Von Anna-Katharina Döring Bielefeld

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1 DISSERTATION Untersuchungen über entzündliche Veränderungen in der Synovialmembran der Kniegelenke von Hunden und deren Korrelation mit degenerativen Alterationen der Kreuzbänder Von Anna-Katharina Döring Bielefeld Hannover 2016

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4 Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. 1. Auflage by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany ISBN Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße Gießen 0641/

5 Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchungen über entzündliche Veränderungen in der Synovialmembran der Kniegelenke von Hunden und deren Korrelation mit degenerativen Alterationen der Kreuzbänder INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.) vorgelegt von Anna-Katharina Döring Bielefeld Hannover 2016

6 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein Institut für Pathologie 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Ralph Brehm Tag der mündlichen Prüfung:

7 Für meine Familie und für mich zur Freude!

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9 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Literaturübersicht Allgemeiner Gelenkaufbau Gelenkkapsel Stratum fibrosum Stratum synoviale Spezieller Gelenkaufbau Anatomie des Kniegelenks des Hundes Histologie der Strukturen des Kniegelenks Kreuzbänder Synovialmembran Die Kreuzbandruptur beim Hund Klinik und Diagnose der Kreuzbandruptur Therapie der Kreuzbandruptur Ätiologie und Pathogenese der Ruptur des kranialen Kreuzbands Epidemiologische Faktoren bei Hunden mit kranialer Kreuzbandruptur Anatomische und histologische Faktoren bei Hunden mit kranialer Kreuzbandruptur Immunpathologische Mechanismen der Kreuzbandruptur Histologische Veränderungen im Kniegelenk Veränderungen am Kreuzband Veränderungen an der Synovialmembran Makrophagen Aktivierung und Polarisation Makrophagen-spezifische Markermoleküle... 33

10 II Inhaltsverzeichnis CD S100A8/S100A9 (Calprotectin) MHC-Klasse-II-Moleküle Tartrat-resistente saure Phosphatase Material und Methoden Untersuchungsmaterial Probengewinnung und -aufbereitung Makroskopische Beurteilung der Kniegelenke Hämatoxylin-Eosin-Färbung Spezialfärbungen Lichtmikroskopische Beurteilung Beurteilung der Kreuzbandproben Beurteilung der Synovialmembranproben Immunhistochemie Primärantikörper Sekundärantikörper Vorversuche Durchführung der immunhistochemischen Reaktionen Kontrollen Auswertung und Dokumentation Enzymhistochemischer Nachweis von Tartrat-resistenter saurer Phosphatase Durchführung der enzymhistochemischen Reaktion Kontrollen Auswertung und Dokumentation Statistische Auswertung... 60

11 Inhaltsverzeichnis III 4 Ergebnisse Makroskopische Befunde Histologische Befunde Histologische Befunde an den Kreuzbandproben Histologische Befunde an den Synovialmembranproben Statistische Ergebnisse Regressionsanalyse Tabellenanalyse Korrelationsanalyse nach Spearman Kruskal-Wallis-Test und Wilcoxon-Mann-Whitney-Test Wilcoxon Signed-Rank Test und Friedman-Test Immunhistochemische und enzymhistochemische Ergebnisse an den Synovialmembranproben Immunhistochemische und statistische Ergebnisse zu CD Immunhistochemische und statistische Ergebnisse zu S100A8/S100A9 (Calprotectin) Immunhistochemische und statistische Ergebnisse zu MHC Klasse II Antigen Statistische Ergebnisse des Vergleichs von CD163 +, S100A8/S100A9 + und MHC II + Makrophagen in Synovialmembranproben mit und ohne histologisch festgestellten entzündlichen Alterationen Enzymhistochemische Ergebnisse zum Nachweis Tartrat-resistenter saurer Phosphatase Immunhistochemische und statistische Ergebnisse zu CD3, CD79a Diskussion Histologische Alterationen Immunhistochemische und enzymhistochemische Ergebnisse Zusammenfassung

12 IV Inhaltsverzeichnis 7 Summary Literaturverzeichnis Anhang Ergebnistabellen... Fehler! Textmarke nicht definiert. 9.2 Puffer und Lösungen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung Citratpuffer Natriumborat-HCl-Puffer Tyramin TRIS Puffer Fast Garnet GBC Salzlösung Bezugsquellen für Geräte, Reagenzien, Chemikalien und Einmalartikel Abkürzungsverzeichnis Danksagung

13 1 Einleitung 1 1 Einleitung Progressive und irreversible degenerative Veränderungen des kranialen Kreuzbands sind die wesentliche Ursache für nicht traumatisch bedingte, spontan auftretende Rupturen des kranialen Kreuzbands beim Hund (DOOM et al., 2008; KNEBEL und MEYER-LINDENBERG, 2014). Trotz aller Bemühungen, die Ätiologie und Pathogenese der spontanen Kreuzbandruptur des Hundes zu entschlüsseln, sind die Mechanismen, die den degenerativen Veränderungen zu Grunde liegen, noch weitgehend unklar (DOOM et al., 2008). Es wird von einem multifaktoriellen Geschehen auf der Basis degenerativer Veränderungen des kranialen Kreuzbands ausgegangen (COOK, 2010; DE ROOSTER, et al. 2006). Aufgrund epidemiologischer Studien werden Alter, Rasse, Geschlecht und Körpergewicht der Hunde als Risikofaktoren für die kraniale Kreuzbandruptur diskutiert (VASSEUR et al., 1985; WHITEHAIR et al., 1993; WILKE et al., 2006). Bei mehr als der Hälfte aller Hunde mit spontaner, kranialer Kreuzbandruptur liegt zum Zeitpunkt der operativen Behandlung eine lymphoplasmazelluläre Synovitis vor (ERNE et al., 2009; GALLOWAY und LESTER, 1995). Bislang ist jedoch unklar, ob die Synovitis die Ursache oder die Folge der degenerativen Kreuzbandalterationen darstellt. Im Schrifttum wurden zwei Hypothesen zur Rolle der Synovitis bei der Entstehung der kranialen Kreuzbandruptur formuliert. Zum einen wird davon ausgegangen, dass die Synovitis das primäre Geschehen darstellt und zur fortschreitenden Degeneration des Kreuzbands mit anschließender Ruptur führt (DOOM et al., 2008; MUIR et al., 2005a, b). Zum anderen wird angenommen, dass Faktoren wie Alter, Geschlecht, Rasse, Körpergewicht (BENNETTT et al., 1988; HARASEN, 2003, 2008; VASSEUR et al., 1985; WHITEHAIR et al., 1993) und besondere anatomische Gegebenheiten (COMERFORD et al., 2006b; INAUEN et al., 2009; LEWIS et al., 2008; SMITH et al. 2011, 2012, 2014) zur Degeneration und zu minimalen Zerreißungen von Kollagenfasern führen, wodurch es zur Freisetzung von Kollagenfragmenten oder anderen Matrixbestandteilen aus dem Kreuzband und sekundär zur Entzündung der Synovialmembran kommt. Um die erstgenannte Hypothese zu überprüfen, sind insbesondere vergleichende histologische Untersuchungen an nicht rupturierten, degenerierten kranialen

14 2 1 Einleitung Kreuzbändern von Hunden und deren Korrelation mit histologischen Befunden an der Synovialmembran hinsichtlich entzündlicher Veränderungen erforderlich. Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war es, aus den Kniegelenken von Hunden mit nicht rupturierten Kreuzbändern postmortal entnommenen Synovialmembranproben hinsichtlich des Vorkommens entzündlicher Alterationen histologisch zu untersuchen und die Befunde mit dem Vorliegen degenerativer Veränderungen an den kranialen Kreuzbändern zu korrelieren. Des Weiteren wurden die histologischen Befunde mittels statistischer Testverfahren dahingehend analysiert, ob es Zusammenhänge zwischen dem Vorhandensein und dem Grad der Synovitis, dem Grad der Kreuzbanddegeneration und den oben genannten, disponierenden Faktoren gibt. Da an der Synovitis, die mit der Ruptur des kranialen Kreuzbands des Hundes assoziiert ist, Makrophagen beteiligt sind (KLOCKE et al., 2005; MUIR et al., 2005a), sollten in dieser Arbeit die in der Synovialis vorhandenen Entzündungszellen unter besonderer Berücksichtigung von Makrophagen immun- beziehungsweise enzymhistochemisch phänotypisiert werden.

15 2 Literaturübersicht 3 2 Literaturübersicht 2.1 Allgemeiner Gelenkaufbau Gelenke sind bewegliche Verbindungen von zwei oder mehreren knöchernen Skelettelementen (NICKEL et al., 2003). Es wird zwischen spaltfreien Knochenverbindungen (Synarthrosen) und echten Gelenken (Articulationes synoviales) unterschieden (KÖNIG und LIEBICH, 2005). Ein Gelenk setzt sich typischerweise zusammen aus den mit hyalinem Gelenkknorpel überzogenen Gelenkenden, zwei oder mehreren Knochen, aus der die Gelenkhöhle umschließenden Gelenkkapsel und aus den Gelenkbändern. Bei den Gelenkbändern werden extrakapsuläre und intrakapsuläre Bänder unterschieden (NICKEL et al., 2003). Echte Gelenke (Articulationes synoviales) bestehen im Grundbauplan aus der Gelenkkapsel (Capsula articularis), der Gelenkhöhle (Cavum articulare) mit der darin befindlichen Gelenkflüssigkeit (Synovia) und dem hyalinen Gelenkknorpel (Cartilago articularis), der die freien Enden der Knochen überzieht (KÖNIG und LIEBICH, 2005). Innerhalb inkongruenter Gelenke können Disci articulares oder Menisci articulares vorhanden sein (WIESNER und RIBBECK, 1991) Gelenkkapsel Die Gelenkkapsel (Capsula articularis) setzt sich zusammen aus dem äußeren Stratum fibrosum, einer derbfaserigen Schicht, und einer inneren zell-, gefäß- und nervenreichen Schicht, dem Stratum synoviale (Synovialmembran), welches die Gelenkhöhle auskleidet und wiederum aus Intima synovialis und Stratum subsynoviale besteht. Die Gelenkkapsel geht an den Rändern der Gelenkflächen aus dem Periost beziehungsweise dem Perichondrium hervor und umschließt die Gelenkhöhle (KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003).

16 4 2 Literaturübersicht Stratum fibrosum Das Stratum fibrosum der Gelenkkapsel besteht aus faserreichem, kollagenem Bindegewebe. Die Wandstärke variiert je nach Beanspruchung. Sie ist nur gering durchblutet, aber besitzt eine ausgeprägte nervale Versorgung. Sie kann durch Bänder zum Teil verstärkt sein (KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003) Stratum synoviale Die Synovialmembran kleidet die Gelenkhöhle nach innen aus, sie besteht aus einer Deckzellschicht, der Intima synovialis und dem darunter liegenden Stratum subsynoviale, auch als Subintima bezeichnet. Das Stratum synoviale kann Zotten (Villi synovialis) ausbilden und ist für die Produktion der Synovia verantwortlich (EVANS und DE LAHUNTA, 2013). Die Subintima enthält Gefäße und nervale Elemente. Die Deckzellschicht des Stratum synoviale wird von unterschiedlichen Synoviozyten gebildet, welche sich lichtmikroskopisch als pleomorphe Zellen mit einer großen Variabilität in Größe, Form und Anzahl darstellen. Sie bilden eine diskontinuierliche Grenze zwischen Gelenkhöhle und der Subintima (HENDERSON und PETTIPHER, 1985; KÖNIG und LIEBICH, 2005). Nach histologischen und ultrastrukturellen Untersuchungen wurden zwei morphologisch unterschiedliche Zellpopulationen beschrieben. Sie werden als Typ A- und Typ B-Synoviozyten bezeichnet und sind auch beim Hund beschrieben (HENDERSON und PETTIPHER, 1985). In der Literatur (siehe 2.3.2) wird auch ein intermediärer Zelltyp, Typ C, angegeben (THOMPSON und STOCKWELL, 1983). 2.2 Spezieller Gelenkaufbau Anatomie des Kniegelenks des Hundes Das Kniegelenk (Articulatio genus) ist ein komplexes Gelenk, welches sich aus zwei Gelenken zusammensetzt, dem Kniescheibengelenk (Articulatio femoropatellaris) und dem Kniekehlgelenk (Articulatio femorotibialis). Von einzelnen Autoren wird auch

