Molekularsystematische Studien in der Subtribus Thrinacinae, mit besonderer Berücksichtigung der Gattung Trachycarpus H. Wendl.

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1 Molekularsystematische Studien in der Subtribus Thrinacinae, mit besonderer Berücksichtigung der Gattung Trachycarpus H. Wendl. (Arecaceae) Diplomarbeit im Studienfach Biologie vorgelegt von Chris Stührk Biozentrum Klein Flottbek und Botanischer Garten Hamburg, 2006

2 Gutachter: Prof. Dr. Hans-Peter Mühlbach Prof. Dr. Jens G. Rohwer

3 I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis III Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis VII 1 Einleitung Die Familie der Arecaceae Subtribus Thrinacinae Becc. (1907) Die Gattung Trachycarpus H. Wendl. (1861) Fragestellung ITS Analyse AFLP, RAPD, ISSR & cpssr AFLP Analyse 20 2 Material und Methoden Material Pflanzenmaterial und Herkunft Chemikalien und Enzyme Behandlung von Geräten und Lösungen DNA-Längenmarker Oligonucleotide (ITS) Oligonucleotide für AFLP Analyse Methoden Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen Karyologische Untersuchungen Molekularbiologische Untersuchungen DNA-Isolierung Gelelektrophorese Konzentrationsbestimmungen von DNA-Lösungen Polymerase-Kettenreaktion für die ITS Untersuchungen Aufreinigung der PCR Produkte Sequenzierungsreaktion Fällung der Sequenzreaktion Auftrennung der Sequenzreaktion 33

4 II Auswertung der Sequenzen Phylogenetische Analyse AFLP Restriktionsverdau Ligation der Adapter Präamplifikation Selektive Amplifikation Längenstandards für den ALF TM express Aufbau des Polyacrylamidgels Probenvorbereitung und Beladung des Gels Gellauf am automatischen Sequenzierer Auswertung der AFLP-Gele am Computer Berechnung der Daten 42 3 Ergebnisse Morphologische Untersuchungen Karyologische Untersuchungen ITS Ergebnisse der ITS Analyse AFLP Ergebnisse der AFLP Analyse Phylogramme der AFLP Analyse 53 4 Diskussion Diskussion der morphologischen Untersuchungen Diskussion der karyologischen Untersuchungen Diskussion der ITS Analyse Diskussion der AFLP Analyse Diskussion der AFLP Analyse und ITS Analyse 78 5 Zusammenfassung Zusammenfassung Abstract 86 6 Literaturverzeichnise 88 7 Anhang 95 8 Danksagung Eidesstattliche Erklärung 129

5 III Abkürzungsverzeichnis AFLP amplified fragment length polymorphism bp Basenpaar cf. conferre, vergleiche! cpdna Chloroplasten-DNA cpssr Chloroplasten simple sequence repeats Cy5 Indodicarbocyanin-Fluorochrom DAPI Diamidino-2-phenylindol DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dntp Desoxynukleotid-5 -Triphosphat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure et al. et alteri/et alii (und andere) ISSR inter simple sequence repeats ITS internal transcribed spacer µm mikromolar ma milliampere ng Nanogramm NJ Neighbor-joining nm Nanometer PCR polymerase chain reaction pers. Mitt. Persönliche Mitteilung pg Picogramm Primerkombi A Primerkombination Eco ATG + Mse AAT Primerkombi B Primerkombination Eco ATG + Mse AGG RAPD random amplified polymorphic DNA REM Rasterelektronenmikroskop RNA Ribonukleinsäure RNAse Ribonuklease SSR simple sequence repeats TBE Tris-Borat-EDTA Tris Tris-(Hydroxymethyl-)Aminomethan

6 IV UPGMA unweighted pair group method using arithmetic averages Upm Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett µm Mikrometer v/v Volumen pro Volumen w/v Gewicht pro Volumen

7 V Abbildungsverzeichnis Abbildung 1.1: Verbreitung der Arecaceae welweit. 1 Abbildung 1.2: Strict consensus tree der trnl-trnf Analyse von Baker et al. (1999). 4 Abbildung 1.3: Strict consensus tree der kombinierten rps16 und trnl-trnf Analyse von Asmussen et al. (2000). 5 Abbildung 1.4: Typische Blattsegmenteinteilung von Fächerpalmen. 7 Abbildung 1.5: Hastula-Typen verschiedener Fächerpalmen 8 Abbildung 1.6: Prophyll einer Infloreszenz einer Fächerpalme (Schippia). 9 Abbildung 1.7: Eophyll (erstes Sämlingsblatt) von Phoenix. 9 Abbildung 1.8: Verbreitung der Thrinacinae weltweit. 10 Abbildung 1.9: Trachycarpus takil im Habitat, Oktober Abbildung 1.10: Oval-kaffeebohnenförmige Samen der Trachycarpus sp. Nagaland 16 Abbildung 1.11: Reniforme Samen der Trachycarpus geminisectus. 16 Abbildung 1.12: Trachycarpus fortunei Typuspflanze in den Royal Botanic Gardens, Kew. 17 Abbildung 1.13: Relative Lage der ETS, ITS- und IGS Abschnitte innerhalb eines rdna Operons. 19 Abbildung 2.1: Die relative Lage der ITS Primerbinderegionen schematisch. 23 Abbildung 3.1: Epicuticulare Wachsablagerungen auf der Unterseite eines Blattsegments von Trachycarpus NagaHills # Abbildung 3.2: Epicuticulare Wachsabsonderung im Querschnitt von Trachycarpus NagaHills # 43 (REM, Schrägansicht). 44 Abbildung 3.3: Epicuticulare Wachsabsonderung in Aufsicht von Trachycarpus NagaHills # 43 (REM). 44 Abbildung 3.4: Epicuticulare Wachsabsonderung in Nahansicht von Trachycarpus NagaHills # 43 (REM). 45 Abbildung 3.5: Trachycarpus princeps # 2 (Typuspflanze) im BG Hamburg 46 Abbildung 3.6: DNA-Histogramm von Trachycarpus nanus # Abbildung 3.7: DNA-Histogramm von Trachycarpus fortunei x takil # Abbildung 3.8: DNA-Histogramm von Trachycarpus takil # Abbildung 3.9: DNA-Histogramm von Trachycarpus takil # Abbildung 3.10: Phylogramm der exhaustive search Analyse (ITS). 50 Abbildung 3.11: ITS Bootstrap 50% majority-rule consensus tree (100 replicates). 51

8 VI Abbildung 3.12: Phylogramm 5 des Sets Abbildung 3.13: Phylogramm 6 des Sets Abbildung 3.14: Phylogramm 9 des Sets Abbildung 3.15: Phylogramm 10 des Sets Abbildung 3.16: Phylogramm 11 des Sets Abbildung 3.17: Phylogramm 12 des Sets Abbildung 3.18: Gesamtphylogramm 1 der Sets 3, 5 und Abbildung 3.19: Gesamtphylogramm 2 der Sets 3, 5 und Abbildung 3.20: Gesamtphylogramm 3 der Sets 3, 5 und Abbildung 3.21: Gesamtphylogramm 4 der Sets 3, 5 und Abbildung 4.1: Ansichtskarte aus Lugano (1913). 72 Abbildung 4.2: Ansichtskarte aus Lugano (1927). 72 Abbildung 4.3: Die Verteilung der Kontinente vor ca. 135 Millionen Jahren. 74 Abbildung 4.4: Verbreitung der T. princeps entlang des Nujiang (Yunnan, China) 79 Abbildung 4.5: Herbarblatt (Holotyp) der Trachycarpus takil Becc. 80 Abbildung 7.1: Phylogramm 1 des Sets Abbildung 7.2: Phylogramm 2 des Sets Abbildung 7.3: Phylogramm 3 des Sets Abbildung 7.4: Phylogramm 4 des Sets Abbildung 7.5: Phylogramm 7 des Sets Abbildung 7.6: Phylogramm 8 des Sets Abbildung 7.7: Phylogramm 13 des Sets Abbildung 7.8: Phylogramm 14 des Sets Abbildung 7.9: Phylogramm 15 des Sets Abbildung 7.10: Phylogramm 16 des Sets Abbildung 7.11: Phylogramm 17 des Sets Abbildung 7.12: Phylogramm 18 des Sets Abbildung 7.13: Phylogramm 19 des Sets Abbildung 7.14: Phylogramm 20 des Sets

9 VII Tabellenverzeichnis Tabelle 1.1: Klassifikation der Arecaceae nach Dransfield und Uhl. 2 Tabelle 1.2: Subtribus Thrinacinae. 10 Tabelle 1.3: Kurzbeschreibungen der Arten der Gattung Trachycarpus. 11 Tabelle 2.1: Bezeichnung und Sequenz der verwendeten ITS-Primer. 23 Tabelle 2.2: Primer zur Amplifikation des Internen Standards nach Rudolph (2001). 24 Tabelle 2.3: AFLP-Adapter nach Vos et al. (1995). 24 Tabelle 2.4: AFLP-Primer nach Vos et al. (1995). 25 Tabelle 2.5: Primerkombinationen zur Herstellung von PCR-Produkten definierter Länge. 39 Tabelle 3.1: Gesamtzahl detektierter Banden und Anteil monomorpher Banden aus sieben Sets der Primerkombination Eco ATG + Mse AAT. 52 Tabelle 3.2: Gesamtzahl detektierter Banden und Anteil monomorpher Banden aus sieben Sets der Primerkombination Eco ATG + Mse AGG. 52 Tabelle 7.1: Gesamtaufsammlung nach laufender Labornummer geordnet. 95 Tabelle 7.2: Gesamtaufsammlung alphabetisch. 98 Tabelle 7.3: Gesamtaufsammlung Thrinacinae alphabetisch. 102 Tabelle 7.4: Angaben und Koordinaten der Herkünfte. 105 Tabelle 7.5: Händler- und Sammlerverzeichnis. 106 Tabelle 7.6: Taxa der ITS Analyse. 107 Tabelle 7.7: Sets der AFLP Analyse (Primerkombinationen und Taxa). 108 Tabelle 7.8: Chemikalienliste. 112

10 Einleitung 1 1 Einleitung 1.1 Die Familie der Arecaceae Die Palmen (Arecaceae oder auch Palmae) sind eine Familie der Monokotylen (Liliopsida) und einzige Familie der Ordnung der Palmenartigen (Arecales), die schon vor etwa 70 Millionen Jahren in der Kreidezeit weit verbreitet war. Die Arecaceae zeigen einen pantropischen Verbreitungsschwerpunkt, vor allem im malesischen Raum und in Amazonien. Relativ artenarm an Palmen dagegen ist Afrika, wie die Abbildung 1.1 veranschaulicht. Abbildung 1.1: Verbreitung der Arecaceae weltweit (Lötschert, 1985). Die Angaben über die Anzahl der Palmenarten variieren zwischen und 3.500, und über die der Gattungen zwischen 210 und 236 (Jones, 2000). In der Familie der Palmen findet sich das längste Blatt (bei Palmen der Gattung Raphia mit bis zu 25 m Länge), der größte Same (von der Seychellenpalme Lodoicea mit bis zu 22 kg Gewicht), sowie die blütenreichste terminale Infloreszenz (des Pflanzenreichs in der Gattung Corypha mit geschätzten 10 Millionen Blüten pro Infloreszenz). Das Ziel einer allumfassenden

11 Einleitung 2 Klassifikation der Palmen, eines Genera Palmarum, verfolgte Harold E. Moore Junior vom L.H. Bailey Hortorium der Cornell University. Moore verstarb 1980, bevor sein Werk vollendet werden konnte. Die Aufzeichnungen wurden jedoch von John Dransfield von den Royal Botanical Gardens Kew und Nathalie Uhl von der Cornell University verwendet, um die erste umfassende Monographie aller bekannten Palmengattungen fertig zu stellen, die unter dem Namen Genera Palmarum A classification of palms based on the work of Harold E. Moore, Jr. erschien (Uhl et al., 1987). Nach dieser Klassifikation werden die Arecaceae in sechs Unterfamilien gegliedert, mit 200 Gattungen und ca Arten. Tabelle 1.1 veranschaulicht dieses Konzept. Tabelle 1.1: Klassifikation der Arecaceae nach Dransfield und Uhl (Uhl et al., 1987). Unterfamilie Tribus Beispiele von Gattungen Coryphoideae Corypheae Phoeniceae Borasseae Brahea, Chamaerops, Corypha, Livistona, Sabal, Trachycarpus Phoenix Borassus, Hyphaene, Latania, Lodoicea Calamoideae Calameae Calamus, Metroxylon, Raphia, Salacca, Lepidocaryum Lepidocaryeae Nypoideae Nypa Ceroxyloideae Cyclospatheae Ceroxyleae Hyophorbeae Pseudophoenix Chamaedorea, Ceroxylon Hyophorbe Arecoideae Caryoteae Iriarteeae Podococceae Areceae Cocoeae Geonomeae Arenga, Caryota Iriartea Podococcus Archontophoenix, Areca, Chrysalidocarpus, Cyrtostachys, Euterpe, Howea, Roystonea Bactris, Cocos, Elaeis, Jubaea, Orbignya, Syagrus Geonoma Phytelephantoideae Phytelephas

12 Einleitung 3 Nach neueren molekularen Studien sind die Corypheae (Coryphoideae), Podococceae, Areceae und Cocoeae (Arececoideae) keine monophyletischen Gruppen. Henderson (2002) unterteilt die Cocoeae in nonspiny cocosoids und in spiny cocosoids. Die nonspiny cocosoids entsprechen den Subtriben Beccariophoenicinae, Butiinae, Attaleinae und Elaeidinae. Für diese Gruppe gibt es keine offensichtliche Apomorphie. Jedoch bilden die spiny cocosoids, die der Subtribus Bactridinae entsprechen, eine monophyletische Gruppe, die durch Dornen und knochiges Endokarp gestützt wird. Untersuchungen der größten Tribus der Palmen, der Areceae, mit Hilfe zweier nukleärer low-copy Gene, der Malatsynthase (MS) und Phosphoribulokinase (PRK) ergaben, dass die Subtriben Iguanurinae, Dypsidinae, Oncospermatinae und Arecinae polyphyletische Gruppen bilden (Lewis & Doyle, 2002). Eine Untersuchung der trnl-trnf Region der cpdna der Arecaceae (Baker et al., 1999) erbrachte eine basale Polytomie in der Innengruppe, besonders in der Unterfamilie Coryphoideae (Abb. 1.2). Jedoch formten in dieser Studie die neuweltlichen Thrinacinae eine moderat unterstützte monophyletische Gruppe mit einem Jackknife Wert von 86%. Die altweltlichen Thrinacinae dagegen konnten nicht aufgelöst werden, bis auf Chamaerops humilis L., welche als Schwester von Phoenix reclinata Jacq. auflöste mit einem Jackknife-Wert von 88%. Die Thrinacinae, welche zu den Fächerpalmen gehören, sind aufgrund des Blütenbaues (apokarpe Karpelle) mit den Phoeniceae (Fiederpalmen) verwandt. Die Thrinacinae zeichnen sich durch eine recht ursprüngliche trimere Blüte aus (Uhl et al., 1987).

13 Einleitung 4 Thrinacinae Abbildung 1.2: Strict consensus tree der trnl-trnf Analyse von Baker et al. (1999). Zahlen unterhalb der Zweige stellen Jackknife Werte dar. Die Analyse von Baker et al. (1999) konnte nicht alle Unterfamilien stützen, die im Genera Palmarum (Uhl et al., 1987) vorgeschlagen wurden. Die Unterfamilie Arecoideae bildet keine monophyletische Gruppe. Caryota, Wallichia, Arenga und Iriartea bilden einen vom Rest der Arecoideae getrennten clade. Eine Studie, basierend auf einer Kombination der Sequenzen des rps16 Introns und des trnl-trnf spacers (beides cpdna), ergaben eine etwas bessere Auflösung, auch wenn die Kerngruppe der

14 Einleitung 5 Coryphoideae nicht weiter aufgelöst werden konnte (Asmussen et al., 2000, siehe Abb. 1.3). Thrinacinae Thrinacinae Abbildung 1.3: Strict consensus tree der kombinierten rps16 und trnl-trnf Analyse von Asmussen et al. (2000). Zahlen unterhalb der Zweige stellen Jackknife Werte dar.

