenschnitte weisen eine komplexe Gewebeorganisation auf und können über längere Zeit unter Zellkulturbedingungen vital bleiben. Im Gegensatz zu Zellkulturen können in PCLS die Interaktionen unterschiedlicher Zelltypen bzw. die Immunantwort von Zellen in ihrer nativen Mikroumgebung beobachtet werden. Durch den Schneideprozess können ferner eine Vielzahl an Schnitten aus einer Lunge generiert werden, sodass mehrere Experimente mit einer einzigen Lunge gemacht werden können (im Gegensatz zu in vivo, wo immer pro Tier nur 1 Zeitpunkt und 1 Konzentration gemacht werden können). Eine Untersuchung von in Pharmakologie bzw. Toxikologie verwendeter Substanzen ist ebenso möglich: Beispielsweise können neuentwickelte Therapeutika in den Lungenschnitten getestet werden. Abb. 2: Schematische Darstellung der Generierung von PCLS Praktische Durchführung Material 1.5 % low-melting Agarose: Das Agarosepulver wird in destilliertem Wasser unter Hitze in Lösung gebracht. Vor der Nutzung wird eine 3%ige Agaroselösung mit DMEM versetzt um eine 1.5%ige Lösung zu generieren. Diese wird bis zur Nutzung auf 37 C gehalten. PBS Dulbecco s Modified Eagle s Medium Nutrient Mixture F-12 HAM (DMEM) mit L- Glutamin, 15 mm HEPES and 7.5 % w/v Natriumbicarbonat, ohne Phenolrot, ph EBSS 100 Units/mL Penicillin and 100 µg/ml Streptomycin in DMEM LIVE/DEAD Staining Kit 1% Allergiker- bzw. Nicht-Allergiker-Serum Capsaicin

28 28 Perfusionskammer und Elektrodenring der EFS Ovalbumin, gelöst in Wasser Metacholin, Konzentrationsreihe, 3 Konzentrationen zwischen und 10-3 M Tiotropium Präparation der Ratte Das Versuchstier (Ratte) wird durch intraperitoneale Injektion von 1 ml Narcoren getötet. Die Präparation erfolgt unter einer Werkbank und beginnt mit dem Öffnen des Abdomens sowie dem Entbluten des Versuchstieres durch Trennen der vena cava inferior. Nach Öffnung des Cervix wird eine Kanüle in die Trachea eingeführt und mit einem Faden befestigt. Die Lunge kann nun aus der Brust herauspräpariert werden und über die Kanüle mit ca. 18 ml 1.5%iger Agarose-Lösung (vorgewärmt auf 37 C um vorzeitiges Auspolymerisieren zu verhindern) gefüllt. Die Lunge wird nun in 4 C kaltes PBS gelegt und auf Eis gelagert um ein Erstarren der Agarose zu erreichen. Die Lunge wird bis zum Beginn des Schneidens auf Eis gelagert. Generierung der PCLS Die präparierte Lunge wird mittels eines Skalpells in die einzelnen Lappen unterteilt und in Zylinder mit einem Durchmesser von je 8 mm gestanzt. Der Krumdieck Gewebeschneider wird mit eisgekühltem EBSS gefüllt, die Gewebestanzen werden eingeführt und in Schnitte von ca. 300 µm Dicke prozessiert. Die PCLS werden in einer Petrischale mit DMEM/F-12 inkl. 1% Pen/Strep gesammelt und verbleiben zunächst auf 4 C. Zum Entfernen von Zelldebris wird die Petrischale bei 37 C, 5% CO 2 und 100% Luftfeuchtigkeit inkubiert und 1 Stunde alle 20 Minuten das Medium erneuert. Potentielle Atemwege werden in eine 24well Platte aussortiert und über den Zilienschlag unter dem Mikroskop als solche verifiziert. LIVE/DEAD Färbung Zur Kontrolle der Vitalität der Schnitte wird eine Lebend/Tot Färbung durchgeführt, welche ein gleichzeitiges Bestimmen sowohl der lebenden als auch der toten Zellen aufgrund intrazellulärer Esterase-Aktivität sowie der Membranintegrität erlaubt. Das allgemeine Prinzip dieses Assays ist die Unterscheidung von lebenden Zellen im Vergleich zu toten Zellen aufgrund der in lebenden Zellen ubiquitär vorkommenden Esterase. Bestimmt wird die Aktivität dieses Enzyms durch die Umsetzung des nicht-fluoreszierenden, zelldurchlässigen Calcein- AM zum intensiv fluoreszierenden Calcein. Durch Abspaltung der Acetomethoxy-Gruppe (s. Abb. 3) ist der polyanionische Farbstoff Calcein nicht mehr in der Lage die intakte Zellmembran zu durchdringen und zeigt starke grüne Fluoreszenz (Anregungswellenlänge: 495 nm, Emmision: 525 nm). Abb. 3: Strukturformel von Calcein, gezeichnet mit MarvinSketch. Abspaltung der Acetmethoxy-Gruppe durch die Esterase verhindert ein Austreten des Farbstoffes in vitalen Zellen. Tote Zellen werden über Ethidium Homodimer-1 (EthD-1) angefärbt: Dieser Farbstoff ist nicht membrangängig und kann somit nur über beschädigte Membranen in das Zellinnere gelangen. Dort bindet der schwach fluoreszierende Farbstoff an Nukleinsäuren und steigert seine Fluoreszenz hiermit um das 40-fache. Der EthD-1/DNA Komplex weist eine starke, rote Fluoreszenz bei einer