17 2 Literaturübersicht 5 die proximale Verbindung zwischen Tibia und Fibula (Articulatio tibiofibularis proximalis) zum Kniegelenk gezählt (ROBINS, 1990). Das Kniescheibengelenk wird vom Femur und der Patella gebildet, es handelt sich um ein Schlittengelenk, bei dem die Patella auf der Trochlea des Femurs gleitet. Die Gelenkkapsel (Capsula articularis) dieses Gelenks ist geräumig und buchtet sich nach proximal unter den Musculus quadriceps femoris und an den Seiten dieses Muskels aus (KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003). Nach distal grenzt die Gelenkkapsel an die Gelenkhöhle des Kniegelenks und steht mit dieser in Verbindung. Die Ansatzsehne des Musculus quadriceps femoris bildet das Ligamentum patellae (Abbildung 2.1), in welches die Patella als Sesambein eingelagert ist und das an der Tuberositas tibiae ansetzt. Dem Band ist der Kniefettkörper (Corpus adiposum infrapatellare) unterlagert (KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003). Medial und lateral der Patella liegt der Cartilago parapatellaris mediale et laterale. Dorsal weist dieser eine Verbindung auf (EVANS und DE LAHUNTA, 2013). Als weitere Bänder des Kniescheibengelenks kommen das Ligamentum femoropatellare laterale und mediale vor (KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003), wobei diese beim Hund nur undeutlich ausgeprägt sind und sich kaum von den Faszienverstärkungen abgrenzen (NICKEL et al., 2003). Das Ligamentum femoropatellare laterale und mediale halten die Patella in der Trochlea (ROBINS, 1990). Die Artikulation des Kniekehlgelenks wird vom Femur beziehungsweise seinen Kondylen und der Tibia gebildet. Nach Angabe verschiedener Autoren handelt sich um ein unvollkommenes Wechselgelenk (KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003). Vereinzelt wird es auch als Rollgleitgelenk (FREWEIN und VOLLMERHAUS, 1994) beschrieben. Auf Grund der Inkongruenz der Gelenkflächen sind ein medialer und ein lateraler Meniscus articularis eingelagert. Es sind Streck- und Beugebewegungen sowie durch die Verschiebbarkeit der Menisken auch Drehbewegungen möglich (KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003). Die Gelenkkapsel ist weit, sie setzt an den Gelenkrändern der beteiligten Knochen und an den Außenrändern der Menisken an und schließt die Sesambeine in den Ursprungssehnen der beiden Gastrocnemiusköpfe ein. Das Stratum synoviale teilt durch Einstülpung die Gelenkhöhle in eine laterale und eine mediale Höhle, wobei diese miteinander in

18 6 2 Literaturübersicht offener Verbindung stehen. Die Gelenkhöhle des Kniekehlgelenks steht beim Hund ebenfalls mit der des Kniescheibengelenks in Verbindung. (KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003). Nach EVANS und DE LAHUNTA (2013) ist die Gelenkkapsel des Kniegelenks die größte des Körpers. Sie bildet drei Aussackungen aus, zwei zwischen den Kondylen von Femur und Tibia (Saccus medialis und Saccus lateralis) und die dritte unter der Patella. Die Menisken teilen die Gelenkhöhle zusätzlich in eine proximale und eine distale Abteilung (NICKEL et al., 2003). Die laterale Gelenkhöhle weist zwei Aussackungen auf, eine umschließt die Ursprungssehne des Musculus extensor digitorum longus, die andere umhüllt die Sehne des Musculus popliteus (KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003). Abbildung 2.1: Schematische Darstellung der Bänder im Kniegelenk des Hundes (modifiziert nach ARNOCZKY, 1985); Kreuzbänder (Ligamentum cruciatum craniale et caudale) gelb unterlegt.

19 2 Literaturübersicht 7 Die Abbildung 2.1 zeigt die Bänder des linken Kniegelenks eines Hundes. Die Bänder lassen sich in zwei Arten einteilen: in Bänder der Menisken und Bänder des Kniekehlgelenks. Beim Hund werden die Menisken durch insgesamt sechs Bänder fixiert (ARNOCZKY, 1985; NICKEL et al., 2003). Dazu gehören die jeweils medial und lateral befindlichen Ligamenta tibiale craniale, welche den kranialen Winkel der Menisken mit der medialen beziehungsweise lateralen Area intercondylaris cranialis der Tibia verbinden. Des Weiteren gehören dazu das Ligamentum tibiale caudale menisci medialis, welches vom kaudalen Rand in die Area intercondylaris caudalis zieht, und das Ligamentum tibiale caudale menisci lateralis, welches den kaudalen Rand des lateralen Meniskus mit der Incisura poplitea verbindet (NICKEL et al., 2003). Der laterale Meniskus wird kaudal zudem durch das Ligamentum meniscofemorale noch an der interkondylären Fläche des medialen Kondylus fixiert. Bei Hund und Katze und manchmal beim Rind kommt noch das Ligamentum transversum genus vor, welches die beiden Menisken an ihrem kranialen Winkel als Querstrang miteinander verbindet (NICKEL et al., 2003). Die Bänder des Kniekehlgelenks sind die zwei Seitenbänder, Ligamentum collaterale mediale und laterale und die Kreuzbänder (Ligamenta cruciata genus). Von KÖNIG und LIEBICH (2005) wird noch ein Ligamentum popliteum obliquum, welches von proximal und lateral nach mediodistal verläuft, beschrieben. Die Seitenbänder verlaufen zwischen den Bandhöckern des Femurs und der Tibia beziehungsweise der Fibula und verbinden so den Femur mit dem Unterschenkel. Das mediale Seitenband verbindet sich in seinem Verlauf zudem noch mit dem medialen Meniskus (KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003). Die Kreuzbänder (Ligamenta cruciata genus) liegen zentral im Gelenk (KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003). Durch die bereits beschriebene Einstülpung der Synovialmembran liegen die Kreuzbänder intraartikulär aber extrasynovial und sind von Synovialmembran überzogen (BUDRAS und MÜLLING, 2012; EVANS und DE LAHUNTA, 2013).

20 8 2 Literaturübersicht Das kraniale Kreuzband (Ligamentum cruciatum craniale oder cranial cruciate ligament) zieht von einem kaudalen Teil der medialen Seite des lateralen Gelenkknorren aus der Fossa intercondylaris in kraniomediale und distale Richtung (ARNOCZKY und MARSHALL, 1977) zur Tibia und setzt in der Area intercondylaris centralis an (Abbildung 2.1) (KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003). Nach ARNOCZKY und MARSHALL (1977) und nach EVANS und DE LAHUNTA (2013) zieht das kraniale Kreuzband über die interkondyläre Fossa und setzt in der Area intercondylaris cranialis an. Zudem ziehen einige Fasern an den kraniolateralen Teil des Tuberculum intercondylare mediale (ARNOCZKY und MARSHALL, 1977). Das kraniale Kreuzband besteht aus einem kaudolateralen und einem kraniomedialen Anteil (ARNOCZKY und MARSHALL, 1977; KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003). Der Großteil der Fasern des kranialen Kreuzbands ist gespannt bei der Streckung und locker und gewunden bei der Beugung des Kniegelenks. Der kraniomediale Teil bleibt auch bei der Streckung gespannt. Wird das gesamte kraniale Kreuzband durchtrennt, lässt sich bei der Streckung eine so genannte kraniale Schublade, das heißt eine Verschiebung der Tibia zum Femur von 2 mm und bei einer Beugung von 90 eine Verschiebung von 9,5 mm auslösen (ARNOCZKY und MARSHALL, 1977). Damit ist das kraniale Kreuzband maßgeblich verantwortlich für die kranio-kaudale Stabilität des Kniegelenks. Das kaudale Kreuzband (Ligamentum cruciatum caudale) zieht aus der Fossa intercondylaris, von der lateralen Fläche des medialen Kondylus (KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003), genauer vom ventralen Teil (ARNOCZKY und MARSHALL, 1977) in kaudodistaler Richtung zur Incisura poplitea und setzt hier sowie in der Area intercondylaris caudalis an (Abbildung 2.1) (ARNOCZKY und MARSHALL, 1977; KÖNIG und LIEBICH, 2005; NICKEL et al., 2003). Es ist ebenfalls leicht gewunden und besitzt einen kranialen und einen kaudalen Anteil. Der kraniale Anteil zeigt sich straff bei Beugung und locker bei Streckung, der kaudale Anteil des kaudalen Kreuzbands locker bei Beugung und straff bei Streckung. Durchtrennt man das gesamte hintere Kreuzband, lässt sich die Tibia zum Femur, in gestrecktem Zustand 2 mm und bei einer Beugung von 90 um 8 mm nach kaudal verschieben (so genannte kaudale Schublade) (ARNOCZKY und MARSHALL, 1977).

21 2 Literaturübersicht Histologie der Strukturen des Kniegelenks Kreuzbänder Die Kreuzbänder werden von einer epiligamentösen Membran umhüllt, nur die Stelle, an der die Kreuzbänder sich berühren, ist frei. Während der Entwicklung des Kniegelenks kommt es zu einer Einstülpung des Stratum synoviale, welches dadurch die Kreuzbänder umgibt (BUDRAS und MÜLLING, 2012; EVANS und DE LAHUNTA, 2013). Die epiligamentöse Membran besteht aus einer Einzelzellschicht von Synoviozyten und einer areolären Subintima (VASSEUR et al., 1985). Die Synovialmembran, welche die Kreuzbänder umgibt, weist ultrastrukturell etwa 5 µm große Fenster auf, was eine Infiltration des Kreuzbands durch die Synovia erlaubt (KOBAYASHI et al., 2006). Die Kreuzbänder bestehen zu über 90% aus Kollagenfasern vom Typ I, der Rest sind Kollagenfasern vom Typ III. Die Kollagenfasern werden von Fibroblasten gebildet und bestehen aus größeren Bündeln von Kollagenfibrillen (LIEBICH, 2004). Bei der Bildung des Kollagens entsteht intrazellulär zunächst Prokollagen aus drei α-polypeptidketten, beim Kollagen vom Typ I sind das zwei gleichartige Peptidketten (Alpha-1-Kette) und eine andersartige Peptidkette (Alpha-2-Kette). Extrazellulär entsteht Tropokollagen (280 nm Länge), welches sich aneinander lagert. Zudem verbinden sich die Enden einzelner Tropokollagene zu Mikrofibrillen ( nm). Diese Mikrofibrillen lagern sich wiederum zu Kollagenfibrillen (Durchmesser circa 0,2 0,5 µm) zusammen und durch weitere Anlagerung und Quervernetzung entstehen die Kollagenfasern (Durchmesser circa 1 20 µm) (LIEBICH, 2004). Die Kollagenfasern liegen in Faserbündeln zusammen. Zwischen den Kollagenfaserbündeln liegt feines, lockeres, gefäßhaltiges Bindegewebe (NARAMA et al., 1996; Zahm, 1964). Die Kollagenfaserbündel besitzen histologisch ein gewelltes Erscheinungsbild (LIEBICH, 2004; DE ROOSTER, et al., 2006). Die Kollagenfasern des Kreuzbands sind parallel zur Längsachse ausgerichtet. Eine Ausnahme stellen die knöchernen Ansatzstellen der Kreuzbänder dar (DE ROOSTER, et al. 2006). VASSEUR et al. (1985) beschreiben, dass an der Stelle, an der sich die Kreuzbänder berühren, die Kollagenfasern dichter und tangential anstatt parallel zur Längsachse liegen. An den knöchernen Ansatzstellen der Bänder finden sich, insbesondere bei jüngeren Tieren,

22 10 2 Literaturübersicht Knorpelzellen im Kreuzband (ZAHM, 1964). Die Fibrozyten haben im gesunden Kreuzband ein fusiformes bis leicht ovoides Erscheinungsbild und liegen parallel in Reihen zwischen den Kollagenfasern (HAYASHI et al., 2003). Die Gefäßversorgung sowohl des vorderen als auch des hinteren Kreuzbands erfolgt hauptsächlich über die Synovialmembran, welche die Bänder umgibt und den Kniefettkörper überzieht (ARNOCZKY et al., 1979). Zahlreiche Gefäße bilden ein Netzwerk in der Synovialmembran, von denen nur wenige das kraniale Kreuzband infiltrieren. Von Seiten des Knochens besteht keine Gefäßversorgung (KOBAYASHI et al., 2006). Der mittlere Anteil des kranialen Kreuzbands ist nach Angaben mehrerer Autoren (ARNOCZKY et al., 1979; TIRGARI, 1978; VASSEUR et al., 1985; ZAHM, 1964) schlechter vaskularisiert als der Rest des Bandes Synovialmembran Nach KEY (1928) und LIPOWITZ et al. (1985) lässt sich die Synovialmembran (Stratum synoviale) histologisch in verschiedene Typen einteilen, den areolären Typ, den adipösen Typ und den fibrösen Typ, wobei die Grenzen fließend sind und an den Übergängen intermediäre Typen vorkommen. Der areoläre Typ kommt an Stellen des Gelenks mit physiologisch hoher Beweglichkeit vor. Der areoläre Typ besitzt eine undulierende oder gefaltete Oberfläche und ein Stratum subsynoviale mit lockerem Bindegewebe und zahlreichen, kleinen Gefäßen unter der Intima synovialis. Beim adipösen Typ der Synovialmembran reichen die Adipozyten direkt bis an die Intima heran. Beim fibrösen Typ besteht das Stratum subsynoviale vor allem aus dichtem, kollagenem Bindegewebe (KEY, 1928; LIPOWITZ et al., 1985). Eine Basalmembran gibt es bei keinem der Typen (WYSOCKI und BRINKHOUS, 1972). Die Intima synovialis des Kniegelenks ist meist dünn und besteht aus ein bis zwei Zelllagen (JOHNSTON, 1997; VASSEUR et al., 1985). Die Intima synovialis weist zwei Typen von Zellen auf, Makrophagen-ähnliche Zellen (Typ A-Synoviozyten) und Fibroblasten-ähnliche Zellen (Typ B-Synoviozyten). Die Typ A-Synoviozyten sind polygonal mit rundem oder ovalem Kern und dienen der Phagozytose und Antigen-