15 Einleitung Subtribus Thrinacinae Becc. (1907) Die Subtribus Thrinacinae gehört zur Tribus Corypheae, Unterfamilie Coryphoideae. Vierzehn Gattungen werden dieser Subtribus zugerechnet. Tabelle 1.2 gibt die Gattungen der Thrinacinae wieder, deren Zahl der Arten und ungefähre Verbreitung (Dransfield & Uhl, 1998). Davon sind acht Gattungen neuweltlich und sechs Gattungen altweltlich. Rhapidophyllum hystrix wird - obwohl in Florida beheimatet - zur altweltlichen Gruppe gerechnet (Shuey & Wunderlin, 1977). Die hauptsächlichen evolutionären Trends in der neuweltlichen Gruppe sind die Reduktion der Karpelle auf eines und die Reduktion des Perianths zu einer einzelnen Cupula. In der altweltlichen Gruppe sind die Haupttrends der Spezialisierung der Diözie und Fusion der Segmente des Perianths. Die Thrinacinae sind pollakanth und besitzen palmate oder costapalmate Blätter, die in der Regel induplikat sind, nur bei Guihaia reduplikat (siehe Abb. 1.4). Die Hastula ist adaxial gut entwickelt, oftmals dreieckig, abaxial dagegen klein oder ganz fehlend (siehe Abb. 1.5, Rhapis). Die Infloreszenzen sind interfoliar inseriert, jede trägt ein tubuläres bicarinates (zweifach gekieltes) Prophyll und keine bis (gewöhnlich) sieben pedunculäre Brakteen (siehe Abb. 1.6). Die Antheren sind latrors. Die Pollenkörner sind elliptisch, sulkat (pantoperkulat in Chamaerops, gelegentlich trichotomosulcat in Cryosophila) mit einer feinen reticulaten oder seltener tectaten Exine. Die Karpelle sind frei, gewöhnlich sind es drei, seltener eins bis vier. Das Endosperm ist homogen und in Chamaerops ruminiert. Die Eophylle (siehe Abb. 1.7) sind einfach und bifid in Chelyocarpus (Uhl et al., 1987). Abbildung 1.8 zeigt die Verbreitung auf einer Weltkarte.

16 Einleitung 7 Abbildung 1.4: Typische Blattsegmenteinteilung von Fächerpalmen (Uhl et al., 1987).

17 Einleitung 8 Abbildung 1.5: Hastula-Typen verschiedener Fächerpalmen (Uhl et al., 1987).

18 Einleitung 9 Abbildung 1.6: Prophyll einer Infloreszenz einer Fächerpalme (Schippia) (Uhl et al., 1987). Abbildung 1.7: Eophyll (erstes Sämlingsblatt) von Phoenix (Uhl et al., 1987). Tabelle 1.2: Subtribus Thrinacinae (Dransfield & Uhl, 1998).

19 Einleitung 10 Gattung # Arten Verbreitung 1. Trithrinax Mart. 4 Bolivien, S Brasilien 2. Chelyocarpus Damm. 4 Bolivien, Brasilien, Peru 3. Cryosophila Blume 10 W Mexiko, NO Kolumbien 4. Itaya H. E. Moore 1 Peru, Brasilien 5. Schippia Burret 1 Belize, Guatemala 6. Thrinax O. Swartz 7 Jamaika, Karibik, Kuba 7. Coccothrinax Sargent 49 Kuba 8. Zombia L.H. Bailey 1 Hispaniola 9. Trachycarpus H. Wendl. 6 S Himalaya, N Thailand, China 10. Rhapidophyllum H. Wendl. & Drude 1 SO USA 11. Chamaerops L. 1 W Mittelmeer 12. Maxburretia Furtado 3 Malaysia, S Thailand 13. Guihaia J. Dransf., SK. Lee & F.N. Wei 2 S China, N Vietnam 14. Rhapis L. f. ex W. Aiton 12 S China, Indochina, Thailand Abbildung 1.8: Verbreitung der Thrinacinae weltweit (Uhl et al., 1987). 1.3 Die Gattung Trachycarpus H. Wendl. (1861) Der Name Trachycarpus stammt aus dem Griechischen und leitet sich von trachos = rauh und karpos = Frucht ab. Trachycarpus ist solitär, in der Regel diözisch, manchmal polygamo-diözisch. Die Chromosomenzahl beträgt n = 18 (Uhl et al., 1987). Die Gattung Trachycarpus umfasst je nach Autor sechs bis neun Arten (Kimnach, 1977;

20 Einleitung 11 Uhl et al, 1987; Jones, 2000). Die World Checklist of Monocotyledons (Govaerts & Dransfield, 2006) gibt acht Arten an. Beccari (1931) hat in seiner Revision der Gattung Trachycarpus, die bereits bekannten Arten T. martianus und T. excelsa (= T. fortunei) ausführlicher sowie T. takil, T. wagnerianus, T. nanus und T. caespitosa neu beschrieben. In den 90iger Jahren des letzten Jahrhunderts und Anfang dieses Jahrhunderts wurden T. princeps, T. oreophilus, T. latisectus und T. geminisectus neu beschrieben (Gibbons et al., 1995, 2003; Gibbons & Spanner, 1997, 1998; Spanner et al., 1997). Die Typusart ist Trachycarpus fortunei (Hook.) H. Wendl. Tabelle 1.3 fasst kurz die Arten und deren hauptsächliche morphologische Unterscheidungsmerkmale aus den Beschreibungen zusammen. Die floralen Strukturen unterscheiden sich in den Beschreibungen kaum. Trachycarpus wagnerianus Becc. wird von Govaerts & Dransfield (2006) inzwischen als Synonym von Trachycarpus fortunei (Hook.) H. Wendl. angesehen. Ebenso wird die horstbildende T. caespitosa Becc. nicht akzeptiert; vermutlich handelte es sich um mehrere zusammen gepflanzte Exemplare, die nur den Eindruck eines Horstes erweckten. Tabelle 1.3: Kurzbeschreibungen der Arten der Gattung Trachycarpus. Spezies Blätter Stamm Frucht und Same T. fortunei H. Wendl. T. takil Becc. (Fortsetzung nächste Seite) ½ bis ¾ kreisförmig. Segmente zerteilen das Blatt sehr tief und unregelmäßig. Auf jeden sehr tiefen Einschnitt folgen 2-3 weniger tief eingeschnittene Segmente. Segmente 50 bis 90 cm lang. Blattdurchmesser ca. 90 cm bis 1,5 m. ½ bis ¾ kreisförmig. Segmente zerteilen das Blatt unregelmäßig etwas tiefer als bis zur Hälfte. Segmente 50 bis 90 cm lang. Blattdurchmesser ca. 90 cm bis 1,5 m. Dicht mit Fasern bedeckt, teilweise wollig. Alte Blätter und Blattbasen verbleiben permanent am Stamm. Im hohen Alter kann der untere Teil des Stammes auch nackt sein. Max. Stammhöhe: m. Dicht mit eng anliegenden Fasern bedeckt. Alte Blätter und Blattbasen verbleiben permanent am Stamm. Im hohen Alter kann der untere Teil des Stammes auch nackt sein. Max. Stammhöhe m. Frucht bläulich, Samen nierenförmig, ca. 12 mm lang. Frucht bläulich, Samen nierenförmig, ca. 12 mm lang.

21 Einleitung 12 T. wagnerianus Becc. (Synonym: T. fortunei) T. princeps M. Gibbons, T.W. Spanner & San Y. Chen ½ bis ¾ kreisförmig. Segmente zerteilen das Blatt sehr tief und unregelmäßig. Auf jeden sehr tiefen Einschnitt folgen 2-3 weniger tief eingeschnittene Segmente. Segmente ca cm lang. Blattdurchmesser ca cm. ½ bis ¾ kreisförmig. Segmente teilen das Blatt ziemlich regelmäßig bis zur Hälfte Segmente, cm lang. Durchmesser ca cm. Dicht mit Fasern bedeckt, teilweise wollig. Alte Blätter und Blattbasen verbleiben permanent am Stamm. Im hohen Alter kann der untere Teil des Stammes auch nackt sein. Max. Stammhöhe: ca m. Mit alten Blattbasen bedeckt oder völlig nackt mit nur wenigen alten Blättern direkt unter der Krone. Höhe bis 10 m. Frucht bläulich, Samen nierenförmig, ca. 12 mm lang. Frucht hellgelb, wenn reif. Samen 6 mm lang und 9 mm breit. T. oreophilus M. Gibbons & T.W. Spanner T. geminisectus Spanner, Gibbons, V.D. Nguyen & T.P. Anh T. nanus Becc. (Fortsetzung nächste Seite) ¾ bis vollkreisförmig, ca. 70 cm lang gemessen von der Hastula. Ca. 100 cm im Durchmesser. Die etwa 60 steifen und tief gefalteten Segmente teilen die Blattfläche ziemlich regelmäßig bis etwas tiefer als zur Hälfte. fächerförmig, ¾ bis völlig kreisförmig, und ca. 85 cm lang gemessen von der Hastula, sowie 130 cm breit. Sehr lederig, oberseits, und wachsig unterseits. Ca. 40 Blattsegmente teilen das Blatt auf einer Länge von ¾ oder tiefer. Sie sind auf der ganzen Länge in Gruppen von 2, selten 3 Segmenten ungeteilt verbunden. Blattsegmente steif, auf der Unterseite bläulich bereift. Die Blattsegmente teilen das Blatt bis zu einer Entfernung von 5 10 cm zur Hastula. Blatt etwas kleiner als T. fortunei. Schlanker, aufrechter, bis zu 10 Meter hoher, unbefaserter, nackter Stamm, mit bräunlicher Farbe und einem Durchmesser von 10 bis 16 cm, der bei noch jungen Exemplaren gelegentlich auch noch mit alten Blattbasen bedeckt ist. Kleinwüchsig, vermutlich erreicht der Stamm nur eine Höhe von 2 Metern und ist umhüllt von dauerhaften, faserigen Blattscheiden, welche einen Durchmesser von ca. 25 cm haben. Buschartiger Wuchs, oder nur kleiner, meist unterirdischer Stamm. Frucht grün, wenn unreif Die Samen sind reniform, breiter als lang (ca. 6 mm lang und 11 mm breit). reniform, breiter als lang, mit homogenem Endokarp Samen ausgeprägt nierenförmig. 10 mm breit und 7 mm dick.

22 Einleitung 13 T. ukhrulense Lorek & Pradhan T. martianus H. Wendl. T. latisectus T.W. Spanner, Noltie & M. Gibbons ¾ kreisförmig, steife Segmente, 2 3,5 cm breit, teilen das Blatt unregelmäßig 1/3 bis 2/3 tief, Segmente, weißlichbläulich auf Unterseite bereift, Oberseite grün. ¾ kreisförmig, ca. 60 bis 80 cm lang von der Hastula bis zur Spitze der mittleren Blattsegmente. Die Blätter werden durch die Segmente regelmäßig bis etwa zur Blatthälfte geteilt, zumindest die mittleren der insgesamt ca. 60 Blattsegmente. Danach werden die Einschnitte ins Blatt allmählich tiefer. ¾ bis völlig kreisförmig, cm lange Segmente, je 3,5 bis 5 cm breit, Blattdurchmesser cm. Ledrig, mit weißem Tomentum bedeckt. Segmente teilen das Blatt sehr regelmäßig bis zur Hälfte 8 Meter hoch, meist nackt bis ca. 1,5 m unterhalb der Krone. Dort dann mit Blattbasen und rauen Fasern bedeckt. Durchmesser bis 30 cm. Schlank, m hoch, aufrecht oder auch verdreht, größtenteils nackt, da die älteren Blätter vom Stamm fallen. Halbkugelförmige Blätterkrone, unterhalb derer ein kurzes Stück des Stammes aber noch mit kurzen alten Blattbasen besetzt ist, welche an den Rändern in ein Netz aus Fasern übergehen, das diesen Teil des Stammes eng umspannt. schlanker, aufrechter, bis 12 Meter hoher, nackter, hellgrauer Stamm, der sichtbare Ringe zeigt. Durchmesser bis 17 cm, in einem Bereich von 0,6 bis 2 Metern unterhalb der Blattkrone mit alten, faserigen Blattbasen bedeckt. Gelb bis braun, wenn reif. reniform, ca. 10 mm lang, 7 mm breit. Frucht gelb, wenn reif. Konvex auf der Rückseite mit einer tiefen Furche über fast die gesamte Länge der Vorderseite (wie eine Kaffeebohne), länglichelliptisch, länger als breit mm lang, 7-8 mm breit, leicht abgeflacht, gleichmäßig an beiden Seiten gerundet. Frucht gelblich-braun wenn reif mm lang. Konvex auf der Rückseite mit einer tiefen Furche über fast die gesamte Länge der Vorderseite (wie eine Kaffeebohne) mm lang, länglich-oval, länger als breit. Trachycarpus wagnerianus unterscheidet sich von T. fortunei durch kleinere Blätter und kürzeren Petiolus. Trachycarpus takil Becc. (Abb. 1.9) ist endemisch in Kumaon, Indien und kommt in Höhenlagen bis zu 2400 m vor (Beccari, 1931). Diese Spezies ist selten und wurde in Indien unter Schutz gestellt (Singh et al., 1995). Trachycarpus martianus und Trachycarpus latisectus bilden kaffeebohnen- oder dattelförmige Samen (Abb. 1.10) aus, der Rest der Gattung dagegen reniforme (nierenförmige) Samen (Beccari, 1931; Abb. 1.11). Trachycarpus ukhrulense aus Manipur wurde 2004 näher beschrieben (Lorek & Pradhan, 2004). Zuvor war diese Herkunft unter den Arbeitsnamen Trachycarpus Manipur und Trachycarpus Naga Hills bekannt. In der Online-Version der World Monocot Checklist of Monocotyledons (Govaerts & Dransfield, 2006) taucht diese Art jedoch nicht auf. Der Typus der T. fortunei (Hook.) H. Wendl. steht heute noch in den Royal Botanic Gardens von Kew und wurde 1846 aus China eingeführt (Baker, pers. Mitt., siehe Abb. 1.9).

23 Einleitung 14 Die ornamentale Hanfpalme Trachycarpus fortunei H. Wendl. ist eine häufige Erscheinung an den vom Golfstrom umspülten Küsten Irlands, Cornwalls und der Bretagne. Jedoch erreicht Trachycarpus auch in der Bundesrepublik in milden Lagen ein reproduktionsfähiges Alter, welches durchschnittlich nach 10 Jahren eintritt. Adulte Blätter dieser Art zeigten erste Schädigungen zwischen -11 C und -14 C im Experiment (Larcher, 1980; Larcher & Winter, 1981; Larcher & Sakai, 1987). Auf der Krim wurden Schäden an Trachycarpus im Winter 1949 nach 35 Tagen Dauerfrost und Tiefsttemperaturen von -17 C festgestellt, die diese jedoch überlebten (Saakov, 1963). Eine ähnliche Frostresistenz besitzt Sabal minor (Jacq.) Pers., die im Südosten der Vereinigten Staaten von Amerika beheimatet ist. Walther berichtet (2003) von einem massiven Vordringen von Trachycarpus und weiterer laurophyller Arten in die Kraut- und Baumschicht des Kantons Tessin seit einigen Dekaden. Dieses ist ein weiterer Beleg für die fortschreitende Klimaerwärmung, die vom Third assessment report des Intergovernmental Panel On Climate Change (IPCC) dokumentiert und von der Mehrheit der Wissenschaftler anerkannt wird (IPCC, 2001). Wildstandorte von Trachycarpus fortunei sind unbekannt, aber im subtropischen China ist sie überall kultiviert zu finden. Kommerziell werden die Fasern zu Umhängen, Besen, Bürsten und Fußmatten verarbeitet (Jones, 2000).

24 Einleitung 15 Abbildung 1.9: Trachycarpus takil im Habitat, Oktober 2005 (Foto: Tobias W. Spanner, Kalamuni, westlicher Himalaya).

25 Einleitung 16 Abbildung 1.10: Oval-kaffeebohnenförmige Samen der Trachycarpus sp. Nagaland (unbeschrieben). Abbildung 1.11: Reniforme Samen der Trachycarpus geminisectus.

26 Einleitung 17 Abbildung 1.12: Trachycarpus fortunei Typuspflanze in den Royal Botanic Gardens, Kew (Foto: Bill Baker, Kew).