29 29 Anregungswellenlänge von 495 nm und einer Emission bei 635 nm auf. Aufgrund der intakten Membran in lebenden Zellen können nur tote Zellen mittels EthD-1 angefärbt werden. Die generierten PCLS werden in eine 24well Platte aussortiert, sodass ein Schnitt pro well vorliegt. Die beiden Komponenten des LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kits werden nun zu einer Arbeitslösung von 4 µm in PBS verdünnt und 300 µl der Verdünnung pro well eingesetzt. Als Totkontrolle wird ein Schnitt vor der Färbung für 1 Stunde mit 1% Triton in PBS bei 4 C inkubiert und nach 3maligem Waschen wie die restlichen Schnitte gefärbt. Die mit 300 µl Färbelösung versetzten Schnitte werden für 45 Minuten lichtgeschützt und unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 3maligem Waschen mit PBS können die Schnitte am konfokalen Mikroskop betrachtet werden. Die Auswertung dieses Experimentes erfolgt am Nachmittag über die Software IMARIS 7.6. Passive Sensibilisierung der PCLS Nach Präparation und Waschen der Ratten-PCLS werden die Schnitte in 1% Serum Ovalbuminallergischer bzw. nicht-allergischer Tiere (verdünnt in DMEM/F-12 inkl. Pen/Strep) inkubiert. Die Inkubation erfolgt über Nacht in 500 µl 1%igem Serum pro 2 PCLS bei 37 C und 5% CO 2. Um eine allergische Reaktion für die Bronchokonstriktion (s. weiter unten bzw. den entsprechenden Abschnitt unter Theoretischer Hintergrund ) auszulösen, werden die sensibilisierten Schnitte am Folgetag mit 0.1% Ovalbumin stimuliert. Messung der Bronchokonstriktion Die Bronchokonstriktionsmessung der sensibilisierten Atemwege erfolgt in einer Petrischale mit 2 ml DMEM/F-12 mit Pen/Strep und 25 mm HEPES. Der zu betrachtende Schnitt wird in die Petrischale überführt, mit einem Anker am Boden fixiert und die Petrischale auf einer vorgewärmten Platte (37 C) unter ein Stereomikroskop gelegt. Es werden jeweils Duplikate betrachtet und pro Stimulanz sowohl mit allergischem als auch mit nicht-allergischem Serum stimulierten Schnitten die Messung durchgeführt. Vor Zugabe der Stimulantien wird von jedem Schnitt ein Ausgangsbild generiert. Im Anschluss werden ca. 700 µl des Mediums mit dem entsprechenden Stimulanz versetzt und auf den Atemweg gegeben. Die Messung erfolgt über das Stereomikroskop, welches mittels der AxioCam IcM1 und der AxioVision Software den Atemweg während der Stimulation und darüber hinaus filmt. Es werden 3 unterschiedliche Stimulantien hinzugegeben: 1) Capsaicin, ein in verschiedenen Paprika- Arten natürlich vorkommendes Alkaloid das eine Freisetzung von Neurotransmittern wie Substanz P auslöst wird in Medium verdünnt, sodass in der Petrischale eine Konzentration von 10 mm erreicht wird. Die Messung erfolgt nach Stimulation 5 Minuten pro Schnitt. 2) Ovalbumin ist das häufigste Protein im Eiklar von Vögeln und das Allergen, gegen welches die mit Serum von Ovalbuminsensibilisierten Ratten sensibilisiert wurden. Die Messung erfolgt analog zur Capsaicin Messung für 5 Minuten nachdem in diesem Fall mit einer 0.1%igen Ovalbumin Lösung, verdünnt in Medium, stimuliert wurde. 3) Metacholin ist ein Analogon des natürlich vorkommenden Acetylcholin, welches nach Ausschüttung von parasympatischen Nerven und Bindung an den Muskarin-Rezeptor zur Bronchokonstriktion führt. Die Metacholin-Stimulation der sensibilisierten PCLS wird in einer Konzentrationsreihe aus 3 Konzentrationen gemessen, durch welche die Metacholin-Konzentration in der Petrischale langsam von auf 10-3 M erhöht wird. Pro Konzentration werden die Schnitte hierbei für 2 Minuten aufgenommen. Die Messungen werden nach Vorinkubation mit Tiotropium, einem Inhibitor, der ebenfalls an den Acetylcholin-Rezeptor bindet, wiederholt. Der Effekt von Tiotropium wird im Vergleich zu unbehandelten Schnitten ausgewertet. Zusätzlich wird im Praktikum die Bronchokonstriktion durch eine Elektrofeld-Stimulation (EFS) durchgeführt. Hierzu werden die Schnitte in eine Perfusionskammer mit 3 ml Medium gegeben. Der Elektrodenring wird nun auf die Kammer gesetzt, mit einem Metallring beschwert und an den Generator angeschlossen. Das Gerät wird für die Stimulation der Rattenschnitte auf 40 Hz und 40 V eingestellt. Die Stimulation der Schnitte erfolgt nun für je 2 ms mit einer Pause von 1 ms zwischen den Stimulationen. Für diese Messung wird eine Minute lang ein Vorlauf ohne Stimulus gemessen,

30 30 anschließend der Strom für 1.5 Minuten angelegt und im Anschluss für 1.5 weitere Minuten pausiert. Diese Behandlung wird nun noch einmal wiederholt. Allen Bronchokonstriktionsmessungen gemein ist der Intervall in welchem die Kamera ein Bild der PCLS erzeugt. Für die vorliegenden Versuche wird ein Intervall von 20 Sekunden gewählt. Die auf diese Weise erzeugten Bilder der Messung werden mit dem Programm ImageJ analysiert. Die Atemwegsgröße der unstimulierten PCLS zu Beginn der Messung wird hierbei als 100% definiert. Die Bronchokonstriktion wird als prozentualer Anteil der initialen Atemwegsfläche dargestellt. Die auf diesem Wege generierten Daten werden mittels GraphPad Prism 4.03 ausgewertet.

31 31 Funktionelle Evaluation des Multi-Domänen-Modells Clostridialer glucosylierender Toxine Praktikumsort Institut für Toxikologie (Direktor: Prof. Dr. med. Ingo Just) Gebäude I 6, Ebene 3, Raum Ansprechpartner Prof. Dr. Ralf Gerhard gerhard.ralf@mh-hannover.de Prof. Dr. Harald Genth genth.harald@mh-hannover.de Tel /-9168 Allgemeine Hinweise: Mitzubringen sind: Kittel Ihre Vorbereitung sollte umfassen: GTP-bindende Proteine, GTPase Zyklus Regulation des Zytoskeletts der Zelle Rezeptor-vermittelte Endozytose Generierung von Antikörpern in Tieren, Impfung 1. Einleitung Rho-GTPasen sind zentrale Regulatorproteine der Zellmotilität, der Endo- und Exozytose sowie des Zellzyklus. Daher sind Rho-GTPasen bevorzugte Zielsubstrate bakterieller Toxine. Die Toxine dienen pathogenen Bakterien zu dem Zweck, die Signalweitergabe der Zielzelle zu manipulieren (z.b. um das Bakterium aufzunehmen) oder um Abwehrmechanismen der Zelle auszuschalten. Diese Strategie ist auch der Funktionsmechanismus der Toxine A und B aus C. difficile. Sie gehören zur Familie der Clostridialer glucosylierender Toxine, einer Gruppe hochmolarer Glycosyltransferasen, die Rho- GTPasen inaktivieren. Toxin A und Toxin B schädigen durch ihre Aktivität das Darmepithel und können eine Durchfallerkrankung oder eine pseudomembranösen Kolitis (PMC) verursachen. Die Toxine zeigen eine Multi-Domänen-Struktur (Abb. 1). Diese Domänen erlauben die Aufnahme des Toxins in die Zielzelle ( Autotransporter ) sowie die enzymatische Aktivität (Abb. 2). catalytic domain delivery domain GTD CPD TMD RBD N W DXD D...H...C C Rho T37 Rho T37 glucose Abb. 1. Multi-Domänen-Struktur der Clostridialer glucosylierender Toxine (am Beispiel des Toxin B). Die Rezeptor-bindende Domäne (RBD) setzt sich aus sich wiederholenden Oligopeptid- Elementen zusammen, die möglicherweise an Zuckerstrukturen des unbekannten Rezeptors binden. Diese multivalente Bindung löst eine Rezeptor-vermittelte Endozytose aus. Eine hydrophobe Region in der Mitte des Moleküls stellt eine Transmembran-Domäne (TMD) dar, welche eine Pore oder einen Kanal formt, durch den die N-terminale Glucosyltransferasedomäne (GTD) in das Zytoplasma gelangt. Die Cysteinproteasedomäne (CPD) trennt die GTD proteolytisch vom Toxinrumpf ab.