23 2 Literaturübersicht 11 präsentation. Typ B-Synoviozyten sind länglich mit spindelförmigem Kern und produzieren die Synovia (JOHNSTON, 1997). Ultrastrukturelle Untersuchungen der Synovialmembran zeigen, dass Typ A-Synoviozyten zahlreiche Vakuolen, einen randständig liegenden Zellkern, prominente Golgi- Apparate und ein mit nur wenigen Ribosomen besetztes (raues) endoplasmatisches Retikulum enthalten (THOMPSON und STOCKWELL, 1983; WYSOCKY und BRINKHOUS, 1972). Die Typ B-Synoviozyten zeichnen sich durch reichlich raues endoplasmatisches Retikulum, nur wenig Golgi-Membranen und nur einige wenige Vakuolen aus. Die Typ B-Synoviozyten dienen der Sekretion (THOMPSON und STOCKWELL, 1983; WYSOCKY und BRINKHOUS, 1972). Synoviozyten vom intermediären Typ (Typ C-Synoviozyten) enthalten reichlich Golgi-Membranen und raues endoplasmatisches Retikulum (THOMPSON und STOCKWELL, 1983). Der Ursprung der Typ A- und Typ B-Synoviozyten ist nicht endgültig geklärt. Manche Autoren nehmen an, dass der intermediäre Typ C eine Vorläuferzelle der Typ A- und Typ B-Synoviozyten darstellt (THOMPSON und STOCKWELL, 1983), andere bezweifeln deren Existenz (HENDERSON und PETTIPHER, 1985). Es wird postuliert, dass sich die Synoviozyten lokal aus Zellen der Subintima entwickeln, dass sie embryologisch von primitiven Mesenchymzellen abstammen oder dass sie Teil des mononukleären Phagozytensystems (MPS) sind. Die Morphologie der Typ A- und Typ B-Synoviozyten weist nach HENDERSON und PETTIPHER (1985) Ähnlichkeiten mit der Morphologie von aktivierten und residenten Makrophagen auf. Aufgrund der Morphologie, der Expresssion von MHC II sowie der Phagozytose und Antigenpräsentation der Typ A-Synovialdeckzellen werden diese auch als Makrophagen (-ähnliche Zellen), die Typ B-Synoviozyten hingegen als Fibroblasten (-ähnliche Zellen) bezeichnet (BURMESTER et al., 1983; BURMESTER et al., 1987; IWANAGA et al. 2000; SUTTON et al. 2009). 2.4 Die Kreuzbandruptur beim Hund Die Ruptur des vorderen Kreuzbands ist eine seit langem bekannte Erkrankung in der Veterinärmedizin (COMERFORD et al., 2011) und ist der häufigste Grund für

24 12 2 Literaturübersicht eine chronische Lahmheit der Beckengliedmaßen und damit assoziierter sekundärer Arthrose (osteoarthritis, OA) (NESS et al., 1996). Die Ruptur des Kreuzbands kann partiell oder vollständig sein. In der Regel ist das kraniale Kreuzband allein betroffen, während Rupturen des kaudalen Kreuzbands nur selten vorkommen. Eine gleichzeitige Ruptur von vorderem und hinterem Kreuzband kommt sehr selten vor (PAATSAMA, 1952). Bei 88% der Hunde mit Ruptur des kranialen Kreuzbands wurden gleichzeitig Veränderungen am kaudalen Kreuzband festgestellt (SUMNER et al., 2010). Nach einer Ruptur des kranialen Kreuzbands kommt es häufig auch zur Ruptur des kontralateralen kranialen Kreuzbands (CHUANG et al., 2014; FULLER et al. 2014). GRIERSON et al. (2011) berichten, dass es bei 38,7% der Hunde meist zeitlich versetzt zu einer bilateralen Ruptur des kranialen Kreuzbands kommt Klinik und Diagnose der Kreuzbandruptur Die klinischen Symptome treten bei einer Kreuzbandruptur plötzlich oder schleichend auf und nur selten ist vorberichtlich ein Trauma bekannt. Bei plötzlichem Auftreten der Symptome ist eine graduell variierende Lahmheit eines Hinterbeines zu beobachten (BENNETTT et al., 1988; CAROBBI und NESS, 2009). Hunde mit allmählich fortschreitender, schleichender Krankheitssymptomatik zeigen einen unsicheren Gang, ein Nachziehen der Hintergliedmaße und Lahmheit nach Belastung. Darüber hinaus zeigt sich die betroffene Gliedmaße steif, insbesondere nach Ruhe und die Hintergliedmaße ist schmerzhaft (BENNETTT et al., 1988). PAATSAMA (1952) beschreibt, dass es sich häufiger um einen schleichenden Prozess mit einer langsam entstehenden Lahmheit handelt, was auf die langsam voranschreitende Ruptur eines degenerativ veränderten Kreuzbands zurückzuführen ist. Die Diagnose kraniale Kreuzbandruptur wird routinemäßig durch eine klinische und röntgenologische Untersuchung gestellt. Als spezielles Diagnostikum der klinischen Untersuchung zur Feststellung einer Ruptur des vorderen Kreuzbands stehen insbesondere der kraniale Schubladentest und der Tibiakompressionstest zur Verfügung (CAROBBI und NESS, 2009). CAROBBI und NESS (2009) beschreiben eine Sensitivität dieser Tests von 60% beziehungsweise 64% am wachen Patienten und

25 2 Literaturübersicht 13 eine signifikant bessere Sensitivität am anästhesierten Patienten von 96% beziehungsweise 92%. Zur Diagnostik einer Ruptur des kaudalen Kreuzbands dient der kaudale Schubladentest. Bei der klinischen Untersuchung zum Zeitpunkt einer kranialen Kreuzbandruptur lassen sich eine unterschiedlich stark ausgeprägte Schmerzhaftigkeit, eine mögliche Schwellung des Gelenks und eventuell eine Atrophie des Musculus quadriceps femoris feststellen (KNEBEL und MEYER-LINDENBERG, 2014). Mittels der zuvor genannten Tests wird die Stabilität der Kreuzbänder überprüft. Bei vorhandenem Kreuzbandriss lässt sich dabei das so genannte Schubladenphänomen, eine erhöhte kraniokaudale Beweglichkeit der Tibia relativ zum Femur, beziehungsweise ein "cranial tibial thrust", eine kraniale Bewegung der Tuberositas tibiae auslösen (FOSSUM, 2006). Beide Tests können zu falsch negativen Ergebnissen führen (CAROBBI und NESS, 2009), was zum Beispiel durch eine starke Bemuskelung der Gliedmaße oder durch eine Gelenkkapselfibrose bedingt sein kann. Röntgenologisch zeigt sich die vermehrte Gelenkfüllung als Kompression des Kniefettkörpers (fat pad sign) und durch eine nach kaudal erweiterte Gelenkkapsel, zudem zeigt sich im Röntgenbild eine kraniale Subluxationsstellung der Tibia. Überdies können röntgenologisch degenerative Gelenkveränderungen wie subchondrale Sklerosierung und Osteophytenbildung dargestellt werden (KNEBEL und MEYER-LINDENBERG, 2014; TOBIAS und JOHNSTON, 2012). Zusätzlich zur klinischen und röntgenologischen Untersuchung können Magnetresonanztomographie (MRT), Sonographie, Arthroskopie oder Arthrotomie zum Einsatz kommen. In der Humanmedizin gilt die Arthroskopie, vor allem auch im Hinblick auf Veränderungen der Synovialmembran und des Knorpels als Goldstandard (AYRAL et al., 1996) Therapie der Kreuzbandruptur Die Therapie der Ruptur des kranialen Kreuzbands kann konservativ oder chirurgisch erfolgen, wobei eine konservative Therapie mit entzündungs- und schmerzhemmenden Medikamenten und konsequenter Ruhigstellung nur bei kleinen Hunden zu

26 14 2 Literaturübersicht einem befriedigenden Ergebnis führt. Bei großen Hunden ist ein operativer Eingriff vorzuziehen (POND und CAMPBELL, 1972). Für die chirurgische Therapie sind zahlreiche Operationsverfahren beschrieben. Man unterscheidet grundsätzlich extraartikuläre und intraartikuläre Operationsverfahren, wobei das gemeinsame Ziel darin liegt, die Gelenkstabilität wieder herzustellen. Die Erfolgsraten der chirurgischen Therapie liegen, unabhängig von der Methode, bei 90% (KNEBEL und MEYER- LINDENBERG, 2014). Laut BÖDDEKER et al. (2012) kommt es nach der Tibial Plateau Levelling Osteotomy (TPLO) im Vergleich zur Kapselraffung mit Fasziendopplung nach Meutstege zu einer schnelleren Erholung des Patienten, wobei jedoch auch häufiger Komplikationen auftreten. Die Tibial Plateau Levelling Osteotomy (TPLO) führt im Vergleich zur Proximalen Tibiaosteotomie (PTO) zu einem verzögerten Voranschreiten der arthrotischen Gelenkveränderungen (FUJITA et al., 2012). Zur Verifizierung von Meniskusläsionen sind weiterführende, diagnostische Untersuchungen notwendig. Es ist umstritten, ob bei einer vorhandenen Meniskusläsion immer operativ eingegriffen werden sollte (KNEBEL und MEYER- LINDENBERG, 2014) Ätiologie und Pathogenese der Ruptur des kranialen Kreuzbands Trotz aller Bemühungen, die Ätiologie und Pathogenese der spontanen Kreuzbandruptur des Hundes zu entschlüsseln, sind die Mechanismen, die den degenerativen Veränderungen zu Grunde liegen, noch weitgehend unklar (DOOM et al., 2008). Es wird diskutiert, dass in Abhängigkeit von prädisponierenden Faktoren, unterschiedliche Pathomechanismen bei der Kreuzbandruptur des Hundes eine Rolle spielen (BENNETTT et al., 1988). Es wird von einem multifaktoriellen Geschehen auf der Basis degenerativer Veränderungen des kranialen Kreuzbands ausgegangen (COOK, 2010; DE ROOSTER, et al. 2006).

27 2 Literaturübersicht Epidemiologische Faktoren bei Hunden mit kranialer Kreuzbandruptur Mehrere Faktoren wie Alter, Rasse, Geschlecht und Körpergewicht werden im Rahmen epidemiologischer Studien als Risiko für die kraniale Kreuzbandruptur diskutiert (TAYLOR-BROWN et al., 2015; VASSEUR et al., 1985; WHITEHAIR et al., 1993; WILKE et al., 2006). Hunde größerer Rassen sind beim Auftreten einer Ruptur des kranialen Kreuzbands jünger als Hunde kleinerer Rassen (BENNETTT et al., 1988; VASSEUR et al., 1985). VASSEUR et al. (1985) beschreiben, dass Hunde über 15 kg Körpergewicht bereits ab einem Alter von 5 Jahren degenerative Veränderungen des kranialen und kaudalen Kreuzbands, wie den Verlust von Fibrozyten, chondroide Metaplasie und Verlust der Kollagenfaserstruktur, zeigen. Hunde unter 15 kg Körpergewicht weisen geringgradigere Veränderungen auf, welche erst einige Jahre später auftreten. BENNETTT et al. (1988) beschreiben, dass Hunde unter 4 Jahren mit Veränderungen des Kreuzbands, wie Auffaserungen, Dehnungen, partieller und vollständiger Ruptur, häufiger großen Rassen angehören. Die Autoren stellen fest, dass über 4 Jahre alte Hunde mit Veränderungen des Kreuzbands eher kleinen Rassen angehören, woraus sie schlussfolgern, dass der kranialen Kreuzbandruptur hinsichtlich kleiner und großer Rassen unterschiedliche Pathomechanismen zugrunde liegen könnten. Bei den großen Hunderassen ist der Rottweiler disponiert (BENNETT et al., 1988). WHITEHAIR et al. (1993) beschreiben ebenfalls, dass schwerere Hunde eine höhere Prävalenz für eine Kreuzbandruptur aufweisen. Weiterhin nennen die Autoren Rottweiler, Neufundländer und Staffordshire Terrier als besonders disponiert. Es tritt eine Zunahme der kranialen Kreuzbandrupturen mit dem Alter auf, wobei die Häufigkeit unabhängig vom Körpergewicht ihren Höhepunkt im Alter von 7-10 Jahren erreicht (WHITEHAIR et al., 1993). In der Tabelle 2.1 sind Angaben zu Rassedispositionen verschiedener Autoren zusammengestellt.