27 Einleitung Fragestellung Es sollte die Frage geklärt werden, welche Arten bzw. Gruppen innerhalb der Gattung Trachycarpus existieren und dazu neben den beschriebenen Arten weitere neue unbeschriebene Herkünfte von Trachycarpus in dieser Arbeit phylogenetisch untersucht werden. Bisher gibt es hierzu keine molekularen Untersuchungen. Seltene Arten wie T. takil, welche unter Schutz gestellt wurden (Singh et al., 1995), könnten mit einem genetischen Fingerabdruck leichter identifiziert werden, da im nordindischen Habitat T. fortunei zu Zierzwecken in räumlicher Nähe zu T. takil kultiviert wird und somit Hybridisierungen zwischen diesen beiden Arten nicht ausgeschlossen werden können (Singh et al., 1995). Als erster Ansatz einer molekularen Charakterisierung der Gattung Trachycarpus und einiger Vertreter der Thrinacinae wurden ITS Untersuchungen gewählt und durchgeführt. In einem zweiten Ansatz wurden AFLP Untersuchungen mit weiteren Trachycarpus Herkünften und weiteren Thrinacinae durchgeführt. 1.5 ITS Analyse Die ribosomale DNA (rdna) ist im Kerngenom lokalsiert und kodiert für die Ribosomen. Sie wird biparental vererbt. Da die Ribosomen unentbehrlich für die Proteinbiosynthese sind, sind sie in allen Organismen in großen Mengen vorhanden. Bedingt durch ihre Schlüsselfunktion sind die für die Ribosomen kodierenden Gene hoch konserviert, während die dazwischen geschalteten Intergen-Regionen eine hohe Mutationsrate und somit eine hohe Variabilität aufweisen können. Bedingt durch diese Eigenschaften, bietet die rdna ein geeignetes Werkzeug für phylogenetische Analysen, oder allgemeiner, zur Aufklärung von Verwandtschaftsverhältnissen in und zwischen fast allen systematischen Kategorien. (Baldwin et al., 1995; Soltis & Soltis, 1998; Hershkovitz & Zimmer, 1996). Das rdna Operon ist in sechs Abschnitte gegliedert (Abb. 1.13): - Die ETS Region (external transcribed spacer) - das für die kleine Ribosomenuntereinheit kodierende 18S Gen - die nicht kodierende ITS1 Region - die kodierende 5,8S Region (Komponente der großen Ribosomenuntereinheit) - die nicht kodierende ITS2 Region - das für die große Ribosomenuntereinheit kodierende 26S Gen

28 Einleitung 19 Auf die 26S Einheit folgt der non transcribed spacer (NTS), auch intergenic spacer genannt, welcher ein Operon von dem nächsten trennt. Dieses Motiv wird vielfach tandemartig wiederholt, bis zu rdna Operons können auf diese Weise aufeinander folgen. Abbildung 1.13: Relative Lage der ETS, ITS- und IGS Abschnitte innerhalb eines rdna Operons (Soltis & Soltis, 2000). Bedingt durch ihre erforderliche Funktionalität, sind die 18S, 5.8S und 26S rdna Regionen hoch konserviert und eignen sich potentiell für Untersuchungen hoher taxonomischer Ränge (Soltis & Soltis, 1999). Da die ITS1 und ITS2 Region lediglich transkribiert, aber nicht translatiert werden und Mutationsereignisse somit im Regelfall nicht letal sind, können Mutationen in viel stärkerem Maße akkumuliert werden, womit sie wiederum für Untersuchungen zur Phylogenie und Systematik niedriger taxonomischer Ränge von Interesse sind. Als Ursachen der konzertierten Evolution von Genfamilien, sind hauptsächlich Genkonversionen, gefolgt von wiederholten inäqualen crossing-over Ereignissen zu sehen (Dover, 1982). Die diversen Kopien einer Genfamilie können bedingt durch diese Prozesse, innerhalb eines Genoms vollständig homogenisiert werden. Bezogen auf die ITS Region (ITS1, 5,8S und ITS2), bedeutet das, das alle Genkopien innerhalb eines Organismus identisch sein können. Trotz ihres biparentalen Vererbungsmodus können sie sich, ebenfalls durch konzertierte Evolution, auch innerhalb aller kreuzbaren Individuen einer Art angleichen. Dies sollte im Idealfall zu einer einzigen identischen ITS Sequenz innerhalb einer Art führen. Es aber ebenfalls möglich, dass eine Organismengruppe,

29 Einleitung 20 gemessen an der Zeitskala der Evolution, erst im Artbildungsprozess begriffen ist und die Prozesse der konzertierten Evolution noch nicht abgeschlossen sind (Mayol & Rosselló, 2001). Dies kann zu einem verfälschten phylogenetischen Signal führen, bedingt durch das Vorhandensein von Pseudogenen, paralogen Genen und auch infraspezifischen Polymorphismen. So weisen z.b. innerhalb der Arecaceae die Unterfamilie Calamoideae einen hohen Grad an Polymorphie auf (Baker et al., 2000, siehe auch Kap. 4.3). 1.6 AFLP, RAPD, ISSR & cpssr Im Rahmen einer Vorstudie zu dieser Arbeit wurden weitere DNA-Marker, die innerhalb der Gattung Trachycarpus eine weitere Auflösung auf Populationsebene ermöglichen sollten von Dipl.-Biol. Sabrina Schmidt getestet. Getestet wurden AFLP (Zabeau & Vos, 1993; Vos et al., 1995), RAPD (Williams et al., 1990), ISSR (Litt & Luty, 1989; Weber & May, 1989; Zietkiewitz et al., 1994) und cpssr Marker (Wang et al., 1994; Provan et al., 2001). Als Methode der Wahl erwiesen sich AFLP, da sie die beste Reproduzierbarkeit und Auswertmöglichkeit zeigten. 1.7 AFLP Analyse Zur Analyse der Verwandtschaftsverhältnisse innerhalb einer Art werden auch sog. AFLPs ( amplified fragment length polymorphisms, Zabeau & Vos, 1993) verwendet. AFLPs sind hypervariable Marker, die viele individuelle Loci in einer Reaktion amplifizieren (Gillet, 1999). Die DNA wird mit Restriktionsenzymen geschnitten, die überhängende Enden ( sticky ends ) erzeugen. Dabei erkennt eines der Restriktionsenzyme vier Basenpaare lange Sequenzen ( frequent cutter ), die statistisch im Genom alle 256 bp vorkommen. Ein weiteres Restriktionsenzym, das sechs Basenpaare erkennt und schneidet ( rare cutter ), kommt statistisch alle 4096 bp im Genom vor. Nach dem Doppelverdau werden an die überhängenden Enden der DNA Adapter mit einer bekannten Sequenz ligiert. Diese dienen in einer PCR den Primern als Ansatzstelle. Durch Verwendung zusätzlicher Basen an den Primern wird die Zahl der zu amplifizierenden Banden selektiv verringert. Bei je drei selektiven Basen pro Primer wird die Gesamtzahl der Fragmente um das 64fache reduziert. Diese Selektion erfolgt in zwei aufeinander folgenden PCR- Reaktionen, der Präamplifikation und der selektiven Amplifikation. Die PCR-Produkte

30 Einleitung 21 werden mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt. Auf einem Polyacrylamidgel können die Fragmente auf eine Base genau aufgetrennt werden. Diese Auftrennung der AFLPs erfolgt an einem automatischen Sequenzierer. Dabei ermöglicht eine Fluoreszenzmarkierung an dem Primer, der komplementär zum rare cutter Enzym ist, die Detektion von Fragmenten, die mindestens eine Schnittstelle dieses seltener schneidenden Restriktionsenzyms enthalten. Die oft vorkommenden Fragmente, die nur durch das frequent cutter Enzym geschnitten wurden, werden dadurch nicht erfasst. Aus dem Bandenmuster der AFLPs wird eine binäre Matrix aufgebaut, die als Grundlage zur Berechnung von Distanzmatrizen und Distanzbäumen dienen. AFLP Analysen wurden erfolgreich an Cocos nucifera (Perera et al., 1998; Teulat et al., 2000), Euterpe edulis (Cardoso et al., 2000) und Bactris gasipaes Populationen (Adin, et al., 2004) durchgeführt (siehe auch Kap. 4.4).

31 Material und Methoden 22 2 Material und Methoden 2.1 Material Pflanzenmaterial und Herkunft Die Liste des für diese Arbeit verwendeten Pflanzenmaterials befindet sich im Anhang mit Angaben zur Herkunft und zum Sammler bzw. Händler. Soweit vorhanden, wurden die genauen Herkünfte in Tabelle 7.4 im Anhang mit Koordinaten spezifiziert. Das Lebendmaterial befindet sich im Palmengewächshaus des Botanischen Gartens Klein Flottbek. Das Herbarmaterial besteht aus getrockneten Blattsegmenten. Frische Blattproben wurden nach Erhalt auf Silica Gel getrocknet. Die Proben wurden mittels einer Stereolupe (Wild Heerbrugg, Heerbrugg, Schweiz) auf Pilz und Parasitenbefall untersucht und gereinigt Chemikalien und Enzyme Eine Chemikalienliste ist im Anhang (Tab. 7.8) aufgeführt. Die verwendeten Chemikalien hatten den Reinheitsgrad pro analysis Behandlung von Geräten und Lösungen Lösungen und Geräte wurden für 20 min bei 121 C und 2 x 10 5 Pa zur Dekontamination und Nukleaseinaktivierung sterilisiert, sofern sie hitzestabil waren. Hitzelabile Lösungen wurden steril filtriert. Das eingesetzte Wasser wurde mit der Wasseraufbereitungsanlage Milli-RX 45 Water Purifikation System (Millipore Corporation Bedford, MA, USA) demineralisiert und anschließend wie oben beschrieben sterilisiert DNA-Längenmarker Als DNA-Längenmarker wurden für Agarosegele alternativ Smart Ladder (Eurogentec, Köln) oder der 1 kb Ladder von GeneCraft (Münster) für die Agarosegele verwendet.

32 Material und Methoden Oligonucleotide (ITS) Die Sequenzen der ITS-Primer sind in Tabelle 2.1 aufgeführt. Tabelle 2.1: Bezeichnung und Sequenz der verwendeten ITS-Primer. Name Sequenz von 5 nach 3 Autor ITS 1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG White et al., 1990 ITS 4 TCCTCCGCTTATTGATATGC White et al., 1990 Synthetisiert wurden die Primer von der Firma Sigma Genosys (Steinheim). Die lyophilisierten Primer wurden in sterilem Wasser gelöst, die Lagerung erfolgte bei 20 C. Die Konzentration der Primerstammlösungen betrug 100 µm, die der Arbeitslösungen 10 µm. Die Ansatzstellen der Primer im Genom/ and die genomische DNA sind in der Abbildung 2.1 dargestellt. Jeder spacer ist in Angiospermen typischerweise weniger als 300 bp lang (Baldwin et al., 1995). Das 18S Gen besitzt eine Länge von 1800 bp, das 26S Gen eine Länge von 3300 bp und das 5,8S Gen ist 160 bp lang (Soltis & Soltis, 2000). ITS 1 ITS 4 Abbildung 2.1: Die relative Lage der ITS Primerbinderegionen schematisch (modifiziert nach: Oligonucleotide für AFLP Analyse Für die AFLP-Analysen wurden Oligos verwendet, die zum einen als Adapter für die Restriktionsschnittstellen dienten. Zum anderen wurden Oligos als Primer für die sog. Präamplifikation, die selektive Amplifikation, sowie für die Herstellung von internen Standards zum Abgleich der Polyacrylamidgele benötigt. Die Zusammenstellung der Primerkombinationen für die Herstellung des internen Standards erfolgte nach Rudolph (2001). Die Sequenzen der Oligos sind in den Tabellen 2.2 bis 2.4 aufgeführt. Je ein

33 Material und Methoden 24 Primer für die PCR zur Herstellung des internen Standards sowie für die selektive Amplifikation waren Cy5-markiert. Dieser Indodicarbocyanin-Fluorochrom-Farbstoff kann von dem Laser des automatischen Sequenzierers (ALFexpress, Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) erkannt, und damit die markierten PCR-Produkte detektiert werden. Alle verwendeten Primer wurden von der Firma Sigma-ARK (Steinheim) synthetisiert. Tabelle 2.2: Primer zur Amplifikation des Internen Standards nach Rudolph (2001). Primer Sequenz 5 3 Verwendung KS TCG AGG TCG ACG GTA TC Primer für den 71 bp Standard M13seq GTA AAA CGA CGG CCA GT Primer für den 140 bp Standard M13seqCy5 GTA AAA CGA CGG CCA GT Cy5-markierter Primer für den 300 bp Standard M300 ACC CCA GGC TTT ACA CTT TA Primer für den 300 bp Standard SKCy5 CGC TCT AGA ACT AGT GGA TC Cy5-markierter Primer für den 71, 140 bp Standard Tabelle 2.3: AFLP-Adapter nach Vos et al. (1995). Adapter Sequenz 5 3 Verwendung AdEcoO CTC GTA GAC TGC GTA CC Adapter zur Ligation an die EcoRI- Schnittstelle AdEcoU AAT TGG TAC GCA GTC TAC Adapter zur Ligation an die EcoRI- Schnittstelle AdMseO GAC GAT GAG TCC TGA G Adapter zur Ligation an die MseI- Schnittstelle AdMseU TAC TCA GGA CTC AT Adapter zur Ligation an die MseI- Schnittstelle

34 Material und Methoden 25 Tabelle 2.4: AFLP-Primer nach Vos et al. (1995). Primer Sequenz 5 3 Markierung Verwendung PEcoRI+A GAC TGC GTA CCA ATT CA - Präamplifikationsprimer passend EcoRI-Adapter, +A als selektive Base PMseI+A PEcoRI+C PMseI+C GAT GAG TCC TGA GTA AA GAC TGC GTA CCA ATT CC GAT GAG TCC TGA GTA AC - Präamplifikationsprimer passend MseI-Adapter, +A als selektive Base - Präamplifikationsprimer passend EcoRI-Adapter, +C als selektive Base - Präamplifikationsprimer passend MseI-Adapter, +C als selektive Base SEcoRI+ATG SMseI+AAT SEcoRI+ACG SMseI+ATG SMseI+ACA GAC TGC GTA CCA ATT CAT G GAT GAG TCC TGA GTA AAA T GAC TGC GTA CCA ATT CAC G GAT GAG TCC TGA GTA AAT G GAT GAG TCC TGA GTA AAC A Cy5 Primer für die Selektive Amplifikation mit 3 selektiven Basen, fluoreszenzmarkiert - Primer für die Selektive Amplifikation mit 3 selektiven Basen Cy5 Primer für die Selektive Amplifikation mit 3 selektiven Basen, fluoreszenzmarkiert - Primer für die Selektive Amplifikation mit 3 selektiven Basen - Primer für die Selektive Amplifikation mit 3 selektiven Basen

35 Material und Methoden 26 SEcoRI+CC SMseI+CC SMseI+CG SEcoRI+CG SMseI+AGG GAC TGC GTA CCA ATT CCC GAT GAG TCC TGA GTA ACC GAT GAG TCC TGA GTA ACG GAC TGC GTA CCA ATT CCG GAT GAG TCC TGA GTA AAG G Cy5 Primer für die Selektive Amplifikation mit 3 selektiven Basen, fluoreszenzmarkiert - Primer für die Selektive Amplifikation mit 3 selektiven Basen - Primer für die Selektive Amplifikation mit 3 selektiven Basen Cy5 Primer für die Selektive Amplifikation mit 3 selektiven Basen, fluoreszenzmarkiert - Primer für die Selektive Amplifikation mit 3 selektiven Basen Zur Herstellung der Primerstammlösungen wurden die lyophilisierten mit sterilem Wasser auf eine Konzentration von 100 µm gebracht und kräftig gemischt. Die Stammlösung wurde übernacht bei 4 C resuspendiert, bevor Arbeitslösungen angesetzt wurden. Die Arbeitslösungen wurden in unterschiedlichen Konzentrationen angesetzt: Die Konzentrationen der Primer für die Prä- und die selektiven Amplifikationen betrugen 50 µm, mit Ausnahme der Cy5-markierten Primer. Hier lag die Konzentration bei 2 µm. Die Lagerung der Primerlösungen erfolgte bei 20 C.

36 Material und Methoden Methoden Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen Zum Studium der epicuticularen Wachse auf der abaxialen Seite der herbarisierten Palmenblätter wurden rasterelektronische Aufnahmen angefertigt. Hierzu wurde das Material mit einem Sputter (Bal-Tec Sputter-Anlage SCD 050, Witten) mit Gold bedampft (40 ma, 200 sec). Die so präparierten Proben konnten mit dem REM (Philipps XL-20, Fei Company, Oregon, USA) aufgenommen werden Karyologische Untersuchungen Die Durchflußzytometrie (engl.: Flow Cytometry, kurz: FCM) ist eine Methode zur automatisierten Differenzierung und Zählung von Zellen und Mikropartikeln. Zellen in Suspension passieren in einem engen Strom eine Durchflußküvette. Die hochempfindliche Interaktionszone ist hierbei der Schnittpunkt zwischen dem Probenstrom und einem bzw. mehreren fokussierten Lichtstrahlen (Laser, UV-Lampe) oder einem elektrischen Feld. Optische (Streulicht, Fluoreszenz) oder elektrische Signale werden sequentiell für jeden einzelnen Partikel bzw. jede einzelne Zelle generiert. Diese Signale werden optoelektronisch detektiert und in Form einer Zellverteilung angezeigt. Messungen nukleärer DNA Mengen putativer Hybriden wurden im Labor der Abteilung Ökologie und Nutzpflanzenbiologie von Frau Dr. Schwarz mittels eines Flowcytometers (PA-II, Partec, Münster, siehe: ) nach Angaben des Herstellers vorgenommen. Die Kerne wurden mit DAPI, einem Fluorochrom, ATspezifisch gefärbt. Als Referenz wurde der 4C-Wert = 22,18 pg von Trachycarpus nanus verwendet (Röser et al., 1997). Der C-Wert (1C-Wert) eines Genotyps ist die DNA-Menge des unreplizierten haploiden Chromosomensatzes. Ein diploider Nucleus (2n = 2x) zu Beginn der Prophase und ein tetraploider Nucleus (2n = 4x) in der frühen Interphase enthalten beide eine DNA-Menge von 4C (Durka, 2002).