32 32 1. RBD toxin recptor RBD TMD GTD RBD TMD GTD 4. TMD GTD RBD H+ ADP ATP TMD GTD TMD GTD 5. GTD RBD ADP H+ H + ADP TMD H+ ATP TMD RBD ADP H + ATP gluc-rho GTD Rho RBD H + ATP H + Abb. 2. Aufnahme der Toxine in die Zielzelle. 1. Das Toxin bindet an einen unbekannten Rezeptor. 2. Die Bindung des Toxins an den Rezeptor löst die Endozytose aus. 3. Das endozytierte Vesikel wird zum Endosom prozessiert. 4. Eine vesikuläre ATPase pumpt Protonen in das endosomale Lumen. Dabei sinkt der ph-wert auf etwa 5,5. 5. Die ph-absenkung führt zu einer Konformationsänderung des Toxins; die hydrophobe Transmembran-Domäne (TMD) bewegt sich zur Oberfläche des Moleküls, um mit der endosomalen Membran zu interagieren. Die Ausbildung der Pore wird durch Hemmstoffe der Protonen-ATPase blockiert. 6. Die katalytische Domäne wird durch die Proteasedomäne abgespalten und gelangt durch die Pore in das Zytoplasma. 7. Die katalytische Domäne monoglucosyliert Rho-GTPasen im Zytoplasma. 2. Ziel des Versuches: Vertieftes Verständnis der Toxinaufnahme Hemmung der Translokation aus dem Endosom durch Bafilomycin Funktionelle Evaluation der GTD und CROPs von TcdB Hemmung der Toxinwirkung durch Antitoxine 3. Testsysteme Zytotoxizitätsassay (Zellabrundung, morphologische Betrachtung) Testsystem Antitoxin Toxin Interaktion ( Dot-Blot )

33 33 4. Zeitplan Bafilomycin/ Funkt. Domänen Toxin-Antitoxin- Testing ( Dot-Blot ) Begrüßung Vergiftung Membran beladen, Blocken Kolloquium Mikroskopie Waschen, 1.AK Dokumentation Mittagspause Waschen 2.AK Waschen ECL/Quantifzierung Dokumentation Abschlussbesprechung Zytotoxizitäts- Testung Vorinkubation Vergiftung Mikroskopie Dokumentation Zellen auszählen 5. Praktikumsaufgabe 1 und Hintergrund: Bafilomycin A1 ist ein Pilzgift aus Streptomyces griseus, das die Protonen-ATPase eukaryonter Zellen inhibiert. Dadurch wird die Ansäuerung endosomaler Vesikel unterbunden. Da die Senkung des intravesikulären ph-wertes auf 5.0 notwendig für die Konformationsänderung der Toxine zur Einlagerung in die Vesikelmembran ist, kann somit die zytotoxizität (intrazelluläre Wirkung) verhindert werden. 5.2 Durchführung Material: Bafilomycin-Stock [0,3 mm] in DMSO Toxin B [200 ng/µl] 10 mm Tris-HCl ph 7,4, 50 mm NaCl, 0,1 mm MnCl 2 Zellen: Swiss 3T3 Fibroblasten in 4er-wells PBS: Fixierlösung: PBS + 3,7% (v/v) Formalin Es werden Zellen mit folgenden Toxinvarianten vergiftet: Kontrolle Toxin B (100 ngl/ml) Toxin B (100 ng/mll) + Bafilomycin A1 (2 µml) Tcd B (1 µg/ml) TcdB (100 ng/ml) TcdB NXN 1 µg/ml Die morphologischen Änderungen werden nach 120 min mikroskopisch untersucht Fragestellung: 1) Welche Domäne ist essentiell für die Aufnahme oder Wirkung in der Zelle? 2) Gibt es eine Wirkung die unabhängig von der Glucosylierung der Rho GTPasen ist? 6. Praktikumsaufgabe 2 Hemmung der Toxinaufnahme durch Antitoxine 6.1 Hintergrund: Zur Diagnose der Clostridium difficile (CD)-assoziierten Erkrankung werden Antikörper gegen die Toxine A (TcdA) und Toxin B (TcdB) verwendet. Anti-TcdA oder anti-tcdb dienen entweder dem Nachweis der Toxine aus z.b. Stuhlproben mittels ELISA oder werden zur Neutralisation der Toxine im Zytotoxizitätstest verwendet.

34 34 Clostridium sordellii produziert ein dem TcdB homologes Toxin, das Letale Toxin (TcsL), welches ebenfalls Glucosyltransferaseaktivität besitzt. Fragestellung: 1. Kreuzreagiert anti-tcdb mit TcsL (und umgekehrt)? 2. Neutralisiert anti-tcdb die zytotoxische Wirkung von TcsL (und umgekehrt)? 6.2 Definitionen: TcdA C. difficile Toxin A aus Stamm VPI10463 TcdB C. difficile Toxin B aus Stamm VPI10463 TcsL C. sordellii Letales Toxin aus Stamm Material Nitrozellulose-Blotmembranen, Schleicher & Schuell, 0,4 µm Porengröße Toxinlösungen: TcdA, TcdB, TcsL Antitoxine: anti-tcdab, anti-tcdb, anti-tcsl Zweitantikörper(1 mg/ml): anti-rabbit IgG, Peroxidase gekoppelt TBST (Tris-buffered Saline Tween): 50 mm TRIS ph 7,2; 150 mm NaCl; 0,05 % (w/v) Tween20 Milchpulver, fettfrei ECL-ROTI Lumineszenz-Reagenz 6.4 Nachweis der Toxin Antitoxin Interaktion ( Dot Blot ) 1. Die bereitgestellten Proteinlösungen werden mit ddh2o 1:10 (TcdB, TcsL) und mit ddh2o 1:2 (TcdA) verdünnt. 2.Jeder Teilnehmer erhält eine Nitrocellulose-Membran, auf die je 4 Dots à 2µl vorsichtig aufgetragen werden (Schema). 3. Die beladenen Membranen werden 30 getrocknet. 4. Das Blocken unspezifischer Protein-Bindungsstellen auf den Membranen erfolgt mit 5% Milchpulver in TBST für Die Membranen werden gründlich mit ddh2o und TBST gespült. 6. Pro Membran wird ein Erstantikörper (Antitoxin) im Verhältnis 1: in TBST eingesetzt. Die Inkubationsdauer beträgt Die Membranen werden 3x10 mit TBST gewaschen. 8. Die Membranen werden mit dem Zweitantikörper im Verhältnis 1:2.000 in TBST für 60 inkubiert. 9. Die Membranen werden erneut 3x10 mit TBST gewaschen. 10. Die Entwicklung erfolgt mit ECL-ROTI. Das ROTI-Reagenz enthält Luminol, welches von der an den Zweitantikörper gekoppelten Peroxidase in Anwesenheit von H2O2 oxidiert wird. Das Reaktionsprodukt chemoluminesziert und kann daher unter Lichtausschluss detektiert werden. Zunächst werden die beiden Komponenten des Lumineszenz-Reagenzes (H2O2 und Luminol) im Verhältnis 1:1 gemischt. Die Mischung wird dann auf die Membranen (hintereinander) gegeben und für 1 abgedunkelt (Alufolie) unter Schwenken inkubiert. Die Detektion der Lumineszenz erfolgt unter Lichtausschluss (Deckel zu) mit der Kodak Station. Die Schwärzung der Punkte wird semi-quantitativ erfasst. 6.5 Zytotoxizitäts-Testung 1. Die Toxinlösung wird im Verhältnis 1:1.000 mit ddh2o verdünnt. Diese Toxinlösung wird im Verhältnis 1:1 mit den unverdünnten Antitoxinen bzw. ddh2o als Kontrolle versetzt. Als weitere Kontrolle werden je 5 µl der unverdünnten Antitoxine mit 5µl ddh2o versetzt. Alle Ansätze werden 10 auf Eis inkubiert. 2. Die Fibroblasten werden in einer 96-well-Platten kultiviert. Die Zellen werden mit den Toxin- bzw. Antikörperlösungen versetzt. Dafür werden je 2µl der Lösungen aus 2. zu je 200 µl Medium pro Ansatz gegeben. Ein Ansatz wird mit 2µl ddh2o versetzt. Die Tabelle zeigt das Schema. 3. Die Zellen werden für 4 Stunden bei 37 C und 5% CO2 inkubiert. 4. Nach der Inkubation erfolgt die Auswertung des Versuches mit dem Phasen-Kontrast-Mikroskop. Dazu wird von jedem Ansatz eine repräsentative Aufnahme mit der Digitalkamera des Mikroskops gemacht (Software: Kappa Image Base, Programm Control ). Zur Quantifizierung werden die