28 BSH = Berner Sennenhund; DM = Dobermann; DSH = Deutscher Schäferhund; Retr. = Retriever; RW = Rottweiler; Staff. Terrier = Staffordshire Terrier 16 2 Literaturübersicht Tabelle 2.1: Rassedispositionen für die kraniale Kreuzbandruptur PAATSAMA (1952) BRUNNBERG (1990) WHITEHAIR et al. (1993) DUVAL et al. (1999) LAMPMAN et al. (2003) HARASEN (2003, 2008) WITSBERGER et al. (2008) GUTHRIE et al. (2012) PAEK et al. (2013) CHUANG et al. (2014) Boxer RW Neufundländer x x x Labrador Retr. Golden Retr. DSH BSH Staff.- Terrier Bulldogge Mastiff DM Pitbull Terrier x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Pudel

29 2 Literaturübersicht 17 Laut HARASEN (2003) hat sich die Prävalenz der kranialen Kreuzbandruptur hinsichtlich der Rassen verschoben. HARASEN (2003) vergleicht die Fälle von Hunden mit kranialer Kreuzbandruptur der eigenen Praxis aus den Jahren 1983 bis 1994 mit denen aus den Jahren 1997 bis In den Jahren 1983 bis 1994 waren 65% der Fälle Hunde kleiner Rassen, in den Jahren 1997 bis 2002 waren es zu 61% Hunde großer Rassen. In einer weiteren Untersuchung von 2002 bis 2007 handelte es sich in 69% der Fälle mit kranialer Kreuzbandruptur um Hunde großer Rassen (HARASEN, 2008). NIELEN et al. (2003) und WILKE et al. (2006) untersuchten die Erblichkeit der kranialen Kreuzbandruptur beim Boxer beziehungsweise beim Neufundländer. NIELEN et al. (2003) wiesen bei einer Kohorte von Boxern eine Heritabilität von 0,28 (= mittlere Heritabilität), WILKE et al. (2006) stellten beim Neufundländer eine Heritabilität von 0,27 fest. Die Autoren vermuten einen rezessiven Erbgang. BAIRD et al. (2014) wiesen beim Neufundländer drei Genomregionen nach, welche mit der Anfälligkeit für eine kraniale Kreuzbandruptur assoziiert sein könnten. Von verschiedenen Autoren wird die Kastration als ein erhöhtes Risiko für eine kraniale Kreuzbandruptur genannt (ADAMS et al., 2011; DUVAL et al., 1999; LAMPMAN et al., 2003; WHITEHAIR et al., 1993). GUTHRIE et al. (2012) hingegen stellten fest, dass weder das Geschlecht noch eine Kastration Einfluss auf das Auftreten einer Kreuzbandruptur haben. ADAMS et al. (2011), GRIERSON et al. (2011) sowie LAMPMAN et al. (2003) sehen zudem einen Zusammenhang zwischen Obesitas beziehungsweise einem erhöhtem body condition score (BCS) und einer Kreuzbandruptur. LAMPMAN et al. (2003) beschrieben außerdem einen Zusammenhang zwischen der Fütterung und der Anfälligkeit für eine Ruptur des kranialen Kreuzbands. GRIERSON et al. (2011) stellten überdies fest, dass Hunde mit einer bilateralen Ruptur des kranialen Kreuzbands jünger waren (im Mittel 4,3 Jahre) als Hunde mit nur einseitiger Ruptur (im Mittel 5,3 Jahre). Der Rottweiler hat laut GRIERSON et al. (2011) das höchste Risiko für eine bilaterale Ruptur.

30 18 2 Literaturübersicht Anatomische und histologische Faktoren bei Hunden mit kranialer Kreuzbandruptur Als mögliche Ursachen für das Auftreten einer kranialen Kreuzbandruptur müssen auch anatomische Besonderheiten des Kniegelenks, in dessen Folge es zu vermehrter Belastung der Kreuzbänder kommt, in Betracht gezogen werden. Beim Vergleich disponierter Rassen mit einer weniger anfälligen Rasse zeigte sich eine geringere kraniokaudale Stabilität des Kniegelenks beim Labrador Retriever und Rottweiler gegenüber dem Greyhound (COMERFORD et al., 2005; WINGFIELD et al., 2000). Bei Hunden mit Ruptur des kranialen Kreuzbands im Vergleich mit gesunden Hunden konnte eine erhöhte kraniale Beweglichkeit der Tibia, assoziiert mit einer weniger ausgeprägten Tuberositas tibiae nachgewiesen werden (INAUEN et al., 2009). LEWIS et al. (2008) und COMERFORD et al. (2006b) wiesen bei einer disponierten Rasse gegenüber Rassen mit niedrigem Risiko für eine kraniale Kreuzbandruptur und bei Hunden mit Kreuzbandruptur gegenüber gesunden Hunden eine engere, schmalere Fossa intercondylaris nach. DUERR et al. (2007) nennen ein steiles Tibiaplateau (Unterschenkelgelenksfläche) sowie übermäßige Innenrotation der Tibia, mediale Patellaluxation und Varusstellung des Kniegelenks als prädisponierende Faktoren. Der Tibiaplateauwinkel (tibial plateau angle, TPA) variiert nicht signifikant zwischen Labradoren mit oder ohne Kreuzbandruptur und zwischen den Rassen Labrador und Greyhound (COMERFORD et al., 2011; WILKE et al., 2002). Unterschiede und Veränderungen der Kreuzbänder auf zellulärer Ebene werden als eine mögliche Ursache für die Unterschiede in der Anfälligkeit für eine Kreuzbandruptur angesehen. SMITH et al. (2011) untersuchten das Vorkommen von elastischen Fasern, Elastin und Fibrillin im Kreuzband. Elastische Fasern finden sich durchgehend im kranialen und kaudalen Kreuzband und in erhöhter Anzahl im Epiligament (SMITH et al., 2011). Die Elastinfasern variieren in ihrer Breite und liegen meist parallel zu den Kollagenfasern, zwischen den Kollagenfaserbündeln. Die Fibrillinfasern sind fein und bilden ein dichtes, unregelmäßiges Maschenwerk. SMITH et al. (2011) nehmen an, dass die elastischen Fasern eine wichtige Rolle in der Mechanik der Kreuzbänder spielen. SMITH et al. (2014) stellten in Untersuchungen an Kreuzbändern von Greyhounds fest, dass Elastin einen höheren Anteil im

31 2 Literaturübersicht 19 kranialen Kreuzband ausmacht als bisher angenommen und dass Oxytalan-Fasern möglicherweise im Rahmen adaptiver und reparativer Vorgänge entstehen. SMITH et al. (2012) untersuchten die Morphologie der Zelltypen im Kreuzband beim Greyhound und beim Labrador Retriever und konnten verschiedene Zelltypen im Kreuzband nachweisen: Typ A-Zellen mit langen Fortsätzen, Typ B-Zellen mit kürzeren, dickeren Fortsätzen und Zellen ohne Fortsätze, die Typ C-Zellen. SMITH et al. (2012) stellten Unterschiede hinsichtlich der Verteilung der verschiedenen Zelltypen in den Kreuzbändern von Greyhound und Labrador Retriever fest (Abbildung 2.2). Abbildung 2.2: Verteilung verschiedener Zelltypen im Kreuzband bei Greyhound und Labrador Retriever (modifiziert nach SMITH et al., 2012).

32 20 2 Literaturübersicht Unterschiede in der Zellmorphologie der Fibroblasten könnten zu einem Unterschied in der Anfälligkeit für eine Kreuzbandruptur führen und möglicherweise lassen sich von der Zellmorphologie Rückschlüsse auf Unterschiede in der Zellphysiologie ziehen (SMITH et al., 2012). Eine nicht ausreichende Stimulation von Fibroblasten des Kreuzbands und dadurch bedingte, veränderte Struktur der Kollagenfaserbündel oder eine veränderte Homöostase werden ebenfalls als möglicher Risikofaktor in Betracht gezogen (ARNOCZKY et al., 2007; COMERFORD et al., 2011; TIPTON et al., 1970). COMERFORD et al. (2006a) wiesen einen Unterschied des Durchmessers der Kollagenfasern im kranialen Kreuzband beim Greyhound im Vergleich zum Labrador Retriever nach. Die Kollagenfasern des Labrador Retrievers hatten im Vergleich zum Greyhound einen signifikant geringeren Durchmesser Immunpathologische Mechanismen der Kreuzbandruptur Im Rahmen von Kreuzbanderkrankungen kommt es zu immunologischen und entzündlichen Veränderungen des Kniegelenks. Umstritten ist dabei, ob diese ursächlich an der Ruptur der Kreuzbänder beteiligt sind oder ob sie sekundär als Folge einer Ruptur entstehen (ERNE et al., 2009; NIEBAUER et al., 1987; LEMBURG et al., 2004). Bakterielle Erreger werden als Ursache oder auch als Trigger für entzündliche Veränderungen im Kniegelenk im Zusammenhang mit einer Kreuzbandruptur in Betracht gezogen (MUIR et al., 2007a; MUIR et al., 2010; SCHWARTZ et al., 2011). 37% beziehungsweise 41% der Hunde mit Arthritis beziehungsweise Kreuzbandruptur zeigten ein positives Ergebnis bei der Untersuchung von Synovia und Synovialmembran mittels polymerase chain reaction (PCR) auf bakterielle DNA (MUIR et al., 2007a; MUIR et al., 2010). SCHWARTZ et al. (2011) wiesen in arthritischen Gelenken im Vergleich mit gesunden Gelenken eine höhere bakterielle Belastung nach und fanden eine Korrelation mit der Schwere der histologisch festgestellten Synovialmembranentzündung.

33 2 Literaturübersicht Humorale Immunreaktionen bei der Kreuzbandruptur Der immunhistologische Nachweis einer vierfach höheren IgG- und achtfach höheren IgM-Ablagerung in der Synovialmembran bei Hunden mit kranialem Kreuzbandriss als bei gesunden Hunden lässt eine humorale Komponente der beim Kreuzbandriss vorkommenden Entzündung der Synovialmembran vermuten (LAWRENCE et al., 1998). NIEBAUER et al. (1987) wiesen bei Hunden mit kranialer Kreuzbandruptur und sekundärer Arthrose Antikörper gegen Kollagen Typ I (91% der Hunde) und gegen Kollagen Typ II (56% der Hunde) in der Synovia nach. MUIR et al. (2007b) konnten in einem in vitro-versuch eine erhöhte Freisetzung von Kollagenfragmenten bei rupturierten Kreuzbändern nachweisen. DE BRUIN et al. (2007a) wiesen einen höheren Antikörpertiter gegen Kollagen Typ I bei Hunden mit einer partiellen Kreuzbandruptur als bei Hunden mit vollständiger Ruptur nach und schlussfolgerten daraus, dass ein entzündlicher Prozess vor dem Eintritt klinischer Symptome an der Entstehung der Kreuzbandruptur beteiligt ist und dass ein niedriger Antikörpertiter zum Zeitpunkt einer Ruptur möglicherweise durch Immunkomplexbildung bedingt ist. Die Antikörperbildung gegen Kollagen Typ I allein wird jedoch als nicht ausreichend angesehen, um eine Kreuzbandruptur auszulösen, da es auch Hunde mit hohem Antikörpertiter gab, die keine Ruptur erlitten (DE BRUIN et al., 2007a). DE BRUIN et al. (2007c) konnten in einem Lymphozyten-Proliferations-Test (LPA) keinen Unterschied zwischen Hunden mit Kreuzbandruptur, gesunden Hunden und scheinoperierten Hunden hinsichtlich der Reaktivität der Lymphozyten gegenüber Kollagen Typ I feststellen. KUROKI et al. (2010) wiesen eine signifikant höhere TLR-4 (toll-like receptor-4) Gen- Expression im Synovialmembrangewebe der Gelenke von Hunden mit induzierter Kreuzbandruptur im Vergleich mit deren kontralateralem Gelenk nach. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie ließ sich auch eine TLR-4-Protein-Expression auf Zellebene nachweisen. Die Synoviozyten in den Synovialmembranproben von Hunden mit sekundärer Osteoarthrose nach Kreuzbandruptur zeigten sich positiv in der Immunfluereszenz für TLR-4 (KUROKI et al., 2010). Die Autoren diskutierten Hyaluronfragmente als mögliche Ursache für die Aktivierung eines durch TLR vermittelten pathogenetischen Mechanismus.