37 Material und Methoden Molekularbiologische Untersuchungen DNA-Isolierung Die genomische DNA wurde mit dem Invisorb Spin Plant Mini Kit der Firma Invitek (Berlin) isoliert. Die DNA Isolierung wurde modifiziert nach dem Protokoll von Rohwer & Rudolph (2005) durchgeführt. Etwa 30 mg getrocknetes Blattmaterial wurde unter Zugabe von flüssigem Stickstoff und einer Spatelspitze Seesand im Mörser mit einem Pistill zerrieben. Das fein gemahlene Blattmaterial wurde in ein Reaktionsgefäß überführt. Alternativ wurde für den physikalischen Aufschluss des Blattmaterials eine Retschmühle (Retsch GmbH, Haan) verwendet. Hierzu wurde das Material in safe-lock Reaktionsgefäße der Firma Eppendorf (Wesseling-Berzdorf) überführt und jeweils zwei Stahlkugeln zugegeben. Die safe-lock Reaktionsgefäße wurden vor dem Einsetzen in die Retschmühle in flüssigem Stickstoff gefroren. Für den chemischen Aufschluss wurden 400 µl Lysispuffer P sowie 4 µl Proteinase K (10 mg/ml) dazugegeben und kurz gemischt. Die Proben wurden für 30 min bei 65 C in einem Heizblock inkubiert und gelegentlich gemischt. Für den RNA-Verdau wurde das Lysat mit 40 µl RNase (10 mg/ µl) versetzt, kurz gemischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Lysat wurde 1 min bei Upm und Raumtemperatur (RT) zentrifugiert (Biofuge fresco, Rotor: , Heraeus, Hanau) und der Überstand auf die Säulen pipettiert. Diese wurden 1 min bei Upm und RT zentrifugiert. Dem Filtrat wurden 200 µl Bindepuffer P zugesetzt und gründlich gemischt. Die Suspension wurde auf eine neue Säule gegeben und 1 min inkubiert. Für 1 min wurde bei Upm und RT zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen und die Säule wieder auf das Reaktionsgefäß gesetzt. Anschließend wurde auf die Säule 550 µl Waschpuffer I pipettiert, 1 min bei Upm (RT) zentrifugiert und das Filtrat verworfen. Auf die Säule wurde 550 µl Waschpuffer II pipettiert, 1 min bei Upm (RT) zentrifugiert und das Filtrat wieder verworfen. Um den restlichen Alkohol zu entfernen, wurde 2 min bei Upm und RT zentrifugiert. Zur Elution der DNA wurden auf die Säulen 50 µl auf 65 C vorgewärmter Elutionspuffer gegeben und 5 min bei RT inkubiert. Die Proben wurden 2 min bei Upm und RT zentrifugiert. Zur Erhöhung der Ausbeute wurden auf die Säulen weitere 50 µl des vorgewärmten Elutionspuffers pipettiert, diese ein weiteres Mal für 5 min bei RT inkubiert, 2 min bei Upm und RT zentrifugiert. Die eluierte DNA-Lösung wurde bei 4 C gelagert.

38 Material und Methoden Gelelektrophorese Zur quantitativen und qualitativen Überprüfung der DNA Isolierung wurden jeweils 2 µl Probe zusammen mit 2 µl Ladepuffer auf einem 0,8%igen Agarosegel, angesetzt in 0,5x TBE aufgetragen und mittels einer Gelelektrophorese Kammer aufgetrennt. Als Marker wurden die in Kapitel erwähnten Längenstandards verwendet. Die Elektrophorese wurde in einer Mini-Sub Cell GT der Firma BioRad Laboratories GmbH (Karlsruhe) durchgeführt. Als Laufpuffer diente 0,5x TBE. Die Elektrophorese erfolgte bei 70 V für 30 min. Das Agarosegel wurde im Ethidiumbromidbad etwa 10 min gefärbt und anschließend im Wasserbad circa 10 min entfärbt. Das Ergebnis wurde unter UV-Licht (UVP Transilluminator, Kodak, Upland, USA) analysiert und mittels Digitalkamera (Olympus, Camedia Zoom 5050, Hamburg) dokumentiert. 5x TBE-Puffer, ph 8,4 (Sambrook & Russel, 2001) Tris 890 mm Borsäure 890 mm EDTA 20 mm Ladepuffer 30% Glycerin (v/v) 0,25% Bromphenolblau (w/v) Ethidiumbromidbad Ethidiumbromid-Stammlösung 10 mg/ml 75 µl Ethidiumbromid-Stammlösung in 250 ml H 2 O bidest.

39 Material und Methoden Konzentrationsbestimmungen von DNA-Lösungen Neben der AbschÄtzung der DNA-Konzentration im Agarosegel nach FÄrbungsintensitÄt des LÄngenmarkers wurde die DNA-Konzentration photometrisch mit einem Bio- Photometer (Eppendorf, Hamburg) gemessen. Hierbei wurde die optische Dichte der DNA bei einer WellenlÄnge von 260 nm gemessen. Die Berechnung der DNA-Konzentration erfolgte nach folgender Formel: C DNA = 50 x (A 260 Å A 260/ 0 ) x VerdÇnnung [Ég/ Él] 1000 = 50 x ÑA260 x VerdÇnnung [Ég/ Él] 1000 Diese Berechnungen fçhrte das Photometer automatisiert durch. Die QualitÄt der DNA wird durch das VerhÄltnis A 260 nm/ A 280 nm ausgedrçckt. Die Ratio sollte zwischen 1,8 und 2,0 liegen. Zur Messung wurden 5 Él der DNA-LÖsung in 45 Él (VerdÇnnung 1:10) Tris-HCl (ph 9,0) verdçnnt und kräftig 30 sec gemischt. Der Leerwert wurde mit dem reinen Puffer abgeglichen. Die Messung wurde dreimal wiederholt und der Mittelwert berechnet. FÇr die Populationsanalysen wurden die DNA-LÖsungen auf 30 ng/él mit H 2 O bidest. verdçnnt Polymerase-Kettenreaktion für die ITS Untersuchungen Zur VervielfÄltigung des zu untersuchenden DNA Abschnitts wurden PCR Analysen mit den in Kapitel angefçhrten Primer durchgefçhrt. Der Reaktionsansatz wurde in einem Volumen von 10 Él wie folgt zusammengestellt:

40 Material und Methoden 31 Reaktionsansatz 1x Puffer (zur Biotherm Polymerase von GeneCraft, Münster) 5 mm MgCl 2 1% DMSO 0,2 mm dntps 0,1 µm Primer F 0,1 µm Primer R 0,5 U Biotherm DNA-Polymerase (GeneCraft) 1 µl DNA (10 bis 30 ng/ µl) Die Polymerase-Kettenreaktionen wurden im Thermocycler der Firma Biometra, Göttingen, Typ T personal oder T gradient durchgeführt. Es wurde eine Touch-down - PCR durchgeführt. Das Programm durchlief 39 Zyklen nach folgendem Schema, wobei die Schritte mal durchlaufen wurden: 1. initiale Denaturierung bei 95 C für 4 min 2. Denaturierung bei 95 C für 30 sec 3. Annealing bei 50 C für 30 sec, bei jedem weiteren Zyklus -0,1 C 4. Elongation bei 72 C für 60 sec, bei jedem weiteren Zyklus + 5 sec C für 6 min Die PCR-Produkte wurden nach Abschluss der Reaktion im Thermocycler bei 10 C gekühlt. Zur darauf folgenden Aufreinigung der PCR Produkte wurden ca. 40 µl Probe benötigt, daher wurden mehrfache 10 µl PCR Reaktionsansätze angesetzt. Eine Qualitäts- und Quantitätsprüfung der PCR Produkte wurde entsprechend den Ausführungen in Kapitel vorgenommen.

41 Material und Methoden Aufreinigung der PCR Produkte Die PCR Produkte wurde mit dem Montage PCR Device Kit nach den Angaben des Herstellers (Millipore, Bedford, USA) aufgereinigt. Es wurden 40 µl der Probe auf die Filter pipettiert und mit 1 x TE-Puffer auf ein Volumen von 400 µl gebracht. Die PCR-Produkte wurden bei Upm (Biofuge fresco, Rotor: , Heraeus, Hanau) und RT für 15 min zentrifugiert und die DNA auf den Filter der Säule pipettert. Zur Resuspendierung der PCR Produkte wurden 20 µl 1x TE-Puffer auf die Filter gegeben, die Säule umgedreht und in neuen Reaktionsgefäßen für 2 minbei Raumtemperautr inkubiert. Die aufgereinigte DNA wurde bei Upm und RT für 2 min abzentrifugiert und bei 4 C gelagert. Es wurde erneut eine Qualitäts- und Quantitätsprüfung der PCR Produkte entsprechend den Ausführungen in Kapitel vorgenommen und mit einer Referenzprobe (Laurus, Cassytha) deren Größe bekannt ist, verglichen. 1x TE-Puffer, ph 8,0 (Sambrook & Russel, 2001) Tris HCl ph 8,0 10 mm EDTA ph 8,0 1 mm Sterilisieren unter Druck und Hitze Sequenzierungsreaktion Die Sequenzierungsreaktion erfolgte im Thermocycler unter den nachfolgend angeführten Parametern, wobei die Schritte mal oder alternativ bis zu 30 mal durchlaufen wurden:? initiale Denaturierung bei 96 C, 4 min? Denaturierung bei 96 C, 30 sec? Annealing bei 50 C, 15 sec? Elongation bei 60 C, 4 min

42 Material und Methoden 33 Je nach DNA-Konzentration des aufgereinigten PCR-Produkts wurden 2 bis 8,5 µl eingesetzt, bzw. etwa 500ng. Diese wurden mit H 2 O bidest. auf ein Gesamtvolumen von 8,5 µl gebracht und pro Ansatz wurden 2 µl DMSO, 2 µl Primer (10 µm), 2,3 µl Big Dye (Abi Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems) sowie 5,7 µl 2,5 x Sequenzierungspuffer hinzugefügt. Nach Ablauf der Reaktion wurden die Proben auf 10 C abgekühlt und bis zur Fällung bei 4 C gelagert Fällung der Sequenzreaktion Die 20 µl Ansätze der Sequenzierungsreaktion wurden mit 80 µl 0,3 M Natriumacetat ph 5,2 und 300 µl 99,8% Ethanol versetzt, gemischt und etwa 20 min bei RT inkubiert. Der Fällungsansatz wurde bei Upm für 60 min bei 4 C zentrifugiert (Biofuge fresco, Rotor: , Heraeus, Hanau). Der wurde Überstand verworfen und das Pellet mit 1 ml 76% Ethanol (-20 C) gewaschen und erneut 60 min mit Upm bei 4 C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet etwa 5 min bei 65 C im Heizblock getrocknet Auftrennung der Sequenzreaktion Die Auftrennung der Proben nach der Sequenzierung wurde mit dem Abi Prism TM 3770 Kapillarsequenzierer des Universitätsklinikums Eppendorf (Hamburg) durchgeführt. Die Kapillaren dieses Geräts sind mit einer Gelmatrix gefüllt, in dem die Einzelfragmente der Proben mit 1 bp Unterschied durch Elektrophorese voneinander getrennt wurden. Beim verwendeten Reaktionskit (Abi Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems) sind an die ddntps entsprechend der vier verschiedenen Basen vier verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe gebunden. Beim Durchlaufen der Kapillare wandern die kleinsten Fragmente am schnellsten und werden sukzessive durch Anregung mit Laserlicht detektiert.

43 Material und Methoden Auswertung der Sequenzen Die Sequenzdaten wurden mit dem Programm Bio Edit (Department of Microbiology North Carolina State University) umformatiert um sie mit dem Programm Sequencher TM (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, USA) bearbeiten zu können. Mit diesem Programm wurden die Sequenzdaten mit den dazugehörigen Chromatogrammen verglichen und manuell editiert. Die Sequenzen wurden durch Abgleich mit Datenbanken (Genbank) überprüft um eine mögliche Kontamination auszuschließen, da ITS Bereiche in allen Eukaryoten vorkommen und somit Kontaminationen durch Mikroorganismen wie z.b. Pilze oder Algen potenziell mitamplifiziert werden können. Die Sequenzen wurden in ein Alignment gebracht, unter Berücksichtigung der größtmöglichsten Übereinstimmung aller Taxa. Gaps (Lücken) wurden nach Möglichkeit vermieden und entstandene Datenmatrix bildete die Grundlage der Berechnungen und Auswertungen Phylogenetische Analyse Die phylogenetischen Analysen und die graphische Darstellung als Kladogramme, bzw. Phylogramme, wurden mit dem Programm PAUP (Version 4.0b10 for Macintosh, Swofford, D. L. 2002, Sinauer Associates Inc. Publishers, Sunderland, MA, USA) durchgeführt. Es wurde die parsimony Methode gewählt mit der Funktion exhaustive search, da die geringe Anzahl der Taxa es ermöglichte, sämtliche topologisch möglichen Kladogramme zu berechnen. MaxTrees wurde initial gleich 100 gesetzt (ohne Limit). Falls die maximale Zweiglänge gleich Null wurde, kollabierte der Zweig. Gaps wurden als missing Data behandelt. Die Bäume wurden durch Definition von Außengruppen bewurzelt. Zur statistischen Unterstüzung der Zweige wurde ein Bootstrap mit der Funktion branch-and-bound mit 100 replicates durchgeführt. Die upper bound wurde heuristisch ermittelt. Die entfernteste Sequenz wurde addiert und Zweiglängen gleich Null kollabierten. Das Ergebnis wurde als 50% majority rule consensus tree dargestellt, d.h. nur die Gruppen, die in mehr als 50% der Topologien vorkommen, wurde als Monophylum dargestellt. Die Bootstrap-Werte geben in Prozent an, wie oft ein Monophylum in Dendrogrammen wiederzufinden ist, die mit Modifikationen des ursprünglichen

44 Material und Methoden 35 Datensatzes gewonnen wurden (Wiederfindungswahrscheinlichkeit). Der Wiederfindungstest besteht darin, aus einem Datensatz zufällig Merkmale (Spalten) auszuwählen, um einen neuen Datensatz gleichen Umfangs zusammenzustellen. In diesem neuen Datensatz fehlen naturgemäß einige Merkmale, andere treten doppelt oder mehrfach auf. Für jeden Datensatz wird die optimale Topologie (beim Maximum Parsimony- Verfahren der kürzeste Baum ) berechnet. Wiederholt man diese Schritte z.b. 100, 500 oder 1000 mal, dann kann man in Prozent angeben, wie oft ein Monophylum in diesen Wiederholungen vorkommt. Es kann bei einer bestimmten Zusammensetzung eines Datensatzes dazu kommen, dass nur solche Monophyla Werte über 95% erhalten, die z.b. von mehr als 3 potentiellen Apomorphien gestützt werden (Wägele, 2000). Als monophyletische Aussengruppe zur Gattung Trachycarpus wurden die Taxa Rhapidophyllum hystrix, Guihaia argyrata, Chamaerops humilis und Trithrinax campestris gewählt AFLP Für die Populationsanalysen wurden AFLPs ( amplified fragment length polymorphisms ) nach dem Protokoll von Vos et al. (1995) verwendet. Bei dieser Methode werden mittels PCR-Amplifikationen selektiv Restriktionsfragmenten genomischer DNA vervielfältigt. Dadurch können im gesamten Genom polymorphe Merkmale identifiziert werden. AFLPs können in der Regel höher auflösen als Sequenzenanalysen. Aus diesem Grund werden AFLPs auch für genetische Fingerprints innerhalb einer Art eingesetzt (siehe auch Kap. 1.7 AFLP Analyse).