35 35 erhaltenen Bilder im Programm Metreo geöffnet. Durch Erzeugen eines Rasters erhält man 6 Quadranten, die dann ausgezählt werden. Man zählt zunächst die komplett abgerundeten Zellen und dann alle weiteren. Pro Aufnahme werden sechs Quadranten ausgezählt. Das höchste und niedrigste Ergebnis werden gestrichen; die übrigen vier Werte werden ausgewertet (Mittelwertbildung, Standardabweichung). Die prozentuale Abrundung [R%] wird berechnet: N(abgerundet) R % = x100 N(abgerundet) + N(weitere Zellen) 6.6 Zusammenfassung der Ergebnisse Bitte tragen Sie die Interaktionen / Neutralisation in semiquantitativer Erfassung ein: ++ starke Kreuzreaktivität / Neutralisation + Kreuzreaktivität besteht / Neutralisation 0 keine Kreuzreaktivität / Neutralisation TcdA Kontrolle Anti-TcdA Anti-TcdB Anti-TcsL TcdB TcsL 6.7 Diskussion 1. Keines der verwendeten Antitoxine blockiert die Glucosyltransferase-Aktivität der Toxins. Formulieren Sie Hypothesen, wie können die Anti-Toxine die zytotoxische Aktivität der Toxine im Zytotoxizitätsassay blockieren? 2. Welche weiteren (theoretischen) Möglichkeiten könnten Sie sich vorstellen, um die zytotoxische Wirkung der Toxine zu blockieren? Gehen Sie hierzu die einzelnen Schritte der Toxinaufnahme und prozessierung anhand Abb. 2 im Detail durch! 3. Auf welchen Zelltypen könnte die Inkubation der Antitoxine allein eine Wirkung zeigen? 4. Diskutieren Sie die Befunde der Antitoxintestung im Kontext derfunktionalen Domänenevaluation

36 36 Toxikologische Prüfung von Materialien Medizinprodukte und Bedarfsgegenstände Praktikumsort: Institut für Toxikologie (Direktor: Prof. Dr. med. Ingo Just) Gebäude I 6, Ebene 3, Raum Versuchsleiter: Prof. Dr. Harald Genth genth.harald@mh-hannover.de, Tel Allgemeine Hinweise: Mitzubringen sind: Kittel Ihre Vorbereitung sollte umfassen: Grundlagen der Zellkulturtechnik Physiologische und toxische Effekte von Schwermetallen Hintergrund 1 Medizinprodukte Unter Medizinprodukte fallen Dentalmaterialien, Implantate, Herzschrittmacher, Kanülen, Spritzen, Blutbeutel, Betten u.v.a. Medizinprodukte müssen seit Inkrafttreten des Medizinproduktegesetzes (MPG) am einer Reihe von verwendungsbezogenen Prüfungen unterzogen werden. Hierzu zählen: Prüfung auf Genotoxizität (DIN ISO ), Prüfung auf Wechselwirkung mit dem Blut (DIN ISO ) Prüfung auf Zytotoxizität (DIN ISO , Prüfung auf Irritation und Sensibilisierung (DIN ISO ) sowie mikrobiologische Prüfungen (z.b. die Prüfung auf Sterilität) ein. 2 Bedarfsgegenstände Bedarfsgegenstände werden in drei Gruppen eingeteilt: 1. Lebensmittelbezogene Bedarfsgegenstände (Geschirr, Küchenmaschinen) 2. Körperbezogene Bedarfsgegenstände (Kleidung, Schmuck) 3. Spielwaren und Scherzartikel Geregelt sind die Bedarfsgegenstände im Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetz, LFGB (früher LMBG) sowie weiteren Verordnungen, wie der Richtlinie über die Sicherheit von Spielzeug (88/378/EWG). Textilien und Lederwaren werden z.b. auf Schwermetalle oder Azofarbstoffe, die kanzerogene Amine abspalten können, getestet. Bei metallischen Gegenständen wie Modeschmuck oder Knöpfen spielt insbesondere die Abgabe von Nickel eine Rolle, da dieses häufig Kontaktallergien auslöst. Schwerpunkte der Sicherheitsprüfung von Spielzeugen bilden die Prüfung auf Speichel- und Schweißechtheit sowie die Bestimmung von Schwermetallen (z.b. Blei in Farben) und Weichmachern. 3 Das 3-R-Konzept in der Toxikologie Russel & Burch schlugen bereits vor mehr als 40 Jahren ein Konzept zur Verminderung von Tierversuchen in der experimentellen Biomedizin vor. Dieses Konzept wurde unter den Schlagworten Replace, Reduce, Refine bekannt. Diese Konzept zielt auf den Ersatz von Tierversuchen durch in vitro Methoden (insbesondere Zellkulturmethoden), um 1. die Zahl der Versuchstiere zu reduzieren 2. das Leiden der Tiere zu vermindern 3. die Versuchsprotokolle zu verbessern.

37 37 4 Prüfung auf Zytotoxizität Zu den Basistests von Medizinprodukten gehört neben der Prüfung auf Irritation und Sensibilisierung der Zytotoxizitätstest. Prüfmaterialien: Feste und flüssige Substanzen sowie Eluate. Prüfverfahren: Direktkontakt-Test Agardiffusions-Test Prüfziel: Nachweis von auslaugbaren toxischen Stoffen Endpunkte: Anfärbung der Zellen mit dem Vitalfarbstoff Neutralrot Morphologische Veränderung der Zellen als Maß für das zytotoxische Potential 5 Ziel des Versuches Anwendung des 3-R-Konzept in der Toxikologie Vor- und Nachteile von in vitro Testmethoden in der Toxikologie 6 Zeitplan Begrüßung Start der Testung Kolloquium Bestimmung der Endpunkte, Dokumentation, Quantifizierung Diskussion / Abschlussbesprechung 7 Durchführung des Direktkontakt-Testes Material: NIH3T3 Fibroblasten in einer 12-Loch Platte, Prüfmedium (Tyrodepuffer) Testgegenstände: Legostein, Billigschmuck, Einmalspritze, 1 cent Münze etc. Das Wachstumsmedium wird durch das Prüfmedium ersetzt. Die Testgegenstände werden mit einer Pinzette (nicht anfassen) direkt in die 12-Loch-Platte gegeben. Die Testgegenstände werden für 1-2 h in einer 12-Loch-Platte bei 37 C inkubiert. Die morphologischen Änderungen der Fibroblasten werden mittels Phasenkontrastmikroskopie erfasst. Anfärbung lebender Zellen mit Neutralrot 8 Diskussion Welche Aspekte toxikologischer Wirkungen lassen sich durch in vitro Testsysteme abbilden, welche nicht? Finden Sie in der Literatur ex vivo Testsysteme, die geeignet sind, Tierversuche in der Toxikologie zu vermeiden? 9 Literatur Marquardt & Schäfer, Lehrbuch der Toxikologie, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart, Russel & Burch, Principles of Human Experimental Technique, Methuen & Co. Ltd., London, 1959.