34 22 2 Literaturübersicht Zelluläre Immunreaktionen bei der Kreuzbandruptur Die meisten Hunde weisen zum Zeitpunkt einer kranialen Kreuzbandruptur eine Entzündung der Synovialmembran auf. Diese ist primär charakterisiert durch B- und T-Lymphozyten, Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) + Makrophagen, Plasmazellen und MHC II + Dendritische Zellen (GALLOWAY und LESTER, 1995; ERNE et al., 2009; HEWICKER-TRAUTWEIN et al., 1999; KLOCKE et al., 2005; LEMBURG et al., 2004; MUIR et al., 2005a; MUIR et al., 2011a). Die beteiligte Lymphozytenpopulation besteht zum großen Teil aus CD4 + T-Lymphozyten (LEMBURG et al., 2004). Es lässt sich zudem eine höhere Anzahl CD4 + und auch CD8 + Lymphozyten in der Synovialmembran von Hunden mit Kreuzbandruptur im Vergleich mit gesunden Hunden nachweisen, wobei die Menge an CD8 + Zellen mit dem Alter korreliert (FALDYNA et al., 2004; MUIR et al., 2011a). KLOCKE et al. (2005) wiesen bei Hunden mit kranialer Kreuzbandruptur eine Assoziation zwischen der immunhistochemisch nachgewiesenen Dichte von Makrophagen (CD11b + /CD18 + ) und dem röntgenologischen Grad der Arthrose der betroffenen Gelenke nach. Der Nachweis von vermehrt CD4 + T-Lymphozyten und Makrophagen lässt auf eine Th1 Antwort schließen (DOOM et al., 2008). Möglicherweise wird das aus einem defekten, degenerierten Kreuzband freigesetzte Kollagen Typ I naiven T-Zellen präsentiert, was mittels einer Th1-Antwort zur Aktivierung von Makrophagen führt. Diese aktivierten Makrophagen nehmen mittels Phagozytose Kollagen Typ I-Antigen oder Immunkomplexe auf und setzen zudem Proteasen frei, die dann zu einer weiteren Degeneration des Kreuzbands führen (DOOM et al., 2008) Zytokine und Entzündung Zytokine können den Verlauf einer Entzündung auf Grund ihrer pro- oder antiinflammatorischen Wirkung maßgeblich beeinflussen. DE BRUIN et al. (2005) zeigten eine erhöhte Interleukin-8 (IL-8) mrna Expression in der Synovia von Hunden mit Arthrose unterschiedlicher Ätiologie, wie zum Beispiel Kreuzbandruptur oder Patellaluxation. Untersuchungen am kontralateralen Knie-

35 2 Literaturübersicht 23 gelenk und einem Schultergelenk bei Hunden mit einseitiger Kreuzbandruptur zeigten, dass die IL-8 mrna Expression in der Synovia in diesen Gelenken bei Hunden höher ist, bei denen in den nächsten sechs Monaten eine Kreuzbandruptur auftritt, als bei Hunden, bei denen keine Ruptur auftritt (DE BRUIN et al., 2007b). EL- HADI et al. (2012) wiesen hauptsächlich mit Gefäßendothel assoziiertes IL-8 immunhistochemisch in der Synovialmembran und im Kreuzband von Hunden mit Ruptur nach. Bei gesunden Kontrollhunden war hingegen kein IL-8 nachweisbar. Zusätzlich zum Nachweis einer Assoziation zwischen der Dichte von Makrophagen und dem röntgenologischen Grad der Arthritis konnten KLOCKE et al. (2005) eine Assoziation mit der Präsenz von IL-6 und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) aufzeigen. Auf Grund ihrer Ergebnisse diskutierten die Autoren, dass Makrophagen eine zentrale Rolle in der Pathogenese zukommt und dass aktivierte Makrophagen der Ursprung des nachgewiesenen IL-6 und TNF-α sein könnten. HAY et al. (1997) wiesen eine negative Korrelation der IL-6 Konzentration mit dem röntgenologischen Grad der Arthrose im betroffenen Kniegelenk nach. Die Konzentration von IL-6 war jedoch positiv korreliert mit dem Alter. HEGEMANN et al. (2005) untersuchten die Synovia von Hunden mit immunmediierter Arthritis (IMA), darunter Hunde mit idiopathischer Arthritis und Hunde mit rheumatoider Arthritis sowie von Hunden mit sekundärer Arthrose (osteoarthritis, OA) bei Kreuzbandruptur hinsichtlich der Zytokin mrna-expression. Die IMA des Hundes ist definiert als chronische Gelenksentzündung mehrere Gelenke, für die keine Ursache ausgemacht werden kann und die nicht auf eine immunsuppressive Therapie anspricht. Die Entzündung ist dabei charakterisiert durch eine Infiltration mit Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen sowie eine Pannusbildung (HEGEMANN et al., 2005). Die Untersuchungen zeigten, dass die Unterschiede zwischen IMA und OA nach Kreuzbandruptur eher quantitativer als qualitativer Natur sind. Bei sekundärer Arthrose zeigte sich insgesamt eine geringere mrna-expression der Zytokine im Vergleich zur immunmediierten Arthritis (IMA). Sowohl bei der IMA als auch bei der OA wiesen HEGEMANN et al. (2005) eine mrna- Expression von IL-2 und IFN-γ nach, wohingegen eine mrna-expression von IL-4 kaum existierte. Demnach lag ein überwiegend proinflammatorisches Zytokinprofil

36 24 2 Literaturübersicht vor. In der Synovia von Hunden mit OA zeigte sich überdies eine mrna-expression von IL-1, IL-6, IL-8 und TNF-α. Neuere Untersuchungen befassen sich häufig mit dem kontralateralen Kniegelenk von Hunden mit einseitiger Kreuzbandruptur, da mit einem Risiko zwischen 40% und 60% das kraniale Kreuzband dieses Gelenks innerhalb der nächsten Monate ebenfalls einer Ruptur unterliegt (BLEEDORN et al., 2011; DE BRUIN et al., 2007d; FULLER et al., 2014). MUIR et al. (2011b) geben die mediane "Überlebenszeit" des kontralateralen kranialen Kreuzbands mit 947 Tagen an. Zudem wiesen MUIR et al. (2011b) eine reduzierte "Überlebenszeit" des kontralateralen Kreuzbands bei kastrierten Hunden nach. Untersuchungen an Labradoren mit einseitiger oder beidseitiger Ruptur zeigten keine Unterschiede in Bezug auf Alter, Körpergewicht, Geschlecht oder Tibia-Plateau-Winkel, wobei die mediane "Überlebenszeit" bei 5,5 Monaten lag (BUOTE et al., 2009). Beim Vergleich von Kniegelenken mit Ruptur des kranialen Kreuzbands mit den kontralateralen, röntgenologisch bereits arthritisch veränderten Kniegelenken und Kniegelenken gesunder Hunde zeigte sich arthroskopisch und histologisch eine Synovitis in beiden Gelenken, also sowohl in Gelenken mit Kreuzbandruptur als auch in den kontralateralen Kniegelenken. Histologisch waren entzündliche Veränderungen sowohl im Kniegelenk mit rupturiertem kranialem Kreuzband als auch im kontralateralen Knie vorhanden, wobei keine signifikanten Unterschiede festzustellen waren (BLEEDORN et al., 2011). CHUANG et al. (2014) zeigten, dass das Auftreten einer Ruptur im kontralateralen Kniegelenk signifikant von den röntgenologischen Veränderungen zum Zeitpunkt der primären Ruptur abhängt. Die Autoren schlussfolgerten, dass die Entzündung der Synovialmembran und die degenerativ-entzündlichen Gelenksveränderungen wichtige Faktoren im der Kreuzbandruptur zu Grunde liegenden Pathomechanismus sind. FULLER et al. (2014) bestätigten mit Ihren Untersuchungen dieses Ergebnis und nannten überdies das röntgenologische fat pad sign (Fettpolsterzeichen) im kontralateralen Kniegelenk als wichtigsten Risikofaktor für eine nachfolgende Ruptur. Auf der Grundlage röntgenologischer Untersuchungen des Kniegelenks sechs und zwölf Monate nach initialer kranialer Kreuzbandruptur nennen DE BRUIN et al. (2007d) die Osteophytenbildung kaudal des Tibiaplateaus, welche während der Studie ohne klinisch

37 2 Literaturübersicht 25 nachweisliche Instabilität des Gelenks zunahm, als sicherstes Zeichen für eine folgende Ruptur des kontralateralen Kreuzbands. Zudem wiesen DE BRUIN et al. (2007d) eine Zunahme der subchondralen Sklerose des Tibiaplateaus und der Inzisur, in welcher der Musculus extensor digitorum longus verläuft, nach. Kniegelenke mit Kreuzbandruptur und kontralaterale Kniegelenke unterschieden sich nicht signifikant hinsichtlich ihrer Dichte an Lymphozyten (LITTLE et al., 2014). In 92% der Kniegelenke mit Kreuzbandruptur und in 83% der kontralateralen Kniegelenke ohne Kreuzbandruptur fanden sich CD3 + Lymphozyten in der Synovialmembran (LITTLE et al., 2014) Proteolytische Enzyme und Stickstoffmonoxid bei der Kreuzbandruptur Es wurden verschiedene proteolytische Enzyme, wie Matrixmetalloproteinasen (MMPs), Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) und Kathepsine in Gelenken von Hunden mit Kreuzbandruptur nachgewiesen (BRESHEARS et al., 2010; MUIR et al., 2002; MUIR et al., 2005a, b; SPRENG et al., 1999). MUIR et al. (2002) wiesen mittels Enzym- beziehungsweise Immunhistochemie im Kreuzband von Hunden mit Ruptur im Vergleich zu jungen und alten Hunden ohne Kreuzbandruptur eine signifikant größere Anzahl von Zellen nach, welche TRAP + und Kathepsin K + waren. Diese fanden sich vorwiegend in der epiligamentösen Region und in geringerer Anzahl in der "core region", also der in der Mitte des Kreuzbands gelegenen Region. Auch bei alten Hunden fanden sich vereinzelt TRAP + und Kathepsin K + Zellen im Kreuzband, assoziiert mit chondroider Metaplasie von Fibroblasten und Unterbrechungen der extrazellulären Matrix (MUIR et al., 2002). MUIR et al. (2005a) wiesen in der Synovialmembran von 73% der Hunde mit Kreuzbandruptur TRAP + Makrophagen-ähnliche Zellen nach, wohingegen sich bei Hunden mit intaktem Kreuzband keine TRAP + Zellen nachweisen ließen. Überdies konnten die Autoren bei Hunden mit Kreuzbandruptur eine erhöhte Expression von TRAP, Kathepsin S, MMP-2 und MMP-9 mittels RT-PCR im Kreuzband nachweisen. Eine Kathepsin K mrna-expression fand sich auch im gesunden Kreuzband (MUIR et al., 2005b). BARRETT et al. (2005) verglichen nach immunhistochemischem beziehungsweise