45 Material und Methoden Restriktionsverdau Bei der Restriktion wird die genomische DNA mit den Enzymen EcoRI ( rare cutter ) und Tru9I (frequent cutter, Isoschizomer MseI, beides GeneCraft, Münster) geschnitten. Der Doppelverdau wurde in zwei aufeinander folgen Reaktionen wie folgt durchgeführt: EcoRI-Verdau 1x Puffer H passend zu EcoRI 10 µl DNA (ca. 30 ng DNA) 10 U EcoRI ad 25 µl H 2 O Die Inkubation erfolgte mindestens 1 h bei 37 C. MseI-Verdau 25 µl EcoRI-Verdau 5 U MseI in 4,5 µl H H 2 O Der Verdau wurde über Nacht bei 65 C inkubiert Ligation der Adapter Die einzelsträngigen Adapter (s. Kap ) wurden in Doppelstränge überführt, bevor sie an die Restriktionsfragmente ligiert wurden. Für den Adaptermix AdEco O + U wurden zu je 7,6 µl der beiden einzelsträngigen Eco-Adapter AdEcoO und AdEcoU 128 µl steriles Wasser gegeben. Für den Adaptermix AdMse O + U wurden 15 µl AdMseO und 15,5 µl AdMseU gemischt. Nach einer Inkubation der beiden Adaptermix-Lösungen bei 70 C für 5 min wurden diese im ausgeschalteten Heizblock über Nacht langsam abgekühlt. Die Ligation der Adaptermix-Lösungen an die geschnittene DNA erfolgte in folgendem Reaktionsansatz:

46 Material und Methoden 37 Ligationsansatz 0,4 pmol AdEcoO+U 4,0 pmol AdMseO+U 3,8x Puffer+ATP (GeneCraft) 0,5 U T4 Ligase (GeneCraft) ad 6,3 µl H 2 O Der Ligationsmix wurde zum gesamten Restriktionsansatz pipettiert. Der Ansatz wurde 3,5 h bei 37 C inkubiert Präamplifikation In der Präamplifikation wurden Primer eingesetzt, die an den Adaptern und der Restriktionsschnittstelle ansetzten. Die Primer besaßen eine zusätzliche selektive Base A oder C, um die Zahl der zu untersuchenden Restriktionsfragmente einzugrenzen. Die Sequenzen der Primer sind in Kap aufgeführt. Der PCR-Ansatz wurde nach folgendem Schema zusammengesetzt: PCR-Ansatz: 10 µl Ligationsansatz 0,93x 10x Puffer 15 mm MgCl 2 0,19 mm dntps 1,4 µm Primer PEcoRI+A oder C 1,4 µm Primer PMseI+A oder C 2,5 U Biotherm Polymerase (GeneCraft) ad 53,5 µl H 2 O Die PCR-Reaktion erfolgte in einem Tgradient oder Tpersonal Thermocycler (Biometra, Göttingen) mit folgendem Programm: 94 C 30 sec 20 x 60 C 30 sec 72 C 60 sec 1 x 10 C 8

47 Material und Methoden Selektive Amplifikation Bei der selektiven Amplifikation wurden Primer verwendet, die zwei weitere zusätzliche Basen (YZ) besaßen. Durch diese weiteren selektiven Basen wurde die Anzahl der PCR- Produkte zusätzlich erniedrigt. Die genauen Sequenzen der selektiven Primer sind in Kap aufgeführt. Der PCR-Ansatz wurde wie folgt zusammengesetzt: PCR-Ansatz: 1µl Präamplifikationsansatz 0,96x 10x Puffer 15 mm MgCl 2 0,19 µm dntps 0,48 µm SEcoRI+XYZ 1,44 µm SMseI+XYZ 0,25 U Biotherm Polymerase (GeneCraft) ad 10,45 µl H 2 O Für die selektive Amplifikation wurde eine Touch-down -PCR in einem Tgradient oder Tpersonal Thermocycler (Biometra, Göttingen) durchgeführt. Der erste Zyklus des Programms bestand aus einer Denaturierung bei 94 C für 50 sec, einem Annealing-Schritt bei 65 C für 60 sec und einer Elongation bei 72 C für 90 sec. Die Annealingtemperatur wurde schrittweise von 65 C auf 56 C abgesenkt. In den ersten drei Zyklen wurde die Temperatur um je 1 C abgesenkt, der dritte Zyklus wurde wiederholt. In den folgenden beiden Zyklen wurde die Temperatur wieder um je 1 C gesenkt, der letzte Zyklus wurde wiederholt. In den nächsten zwei Zyklen wurde die Annealingtemperatur wieder um je 1 C gesenkt, und der letzte wurde wiederholt. Drei weitere Zyklen folgten mit einer Temperaturreduktion um je 1 C. Der letzte Schritt wurde 23 x bei einer Annealingtempertur von 56 C wiederholt. Die PCR-Produkte wurden nach Abschluss der Reaktion im Thermocycler bei 10 C gekühlt Längenstandards für den ALF TM express Zum basengenauen Abgleich der PCR-Produkte auf dem Polyacrylamidgel wurde zu jeder Probe interne Standards mit bekannter Größe gegeben. Hierfür wurden Standards der

48 Material und Methoden 39 Größe 71 bp, 140 bp und 300 bp nach Rudolph (2001) selbst hergestellt. Als Template für die PCR diente das Phagmid pbluescript II KS (+) mit einer Länge von 2961 bp (Stratagene, La Jolla, USA). Die für die Herstellung des internen Standards benötigten Primersequenzen sind in Kap aufgelistet. Die Primerkombinationen für die Amplifikation der internen Standards sind in Tab. 2.5 aufgeführt. Tabelle 2.5: Primerkombinationen zur Herstellung von PCR-Produkten definierter Länge. Als DNA- Template diente das Phagmid pbluescript II KS (+) (nach Rudolph, 2001). Fragmentgröße Primer Cy5-markiert Primer unmarkiert 71 bp SKCy5 KS 140 bp SKCy5 M13seq 300 bp M13seqCy5 M300 Der PCR-Ansatz wurde wie folgt zusammengesetzt (Rudolph, 2001): 1x 10x Puffer 1,5 mm MgCl 2 0,2 mm dntps 0,2 µm Primer F Cy5-markiert 0,2 µm Primer R 2,5 U Biotherm Polymerase (GeneCraft, Münster) 30 ng Phagmid DNA ad 100 µl H 2 O Die Reaktion wurde im Tgradient oder Tpersonal Thermocycler (Biometra, Göttingen) unter folgenden Reaktionsbedingungen nach Rudolph (2001) durchgeführt: 1 x 94 C 2 min 94 C 1 min 25 x 50 C 1 min 72 C 1 min 1 x 72 C 5 min 1 x 10 C 8

49 Material und Methoden 40 Je ein PCR-Ansatz (100 µl) der fertigen 71 bp, 140 bp und 300 bp Standards wurden mit 600 µl oder 300 µl ALF-Ladepuffer versetzt. ALF-Ladepuffer (Rudolph, 2001): 5 mg Dextranblau ad 1 ml deionisiertes Formamid über Nacht schütteln, aliquotieren bei -20 C lagern Aufbau des Polyacrylamidgels Die AFLP-Reaktion wurde auf einem automatischen Sequenzierer ALFexpress (Amersham Biosciences, Uppsala) basengenau aufgetrennt. Hierfür wurde ein Gel der Größe Standard und einer Dicke von 0,3 mm verwendet. Die Glasplatten wurden unter fließendem Wasser gereinigt, mit H 2 O bidest abgewischt und mit Ethanol entfettet. In der Region des Kamms wurden nach jedem dritten Lauf 30 µl Bindesilan aufgetragen und streifenfrei verrieben, um gute Taschen zum Auftragen der Proben zu erhalten. Die Glasplatten und Spacer wurden fusselfrei zusammengesetzt und mit Klemmen befestigt. Als Gelmatrix wurde das ReproGel TM High Resolution Kit der Firma Amersham Biosciences (Uppsala) verwendet. Es besteht aus zwei Lösungen, die miteinander gemischt wurden, ohne Luftblasen zu bilden. Die Gelmatrix wurde langsam zwischen die Glasplatten gegossen. Die Polymerisation des Acrylamids im Gel wurde durch UV-Licht (ReproSet UV-Tisch, Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) gestartet. Das nach ca. 10 min auspolymerisierte Gel musste innerhalb einer Stunde verwendet werden. Das Gel wurde in den automatischen Sequenzierer gehängt und mit dem Wassertank verbunden. Als Laufpuffer wurde 0,5x TBE verwendet. Der Kamm wurde vorsichtig entfernt und die Taschen mit Hilfe einer Spritze mit Laufpuffer gespült. Der Laser wurde durch Schließen des Deckels des automatischen Sequenzierers aktiviert und ausgerichtet Probenvorbereitung und Beladung des Gels Die Proben wurden mit dem ALF-Ladepuffer mit internen Standards (Kap ) in einem Verhältnis von 1:1 bis 2:1 gemischt, 5 min bei 97 C denaturiert und sofort bis zum

50 Material und Methoden 41 Auftragen auf das Gel auf Eis gelagert. Pro Geltasche wurden maximal 8 µl der Lösung aufgetragen. In die erste und letzte Tasche des Gels, die beide unbeleuchtet waren, wurden bis zu 8 µl ALF-Ladepuffer aufgetragen, um einen gleichmäßigeren Gellauf zu erreichen. In die erste beleuchtete Tasche wurden 4 µl des Internen Standards ohne Probe pipettiert, ab der zweiten Tasche wurden jeweils bis zu 8 µl der denaturierten Proben aufgetragen. Jeweils bis zu 19 Taxa wurden ab Tasche 2 aufgetragen. In Tasche 21 wurde wieder der interne Standard allein aufgetragen und ab Tasche 22 die Wiederholung der 19 Taxa als Kontrolle Gellauf am automatischen Sequenzierer Für die Populationsanalysen mittels AFLP wurden insgesamt 33 Gel-Läufe mit dem automatischen Sequenzierer ALFexpress mit jeweils stichprobenartiger Zusammenstellung der Taxa aus der Gesamtaufsammlung in sieben verschiedenen Sets durchgeführt. Die sieben Sets (siehe Tab. 7.7 im Anhang) wurden jeweils mit zwei Primerkombinationen getestet (Eco ATG + Mse AAT und Eco ATG + Mse AGG). Diese beiden Primerkombinationen erwiesen sich aus den getesteten Primerkombinationen (Tab. 2.4) als auswertbar. Die Gelelektrophorese zur Auftrennung der AFLP-Proben wurde mit folgenden Laufparametern am ALFexpress durchgeführt: Spannung: 1500 V Stromstärke: 60 ma Leistung: 25 W Laufzeit: 700 min Temperatur: 55 C Probenintervall: 2 sec Auswertung der AFLP-Gele am Computer Zur Auswertung der AFLP-Gele wurde das Programm ALFwin TM Fragment Analyser Version 1.03 der Firma Amersham Biosciences (Uppsala, Schweden) verwendet. Das Vorhandensein einer Bande mit einer bestimmten Größe wurde als 1, das Fehlen als 0 kodiert.

51 Material und Methoden 42 Alle Banden wurden ausgewertet, die an einem Individuum vorhanden waren. Diese wurden mit der Kontrolle auf demselben Gel überprüft. Nur PCR-Produkte, die auch in der Wiederholung vorkamen und damit reproduzierbar waren, wurden in die späteren Auswertungen übernommen. Mögliche Verschiebungen (sog. Shifts ) der Banden von 1 2 bp wurden berücksichtigt und korrigiert. Zweifelhafte Banden wurden aus der Auswertung ausgeschlossen. Polymorphe Banden (Banden die nicht bei allen Taxa/Herkünften vorkommen) und monomorphe Banden (Banden die bei allen Taxa/Herkünften vorkommen) wurden gezählt. Monomorphe Banden kann man weglassen, da sie keine phylogenetische Information tragen. Bei der weiteren Auswertung wurde vorausgesetzt, dass Fragmente mit gleicher Länge homolog sind, und dass diese PCR- Produkte nicht zufälligerweise dieselbe Größe aufweisen. Die 1/0-Matrizen wurden ins Nexus-Format überführt, welches in PAUP gelesen werden kann. Taxa/Herkünfte aus mehreren Gelen wurden zu einer Gesamtmatrix kombiniert, wenn gleiche Taxa/Herkünfte aus verschiedenen Gelen reproduzierbare Bandenmuster aufwiesen Berechnung der Daten Zur Berechnung der Distanzbäume wurde das Programm PAUP (siehe Kapitel 2.6.8) verwendet. Es wurden die Distanz-Analysen UPGMA sowie Neighbor-Joining genutzt. UPGMA steht für: unweighted pair-group method using arithmetic averages. Mit diesem Verfahren vergleicht man Distanzen von Objekten paarweise und berechnet für die einander nächsten Paare die gemeinsame Distanz zu den anderen Objekten mit dem arithemtischen Mittel. Neighbor Joining: Dieses Clusterverfahren benötigt nicht ultrametrische Distanzen, toleriert also auch taxaspezifische Abweichungen in den Substitutionsraten (Wägele, 2000). Einige Bäume wurden durch Aussengruppen bewurzelt. Als Aussengruppe wurde Rhapidophyllum hystrix gewählt.

52 Ergebnisse 43 3 Ergebnisse 3.1 Morphologische Untersuchungen Epicuticulare Wachse wurden an der Unterseite von herbarisierten Blattsegmenten der Trachycarpus NagaHills # 43 (Labornummern korrespondieren mit der Aufsammlungsliste Tab. 7.1 im Anhang) fotografiert (Abb. 3.1) sowie REM-Aufnahmen angefertigt. Die REM-Aufnahmen (Abb. 3.2, Abb. 3.3.) zeigen einzelne Wachsinseln in 1150facher Vergrößerung und in 5510facher Vergrößerung (Abb. 3.4). Die Wachsinseln treten linear entlang verdickter Rippen der Blattsegmente auf. Abbildung 3.1: Epicuticulare Wachsablagerungen auf der Unterseite eines Blattsegments von Trachycarpus NagaHills # 43 (3,7x vergrössert).

53 Ergebnisse 44 Abbildung 3.2: Epicuticulare Wachsabsonderung im Querschnitt von Trachycarpus NagaHills # 43 (REM, Schrägansicht, siehe Pfeil). Abbildung 3.3: Epicuticulare Wachsabsonderung in Aufsicht von Trachycarpus NagaHills # 43 (REM, siehe Pfeil).

54 Ergebnisse 45 Abbildung 3.4: Epicuticulare Wachsabsonderung in Nahansicht von Trachycarpus NagaHills # 43 (REM). Beobachtet wurden die epicuticularen Wachse auch an herbarisierten Blättern der Trachycarpus latisectus #44 (Bengalen, Indien), T. fortunei #45 (Kultivar aus Bengalen, Indien), T. cf. princeps #34 (Yunnan, China), T. takil #105, T. geminisectus #64 (Vietnam) und schwach ausgeprägt an frischen Blattproben von T. princeps #2 (Yunnan, China, siehe Abb. 3.5). Nähere ökologische Angaben siehe Tab Weder an weiteren Lebendpflanzen konnten (aufgrund der Juvenilität?) diese Wachse beobachtet werden noch an anderen herbarisierten Blättern.

55 Ergebnisse 46 Abbildung 3.5: Trachycarpus princeps # 2 (Typuspflanze) im BG Hamburg 3.2 Karyologische Untersuchungen Die DNA-Histogramme (Abbildungen ) zeigen eine Verteilungskurve der gemessenen Kerne. Die Fläche des Peaks enspricht der Anzahl gemessener Partikel. Der peak bei ca. 100% relativer Einheiten der x-achse entspricht dem externen Referenzwert von 22,18 pg 4C-DNA von Trachycarpus nanus (Röser, et al., 1997) (siehe auch Kap ). Analysiert wurden Trachycarpus nanus #8 (Yunnan, China), T. fortunei x takil #16 (Tessin), T. takil #15 (Beccari-Garten, Florenz) und T. takil #21. Der einzelne peak in den Histogrammen stellt einen diploiden Zustand der Probe dar.

56 Ergebnisse 47 File: Tnanus_b.FCS Date: Time: 13:58:27 Particles: 971 Acq.-Time: 13 s 100 Peak Index Mean Area Area% CV% ChiSqu partec PAS counts FL4 Abbildung 3.6: DNA-Histogramm von Trachycarpus nanus # 8. Detektiert wurden 971 Kerne, der 4C DNA-Gehalt betrug 18,06 pg pro Kern (22,18 pg x 81,43%). File: TfxtTessin_2.FCS Date: Time: 13:53:08 Particles: 511 Acq.-Time: 24 s 100 Peak Index Mean Area Area% CV% ChiSqu partec PAS counts FL4 Abbildung 3.7: DNA-Histogramm von Trachycarpus fortunei x takil # 16. Detektiert wurden 511 Kerne, der 4C DNA-Gehalt betrug 21,28 pg pro Kern (22,18 pg x 95,94%).

57 Ergebnisse 48 File: TtakilBeccari_2.FCS Date: Time: 13:49:00 Particles: 485 Acq.-Time: 38 s 100 Peak Index Mean Area Area% CV% ChiSqu partec PAS counts FL4 Abbildung 3.8: DNA-Histogramm von Trachycarpus takil # 15. Detektiert wurden 485 Partikel, der 4C DNA-Gehalt betrug 22,42 pg pro Kern (22,18 pg x 101,09%). File: TtakilPPP.FCS Date: Time: 13:32:03 Particles: 444 Acq.-Time: 65 s 100 Peak Index Mean Area Area% CV% ChiSqu partec PAS counts FL4 Abbildung 3.9: DNA-Histogramm von Trachycarpus takil # 21. Detektiert wurden 444 Partikel, der 4C DNA-Gehalt betrug 21,81 pg pro Kern (22,18 pg x 98,33%).