38 38 Immunhistochemische Untersuchungen von C3bot induzierten morphologischen Veränderungen in kultivierten hippokampalen Zellen Praktikumsort Institut für Toxikologie (Direktor: Prof. Dr. med. Ingo Just) Gebäude I6, Ebene 3, Raum 2070 Ansprechpartner Dr. Astrid Rohrbeck Sandra Hagemann Tel /-2844 Allgemeine Hinweis Bitte bringen Sie Kittel mit! Vorbereitung: Zur Vorbereitung sollten Sie sich mit folgenden Themengebieten vertraut machen: - Biochemie des Zytoskeletts (Aktin, Tubulin, Intermediärfilamente) - Signaltransduktionsvorgänge der kleinen GTPasen (Rho-Familie) - Grundlagen der Immunfluoreszenz - Kenntnis des Versuchablaufs Einleitung Clostridium botulinum C3 Exoenzym Das C3 Exoenzym von Clostridium botulinum ist namensgebend für die Familie der C3- ähnlichen ADP-Ribosyltransferasen. Das C3 Exoenzym hat ein Molekulargewicht von ca. 25 kda und überträgt eine ADP-Ribose des Cosubstrates NAD auf die Aminosäure Asparagin 41 der Zielproteine RhoA, B und C. Durch die Mono-ADP-Ribosylierung der Rho-GTPasen werden diese funktionell inaktiviert und es kommt nachfolgend zur Inhibition der Aktin- Polymerisierung (Aktories, 2004). Dies führt in Folge zu einer Umverteilung der Aktinfilamente einhergehend mit einer Depolymerisation der Aktin-Stress-Fasern, was zu deutlichen morphologischen Veränderungen führt. Anhand der morphologischen Veränderungen (Abb.1) kann gezeigt werden, dass eine C3- Behandlung eine Zellteilung (Cytokinese) verhindert wobei die Kernteilung (Karyokinese) scheinbar unverändert bleibt, was in Folge zu einer Mehrkernbildung führt. Bereits in vorangegangenen Studien wurde beschrieben, dass eine Depolymerisation des Aktinzytoskeletts zu einer Mehrkernbildung führt (Gachet, 2001). Daher ist zu vermuten, dass durch die C3-Behandlung eine Rho-abhängige Reorganisation des Aktinzytoskeletts verursacht wird. Diese Modifikation des Aktinzytoskeletts wirkt sich negativ auf die Ausbildung des kontraktilen Rings aus und beeinflusst den Zellzyklus. Neben der Mehrkernbildung ist aufgrund der C3-Behandlung auch ein multipolarer Phänotyp zu erkennen.

39 39 Abbildung 1: Morphologische Veränderung nach C3 Inkubation im Fluoreszenzmikroskop. Die obere Reihe zeigt die unbehandelten Kontrollzellen. In der mittleren und unteren Reihe sind die mit C3 behandelten Zellen dargestellt. In der mittleren Reihe ist exemplarisch eine Multikernbildung und in der unteren Reihe der multipolare Phänotyp gezeigt. Ziel des Versuches Visualisierung der C3-induzierten morphologischen Veränderungen. Bewertung der C3-induzierten Multikernbildung und scheinbar bipolaren Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Ablaufplan Uhr Begrüßung ca Uhr Waschen, Fixierung, Permeabilsierung und Blockierung der Zellen Kolloquium I Uhr Überführung der Deckgläschen Uhr 1.AK Inkubation Mittagspause Uhr Waschen und erneute Permeabilisierung Uhr 2.AK Kolloquium II Uhr Waschen, Antifade ca ab Uhr Mikroskopische Auswertung und im Anschluss Abschlussbesprechung (Die Zeiten können sich je nach experimentellen Gegebenheiten etwas nach hinten verschieben.) Durchführung - aussäen der HT22 Zellen auf Deckgläschen - 24h später altes Medium entfernen und Zellen vergiften (500nM C3botWT) - 24h bzw. 48h Inkubation bei 37 C, 5%CO 2

40 40 - nach Ablauf der C3-Inkubationsdauer altes Medium absaugen - Zellen mit 500μl kaltem PBS waschen - 20 Minuten mit 500μl 4% Paraformaldehyd in PBS bei Raumtemperatur fixieren - anschließend das Paraformaldehyd absaugen, die Zellen erneut dreimal mit 500μl kaltem PBS waschen - um die Zytoskelettstrukturen für die Fluoreszenzstoffe zugänglich zu machen, werden die Zellen für 5 Minuten mit 500μl 0,1-0,3% Triton X-100 in PBS permeabilisiert - um unspezifische Bindungen der Fluoreszenzstoffe zu vermeiden, folgt eine Inkubation mit 500μl 5% BSA in PBS für 30min (Blockierung) - 1.AK ansetzen (α-tubulin /Ratte; ZK, -20 C, Fach AK, gelbe Box): Verdünnung: 1:500 in 5% BSA - im Anschluss daran werden die Deckgläschen in eine mit Parafilm ausgelegte feuchte Kammer gelegt (Dabei ist darauf zu achten, dass die Oberseite der Deckgläschen mit den fixierten Zellen nach oben gelegt werden!!!) - 80μl 1.AK auf jedes Deckgläschen pipettieren - 1h bei RT inkubieren - anschließend die Zellen zweimal mit 80μl PBS waschen - nochmalige Inkubation mit 80μl 0,1-0,3% Triton X-100 für 5 Minuten - 2.AK ansetzten in 5% BSA, alle zusammen (z.b. 1000μl Gesamtvolumen): - Alexa 488 α-rat (Tubulin) 1:1000 = 1μl (ZK, 4 C, blau-rote Box, blaues Eppi) Rhodamin/Phalloidin (Actinfärbung) 1:1000 = 1μl (ZK, -20 C, AK s, grüne Box) Dapi (Kernfärbung) 1:100 = 10μl oder 20μl der Arbeitslösung (4 C) - 80μl der 2.AK-Lösung auf die Deckgläschen geben - Deckgläschen für 30min, abgedeckt mit Alufolie, stehen lassen - AK-Lösung absaugen und zweimal für fünf Minuten mit 80μl kaltem PBS und dann zweimal mit 80μl kalten 0,1 % TWEEN 20 in PBS waschen - zuletzt folgt noch ein Waschschritt mit 80μl Aqua dest. - um ein Ausbleichen der Fluoreszenz zu verhindern, werden 10μl des Antifade (Pro Long Antifade Kit) auf die Objektträger vorgelegt - Deckgläschen kurz abtropfen lassen und mit den Zellen nach unten auf das Antifade bzw. Objektträger legen (ggf Luftblasen vorsichtig rausdrücken) - nach einer Trocknungszeit von einigen Minuten bis einer Stunde werden die Ränder der Deckgläser mit Nagellack versiegelt (zur längeren Aufbewahrung) - die Objektträger bis zur Auswertung durch die Fluoreszenzmikroskopie dunkel und bei 4 C lagern - mikroskopische Auswertung erfolgt am Zeiss Axiovert 200 M Mikroskop Literatur 1 Aktories K, Wilde C, Vogelsgesang M, Rho-modifying C3-like ADP-ribosyltransferases Rev Physiol Biochem Pharmacol (2004) 152: Gachet Y, Tournier S, BA Miller J, Hyams JS, A MAP kinase-dependent actin checkpoint ensures proper spindle orientation in fission yeast; Nature (2001) 412,