38 26 2 Literaturübersicht histochemischem Nachweis von Kathepsin K und TRAP deren Präsenz in rupturierten und intakten kaninen kranialen Kreuzbändern mit der in rupturierten und intakten humanen vorderen Kreuzbändern, wobei die kaninen Proben signifikant mehr TRAP + und Kathepsin K + Zellen aufwiesen. BOLAND et al. (2014) bestätigten mittels ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) das Vorhandensein einer erhöhten Expression von MMP-2 in der Synovia von Hunden mit Kreuzbandruptur. Überdies verglichen die Autoren die Expression im kontralateralen Kniegelenk mit der in Kniegelenken gesunder Hunde und fanden keine signifikanten Unterschiede. Bei Hunden mit sekundärer Arthrose (osteoarthritis, OA) nach experimentell induzierter medialer Patellaluxation ließ sich durch wiederholte Messungen nach drei, sechs und zwölf Monaten ein Anstieg von TRAP + Zellen in der Synovialmembran im kranialen Kreuzband und im Gelenkknorpel nachweisen (ALAM et al., 2011). Das kontralaterale Gelenk und scheinoperierte Gelenke zeigten hingegen keinen Anstieg TRAP + Zellen (ALAM et al., 2011). Stickstoffmonoxid (nitric oxide, NO) war Gegenstand verschiedener Untersuchungen und führte zu unterschiedlichen Ergebnissen. SPRENG et al. (2000) wiesen eine erhöhte Konzentration von Stickstoffmonoxid-Metaboliten (NOt) in Überständen explantierter Knorpelproben von Hunden mit Kreuzbandruptur und sekundärer Arthrose im Vergleich mit gesunden Kontrollhunden nach. In Synovialmembranproben von Hunden mit und ohne Kreuzbandruptur fanden SPRENG et al. (2000) keine Unterschiede bezüglich der Konzentration der Stickstoffmonoxid-Metaboliten. Die Proben rupturierter kranialer Kreuzbänder von Hunden wiesen eine geringere Produktion von Stickstoffmonoxid-Metaboliten auf als die Proben von Kreuzbändern gesunder Kontrollhunde. Es wurde festgestellt, dass der Ursprung von Stickstoffmonoxid hauptsächlich das Knorpelgewebe ist (GYGER et al., 2007; MURRELL et al., 1996; SPRENG et al., 2000). Die Kreuzbänder gesunder Hunde produzierten in Kultur mehr Stickstoffmonoxid (NO), gemessen an den Metaboliten Nitrat und Nitrit, im Vergleich zum medialen Kollateralband und dem Ligamentum capitis ossis femoris (LOUIS et al., 2006). RIITANO et al. (2002) wiesen in explantierten Kreuzbändern sowohl nach Stimulation mit einer Kombination aus IL-1, TNF-α und Lipopolysacchariden als auch in Kreuzbandexplantaten ohne Stimulation Stickstoff-

39 2 Literaturübersicht 27 monoxid-metaboliten (NOt) nach, wobei die stimulierten Proben im Vergleich zu den nicht stimulierten Proben signifikant mehr Stickstoffmonoxid-Metaboliten produzierten. In Untersuchungen von MURRELL et al. (1996) wurde weder eine konstitutive noch induzierbare Produktion eines Stickstoffmetaboliten in kaninen kranialen und kaudalen Kreuzbändern, in den Kollateralbändern oder in der Patellarsehne nachgewiesen. HOFER et al. (2009) untersuchten immunhistologisch die Expression von Caspase-3 im kaninen Kreuzband nach Gabe eines NO-Inhibitors und ohne NO- Inhibition, da eine erhöhte NO-Produktion als mögliche Ursache für eine vermehrte Apoptose von Zellen angesehen wird. Bei Hunden mit kranialer Kreuzbandruptur konnten nach Inhibition der Stickstoffmonoxid-Synthase (nitric oxide synthase, NOS) im Vergleich mit Hunden ohne Gabe eines selektiven NOS-Inhibitors keine Unterschiede in der Stickoxidproduktion und der Expression von Caspase-3 feststellt werden Histologische Veränderungen im Kniegelenk Veränderungen am Kreuzband Das Vorhandensein degenerativer Veränderungen des Kreuzbands wird bei Hunden disponierter Rassen bereits im Alter von zwei Jahren beschrieben (COOK, 2010). In der frühen Phase degenerativer Veränderungen zeigen die Fibroblasten des Kreuzbands einen sphäroiden Phänotyp, was als frühe chondroide Metaplasie interpretiert wird (VASSEUR et al., 1985). Mittels einer Spezialfärbung kann Alcianblau-positives Material perinukleär in den metaplastischen Fibrozyten sowie extrazellulär nachgewiesen werden (ICHINOHE et al., 2015; NARAMA et al., 1996). Der extrazelluläre Anteil Alcianblau-positiven Materials ist in Kreuzbandproben von Hunden mit kranialer Kreuzbandruptur höher als bei Hunden ohne Ruptur des kranialen Kreuzbands. Im weiteren Verlauf der Degeneration kommt es zum Verlust von Fibroblasten, vor allem in der sogenannten "core region mit Auftreten azellulärer Bereiche (VASSEUR et al., 1985). Beim Vergleich von rupturierten kranialen Kreuzbändern mit Kreuzbändern gesunder Hunde konnte in der "core region" und in

40 28 2 Literaturübersicht der epiligamentösen Region mittels immunhistochemischem Nachweis von Caspase- 3 eine gesteigerte Apoptoserate festgestellt werden (GYGER et al., 2007). Vor allem die Fibrozyten des Ligaments und vereinzelt Synovialdeckzellen exprimierten Caspase-3 (GYGER et al., 2007). Die Autoren gehen davon aus, dass eine gesteigerte Apoptose eine Rolle bei der kranialen Kreuzbandruptur spielt. Im Rahmen der sich im Kreuzband entwickelnden degenerativen Veränderungen geht die typische Architektur der Kollagenfasern verloren (VASSEUR et al., 1985). Innerhalb der Kollagenfaserbündel verlieren die Kollagenfibrillen ihr charakteristisches, leicht gekräuseltes Erscheinungsbild und die parallele Anordnung der Fasern ist nicht mehr gegeben (VASSEUR et al., 1985). HAYASHI et al. (2003) beschreiben zudem eine geringere Dichte und ein zerrissenes Erscheinungsbild der Kollagenfasern. TIRGARI (1977) bezeichnet diese Veränderung als Desorganisation der Kollagenfasern, mit partieller Ruptur einzelner Fibrillen und relativ azellulären Bereichen. In späteren Stadien der Degeneration finden sich große, azelluläre Bereiche mit Verlust der Kollagenfaserstruktur und eine deutliche chondroide Metaplasie (VASSEUR et al., 1985). Bei hochgradiger Degeneration des Kreuzbands nehmen die Veränderungen mehr als die Hälfte des Kreuzbanddurchmessers ein und es sind nur noch vereinzelt chondroide metaplastische Fibroblasten in azellulären Bereichen vorhanden. Eine dystrophische Verkalkung kann vorkommen (VASSEUR et al., 1985). ICHINOHE et al. (2015) wiesen immunhistochemisch eine erhöhte Anzahl SOX-9 + Zellen in degenerierten und rupturierten Kreuzbändern gegenüber intakten Kreuzbändern nach. Sox-9 ist essentiell für die Differenzierung von Chondrozyten (BI et al., 1999). Die Autoren nehmen an, dass eine chondroide Metaplasie der Fibrozyten des Kreuzbands durch eine erhöhte Expression von SOX- 9 gefördert wird. Ursächlich dafür ist möglicherweise ein äußerlicher Einfluss, wie z.b. ein Mikrotrauma (BI et al., 1999). Zudem wiesen ICHINOHE et al., (2015) eine Abnahme von Typ I-Kollagen (COL I) und eine Zunahme von Typ III-Kollagen (COL III) in den Kreuzbändern mit Ruptur gegenüber den intakten Kreuzbändern der Kontrolltiere nach. Die Autoren schlussfolgerten, dass eine Abnahme des Kollagen Typ-I zu einer verminderten Zugfestigkeit des Kreuzbands führen könnte und dass Kollagen Typ-III möglicherweise ebenfalls in Folge von Mikrotraumen zunimmt. Ver-

41 2 Literaturübersicht 29 änderungen des kranialen Kreuzbands finden sich häufig in der Bandmitte, wofür eine Minderdurchblutung dieses Bereichs verantwortlich gemacht wird (GALLOWAY und LESTER, 1995; TIRGARI, 1977; ZAHM, 1964). Bei einer Kreuzbandruptur kann es zudem zu reparativen und regenerativen Veränderungen kommen (TIRGARI, 1977). Die rupturierten Enden der Bänder zeigen sich unverändert oder weisen Granulationsgewebe auf und es kommen Bereiche mit Nekrosen und zum Teil Fibrinansammlungen vor (TIRGARI, 1977). Es kann eine erhöhte Zellularität und Vaskularität auftreten und eine epiligamentöse Proliferation mit vermehrt Fibroblasten und Kollagenfasern vorkommen (BARRETT et al., 2005; HAYASHI et al., 2003) Veränderungen an der Synovialmembran Die Synovialmembran beziehungsweise die gesamte Gelenkkapsel zeigt sich beim Vorliegen einer Kreuzbandruptur verdickt und vermehrt vaskularisiert (TIRGARI, 1977). Die Synovialmembran weist zahlreiche Zotten mit kleinen Kapillaren und einer lymphozytären Infiltration auf (TIRGARI, 1977). TIRGARI und VAUGHAN (1975) beschreiben überdies eine perivaskuläre Ansammlung mononukleärer Zellen um die Gefäße unterhalb der Intima synovialis. NARAMA et al. (1996) beschreiben Ansammlungen von Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen in der Subintima der epiligamentösen Membran und in der Synovialmembran. LIPOWITZ et al. (1985) untersuchten die Veränderungen der Synovialmembranen bei Hunden nach experimenteller Durchtrennung des kranialen Kreuzbands. Eine Woche nach der Durchtrennung des Kreuzbands fanden sich mononukleäre Zellen in der Subintima, die Zellen lagen vereinzelt im Gewebe oder stellten sich als perivaskuläre Ansammlungen dar. Zwei Wochen post operationem zeigte sich eine Hypertrophie der Synovialdeckzellschicht, nach acht Wochen eine massive Proliferation von Zotten, eine verdickte Synovialmembran sowie Pannus- und Osteophytenbildung (LIPOWITZ et al., 1985). Darüber hinaus fanden sich Hämosiderophagen, oft in Verbindung mit großen Ansammlungen von Plasmazellen und einer geringeren Anzahl von Lymphozyten. Perivaskuläre, lymphoplasmazelluläre Ansammlungen in

42 30 2 Literaturübersicht der Synovialis werden von GALLOWAY und LESTER (1995) bei spontanen Kreuzbandrupturen beschrieben. Des Weiteren stellten GALLOWAY und LESTER (1995) eine deutliche villöse Hyperplasie der Synovialmembran mit zahlreichen kleinen Gefäßen fest. Innerhalb von Entzündungszellinfiltraten fanden sich zum Teil Hämosiderin-haltige Makrophagen sowie Lymphozyten in der Subintima (LEMBURG et al., 2004). Weiterhin beschreiben GALLOWAY und LESTER (1995) noduläre Anordnungen der lymphoplasmazellulären Infiltrate, vorrangig bei über 15 kg schweren und weiblich-kastrierten Hunden und zum Teil lineare, subsynoviale Infiltrate. Die Synovialmembran der medialen Probenentnahmestelle zeigte sich hinsichtlich der Entzündungszellinfiltrate schwerwiegender betroffen als die Synovialmembran der lateralen Probenentnahmestelle (GALLOWAY und LESTER, 1995). 2.5 Makrophagen Makrophagen sind Zellen des mononukleären Phagozytensystems (MPS) und zählen zu den antigenpräsentierenden Zellen (APC). Sie besitzen zahlreiche Funktionen und spielen eine zentrale Rolle bei der Entzündung und in der Wirtsabwehr (TIZARD, 2008). Makrophagen stellen eine sehr heterogene Zellpopulation dar (BARROS et al., 2013). Sie entwickeln sich aus Monoblasten des Knochenmarks, die sich unter dem Einfluss des Zytokins "colony stimulating factor" (CSF) zu Promonozyten und dann zu Monozyten weiter differenzieren (TAKAHASHI, 2000; TIZARD, 2008). Monozyten zirkulieren für kurze Zeit im Blut, wandern dann ins Gewebe ein und differenzieren dort zu langlebigen Makrophagen. In verschiedenen Geweben kommen gewebetypische Formen von Makrophagen vor, wie Kupffer`sche Sternzellen in der Leber, Alveolarmakrophagen in der Lunge oder Mikroglia im Gehirn (TAKAHASHI, 2000; TIZARD, 2008). Sie finden sich zudem in großer Zahl in den Sinusoiden der Milz, im Knochenmark und in den Lymphknoten. In Suspension sind es runde, circa 15 µm im Durchmesser große Zellen mit reichlich Zytoplasma. Der zentral gelegene Kern ist rund, bohnenförmig oder eingebuchtet. Das Zytoplasma enthält Mitochondrien und eine große Anzahl an Lysosomen, einige raue endoplasmatische Retikula und Golgi-Apparate (TIZARD, 2008). Alveolarmakrophagen