58 Ergebnisse ITS Tabelle 7.6 im Anhang gibt die Taxa wieder, die einer ITS Analyse unterzogen wurden Ergebnisse der ITS Analyse Die genetische Distanz (P-Distanz) zwischen den Taxa T. x takaghii #9, T. nanus #8 und Trachycarpus takil #15 betrug Null. Trachycarpus fortunei #20 und T. fortunei #11 zeigten ebenfalls keine genetische Differenz, ebenso war keine Distanz zwischen T. latisectus #26 und Trachycarpus martianus #23 vorhanden. Zur Optimierung der Berechnungen wurden Trachycarpus x takaghii, T. nanus #8, T. fortunei #20 sowie T. latisectus #26 nicht in die Analyse mit einbezogen. Abbildung 3.10 repräsentiert das Phylogramm der ITS Analyse gerechnet nach der Methode exhaustive search in PAUP (siehe Kapitel 2.4.7). Insgesamt wurden 713 Merkmale verrechnet. Davon waren 563 konstant und 113 variabel aber für die Parsimony uninformativ. Siebenunddreißig Merkmale waren parsimony informativ. Die Länge des kürzesten Baums (1) von insgesamt berechneten Bäumen betrug 184 Schritte. Das Phylogramm der ITS Analyse (Abb. 3.9) bildet zwei Cluster ab. Im oberen Cluster erscheinen die untersuchten Arten der Gattung Trachycarpus und im unteren Cluster die ausgewählten Vertreter aus der Subtribus Thrinacinae. Im Trachycarpus Cluster bilden T. wagnerianus #7, T. geminisectus #29, T. fortunei #11, T. takil #15 (nicht sicher als T. takil bestimmt) und T. takil x fortunei #16 (nicht sicher als Hybride bestimmt) eine Polytomie. Basal dazu gruppiert T. martianus #23 (Nepal-Form). Trachycarpus martianus (und Trachycarpus latisectus) bilden oval-kaffeebohnenförmige Samen, die restlichen Vertreter der Gattung jedoch reniforme (nierenförmige) Samen aus. Im zweiten Cluster bildet Chamaerops humilis #5 mit Trithrinax campestris #18 einen clade, als Schwestergruppen erscheinen (unaufgelöst) Guihaia argyrata #19 und Rhapidophyllum hystrix #18. In der bootstrap Analyse (Abb. 3.11) wird die nahe Verwandtschaft der reniformen Trachycarpus mit 99% unterstützt. Der gesamte Trachycarpus Cluster wird mit 97% unterstützt. Der Chamaerops humilis #5, Trithrinax campestris #18 Clade wird mit 61% gestützt. Der Guihaia argyrata #19 Knoten kollabiert. Werte unter 50% werden auf den Zweigen nicht angezeigt.

59 Ergebnisse 50 T wagnerianus#7 T geminisectus#29 T fortunei#11 T takil#15 T fortunei x takil#16 T martianus#23 R hystrix#4 G argyrata#19 C humilis#5 10 changes T campestris#18 Abbildung 3.10: Phylogramm der exhaustive search Analyse (ITS).

60 Ergebnisse 51 Bootstrap T wagnerianus#7 T geminisectus#29 99 T fortunei#11 T takil#15 T fortunei x takil#16 T martianus#23 97 R hystrix#4 G argyrata#19 C humilis#5 61 Abbildung 3.11: ITS Bootstrap 50% majority-rule consensus tree (100 replicates). T campestris#18

61 Ergebnisse AFLP Ergebnisse der AFLP Analyse Mit PAUP (Version 4.0b10) wurden die Rechenmethoden UPGMA und Neighbor-Joining verwendet für die Berechnung der Dendrogramme. Die Tabelle 3.1 gibt Gesamtzahl detektierter Banden sowie den Anteil monomorpher Banden aus den ausgewählten sieben Sets wieder mit der Primerkombination Eco ATG + Mse AAT. Tabelle 3.1: Gesamtzahl detektierter Banden und Anteil monomorpher Banden Set # Primerkombination Eco ATG + Mse AAT aus sieben Sets der Primerkombination Eco ATG + Mse AAT. Gesamtzahl Banden Zahl monomorpher Banden , , , , , , , 5 und ,31 Durchschnitt 373,5 6,25 1,59 Zahl monomorpher Banden in Prozent [%] Die Tab. 3.2 gibt die Gesamtzahl detektierter Banden sowie den Anteil monomorpher Banden aus den ausgewählten sieben Sets wieder mit der Primerkombination Eco ATG + Mse AGG. Tabelle 3.2: Gesamtzahl detektierter Banden und Anteil monomorpher Banden Set # Primerkombination Eco ATG + Mse AGG aus sieben Sets der Primerkombination Eco ATG + Mse AGG. Gesamtzahl Banden Zahl monomorpher Banden , , , , , , 5 und Durchschnitt 343 7,5 2,74 Zahl monomorpher Banden in Prozent [%]

62 Ergebnisse Phylogramme der AFLP Analyse Die Primerkombination Eco ATG + Mse AAT wird im folgenden mit PK A und die Primerkombination Eco ATG + Mse AGG mit PK B angegeben. Die Kladogramme wurden mit der UPGMA Methode berechnet, wenn nicht anders angegeben. Es wurden sieben Sets ausgewertet. Set 1 besteht aus verschiedenen T. fortunei Herkünften. Set 2 vergleicht Repräsentanten der Kaffebohnen Gruppe (T. martianus und T. latisectus) mit Vertretern der reniformen Samen Gruppe. Set 3 beinhaltet T. wagnerianus Herkünfte (aus Korea und Japan), T. nanus Herkünfte (aus Südchina) und T. princeps aus Südchina. Set 4 vergleicht T. princeps Herkünfte mit T. wagnerianus, T. fortunei und T. takil Herkünfte sowie T. nanus. Trachycarpus wagnerianus gilt als Synonym von T. fortunei (Govaerts & Dransfield, 2000). Set 5 vergleicht T. princeps und putative T. princeps Individuen mit T. oreophilus Individuen sowie Individuen von T. geminisectus, T. Manipur und T. NagaHills. Trachycarpus ukhrulense ist der gültige Name für die älteren Arbeitsnamen T. Manipur und T. NagaHills (Lorek & Pradhan, 2004). Trachycarpus ukhrulense wird aber nicht in der Monocot Checklist aufgeführt (Govaerts & Dransfield, 2006). Set 6 stellt Vertreter der Kaffeebohnen Gruppe mit neueren unbeschriebenen Herkünften (T. Nagaland und T. Lushai ) Individuen der T. ukhrulense Gruppe sowie T. takil und T. fortunei Individuen gegenüber. In Set 7 wurden weitere Vertreter der Thrinacinae (Chamaerops humilis, Guihaia argyrata, Rhapis, Coccothrinax und Cryosophlia warscewiczii) mit Individuen der reniformen Trachycarpus verglichen. Bestimmte Proben wurden aus den Datensätzen ausgeblendet, da aufgrund degradierter DNA die Ergebnisse nicht reproduzierbar waren. Nähere Details siehe in den Beschreibungen zu den Dendrogrammen und im Diskussionsteil. Eingehend diskutiert werden die Set 3, 5 und 6, da aus ihnen kombinierte Bäume berechnet wurden (Abb bis 3.21). Die Bäume der Sets 1, 2, 4 und 7 befinden sich im Anhang (Abb. 7.1 bis 7.14).

63 Ergebnisse 54 Das Phylogramm 5 (Abb. 3.12) bildet den Datensatz des Sets 3 ab (PK A). Individuen von Trachycarpus wagnerianus (#70, #106, #7 und #27), T. nanus (#33, #25, #75, #8 und #116a) und T. princeps (#10, #28, #76, #31a, #31b, #69, #35 und #71) bilden jeweils getrennte Schwesterclades. Ein Individuum von T. cf. princeps #120a clustert in dem T. wagnerianus Grade (1). Trachycarpus wagnerianus x fortunei #92 ist Schwestergruppe von 1 bis 3. T. wagnerianus x fortunei #92 T. wagnerianus #70 T. cf. princeps #120a T. wagnerianus #106 1 = T. wagnerianus Gruppe T. wagnerianus #7 T. wagnerianus #27 T. nanus #33 T. nanus #25 T. nanus #75 T. nanus #8 2 = T. nanus Gruppe T. nanus #116a T. princeps #10 T. princeps #28 T. cf. princeps #76 T. princeps #31a T. princeps #31b 3 = T. princeps Gruppe T. princeps #69 T. princeps #35 10 T. cf. princeps #71 Abbildung 3.12: Phylogramm 5 des Sets 3 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 19 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10).

64 Ergebnisse 55 In Phylogramm 6 (Abb. 3.13, PK B, Set 3) bilden T. wagnerianus Exemplare (#7, #27, #70 und #106) einen Clade (1) getrennt von einem Cluster bestehend aus einem T. princeps (#10, #31a, #31b, #69, #28, #35, #71 und #76) Clade (2) und T. nanus (#116a, #33, #75, #120a, #8 und #25) Clades (3 und 4 9. Trachycarpus cf. princeps #120a gruppiert in dem T. nanus (#8 und #25) Clade 4. Trachycarpus wagnerianus x fortunei #92 ist Schwestergruppen zu allen Gruppen. T. wagnerianus x fortunei #92 T. wagnerianus #7 T. wagnerianus #27 T. wagnerianus #70 1 = T. wagnerianus Gruppe T. wagnerianus #106 T. princeps #10 T. princeps #31a T. princeps #31b T. princeps #69 T. princeps #28 2 = T. princeps Gruppe T. princeps #35 T. cf. princeps #71 T. cf. princeps #76 T. nanus #116a T. nanus #33 T. nanus #75 3 = T. nanus Gruppe I T. cf. princeps #120a T. nanus #8 4 = T. nanus Gruppe II 10 T. nanus #25 Abbildung 3.13: Phylogramm 6 des Sets 3 (PK B; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 19 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10).

65 Ergebnisse 56 In Phylogramm 9 (Abb. 3.14, PK A, Set 5) wird Cluster 1 von T. princeps #61b mit T. cf. princeps #120b sowie b#120a gebildet. Der nächste Clade mit T. princeps #109 (Dulong river Population, Yunnan) und #118 sind Schwestergruppe dazu. Ein weiterer Clade bestehend aus T. princeps #69 und T. cf. princeps #71 ist Schwestergruppe zu den vorhergehenden. Trachycarpus oreophilus (#24 und #30) bildet zu den vorhergehenden Gruppen einen Clade (2). Ein T. geminisectus Clade (3) (#63, #29, #64 und #72) grenzt sich als Schwestergruppe zu 1 und 2 ab. Der T. Manipur #46 mit T. NagaHills (#43 und #62) Clade (4) wiederum ist Schwestergruppe zu den Gruppen 1 bis 3. T. cf. princeps #120a T. princeps #61b T. cf. princeps #120b T. princeps #109 1 = T. princeps Gruppe T. princeps #118 T. princeps #69 T. cf. princeps #71 T. oreophilus #24 T. oreophilus #30 2 = T. oreophilus Gruppe T. geminisectus #63 T. geminisectus #29 T. geminisectus #64 3 = T. geminisectus Gruppe T. geminisectus #72 T. Manipur #46 10 T. NagaHills #43 T. NagaHills #62 4 = T. ukhrulense Gruppe Abbildung 3.14: Phylogramm 9 des Sets 5 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 16 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10).

66 Ergebnisse 57 In Phylogramm 10 (Abb. 3.15, PK B, Set 5) treten drei Cluster auf. (1) Der T. princeps Grade (#118, #109, #61b, #120a und #120b) erscheint als Schwesterclade zum (2) T. oreophilus (#24 und #30) und (3) T. NagaHills und T. Manipur (#62, #43 und #46) Clade. Basal dazu gruppiert ein T. princeps (#69 und #71) Clade (4). Schwestergruppe (5) zu den Gruppen 1 bis 4 ist der T. geminisectus Cluster (#29, #72, #63 und #64). T. princeps #118 T. princeps #109 T. princeps #61b 1 = T. princeps Gruppe I T. cf. princeps #120a T. cf. princeps #120b T. oreophilus #30 T. oreophilus #24 2 = T. oreophilus Gruppe T. NagaHills #62 T. NagaHills #43 3 = T. ukhrulense Gruppe T. Manipur #46 T. princeps #69 T. cf. princeps #71 4 = T. princeps Gruppe II T. geminisectus #29 T. geminisectus #72 T. geminisectus #63 5 = T. geminisectus Gruppe 10 T. geminisectus #64 Abbildung 3.15: Phylogramm 10 des Sets 5 (PK B; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 16 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10).

67 Ergebnisse 58 In Phylogramm 11 (Abb. 3.16, PK A, Set 6) sind drei Gruppen zu verzeichnen. Die erste Gruppe besteht aus einem Grade (1) T. ukhrulense Clade (#122B und #122A) mit T. NagaHills #62, T. Manipur #46 (T. Manipur und T. NagaHills sind ältere unbeschriebene Synonyme von T. ukhrulense) und als indischen Schwesterclade T. takil (#136 und #135). Zu diesen Clades bilden T. Myanmar #96 (unbeschriebene Herkunft) und T. takil #130 (Kumaon, Indien) sukzessiv Schwestergruppen. Clade 2 bestehend aus T. fortunei #134 (Nainital Kumaon, Kultivar) und T. fortunei #124 (Typuspflanze, Kew Gardens) ist Schwestergruppe zu Gruppe 1. Schwestergruppe zu den Gruppen 1 und 2 ist der T. martianus Cluster bestehend aus T. martianus #131 (Khasia Hills, Indien), T. Lushai (Lushai Hills, Indien, unbeschriebene Form) und Trachycarpus Nagaland (Nagaland, Indien, unbeschriebene Form) sowie T. sikkimensis (älterer Arbeitsname für T. latisectus) und T. latisectus #78 (Sikkim, Indien). T. Lushai und T. Nagaland gehören ebenfalls wie T. martianus und T. latisectus zur kaffebohnenförmigen Samen ausbildenden Gruppe. Basal zu diesen Gruppen tritt Rhapidophyllum hystrix #4 (Florida, USA) als Aussengruppe und unaufgelöst T. Doi Ang #97 (Doi Ang Khang, Thailand, unbeschriebene Form) auf.

68 Ergebnisse 59 T. Doi Ang #97 Rhapidophyllum hystrix #4 T. takil Kaushani #130 T. Myanmar #96 T. takil Kalamuni #136 T. takil Thalkedar #135 T. Manipur #46 1 = T. takil & T. ukhrulense Gruppe T. NagaHills #62 T. ukhrulense #122B T. ukhrulense #122A T. fortunei Nainital #134 2 = T. fortunei Gruppe T. fortunei Kew #124 T. martianus #131 T. Lushai #113A T. Nagaland #114A 3 = T. martianus Gruppe T. sikkimensis #44 10 T. latisectus #78 Abbildung 3.16: Phylogramm 11 des Sets 6 (PK A; unbewurzelt; Aussengruppe: Rhapidophyllum hystrix; 17 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10).

69 Ergebnisse 60 Phylogramm 12 (Abb. 3.17) repräsentiert Set 6 mit PK B. Hier treten drei Gruppen auf, ähnlich zu Kladogramm 11. Gruppe 1 besteht aus T. takil #136 (Kalamuni, Kumaon) mit T. takil #135 (Thalkedar, Kumaon) mit dem Schwesterclade T. ukhrulense #122B mit T. ukhrulense #122A (Manipur, Indien) und als dritten Clade T. NagaHills #62 mit T. Manipur #46. Sukzessive treten als Schwestergruppen zu den erwähnten T. Myanmar und T. takil Kaushani #130 (Kumaon, Indien) auf. Als Schwestergruppe zu Gruppe 1 erscheint ein Cluster (2) aus T. Doi Ang #97, T. fortunei #134 (Nainital Kumaon, Kultivar) und T. fortunei #124 (Typuspflanze, Kew Gardens). Basal hiervon bildet ein Cluster (3) zwei Schwestergruppen zum einen bestehend aus T. Lushai #113A mit T. Nagaland #114A und zum anderen T. sikkimensis #44 mit T. latisectus #78. Gruppe 3 steht als Schwestergruppe zu den Gruppen 1 und 2. Sukzessive gliedern als basale Schwestergruppen von den Gruppen 1 bis 3 T. martianus #131 der Herkunft Khasia Hills (Indien) ab und als Aussengruppe zu allen vorherigen Gruppen erscheint Rhapidophyllum hystrix #4.