41 41 Nervus Phrenicus-Zwerchfell-Präparat der Maus Versuchstier: 2 Mäuse, Stamm NMRI (Naval Marine Research Institute), ca. 30 g schwer Pharmaka Konzentration der Stammlösungmg/ml. (+)-Atracurium 10 Physostigmin 0,4 Suxamethoniumchlorid 20 Botulinum Neurotoxin A (BoNT/A) 100 U (=MLD, 500 pg). Nährlösung Krebs-Ringer-Lösung mit 11 mmol/l Glucose, Carbogen-durchspült (95 % O 2, 5 % CO 2 ). Apparaturen und Instrumente Apparatur für isolierte Organe mit Umlaufthermostat, 5 ml Badvolumen, 37 C. 1 Dehnungsmessstreifen zur isometrischen Registrierung der Kontraktionen (DMS- Aufnehmer) 1 PC 1 elektrisches Reizgerät 1 Halterung mit Reizelektroden Operationsbrett, Petrischalen, Präparierbesteck Versuchsvorbereitung Die Maus wird in CO 2 -Narkose durch Entbluten getötet. Danach wird die Maus in Rückenlage auf dem Operationsbrett fixiert, das Fell über dem Thorax nach Medianschnitt bis zur Wirbelsäule abgelöst und das Sternum entfernt. Anschließend wird die Brustwand linksseitig etwa 0,5 cm oberhalb des Zwerchfells horizontal durchtrennt und weitgehend herausgeschnitten. Aus präparatorischen Gründen wird lediglich der linke N. phrenicus sowie das linke Zwerchfell verwandt. Der linke N. phrenicus wird möglichst weit kopfwärts mit einem Faden angeschlungen, oberhalb der Schlinge durchtrennt und bis zum Zwerchfell vorsichtig freipräpariert. Der freipräparierte, angeschlungene Nerv wird zum Schutz vor Beschädigung und Austrocknung bei der Fortsetzung der Präparation in den Costodialphragmalwinkel gelegt. Das linke Zwerchfell wird dorsal von der Wirbelsäule gelöst, medial von der rechten Zwerchfellhälfte abgetrennt und dann mit dem Rippenbogen zur weiteren Feinpräparation in eine mit Puffer gefüllte Petrischale gelegt. Aus dem Zwerchfell wird unter Schonung des Nerven ein ca. 0,7 x 1,5 cm großer Abschnitt (vom Rippenbogen zum Centrum tendineum verlaufend) herausgetrennt. Das Zwerchfellpräparat wird nunmehr in der Versuchsapparatur zwischen einem Haken (Rippenbogen) und einer Klemme (Centrum tendineum) fixiert, wobei letztere über einen Faden mit dem Dehnungsmessstreifen verbunden ist. Schließlich wird der N. phrenicus schonend durch zwei Ringelelektroden gezogen. Danach wird das Präparat in das mit Krebs-Ringer-Lösung (carbogengesättigt, 37 C) gefüllte Organbad vollständig eingetaucht.

42 42 Prinzip der Registrierung Am N. phrenicus-zwerchfell-präparat der Maus, welches von BÜLBRING (1946) eingeführt wurde, kann demonstriert werden, dass die Hemmung der neuromuskulären Übertragung durch Muskelrelaxantien spezifisch in der Endplatte lokalisiert ist. Die Kontraktionen des Zwerchfells werden isometrisch über einen DMS-Aufnehmer auf dem PC registriert. Das Präparat wird indirekt über den Nerven gereizt. Die Reizung erfolgt mit Rechteckimpulsen bei einer Frequenz von 1 Hz und supramaximaler Intensität. Die Impulsdauer beträgt bei indirekter Reizung 0,1 ms. Durchführung des Versuchs Sofort nach Einhängen des Präparates in das Organbad wird mit der indirekten Reizung begonnen. Pharmakonhaltige Lösungen werden in der angegebenen Reihenfolge mit einer Pipette der Badflüssigkeit zugesetzt. Nach Eintritt des Effektes wird das Pharmakon durch mehrmaliges Wechseln der Badflüssigkeit ausgespült. Reihenfolge der Versuchsschritte Pharmakon Konzentration der Stammlösung (mg/ml) Erwünschte Endkonzentration in Badflüssigkeit (mg/ml) (bitte errechnen) Volumen der Stammlösung für 4 ml Badvolumen (μl) Maus 1 Zugabe von BoNT/A 500 pg ad 4 ml Maus 2 1. (+)-Atracurium nach Eintritt des Effektes spülen wenn indirekter Reizerfolg wiederherstellt 2. (+)-Atracurium nach ca. 15 min Physostigmin wenn indirekter Reizerfolg wiederherstellt, spülen nach ca. 15 min 3. Suxamethonium nach ca. 15 min Physostigmin nach ca. 10 min spülen 10 3 (3x1uL) 10 0,4 20 0,

43 43 Erläuterung der Ergebnisse 1. BoNT/A Die aus den Bakterium C. botulinum stammenden BoNT sind 150 KDa große Proteine, die nach einer Latenzzeit die Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) aus den präsynaptischen Nervenenden hemmen. Sie sind also periphere Muskelrelaxanzien, welche im Gegensatz zu den übrigen Pharmaka nicht den postsynaptischen Rezeptor blockieren, sondern hochspezifisch am Motorneuron angreifen. 2. (+)-Atracurium (+)-Atracurium hemmt die neuromuskuläre Übertragung am Skelettmuskel. Die direkte Reizung des Muskels wird durch Atracurium nicht behindert. Bei der Nervenreizung freigesetztes Acetylcholin führt zur Depolarisation der postsynaptischen Membran. Dadurch kommt es zum Entstehen eines Aktionspotentials, das über die gesamte Muskelfaser fortgeleitet wird und eine Kontraktion des Muskels zur Folge hat. Der Depolarisation liegen Permeabilitätsänderungen für kleine Ionen wie Na +, K + und Ca 2+ zugrunde. Atracurium zählt zu den nicht depolarisierenden Substanzen, da es am Acetylcholinrezeptor bindet, aber keine Permeabilitätsänderungen hervorruft. So kann die vorher wirksame indirekte elektrische Reizung bzw. das dabei freigesetzte Acetylcholin nicht mehr wirken. 3. Physostigmin Atracurium und Acetylcholin konkurrieren um denselben Rezeptor an der motorischen Endplatte. Dabei handelt es sich um einen kompetitiven Antagonismus. Bei Atracurium- Dosierungen, die gerade eine Blockierung der neuromuskulären Überleitung hervorrufen, kann durch Vermehrung der Acetylcholin-Moleküle am Rezeptor der kompetitive Antagonismus zwischen Atracurium und Acetylcholin zugunsten des Acetylcholins entschieden und damit eine Überleitung wieder herstellt werden. Eine Hemmung des raschen Acetylcholinabbaues durch reversible Hemmung der spezifischen, in der Basalmembran lokalisierten Cholinesterase (hier durch Physostigmin, aber auch Pyridostigmin, Neostigmin, Edrophonium) bewirkt eine Anhäufung von Acetylcholin im Gebiet des Rezeptors sowie eine Verdrängung von Atracurium, wodurch die neuromuskuläre Impulsübertragung wieder hergestellt wird.