43 2 Literaturübersicht 31 besitzen nur wenig raues endoplasmatisches Retikulum, aber reichlich Granula im Zytoplasma (TIZARD, 2008). In Abhängigkeit von ihrer Umgebung sind Makrophagen sehr vielgestaltig und entwickeln sich zu verschiedenen funktionellen Phänotypen (BARROS et al., 2013; SICA und MANTOVANI, 2012; TIZARD, 2008). Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei physiologischen und pathologischen Vorgängen im Organismus (FAIRWEATHER und CIHAKOVA, 2009). Die Makrophagen der Synovialmembran sind ruhende Zellen des gesunden Gelenks, welche bei entzündlichen Vorgängen aktiviert werden, was zur Sekretion von Zytokinen und Enzymen führt und eine Entzündung und Zerstörung des Gelenks vorantreibt (KENNEDY et al., 2011). Die Beendigung einer Entzündung stellt vielmehr einen aktiven Prozess als eine passive Rückkehr in den Normalzustand dar (KENNEDY et al., 2011). Bei der Pathogenese von autoimmunen und infektiösen Gelenkserkrankungen spielen die Makrophagen der Synovialmembran eine zentrale Rolle (DE RYCKE et al., 2005; STOPPIELLO et al., 2014). Bei verschiedenen Gelenkserkrankungen des Menschen korreliert die Anzahl von aktivierten Makrophagen mit den klinischen Parametern einer Entzündung (AMBARUS et al., 2012; BAETEN et al., 2005; BIERRY et al., 2010) Aktivierung und Polarisation Die Polarisation von Makrophagen spielt eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese entzündlicher und neoplastischer Erkrankungen (BARROS et al., 2013). Über die Polarisation kaniner Makrophagen ist bislang nur sehr wenig bekannt. Untersuchungen am kaninen Mammakarzinom zeigen, dass Tumorzellen den Phänotyp von Makrophagen beeinflussen können (BEIRÃO et al., 2015). Man unterscheidet je nach Polarisation M1 und M2 Makrophagen. Unter dem Einfluss von zum Beispiel aktivierten T-Lymphozyten, Bakterien oder Zell-Untergängen in der Umgebung entwickeln sich Makrophagen, in Erwiderung auf Interferone (IFNs), Toll-like-Rezeptoren-Bindung oder Interleukine, zu M1 Makrophagen (klassisch aktivierte Makropagen) oder zu M2 Makophagen (alternativ aktivierte Makrophagen) (FAIRWEATHER und CIHAKOVA, 2009; SICA und MANTOVANI, 2012), wobei diese nur die äußersten Gegensätze eines Kontinuums darstellen. Es

44 32 2 Literaturübersicht gibt Phänotypen, die den Eigenschaften beider Zelltypen entsprechen und die unterschiedlichen Zelltypen kommen auch nebeneinander vor. Es ist ein stetiger dynamischer Fluss zwischen den Phänotypen unter dem Einfluss von Signalen aus dem umgebenden Gewebe (FAIRWEATHER und CIHAKOVA, 2009; SICA und MANTOVANI, 2012; XU et al., 2013), wobei in vitro-modelle nicht in der Lage sind, diese komplexen Gegebenheiten darzustellen (MARTINEZ und GORDON, 2014). In vitro führt die Polarisierung von Makrophagen durch IFN-γ oder Lipopolysaccharide (LPS) zu klassisch aktivierten Makrophagen (M1 Makrophagen). IFNγ wird von Zellen wie CD8 + zytotoxischen T-Lymphozyten, natürlichen Killerzellen (NK) und Th1 Helferzellen produziert. Die Polarisation mittels IL-4 oder IL-13 führt hingegen zu alternativ aktivierten Makrophagen (M2 Makrophagen) (FAIRWEATHER und CIHAKOVA, 2009). MARTINEZ et al. (2008) beschreiben überdies eine weitere Unterteilung in verschiedene Subtypen (M2a, M2b, M2c) und eine Differenzierung zu alternativ aktivierten Makrophagen unter Einfluss von Immunkomplexen mit LPS und/oder IL-β (M2b), IL-10, Transforming growth factor-beta (TGF-ß) oder Glukokortikoiden (M2c). M1 Makrophagen werden proinflammatorische Eigenschaften zugesprochen. Sie sind charakterisiert durch die Expression proinflammatorischer Zytokine, die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und Stickstoffmonoxid (NO), die Förderung einer Th1 Antwort sowie durch antitumorale und mikrobizide Aktivität (SICA und MANTOVANI, 2012). M2 Makophagen werden eher immunoregulatorische, antiinflammatorische Eigenschaften zugesprochen. Sie sind unter anderem involviert in Geweberemodellierung und Parasiteneingrenzung und sind charakterisiert durch eine effiziente Phagozytoseaktivität, eine hohe Expression von Scavenger-Rezeptoren und die Expression von Mannose- und Galakose-Rezeptoren (SICA und MANTOVANI, 2012). Polarisierte M1 und M2 Makrophagen unterscheiden sich in ihrer Zytokinexpression. So produzieren humane, in vitro erzeugte M1 Makrophagen proinflammatorische Zytokine wie IL-1, IL-6, IL-12 IL-23, TNF-α und reaktive Sauerstoffspezies (MARTINEZ et al., 2006; VERRECK et al., 2004). In vitro generierte M2 Makrophagen produzieren hingegen eine große Menge des antiinflammatorischen Zytokins

45 2 Literaturübersicht 33 IL-10, aber zeigen keinerlei Produktion, beziehungsweise unter LPS-Stimulation nur eine geringe Produktion von IL-6 und TNF-α (MARTINEZ et al., 2006; VERRECK et al., 2004; XU et al., 2006; XU et al., 2013). Zudem exprimieren M2 Makrophagen in hohem Maße Mannose- und Galaktoserezeptoren (MARTINEZ et al., 2006). Makrophagen behalten nach Polarisation ihre Plastizität, was sie für ein therapeutisches Eingreifen interessant macht (FAIRWEATHER und CIHAKOVA, 2009; KENNEDY et al., 2011). Bei der Untersuchung von Makrophagen im Zusammenhang mit Gelenksentzündungen des Menschen liegt der Fokus daher mehr bei der Funktion der Makrophagen als bei der Polarisation. Bei der Spondylarthrose, einer autoimmunen Gelenkserkrankung des Menschen, wurde im Vergleich mit der rheumatoiden Arthritis ein für M2 Makrophagen typisches Zytokinprofil nachgewiesen (KENNEDY et al., 2011). Beim Hund besteht eine Korrelation zwischen der Dichte von Makrophagen und dem röntgenologischen Grad der Arthritis nach kranialer Kreuzbandruptur. Zudem wurde eine Assoziation mit der Präsenz von IL-6 und TNFα festgestellt (KLOCKE et al., 2005) Makrophagen-spezifische Markermoleküle CD163 CD163 ist ein Oberflächenmolekül, welches zur scavenger receptor cysteine rich (SRCR) superfamily gehört (KOMOHARA et al., 2006; LAU et al., 2004; ONOFRE et al., 2009). CD163 wird ausschließlich von Monozyten und Makrophagen exprimiert und ist ein Rezeptor für den Hämoglobin-Haptoglobin-Komplex (Hb-Hp) (KRISTIANSEN et al., 2001; ONOFRE et al., 2009). CD163 wird eine regulatorische, antiinflammatorische Rolle bei entzündlichen Vorgängen zugesprochen. Zudem ist CD163 als Rezeptor für den Hämoglobin-Haptoglobin-Komplex an der Beseitigung von Hämoglobin im Rahmen der Erythrolyse beteiligt (ONOFRE et al., 2009). Humane mononukleäre Zellen zeigen nach in vitro-polarisation zu M2 Makrophagen eine Expression von CD163. Im Vergleich dazu zeigen M1 Makrophagen keine Expression von CD163 (VERRECK et al., 2004; XU et al., 2006). Der monoklonale Antikörper AM-3K bindet an CD163 und wird als ein nützlicher und spezifischer Marker

46 34 2 Literaturübersicht für alternativ aktivierte, antiinflammatorische Makrophagen angesehen (KOMOHARA et al., 2006; LAU et al., 2004). ZENG et al. (1996a, b) wiesen eine Reaktivität des Antikörpers AM-3K auch beim Hund nach. YAMATE et al. (2000) untersuchten immunhistochemisch mit diesem Antikörper das Vorkommen CD163 + Makrophagen in verschiedenen Geweben von Hund, Katze, Pferd, Rind, Schwein und Kaninchen. Beim Hund reagierten unter anderem Kupffer`sche Sternzellen in der Leber und subkapsuläre und medulläre Makrophagen im Lymphknoten positiv. In Proben von Hunden mit entzündlichen Läsionen wie Arthritis waren viele Makrophagen CD Im Blutausstrich waren weder Monozyten noch andere Leukozyten CD163 + positiv (YAMATE et al., 2000). Bei der Ratte wird CD163 von Makrophagen, nicht jedoch von Monozyten exprimiert und spielt eine Rolle bei der Aktivierung von Makrophagen während hämolytischer und entzündlicher Vorgänge (MACHTELD et al., 2006) FABRIEK et al. (2009) wiesen nach, dass CD163 in vitro der Erkennung von Bakterien dient und in Folge dessen die Produktion von Zytokinen durch Makrophagen auslöst. CD163 + Makrophagen finden sich in der Synovialdeckzellschicht und der Subintima bei Menschen mit rheumatoider Arthritis und Spondylarthrose (DE RYCKE et al., 2005). Bei der Spondylarthrose des Menschen korreliert die Infiltration mit Makrophagen, insbesondere von CD163 + Makrophagen, mit der klinischen Aktivität der Krankheit (BAETEN et al., 2005). In Biopsien der Synovialmembran von Patienten mit Spondylarthrose finden sich im Vergleich mit Biopsien der Synovialmembran von Patienten mit rheumatoider Arthritis signifikant mehr CD163 + Synovialdeckzellen und CD163 + Makrophagen in der Subintima (AMBARUS et al., 2012; BAETEN et al., 2005; DE RYCKE et al., 2005) S100A8/S100A9 (Calprotectin) S100A8/S100A9 (Calprotectin) wird auf der Membran von Monozyten und Makrophagen exprimiert und ist zudem ein in neutrophilen Granulozyten zytoplasmatisch lokalisiertes Antigen (STRÍZ und TREBICHAVSKÝ, 2004). Das Antigen ist ein

47 2 Literaturübersicht 35 Heterodimer aus den Proteinen S100A8 (myeloid-related protein 8 = MRP8) und S100A9 (myeloid-related protein 14 = MRP14) und wird auch als Leukozytenantigen L1 bezeichnet (STRÍZ und TREBICHAVSKÝ, 2004). Die Charakterisierung des kaninen S100A8/S100A9 ergab eine relative Molekülmasse der beiden Proteine von 10,340 und 14,628 (HEILMANN et al., 2008). S100A8/S100A9 wird überdies auch als Alarmin bezeichnet (BIANCHI, 2007). Der Ausdruck Alarmine (alarmins) wird für Moleküle, die Gewebe- und Zellschäden signalisieren, benutzt. Sie stellen eine Untergruppe der damage-associated molecular patterns (DAMP s) dar (BIANCHI, 2007). Das Alarmin S100A8/S100A9 wird lokal von aktivierten oder zugrundegehenden neutrophilen Granulozyten und Makrophagen sezerniert und fördert früh eine Entzündung (BIANCHI, 2007; SCHIOPU und COTOI, 2013; VOGL et al., 2014). S100A9/MRP14 wird in der frühen Phase akuter Entzündungen von kürzlich infiltrierten Makrophagen exprimiert. S100A8/MRP8 + Makrophagen finden sich hingegen bei chronischer Entzündung (ODINK et al., 1987; SOULAS et al., 2011). Eine S100A8/MRP8- und S100A9/MRP14-Expression findet sich nicht bei reifen, residenten Gewebemakrophagen (SEELIGER et al., 2003; YOUSSEF et al., 1999). Die Expression von MRP8/MRP14 charakterisiert einen proinflammatorischen Subtyp von Makrophagen, der M1-ähnlichen Makrophagen entspricht (SEELIGER et al., 2003; SOULAS et al., 2011). Die Expression von MRP8 und MRP14 in vivo korreliert bei verschiedenen humanen und murinen Krankheiten mit der Aktivität des Entzündungsprozesses (SEELIGER et al., 2003; VAN LENT et al., 2012). Bei der rheumatoiden Arthritis des Menschen wurden MRP8/MRP14 + Zellen in der Synovialdeckzellschicht und der Subintima der Synovialmembran von Patienten mit aktiver Erkrankung nachgewiesen (YOUSSEF et al., 1999). Bei der rheumatoiden Arthritis des Menschen besteht zudem eine Korrelation zwischen S100A8/S100A9 in Serum und Synovia mit klinischen Parametern und Laborwerten (KANG et al., 2014). VOGL et al. (2014) zeigten in einem in vivo-modell, dass S100A8/S100A9 ein hilfreicher sensitiver, lokaler und systemischer Marker zur Erkennung klinischer und sogar subklinischer, entzündlicher und immunologischer Krankheitsprozesse darstellt. Die Autoren BLOM et al. (2004) beschreiben eine nahezu vollständige