70 Ergebnisse 61 Rhapidophyllum hystrix #4 T. martianus #131 T. takil Kaushani #130 T. Myanmar #96 T. takil Kalamuni #136 T. takil Thalkedar #135 T. ukhrulense #122B 1 = T. takil & T. ukhrulense Gruppe T. ukhrulense #122A T. NagaHills #62 T. Manipur #46 T. Doi Ang #97 T. fortunei Nainital #134 2 = T. fortunei Gruppe T. fortunei Kew #124 T. Lushai #113A T. Nagaland #114A T. sikkimensis #44 3 = T. martianus Gruppe 10 T. latisectus #78 Abbildung 3.17: Phylogramm 12 des Sets 6 (PK B; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 17 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10).

71 Ergebnisse 62 In Gesamtphylogramm 1 (Abb.3.18, PK A, Sets 3, 5 und 6 kombiniert) finden sich acht Gruppen. Gruppe 1 setzt sich aus Aufsammlungen von T. wagnerianus (#106, #70, #7 und #27) zusammen. Gruppe 1 ist Schwestergruppe zu Gruppe 2, bestehend aus T. cf. princeps (#120a und #120b) und T. princeps (#61b, #120b, #109 und #118). Aus diesem bildet T. fortunei #134 (Nainital, Kumaon, Kultivar) und T. fortunei #124 (Typus, Kew) einen Clade 3. Gruppe 4 mit T. geminisectus (#63, #29, #64 und #72) steht als Schwestergruppe zu Gruppe 1 bis 3. Als Schwestergruppe zu den Gruppen 1 bis 4 stehen Cluster 5 und 6. Cluster 5 besteht aus T. wagnerianus x fortunei #92 und T. nanus (#25, #75, #8 und #116a). Cluster 6 ist Schwestergruppe von (5) mit folgenden Exemplaren: T. cf. princeps (#76 und #71), T. princeps (#31a, #10, #28, #31b, #35 und #69), T. nanus #33 und T. Manipur #46. Cluster 7 ist Schwestergruppe zu den vorhergehenden Gruppen 1 bis 6 und umfasst T. takil (#130, #136 und #135), T. oreophilus (#10 und #30), T. Myanmar #96, T. NagaHills (#43 und #62) und T. ukhrulense (#122B und #122A). Die zu den Gruppen 1 bis 7 basal stehende Gruppe 8 wird gebildet von T. martianus #131, T. Lushai #113A (Lushai Hills, unbeschriebene Form), T. Nagaland (Nagaland, unbeschriebene Form), T. sikkimensis #44 (älterer Arbeitstitel von T. latisectus) und T. latisectus #78. Basal gliedern sich Rhapidophyllum hystrix #4 und T. Doi Ang #97 (Doi Ang Khang, Thailand, unbeschriebene Form) ab.

72 Ergebnisse R. hystrix #4 T. Doi Ang #97 T. martianus #131 T. Lushai #113A T. wagnerianus #106 T. wagnerianus #70 T. wagnerianus #7 T. wagnerianus #27 T. cf. princeps #120a T. princeps #61b T. cf. princeps #120b T. princeps #109 T. princeps #118 T. fortunei Nainital #134 T. fortunei Kew #124 T. geminisectus #63 T. geminisectus #29 T. geminisectus #64 T. geminisectus #72 T. wagnerianus x fortunei #92 T. nanus #25 T. nanus #75 T. nanus #8 T. nanus #116a T. cf. princeps #76 T. princeps #31a T. princeps #10 T. princeps #28 T. princeps #31b T. princeps #35 T. princeps #69 T. cf. princeps #71 T. nanus #33 T. Manipur #46 T. takil Kaushani #130 T. oreophilus #24 T. oreophilus #30 T. Myanmar #96 T. Nagaland #114A T. sikkimensis #44 T. latisectus #78 T. NagaHills #43 T. NagaHills #62 T. ukhrulense #122B T. ukhrulense #122A T. takil Kalamuni #136 T. takil Thalkedar #135 1 = T. wagnerianus Gruppe 2 = T. princeps Gruppe I 3 = T. fortunei Gruppe 4 = T. geminisectus Gruppe 5 = T. nanus Gruppe 6 = T. princeps Gruppe II 7 = T. oreophilus, T. takil & T. ukhrulense Gruppe 8 = T. martianus Gruppe Abbildung 3.18: Gesamtphylogramm 1 der Sets 3, 5 und 6 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 47 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP- Version 4.0b10).

73 Ergebnisse 64 Gesamtphylogramm 2 (Abb. 3.19) spiegelt den Probensatz von Gesamtphylogramm 1 (Abb. 3.17) wieder, vermindert um die Taxa: T. Doi Ang #97, T. wagnerianus (#106, #70, #7 und #27), T. wagnerianus x fortunei #92, T. cf. princeps (#76 und #71), T. princeps (#31a, #10, #28, #31b, #35 und #69) und T. Manipur #46. T. Doi Ang #97 wurde entfernt, da diese Herkunft in Abbildung 3.17 als Schwestergruppe zu Rhapidopyhllum hystrix #4 erscheint. Bei T. wagnerianus handelt es sich um ein Synonym von T. fortunei. Die T. princeps Individuen der Gruppe 6 in Abbildung 3.17 wurden entfernt, da sie einen getrennten Cluster von T. princeps Exemplaren des Clusters 2 in Abbildung 3.17 bildeten. Trachycarpus takil #130 (Kaushani, Kumaon) positioniert nun als Schwestergruppe zum Rest der Gattung Trachycarpus. Trachycarpus nanus #33 gruppiert mit dem T. nanus Cluster (5). Der T. nanus Cluster erscheint hier als Schwestergruppe zu den Gruppen 1 bis 4. Die Gruppen sind weitestgehend identisch mit den Gruppen in Gesamtphylogramm 1 (Abb. 3.17).

74 Ergebnisse 65 R. hystrix #4 T. takil Kaushani #130 T. cf. princeps #120a T. princeps #61b T. cf. princeps #120b 1 = T. princeps Gruppe I T. princeps #109 T. princeps #118 T. fortunei Nainital #134 T. fortunei Kew #124 2 = T. fortunei Gruppe T. geminisectus #63 T. geminisectus #29 T. geminisectus #64 T. geminisectus #72 3 = T. geminisectus Gruppe T. oreophilus #24 T. oreophilus #30 T. Myanmar #96 T. NagaHills #43 T. NagaHills #62 T. ukhrulense #122B T. ukhrulense #122A 4 = T. oreophilus, T. takil & T. ukhrulense Gruppe T. takil Kalamuni #136 T. takil Thalkedar #135 T. nanus #25 T. nanus #33 T. nanus #75 5 = T. nanus Gruppe T. nanus #8 T. nanus #116a T. martianus #131 T. Lushai #113A T. Nagaland #114A T. sikkimensis #44 6 = T. martianus Gruppe 10 T. latisectus #78 Abbildung 3.19: Gesamtphylogramm 2 der Sets 3, 5 und 6 (PK A; unbewurzelt; Keine Aussengruppe gesetzt; 32 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP- Version 4.0b10).

75 Ergebnisse 66 Das Gesamtphylogramm 3 (Abb. 3.20, PK B, Sets 3, 5 und 6 kombiniert) repräsentiert den Probensatz aus Gesamtphylogramm 1 (Abb. 3.18). Die Gruppen 1 bis 3 und die Gruppen 4 bis 9 stehen in einem Schwestergruppenverhältnis zueinander. Gruppe 1 beinhaltet Individuen der T. wagnerianus (#7, #27, #70 und #106). Gruppe 2 setzt sich aus T. wagnerianus x fortunei #92, T. nanus #8, T. princeps (#31b, #10, #31a, #28 und #35) und T. cf. princeps #76 zusammen. Gruppe 3 besteht aus T. nanus (#25, #116a, #33 und #75). Gruppe 4 beinhaltet Individuen von T. princeps #69 sowie T. cf. princeps (#120a und #71), welche als Schwester zu den Gruppen 5 bis 9 steht. Gruppe 5 setzt sich aus T. princeps (#118, #109 und #61) sowie T. cf. princeps #120b zusammen, der Schwestergruppe der Gruppen 6 bis 9 ist. Gruppe 6 formt sich aus den Individuen T. oreophilus (#24 und #30), T. NagaHills (#43 und #62), T. Manipur #46, T. takil #130 (Kaushani, Kumaon), T. Myanmar #96, T. takil #136 (Kalamuni, Kumaon), T. takil #135 (Thalkedar, Kumaon). T. ukhrulense (#122B und #122A). Gruppe 6 steht als Schwestergruppe zu Gruppe 7 7 mit den folgenden Individuen: T. Doi Ang #97, T. sikkimensis #44, T. latisectus #78, T. Lushai #113A und T. Nagaland #114A. Gruppe 8 mit T. fortunei #134 (Nainital, Kumaon, Kultivar) und T. fortunei #124 (Typus, Kew) erscheint als Schwestergruppe zu den Gruppen 6 und 7. Gruppe 9 bestehend aus T. geminisectus (#63, #64, #29 und #72) ist Schwestergruppe zu den Gruppen 5 bis 8. Trachycarpus martianus #131 steht basal zu den Gruppen 6 bis 8. Rhapidophyllum hystrix #4 (als Aussengruppe gewählt) erscheint basal unaufgelöst neben den neben allen Gruppen. Die Gruppen sind gegenüber den Gruppen in Gesamtphylogramm 1 (Abb. 3.18) weitestgehend erhalten, allerdings variieren die Beziehungen der Gruppen zueinander.

76 Ergebnisse R. hystrix #4 T. wagnerianus #7 T. wagnerianus #27 T. wagnerianus #70 T. wagnerianus #106 T. wagnerianus x fortunei #92 T. nanus #8 T. cf. princeps #76 T. nanus #25 T. princeps #31b T. nanus #116a T. cf. princeps #120a T. princeps #10 T. princeps #31a T. princeps #28 T. princeps #35 T. nanus #33 T. nanus #75 T. princeps #69 T. cf. princeps #71 T. princeps #118 T. princeps #109 T. martianus #131 T. princeps #61b T. cf. princeps #120b T. oreophilus #24 T. oreophilus #30 T. NagaHills #43 T. NagaHills #62 T. Manipur #46 T. Doi Ang #97 T. takil Kaushani #130 T. Myanmar #96 T. sikkimensis #44 T. latisectus #78 T. Lushai #113A T. Nagaland #114A T. fortunei Nainital #134 T. fortunei Kew #124 T. geminisectus #63 T. geminisectus #64 T. takil Kalamuni #136 T. takil Thalkedar #135 T. ukhrulense #122B T. ukhrulense #122A T. geminisectus #29 T. geminisectus #72 1 = T. wagnerianus Gruppe 2 = T. princeps Gruppe II 3 = T. nanus Gruppe 4 = T. princeps Gruppe II 5 = T. princeps Gruppe I 6 = T. oreophilus, T. takil & T. ukhrulense Gruppe 7 = T. martianus Gruppe 8 = T. fortunei Gruppe 9 = T. geminisectus Gruppe Abbildung 3.20: Gesamtphylogramm 3 der Sets 3, 5 und 6 (PK B; unbewurzelt; Aussengruppe: Rhapidophyllum hystrix; 47 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10).

77 Ergebnisse 68 Das Gesamtphylogramm 4 (Abb. 3.21, PK B, Sets 3, 5 und 6 kombiniert) entspricht dem reduzierten Probensatz aus Gesamtphylogramm 2 (Abb. 3.19) mit PK B (ohne die Taxa T. Doi Ang #97, T. wagnerianus (#106, #70, #7 und #27), T. wagnerianus x fortunei #92, T. cf. princeps (#76 und #71), T. princeps (#31a, #10, #28. #31b, #35 und #69) und T. Manipur #46). Gruppe 1 bildet einen Grade aus T. princeps (#118, #109, #61b) und T. cf. princeps (#120a und #120b), welche Schwestergruppe zu den Gruppen 4, 3 und 2 ist. Gruppe 2 besteht aus T. oreophilus (#24 und #30), T. NagaHills (#43 und #62), T. takil (#130, #136 und #135), T. Myanmar #96, und T. ukhrulense (#122B und #122A) (entspricht Cluster 6 aus Gesamtphylogramm 3 in Abb. 3.20). Als Schwestergruppe dazu erscheint T. fortunei (#134 und #124) mit Clade 3 (entspricht Clade 8 in Abb. 3.19). Cluster 4 repräsentiert die T. martianus Gruppe mit T. martianus #131, T. Lushai #113A, T. Nagaland #114A, T. sikkimensis #44 und T. latisectus #78, diese steht als Schwestergruppe zu den Gruppen 2 und 3. Die T. geminisectus Gruppe 5 bildet einen Grade (entspricht Grade 9 in Abb. 3.19) mit T. geminisectus (#63, #64, #29 und #72), dieser ist Schwestergruppe zu den Gruppen 1 bis 4. Rhapidophyllum hystrix #4 (hier als Aussengruppe gewählt) und die T. nanus Gruppe 6 (entspricht Grade 3 in Abb. 3.19) mit T. nanus (#8, #25, #116a, #33 und #75) erscheinen unaufgelöst als Schwestergruppen. Die Gruppen sind weitestgehend mit den Gruppen im Gesamtphylogramm 2 (Abb. 3.19) identisch, ihre Beziehungen zueinander sind aber verändert.

78 Ergebnisse 69 R. hystrix #4 T. cf. princeps #120a T. princeps #118 T. princeps #109 T. princeps #61b 1 = T. princeps Gruppe I T. cf. princeps #120b T. oreophilus #24 T. oreophilus #30 T. NagaHills #43 T. NagaHills #62 T. takil Kaushani #130 T. Myanmar #96 T. takil Kalamuni #136 T. takil Thalkedar #135 2 = T. oreophilus, T. takil & T. ukhrulense Gruppe T. ukhrulense #122B T. ukhrulense #122A T. fortunei Nainital #134 T. fortunei Kew #124 3 = T. fortunei Gruppe T. martianus #131 T. Lushai #113A T. Nagaland #114A T. sikkimensis #44 4 = T. martianus Gruppe T. latisectus #78 T. geminisectus #63 T. geminisectus #64 T. geminisectus #29 5 = T. geminisectus Gruppe T. geminisectus #72 T. nanus #8 T. nanus #25 T. nanus #116a T. nanus #33 6 = T. nanus Gruppe 10 T. nanus #75 Abbildung 3.21: Gesamtphylogramm 4 der Sets 3, 5 und 6 (PK B; unbewurzelt; Aussengruppe: Rhapidophyllum hystrix; 32 Taxa; UPGMA-Berechnung in PAUP-Version 4.0b10.

79 Diskussion 70 4 Diskussion 4.1 Diskussion der morphologischen Untersuchungen Epicuticulare Wachse sind mikromorphologische Strukturen, die als erhabene oberflächliche Strukturen kristallähnliche Eigenschaften aufweisen. Form und Struktur der Wachse können diagnostischen Wert besitzen (Barthlott & Frölich, 1983). Barthlott & Frölich (1983) unterscheiden vier verschiedene Typen von Wachsen. Zu Typ I gehören durchgehende Wachsschichten mit dünnen Filmen auf den Oberflächen (Monokotyle). Typ II sind nicht-orientierte Wachs-Kristalloide (Monokotyle und Dikotyle). Typ III entspricht dem Convallaria-Wachs-Typ, der durch feine schuppenförmige Kristalloide, die parallel und gerichtet verlaufen, gekennzeichnet ist. Der Strelitzia-Wachs-Typ (Typ IV) wird repräsentiert durch lange stäbchenförmige Kristalloide, die meist verwachsen oder zu massive Wachs-Projektionen verschmelzen. Die Arecaceae sind hauptsächlich dem Typ IV zuzuordnen. Beispiele sind die Wachspanzer der Gattungen Ceroxylon und Copernicia (Barthlott & Frölich, 1983). Die Wachse bestehen generell aus einer komplexen Mischung langkettiger aliphatischer Komponenten, wie beispielsweise primärer und sekundärer Alkohole, Aldehyde und Ketone, während andere Wachse dominiert werden von zyklischen Komponenten wie Triterpenen oder Flavonoiden (Koch et al., 2004). Anhand der REM-Aufnahmen (Abb ) konnten die auftretenden Wachsinseln auf der Blattunterseite von Trachycarpus NagaHills #43 dem Strelitzia-Wachs-Typ zugeordnet werden. Da diese Wachsinseln auch an herbarisierten Blättern von T. latisectus #44 (Bengalen, Indien), T. fortunei #45 (Kultivar aus Bengalen), T. cf. princeps #34 (Yunnan, China), T. takil #105, T. geminisectus #64 (Vietnam) sowie schwach ausgeprägt an einer T. princeps #2 Lebendpflanze (Yunnan, China, siehe Abb. 3.5) zu erkennen waren, bleibt fraglich, ob diese Wachse nicht mehr oder weniger an allen Trachycarpus-Arten auftreten, in Abhängigkeit von Klima und Standort. Daher kann der diagnostische Wert dieser epicuticularen Wachse für T. NagaHills #43 möglicherweise relativ gering ausfallen.