44 44 4. Suxamethonium Suxamethonium wirkt auf die Membran der motorischen Endplatte ähnlich wie ACh, d.h. es depolarisiert die Membran. Da es aber im Gegensatz zu Acetylcholin nur sehr langsam durch Cholinesterasen inaktiviert wird, tritt in der Anfangsphase der Applikation eine Dauerpolarisierung ein. Obwohl Suxamethonium weiter auf die Endplatte einwirkt, kommt es im weiteren Verlauf zu einer Repolarisation der postsynaptischen Membran. Aufgrund einer Desensibilisierung der Acetylcholin-Rezeptoren ist die neuromuskuläre Übertragung weiterhin blockiert. Bei depolarisierenden Substanzen ist die Gabe von Cholinesterasehemmern nicht sinnvoll, da Acetylcholin und Suxamethonium beide depolarisierend wirken. Beziehungen zur praktischen Arzneimitteltherapie Aus den vorliegenden Versuchen ergeben sich wichtige Anwendungsmöglichkeiten für die praktische Therapie. Die vorgestellten Substanzen haben vor allem in der Anästhesie einen großen Einsatzbereich gefunden, da zu vielen operativen Eingriffen eine zuverlässige Muskelrelaxation eine wesentliche Voraussetzung ist. Wie die Praktikumsversuche zeigen, ist eine Blockade der neuromuskulären Erregungsübertragung und damit eine Muskelrelaxation durch zwei Typen von Pharmaka möglich. Muskelrelaxantien vom Typ des (+)-Atracuriums besetzen die postsynaptischen Acetylcholinrezeptoren und verhindern eine Depolarisation der postsynaptischen Membran durch ACh, sie führen damit zu einer elektrischen Stabilisierung der postsynaptischen Membran (Stabilitätsblock). Wegen geringer Nebenwirkungen (Kreislaufreaktionen, Histaminfreisetzung, Bronchokonstriktion) werden heute in der Praxis an Stelle von (+)- Atracurium vielfach andere Pharmaka mit gleichem Wirkungsmechanismus verwandt (z.b. Gallamin, Pancuronium). Sie alle werden unter dem Begriff der stabilisierenden oder besser nicht polarisierenden Muskelrelaxantien zusammengefasst. Ihre Wirkung kann durch Cholinesterasehemmer wie Physostigmin (Erhöhung der Acetylcholinkonzentration und kompetitive Verdrängung des Muskelrelaxans) wieder aufgehoben werden, was z.b. bei vorzeitigem Operationsabbruch oder Überdosierung von Bedeutung ist. Daneben kommen auch Pharmaka vom Wirkungstyp des Suxamethoniums in der Anästhesie zur Anwendung, die durch Besetzung der Acetylcholinrezeptoren eine länger dauernde Depolarisierung der postsynaptischen Membran und damit eine Hemmung der neuromuskulären Erregungsübertragung bewirken (Depolarisationsblock). Substanzen dieses Wirktyps werden als depolarisierende Muskelrelaxantien bezeichnet. Außerhalb der operativen Fächer haben Pharmaka dieses Typs bei der Behandlung von Tetanuskrämpfen ihre Anwendung gefunden. Für den praktischen Einsatz ist von Belang, dass der Depolarisationsblock nicht durch Cholinesterasehemmer antagonisiert werden kann. Während bei den bisher genannten Beispielen das therapeutische Ziel in einer passageren Unterbrechung der neuromuskulären Überleitung besteht, muss bei der Myastenia gravis eine Verbesserung der Überleitung angestrebt werden. Diese Erkrankung beruht auf einem offenbar autoimmunologisch bedingten Mangel an Acetylcholinrezeptoren. Cholinesterasehemmer wie Neostigmin verlängern die Wirkdauer von ACh im synaptischen Spalt und führen damit zu einer Verbesserung der neuromuskulären Impulsübertragung. BoNT/A wird bei chronischen lokal umschriebenen Muskelverkrampfungen (Blepharospasmus, zervikale Dystonien) eingesetzt. Es wirkt über 3-4 Monate, indem es den verkrampften Muskel paralysiert.

45 45 Einführung in die MS-basierte Proteinanalytik Betreuer: Prof Dr. Andreas Pich Tel.: , Unterstützung Karin Agternkamp / Karsten Heidrich Praktikumsort: Institut für Toxikologie, Gebäude I6, Ebene 3, Raum 2510 Allgemeiner Hinweis: Bitte bringen Sie Kittel mit! Bitte benutzen Sie Geräte nur nach Einweisung! Vorbereitung: Zur Vorbereitung sollten Sie sich mit folgenden Themengebieten vertraut machen: - Grundlagen der Massenspektrometrie - Versuchsablauf Einleitung Als Therapeutika zur Behandlung von Erkrankungen gewinnen Proteine und Peptide eine immer größere Bedeutung. Ihr Anteil unter neu zugelassenen Medikamenten ist stetig gestiegen und es ist zu erwarten, dass sich diese Entwicklung in den nächsten Jahren fortsetzt. Um Proteine bzw. Peptide derart zu nutzen, müssen diese nicht nur in großen Mengen, sondern auch in hoher Reinheit und Qualität produzierbar werden. Neben der biologischen Aktivität muss die Primärstruktur der Proteine überprüft werden. Dies erfolgt heutzutage ausschließlich mit massenspektroskopischen Techniken mit denen die Proteinsequenz und etwaige posttranslationale Modifikationen ermittelt werden und somit die Qualität des hergestellten Proteins bewertbar ist. Weiterhin wird die Massenspektrometrie zur Identifizierung unbekannte Proteine eingesetzt. Dies setzt natürlich die vorherige Isolierung der Proteine mittels Chromatographie oder Elektrophorese voraus. Zur massenspektrometrischen Analyse müssen Proteine in Lösung oder auch direkt im Gel mit einer Endoproteinase verdaut werden. Zumeist wird Trypsin verwendet, das spezifisch an der C-terminalen Seite von Lysin- und Argininresten die

46 46 Peptidbindung hydrolysiert. Die entstehenden Peptide weisen durchschnittlich eine Größe von Da auf, wobei es jedoch auch sequenzabhängig deutlich kleinere und größere Bruchstücke gibt. Die ermittelten Massen der tryptischen Peptide eines Proteins werden als peptide mass fingerprint (PMF) bezeichnet. Um die Sequenzen der Peptide zu ermitteln, kommen Massenspektrometer zum Einsatz mit denen MS/MS-Analysen möglich sind. Zunächst wird ein PMF für ein Proteins generiert. In einem zweiten Schritt wird eines der Peptide im Massenspektrometer isoliert, fragmentiert und die Massen der Bruchstücke werden bestimmt. Die Fragmentierung erfolgt spontan (post source decay PSD) oder kann durch den Einsatz eines Stossgases induziert werden (collision induced dissociation CID). Glücklicherweise zerbrechen Peptide am leichtesten an der Peptidbindung, so dass bei Bedingungen unter denen statistisch ein Peptidmolekül nur einmal fragmentiert eine Sequenzleiter im Massenspektrum zu sehen ist. Der Massenabstand der Peaks entspricht also jeweils genau der Masse der entsprechenden Aminosäure. So können Sequenzen bestimmt und Peptide bzw. Proteine identifiziert werden. In der Regel erhält man in einem PMF nur einen Teil der theoretisch vorhandenen Peptide und auch mit MS/MS-Techniken werden nur sehr selten alle Bruchstücke identifiziert. Dennoch lassen sich die meisten Proteine eindeutig identifizieren, da man die unvollständigen Massenspektren mit Datenbanken vergleichen kann, in denen alle bekannten Proteine und ihre theoretisch zu erwartenden Bruchstücke verzeichnet sind. Praktikumsaufgabe Jeder Praktikumsteilnehmer erhält eine Proteinbande deren Identität er im Laufe des Praktikums bestimmen soll. Im Vorfeld des Praktikums wurde eine SDS-PAGE mit den zu untersuchenden Proteinen von den Praktikumsbetreuern durchgeführt. Jeder Student erhält eine mit Coomassie brilliant Blue gefärbte Proteinbande. Das Protein wird im Gel durch die Endoproteinase Trypsin verdaut und die entstehenden Peptide werden aus dem Gel extrahiert. Im MALDI-TOF-MS oder einem anderen MS werden die Peptide analysiert und entsprechende MS und MS/MS-Spektren aufgenommen. Die Rohdaten werden dann mit einer Datenbanksuche den jeweiligen Proteinen zugeordnet. Wenn mit dem MALDI-TOF/TOF-MS gearbeitet wird, findet die Vorbereitung der Proben und der tryptische Verdau am ersten Tag am Nachmittag statt, die Extraktion der Peptide aus dem Gel und die nachfolgende MS-Analytik erfolgt am Morgen des zweiten Tages. Wenn mit einem LC-MS-Systemgemessen wird, wird wie oben beschrieben eine Probe vorbereitet, die dann allerdings der nächsten Gruppe zur Verfügung gestellt wird. Die zu

47 47 untersuchende Probe stammt aus dem MS-Labor oder von der vorherigen Gruppe. Geeignete Probenmengen werden 15 min scharf zentrifugiert, sofort in LC-vials umgefüllt und dann in das entsprechende MS hineingestellt und über Nacht automatisch gemessen. Am nächsten Tag werden die Rohdaten mit einer Datenbanksuche ausgewertet. Ablaufplan Zeit Thema 11 - C3 Exoenyme 1.Tag 13:00 Begrüßung und Einführung 13:30 Proteinbanden ausschneiden, entfärben, trocknen, Trypsin zugeben 14:00 Kolloquium: MS- MS/MS-Techniken, Praktikumsablauf 15:30 Ggf. Probenvorbereitung für LC-MS-Messung und 16:30 Ggf. Start LC-MS-System 2. Tag 9:00 Peptide aus dem Gel extrahieren und auf MALDI-Target auftragen 10:00 MS- MS/MS-Messung im ABSciex5800 MALDI-TOF/TOF 11:00 Auswertung der MS-Daten, Datenbankvergleiche 12:00 Abschlußbesprechung Material und Methoden Materialien Skalpell, Eppendorf-Reaktionsgefäße, Pipetten und Spitzen Lösungen A) 50 % Acetonitril B) Acetonitril C) 50 mm Ammoniumhydrogencarbonat, ph 8,5 D) 50 mm Ammoniumhydrogencarbonat, ph 8,5, 10 % Acetonitril E) Trypsin 10 ng/ l in 50 mm Ammoniumhydrogencarbonat, ph 8,5, 10 % Acetonitril F) Matrix: -Cyano-Hydroxy-Zimtsäure, gesättigte Lösung 1:5 verdünnt in 50 % Acetonitril, 0,2 % TFA, 10 mm Diamoniumhydrogenphosphat

48 48 Tryptischer Verdau 1) Coomassie-gefärbte Bande genau ausschneiden 2) In 0,5-ml-E-cup überführen und 2 x 1 min bei RT mit 100 l Ammoniumhydrogencarbonat waschen 3) 100 l 50 % Acetonitril zugeben und 30 min bei 37 C schütteln. Wiederholen, bis die Bande entfärbt ist 4) Zugabe von l Acetonitril (je nach Bandengröße), 5 min Inkubation bei RT bis das Gelstück milchig weiß aussieht (ggf. wiederholen) 5) Entfernen des Acetonitril und trocknen im Vakuum (Speed-Vac) 6) 20 l Trypsin-Lösung auf das trockene Gelstück geben und ca. 30 min auf Eis inkubieren 7) restliche Trypsinlösung entfernen und durch ausreichend Ammoniumhydrogencarbonat-, 10 % Acetonitril-Puffer (ca l) ersetzen 8) Probe bei 37 C über Nacht inkubieren 9) Probe kurz zentrifugieren, flüssigen Überstand abnehmen. In der Regel enthält dieser Überstand ausreichend Peptide, um eine verlässliche MS- bzw. MS/MS-Messung anzufertigen. Höhere Ausbeuten vor allem für größere Peptide erzielt man durch Extraktion des Gelstücks. A) das Gelstück wird mit 0,5 % TFA und 10 % Acetonitril, für 30 min geschüttelt. Der Überstand wird abgenommen und zu dem wässrigen Überstand gegeben, der nach dem Verdau abgenommen wurde B) anschließend wird das Gelstück durch Zugabe von 80 % Acetonitril 0,5 % TFA ausgedrückt und der Überstand abgenommen. C) Die Überstände von Schritt 9, A und B werden vereinigt, in der Speedvac eingetrocknet und in ca. 5 l 5 % Acetonitril, 0,2 % TFA aufgenommen. Die Schritte A und B werden im Praktikum nicht durchgeführt.

49 49 Massenspektrometrische Messung 1) Von jeder Probe werden 1,0 l auf einen Spot eines anchor-targets aufgetragen und sofort auf dem target mit 1,0 l Matrix-Lösung versetzt, gemischt durch vorsichtiges hin-und her-pipettieren und zum Trocknen stehen gelassen (ca. 5 min). 2) Direkt neben die zwei Probenspots werden 0,5 l eines Peptidstandards aufgetragen, ebenfalls mit Matrix-Lösung versetzt und getrocknet. 3) Das target wird in das Ultraflex MALDI-TOF/TOF-Massenspektrometer eingeschleust und die Probe gemessen. 4) Die Messung und Auswertung der MS-Daten wird mit den Software-Paketen Flex-Control, Flex-Analysis und Biotools unter Anleitung durchgeführt. Diskussion und Fragen Warum wird nach Zugabe der Trypsinlösung auf Eis inkubiert und die überschüssige Lösung durch Puffer ersetzt? Welche Ionentypen entstehen in erster Linie beim post source decay? Warum gibt man im Massenspektrometer gemessene Daten als m/z und nicht in Dalton an? Wie werden Peptide bei einer MALDI-Messung ionisiert? Wo spaltet Trypsin im Protein, wann kann es nicht spalten, obwohl die entsprechende Aminosäure vorhanden ist? Wieso werden die Proteine vor dem Verdau mit Acrylamid oder Jodacetamid behandelt? Welche weiteren Ionisierungstechniken kennen Sie? Literatur 2) Aebersold R, Mann M Mass spectrometry-based proteomics Nature. (2003) 422:

50 50 Anhang Zählen von Zellen in der Neubauer Zählkammer Die Neubauer Zählkammer besteht aus neun Großquadraten. Jedes Quadrat hat eine Fläche von 1mm². Es wird mindestens eines der äußeren Großquadrate ausgezählt. Besser ist es, alle vier äußeren Großquadrate auszuzählen. Berechnung: Meist ist die Angabe in Zellen / ml Medium, daher werden die ausgezählten Zellen auch in Zellen / ml berechnet. Sie haben die äußeren 4 Großquadrate gezählt. Sie bilden die Summe aller gezählten lebenden Zellen. Summe / 4 x 10 = Anzahl der Zellen in 1 μl x 1000 = Zellen / ml Wenn sie mit Trypanblau die toten Zellen angefärbt haben, dann haben sie die Zellsuspension verdünnt. Dann ergibt sich: Summe / 4 x 2 x 10 = Anzahl der Zellen in 1 μl x 1000 = Zellen / ml Haben sie die Suspension, die sie auszählen, vorverdünnt, geht dieser Faktor ebenfalls in die Berechnung ein.