80 Diskussion Diskussion der karyologischen Untersuchungen Nukleäre DNA Gehalte von Palmen wurden von 83 Spezies und 53 Gattungen berichtet, aus allen sechs Unterfamilien. Die in der Literatur (Röser et al., 1997) genannten 4C DNA Gehalte variieren zwischen 3,89 und 55,62 pg bei diploiden Palmen. Polyploide Palmen besitzen DNA Gehalte von bis zu 156,40 pg/4c. Diploide Palmen mit hohen DNA Gehalten treten in drei Unterfamilien auf (Coryphoideae, Calamoideae, Arecoideae) und scheinen weiter auf einige Tribus und Subtribus eingegrenzt zu sein (Thrinacinae, Borasseae, Lepidocaryeae, Caryoteae, einige Subtribus der Areceae). Die Mehrheit der Palmen sind diploid mit Chromosomenzahlen zwischen 2n = 36 und 2n = 26 in einer gewöhnlich absteigenden dysploiden Reihe. Polyploide sind selten, können aber extrem hohe Chromosomenzahlen aufweisen, zum Beispiel Voanioala gerardii mit 2n = 596 bis 606 ± 3. Der 4C DNA Gehalt von Trachycarpus nanus wurde mit 22,18 pg ± 0,53 gemessen (Röser et al., 1997). Die mit dieser Referenz verglichenen und untersuchten Proben von T. nanus #8 (Yunnan, China) mit 18,06 pg, T. fortunei x takil #16 (Tessin Kultivar) mit 21,28 pg, T. takil #15 (Beccari-Garten, Florenz) mit 22,42 pg und T. takil #21 mit 21,81 pg, geben keine Hinweise auf Polyploidisierungen. Es gibt keine Belege dafür, daß T. fortunei x takil #16 tatsächlich eine Hybride aus dem Tessin darstellt. Postkarten aus der Zeit des frühen zwanzigsten Jahrhunderts zeigen schon große Trachycarpus fortunei im Tessin (Abb. 4.1, Abb. 4.2). Trachycarpus takil wurde 1905 von Odoardo Beccari beschrieben. Beccari zog diese Art aus einigen Samen selbst heran, die er direkt aus Indien bekam (Beccari, 1905). Die Möglichkeit der Introgression von T. takil Erbgut in bestehende T. fortunei Bestände im Tessin ist daher eher gering einzuschätzen.

81 Diskussion 72 Abbildung 4.1: Ansichtskarte aus Lugano (1913) (Quelle: Abbildung 4.2: Ansichtskarte aus Lugano (1927) (Quelle:

82 Diskussion Diskussion der ITS Analyse Die Aufklärung der Systematik von Palmen basierend auf ITS kann schwierig sein, da Palmengenome einen hohen Grad an Polymorphie innerhalb der ITS Region offenbaren und die Interpretation auf Artniveau und oberhalb davon erschweren (Asmussen, 1999; Lewis & Doyle, 2001). ITS Analysen der Unterfamilie Calamoideae offenbarten einen hohen Grad an Polymorphie innerhalb der ITS Region (Baker et al., 2000). Für die ITS Analysen der Gattung Trachycarpus und Vertretern der Thrinacinae (siehe Tab. 7.6, Anhang) trifft diese Aussage nicht zu. Die genetischen Distanzen der Arten T. x takaghii #9, T. nanus #8 und T. takil #15 sind gleich Null, d.h. die erhaltenen ITS Sequenzen sind identisch. Die Sequenzen von T. fortunei #20 und T. fortunei #11 waren ebenso identisch. Trachycarpus latisectus #26 und T. martianus #23 zeigten ebenfalls keinen Unterschied in der Sequenz, unterschieden sich aber zu den vorgenannten Arten. Die weiteren Vertreter der Thrinacinae lieferten dagegen Sequenzunterschiede. Trachycarpus unterschied sich in 45 bp von Rhapidophyllum hystrix gefolgt von Chamaerops humils (61 bp), Guihaia argyrata (75 bp) und Trithrinax campestris mit 192 bp. Die exhaustive search Analyse (Abb. 3.10, Abb. 3.11) belegte die Homogenität der reniformen Trachycarpus, die hier unaufgelöst als Polytomie abgebildet wurden. Die Identität von T. fortunei x takil #16 wurde nicht zweifelsfrei bestimmt (siehe Kapitel 4.2 Diskussion der karyologischen Untersuchungen). Trachycarpus takil Becc. ist ein Vertreter der Gattung aus dem westlichen Himalaya (Kumaon) und Saat dieser Palmenart wurde nach ihrer Beschreibung im Jahre 1905 (Beccari, 1905) lange Zeit nicht nach Europa eingeführt. Trachycarpus takil unterscheidet sich von T. fortunei in der breiteren Ligula und stärker angepressten Fasern, die aus sich auflösenden Blattbasen gebildet werden. Die Blätter sind im Alter typischerweise herzförmig im Gegensatz zu den kreisrunden Blättern der T. fortunei. Jedoch ist oberflächlich kaum ein Unterschied zu T. fortunei festzustellen, wie das Foto (Abb. 1.9) aus Kalamuni (Kumaon) belegt, welches auf einer Expedition von Gibbons und Spanner im Oktober 2005 aufgenommen wurde (Spanner, pers. Mitt.). Daher kann nicht ausgeschlossen werden, daß fehlbestimmtes Material unter den Namen T. takil in den Handel gelangte.

83 Diskussion 74 Da T. wagnerianus inzwischen als Synonym von T. fortunei angesehen wird (Govaerts & Dransfield, 2006), überrascht die Homogenität der Sequenz von T. fortunei #11 mit T. wagnerianus #8 ebenfalls nicht. Proben der T. takil aus Kalamuni und Thalkedar (Kumaon) konnten erst in der folgenden AFLP Analyse miteinbezogen werden. Eine ITS Analyse dieser Herkünfte wäre sicher interessant. Die nahe Verwandtschaft der reniformen Trachycarpus wird in der Bootstrap Berechnung mit 99% gestützt (Abb. 3.11). Trachycarpus martianus #23 repräsentiert die kaffeebohnenförmige Samen ausbildende Gruppe und steht als Schwestergruppe zu den reniformen Trachycarpus. Rhapidophyllum hystrix #18 als Vertreter der Thrinacinae in der neuen Welt gehört morphologisch in die altweltliche Gruppe der Thrinacinae (Uhl et al., 1987). Im Cluster der Aussengruppen, bestehend aus Rhapidophyllum hystrix #4, Guihaia argyrata #19, Chamaerops humilis #5 und Trithrinax campestris #18 (Abb. 3.9), steht Rhapidophyllum dem Trachycarpus Clade am nächsten. Eine Erklärung kann die Kontinentalverschiebung darstellen. Vor ungefähr 135 Millionen Jahren brach der Kontinent Laurasia auseinander, woraus Nord-Amerika und Asien entstanden (Abb. 4.3). Abbildung 4.3: Die Verteilung der Kontinente vor ca. 135 Millionen Jahren (Quelle: Möglicherweise existierten damals Vorfahren der heutigen Gattungen Trachycarpus und Rhapidophyllum im Bruchbereich und evoluierten getrennt auf den separaten Kontinenten. Trithrinax campestris #18 ist eine Art aus Südamerika und gruppiert in der exhaustive search Analyse mit Chamaerops humilis #5, einer Vertreterin der Thrinacinae aus Süd- Europa. Dieser Clade wird in der Bootstrap Berechnung mit nur 61% gestützt. Der Guihaia argyrata #19 Zweig aus Süd-China kollabiert hier. Die gesamte Aussengruppe ist gegenüber dem Trachycarpus Cluster mit 97% abgestützt.

84 Diskussion 75 Die ITS Analyse erbrachte keine nennenswerte Auflösung innerhalb der Trachycarpus Gruppe mit reniformen Samen. Als Ursache ist ein hoher Grad an Konservierung der ITS Region der Gattung Trachycarpus zu nennen. Es ist auch nicht auszuschließen, dass Probenmaterial von T. fortunei als T. takil bzw. T. fortunei x takil deklariert wurde. Die Hybridisierungsfähigkeit einzelner Arten untereinander ist auch nicht ausschöpfend ermittelt worden, um klären zu können, ob es sich um Morpho- oder Biospezies handelt. Trotz unterscheidbarer Sequenzen lösten innerhalb der Aussengruppen nur Chamaerops humilis #19 mit Trithrinax campestris #18 klar auf (Abb. 3.11). ITS Sequenzierungen innerhalb der Subtribus Thrinacinae scheinen keine Probleme zu bereiten. Da die Thrinacinae hauptsächlich Zierpalmen umfassen von wirtschaftlich geringerem Wert, scheint es keine eingehenderen Studien zu geben.

85 Diskussion Diskussion der AFLP Analyse AFLP Analysen sind allgemein schneller etablierbar als Mikrosatelliten Analysen, da sie keine zusätzlichen Sequenzinformationen erfordern. In der Regel stellen AFLP dominante Marker dar, d. h. es kann nicht zwischen homozygoten und heterozygoten Loci unterschieden werden. Sie erreichen eine hohe Multiplex-Ratio, da sie in einer PCR Reaktion verschiedenste Bereiche der Genome amplifizieren. AFLPs erzeugen einen hohen Grad an Polymorphie, die besonders bei entfernt verwandten Taxa zur unpräzisen Aufklärung der verwandtschaftlichen Beziehungen führen können. Ein weiteres Problem sind nicht-homologe Fragmente, die als homolog betrachtet werden, da sie zufällig die gleiche Länge besitzen. Dies trifft häufiger bei entfernt verwandten Taxa auf. Hier würde nur Sequenzierung der erhaltenen DNA-Fragmente helfen. Neben der Mutation einer Restriktionsschnittstelle können Deletionen, Insertionen und Duplikationen (beispielsweise eines Mikrosatelliten-Motivs) zur Veränderung der Fragmentlängen führen. Verschiedene Ursachen können also zufällig zu Veränderung von Fragmenten mit gleicher Länge führen. Ein weiterer Hauptfaktor für verfälschte Analysen ist methylierte oder verunreinigte DNA. Methylierungen der DNA bewirken, daß Restriktionsschnittstellen nicht mehr erkannt und geschnitten werden. Verunreinigte DNA kann auch zu einem partiellem Verdau während der Reaktion führen, so daß Fragmente größerer Länge amplifiziert werden. AFLP können jedoch eine Phylogenie aufklären, wenn Sequenzen zu konserviert sind, um phylogenetische Signale zu beinhalten (Robinson & Harris, 1999). Die Isolierung genomischer DNA aus alten Herbarproben ist meist erschwert, da die DNA sehr oft degradiert ist. Dies hängt in erster Linie nicht vom Alter der Proben, sondern von der Art der Konservierung ab. Von Extraktion über 100 Jahre alter DNA wurde berichtet (Jankowiak et al., 2005). Eine weitere Fehlerquelle stellen Kontaminationen mit fremder Eukaryoten-DNA dar, daher sollten Proben eingehend darauf überprüft werden. Die DNA Isolierungsmethode entscheidet besonders bei AFLP Analysen ebenfalls über die Qualität der DNA, da verschiedene DNA Isolierungskits die DNA unterschiedlich gut aufreinigen und enzymatisch behandeln (Elling, 2004). Daher sollte für die untersuchten Taxa möglichst eine Isolierungsmethode benutzt werden.

86 Diskussion 77 Für die Distanzberechungsmethoden UPGMA und Neighbor joining kann die Reihenfolge der Taxa in einer Matrix-Tabelle Einfluß auf das Ergebnis haben (Wägele, 2000). Weitere Schwierigkeiten kann der Smiley-Effekt bereiten, wenn dieser nicht schon von einer guten Auswertungssoftware ausgeglichen wird. AFLPs wurden u.a. erfolgreich zur Aufklärung verwandtschaftlicher Beziehungen und genetischer Variation von Populationen von Euterpe edulis eingesetzt, einer Palmenart, deren Palmenherzen in Südamerika verspeist werden. In jener Studie ergaben fünf getestete Primerkombinationen an 150 Individuen 429 Marker, davon waren 92,07% polymorph (Cardoso et al., 2000). In einer anderen Studie wurde nachgewiesen, daß Samen der Bactris gasipaes (Pfirsichpalme) durch den Handel weiter verbreitet wurden als durch natürliche Vektoren wie Vögel und Nagetiere (Adin et al., 2004). Mittels AFLP wurden auch die Cocos nucifera Formen Typica (lange Form), Aurantiaca (intermediär) und Nana (Zwergform) auf Sri Lanka molekular typisiert (Perera et al., 1998). In einer weiterführenden SSR und AFLP Untersuchung wurden Cocos nucifera Populationen aus dem gesamten Verbreitungsgebiet untersucht. Analysiert wurden 31 Individuen aus 14 Populationen. AFLP Daten ermöglichten eine bessere Auflösung zwischen Populationen, während SSR Daten einen genaueren Einblick innerhalb von Populationen gewährten. Cocos nucifera ließ sich grob in die südostasiatisch-pazifische und südasiatischwestafrikanische Gruppe einteilen. Durch den Handel an der ostafrikanischen Küste gelangten Kokosnüße aus anderen Gebieten in die indigenen Populationen (Teulat et al., 2000). Da Trachycarpus Arten in ITS Sequenzen einen hohen Grad an Konservierung offenbarten, erschien es zweckmäßig höherauflösende AFLP zur Untersuchung dieser Gattung zu verwenden.

87 Diskussion Diskussion der AFLP Analyse und ITS Analyse Die folgenden Phylogramme wurden mit der UPGMA Methode berechnet, wenn nicht anderes angegeben wird. Die einzelnen Trachycarpus Arten lassen sich wiederkehrenden Gruppen und Clustern zuordnen. In Phylogramm 5 und 6 (Abb. 3.12, PK A und Abb PK B) tauchen T. wagnerianus, T. princeps und T. nanus als Gruppen auf. In Phylogramm 6 bilden T. nanus zwei Clades, da T. cf. princeps #120a hier gruppiert, jedoch in Phylogramm 5 jedoch mit der T. wagnerianus Gruppe. Vermutlich ist dieses Springen auf die DNA Qualität dieser Probe zurückzuführen. Da T. wagnerianus als Form der T. fortunei gilt (Govaerts & Dransfield, 2006), bilden T. wagnerianus Exemplare Gruppen mit T. fortunei (Abb. 7.5, Phylogramm 7, PK A; Abb. 7.6, Phylogramm 8, PK B). In Phylogramm 9 und 10 (Abb. 3.14, PK A und Abb. 3.15, PK B) bilden Individuen von T. princeps, T. oreophilus, T. geminisectus und T. ukhrulense abgrenzbare Cluster. T. Manipur und T. NagaHills sind ältere Arbeitsnamen der beschriebenen T. ukhrulense. In Phylogramm 10 (Abb. 3.15) bildet T. princeps zwei Clades. Trachycarpus princeps Gruppe I besteht aus Individuen der Firma Rarepalmseeds (Ausnahme T. princeps #118, diese stammt von Europalms). Trachycarpus princeps Gruppe II beinhaltet Individuen der Firma Europalms (Belgien). Abbildung 4.4 veranschaulicht das Verbreitungsgebiet der T. princeps.

88 Diskussion 79 Abbildung 4.4: Verbreitung der T. princeps entlang des Nujiang (Yunnan, China) (Karte: James Verhaegen). Die Phylogramme 11 und 12 bilden die T. takil & T. ukhrulense, T. fortunei und T. martianus Gruppen ab (Abb. 3.16, PK A und Abb. 3.17, PK B). Die T. ukhrulense Gruppe bildet einen Schwesterclade zu T. takil aus Indien (Kalamuni und Thalkedar, Kumaon). Proben dieser T. takil stammen von Spanner & Gibbons aus einer Expedition im Wildhabitat im Oktober 2005 (Spanner, pers. Mitt.). Trachycarpus Myanmar (unbeschriebene Form) fällt ebenfalls in die T.takil & T. ukhrulense Gruppe. DNA der T. takil #130 (Kaushani, Kumaon) wurde als DNA Isolat von den Royal Botanic Gardens Kew zur Verfügung gestellt. DNA dieser Proben wurden mit einem Qiagen Kit isoliert (Kapinos, pers. Mitt.). Geographisch ist diese Herkunft eng benachbart mit den Herkünften aus Kalamuni und Thalkedar. DNA aus Proben von T. takil Herbarmaterial aus Rom und Florenz (#137 - #140) erwiesen sich als zu degradiert, bildeten aber eigene Cluster (Abb. 7.5, Phylogramm 7, PK A; Abb. 7.6, Phylogramm 8, PK B). Sie wurden in den Gesamtphylogrammen daher ausgeschlossen. Abbildung 4.5 zeigt das Trachycarpus takil

89 Diskussion 80 Becc. Herbarblatt (Holotyp) des Herbariums der Universität Florenz, von der die Probe #139 stammt. Abbildung 4.5: Herbarblatt (Holotyp) der Trachycarpus takil Becc. (Quelle: Herbarium der Universität Florenz, Cuccuini).