48 36 2 Literaturübersicht Abwesenheit von MRP8/MRP14 + Makrophagen nach Depletion der Synovialmembranmakrophagen und eine vermutlich dadurch bedingte reduzierte Bildung von Osteophyten nach experimentell induzierter Osteoarthrose. Der monoklonale Antikörper MAC387 bindet an das humane Antigen MRP14 und in geringerem Maße an MRP8/MRP14 (Calprotectin) (SOULAS et al., 2011). Beim Hund reagiert der monoklonale Antikörper MAC387 mit Monozyten, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten (MOZOS et al., 1999) MHC-Klasse-II-Moleküle Antigenpräsentierende Zellen besitzen auf der Zelloberfläche zur Bindung und Präsentation der Antigene spezifische Rezeptoren, die MHC-Proteinkomplexe (TING und TROWSDALE, 2002). Der MHC II-Proteinkomplex besteht aus zwei, in der Zellmembran verankerten Proteinketten (α- und β-untereinheit) und wird beim Hund von Makrophagen, Dendritischen Zellen, B-Lymphozyten und nahezu allen T-Lymphozyten exprimiert. Beim Menschen wird auch die Bezeichnung HLA (human leucocyte antigen) und beim Hund entsprechend die Bezeichnung DLA (dog leucocyte antigen) verwendet. Der DLA Komplex ist auf dem Chromosom 12 lokalisiert (TIZARD, 2008). Klassisch aktivierte, humane Makrophagen (M1 Makrophagen) sind charakterisiert durch die Expression von MHC II und CD86, wobei entzündliche Vorgänge zu einer vermehrten MHC II-Expression führen (FAIRWEATHER und CIHAKOVA, 2009; MARTINEZ et al., 2008). Die Anfälligkeit für rheumatoide Arthritis beim Menschen und die Kollagen-induzierte Arthritis (collagen induced arthritis, CIA) im Mausmodell ist assoziiert mit einer Expression spezifischer MHC-Klasse-II-Moleküle (BRAND et al., 2007). In Untersuchungen von unveränderten Synovialmembranproben des Menschen zeigte sich, dass die Typ A-Synovialdeckzellen zum Großteil MHC II + und Typ B Synoviozyten negativ für MHC II sind (BURMESTER et al., 1983; BURMESTER et al., 1987). In histologisch unveränderten Synovialmembranproben von Hunden zeigten 2 20% der Synovialdeckzellen eine positive immunhistochemische Reaktion für MHC II (LEMBURG et al., 2004). In Synovialmembranproben von Hunden mit

49 2 Literaturübersicht 37 kranialer Kreuzbandruptur lag der Prozentsatz der MHC II + Synovialdeckzellen bei 2 60% (LEMBURG et al., 2004). Bei Hunden mit sekundärer Arthrose finden sich MHC II + Makrophagen mit runder Zellmorphologie sowie MHC II + Zellen mit dendritischer Morphologie (HEWICKER-TRAUTWEIN et al., 1999; LEMBURG et al., 2004). MHC II + Zellen spielen eine Rolle bei der Aktivierung und Differenzierung von T- Helferzellen (Th0) zu Th1 und Th2 Zellen (JIN et al., 2008). Die Entzündung des Kniegelenks im Rahmen der Kreuzbandruptur beim Hund wird möglicherweise initiiert und aufrechterhalten durch die Reaktion von T-Helferzellen auf ein von antigenpräsentierenden Makrophagen präsentiertes, unbekanntes Antigen (DOOM et al., 2008; LEMBURG et al., 2004). LEMBURG et al. (2004) wiesen MHC-Klasse-II exprimierende Zellen und einen hohen Anteil CD4 + Lymphozyten in der Synovialmembran von Hunden mit kranialer Kreuzbandruptur nach. MHC II-positive Typ-A- Synoviozyten haben sowohl in der gesunden als auch in der entzündlich veränderten Synovialmembran vermutlich eine Antigen-präsentierende Funktion (GANABADI, 1997; HEWICKER-TRAUTWEIN et al., 1999) Tartrat-resistente saure Phosphatase Die Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) ist ein lysosomal lokalisiertes, eisenhaltiges Glykoprotein, welches zu den sauren Phosphatasen gehört und nicht durch Tartrat hemmbar ist. TRAP wurde in den 70ern als zytochemischer Marker bei der Haarzellleukämie des Menschen angewandt und ist in typischen Haarzellen im Blutausstrich beziehungsweise in Knochenmarksausstrichen zytochemisch nachweisbar (JANCKILA et al., 2007). TRAP ist überdies ein Marker für Osteoklasten, Makrophagen und Dendritische Zellen (LAMP und DREXLER, 2000). TRAP besitzt ein Eisenzentrum mit einem redoxaktiven Eisenatom und ist damit in der Lage, mittels Fenton-Reaktion reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) zu erzeugen (HALLEEN et al., 1999; RÄISÄNEN et al., 2005). Die Reduktion und Oxidation des TRAP-Eisenzentrums führt zur Bildung von Hydroxyl- ( OH) und Superoxidradikalen (O2 -), welche in vitro die Fähigkeit besitzen, Kollagen vom Typ I abzubauen (HALLEEN et al., 1999).

50 38 2 Literaturübersicht HAYMAN et al. (2000) wiesen TRAP in verschiedenen Geweben der Maus nach und halten TRAP für einen nützlichen Marker für Osteoklasten und Makrophagen. Die Autoren zeigten eine erhöhte TRAP-Aktivität in aktivierten Makrophagen und eine hohe TRAP-Aktivität in Knochen, Milz, Leber, Thymus und Kolon adulter Mäuse. TRAP - Aktivität ist assoziiert mit der physiologischen Knochenresorption und ein TRAP-Knockout führt zu einer milden Osteopetrose (HAYMAN et al., 1996). SUZUKI et al. (1998) wiesen bei Mäusen, nach Kollagen-Typ-II-induzierter Arthritis, eine Zunahme TRAP + Makrophagen-ähnlicher Zellen mit dem Voranschreiten der Gelenksveränderungen nach. Die Makrophagen-ähnlichen TRAP + Zellen stellten sich dabei als runde oder polygonale Zellen in der proliferativen, hyperplastischen Synovialmembran dar. Die Gelenke von Hunden mit induzierter Arthritis wiesen im Vergleich mit gesunden Gelenken eine höhere Freisetzung von TRAP und ein höheren Grad an reaktiven Sauerstoffspezies in der Synovia auf (SEOL et al., 2009). In der Synovialmembran und im Kreuzband von Hunden mit kranialer Kreuzbandruptur wurden kollagenolytische Enzyme wie TRAP und Kathepsin K nachgewiesen (BARRETT et al., 2005; LITTLE et al., 2014; MUIR et al., 2002; MUIR et al., 2005a; MUIR et al., 2005b). Die TRAP + Zellen nahmen bei induzierter Arthrose (OA) nach medialer Patellaluxation mit der Zeit zu (ALAM et al., 2011). Im Knochen wird TRAP von Osteoklasten sezerniert und ist an der Knochenresorption beteiligt (ODDIE et al. 2000). Die genaue Funktion von TRAP außerhalb des Knochengewebes ist nicht bekannt (MUIR et al., 2002).

51 3 Material und Methoden 39 3 Material und Methoden 3.1 Untersuchungsmaterial Als Untersuchungsmaterial dienten formalinfixierte und in Paraffin eingebettete Synovialmembranproben und Kreuzbänder aus den Kniegelenken von insgesamt 72 Hunden unterschiedlichen Alters und unterschiedlicher Rassezugehörigkeit. Nähere Angaben zu Rasse, Alter, Geschlecht, Körpergewicht, Erkrankungs- und Todesursache beziehungsweise Herkunft der einzelnen Hunde finden sich in Tabelle 3.1. Die beprobten Hunde stammten aus der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, dem Institut für Parasitologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover sowie aus privaten Kleintierpraxen niedergelassener Tierärzte. Hunde mit einer mit dem Buchstaben S beginnenden Untersuchungsnummer wurden im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover vollständig seziert. Die mit V beginnenden Untersuchungsnummern erhielten Hunde, die in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule euthanasiert wurden und von denen ausschließlich die Kniegelenke gewonnen wurden. Bei den aus dem Institut für Parasitologie stammenden Beagle handelt es sich um Kontrolltiere tierexperimenteller Studien, die von der zuständigen Behörde (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit A346) genehmigt wurden. Tabelle 3.1: Untersuchte Hunde Fall Nr. (LAVES), Oldenburg, Deutschland, Aktenzeichen: A241, Unters.- nummer Rasse Alter (J.) Geschl. KGW (kg) Klinische/ Pathologische Diagnose bzw. Herkunft 1 V521/12 Beagle 1,00 w 10,8 Kontrolltier Parasitologie 2 V522/12 Beagle 1,00 w 11,05 Kontrolltier Parasitologie 3 V523/12 Beagle 1,00 w 11,05 Kontrolltier Parasitologie 4 V524/12 Beagle 1,00 w 11,5 Kontrolltier Parasitologie

52 40 3 Material und Methoden Fall Nr. Unters.- nummer Rasse Alter (J.) Geschl. KGW (kg) Klinische/ Pathologische Diagnose bzw. Herkunft 5 V525/12 Beagle 1,00 wk 13,95 Kontrolltier Parasitologie 6 V526/12 Beagle 1,00 wk 12,05 Kontrolltier Parasitologie 7 V527/12 Beagle 1,00 wk 11,75 Kontrolltier Parasitologie 8 V528/12 Beagle 1,00 wk 12,85 Kontrolltier Parasitologie 9 V529/12 Beagle 1,00 wk 12,35 Kontrolltier Parasitologie 10 V530/12 Beagle 1,00 w 10,45 Kontrolltier Parasitologie 11 V531/12 Beagle 1,00 w 10,00 Kontrolltier Parasitologie 12 V532/12 Beagle 1,00 w 10,35 Kontrolltier Parasitologie 13 V535/12 Beagle 1,00 wk 13,45 Kontrolltier Parasitologie 14 V536/12 Beagle 1,00 wk 12,30 Kontrolltier Parasitologie 15 V546/12 DSH 10,75 wk 32,20 UV Abdomen 16 V550/12 Shar Pei 6,00 m 20,70 Blaualgenintoxikation 17 V551/12 Amerik. 15,80 m 9,80 Anorexie, Vomitus Cocker Spaniel 18 V552/12 Dt. Dogge 2,75 wk 70,00 Torsio ventriculi 19 V553/12 Golden 13,42 w 31,70 Agonie Retriever 20 V572/12 Mischling 16,50 wk 35,40 UV Abdomen, Anorexie 21 V612/12 Rottweiler 2,90 wk 50,10 22 V615/12 Neufundländer Mischling 6,34 mk 62,30 Nierenversagen, Hepatopathie 23 V822/12 Dt. Drahthaar 8,67 wk 24,20 Wundheilungsstörung nach Bissverletzung

53 3 Material und Methoden 41 Fall Nr. Unters.- nummer Rasse 24 V882/12 Dobermann Alter (J.) Geschl. KGW (kg) Klinische/ Pathologische Diagnose bzw. Herkunft 8,17 wk 35,00 Bandscheibenvorfall 25 V38/13 DSH 9,00 mk 32,00 Herzinsuffizienz, Perikarderguss 26 V186/13 Dt. Dogge 6,00 wk 64,00 Torsio ventriculi 27 V382/13 Berner 7,00 w 43,20 Torsio ventriculi Sennenhund Mischling 28 V383/13 Labrador 9,00 mk 36,40 Hepatopathie Retriever 29 V844/13 Beagle 2,00 w 8,70 Kontrolltier Parasitologie 30 V845/13 Beagle 2,00 m 12,80 Kontrolltier Parasitologie 31 V115/14 Berner Sennenhund Mischling 32 S939/12 Labrador Retriever 33 S966/12 Magyar Vizsla 9,50 mk 41,30 Anämie, PU/PD, reduziertes AB 0,17 wk 8,90 hochgradige, multifokale, akute Lebernekrosen 9,00 w 19,80 Übergangszellkarzinom der Blase, Meningoenzephalitis 34 S984/12 DSH 3,00 wk 34,70 Dermatitis 35 S1026/12 Mischling 1,50 m 17,00 Idiopathische Epilepsie 36 S1043/12 Staff. Terrier 13,84 m 19,70 rundzelliges Blastom Mischling 37 S1051/12 Berger Blanc 8,75 wk 35,75 Hämangiosarkom Suisse 38 S1060/12 Holländ. SH 3,00 wk 29,60 Idiopathische Epilepsie 39 S1100/12 DSH 8,75 wk 39,15 rupturiertes Milzhämatom

54 42 3 Material und Methoden Fall Nr. Unters.- nummer Rasse Alter (J.) Geschl. KGW (kg) Klinische/ Pathologische Diagnose bzw. Herkunft 40 S1161/12 Dt. Drahthaar 0,58 w 20,90 Hämothorax, hypovolämischer Schock 41 S1170/12 Mischling 11,75 mk 22,05 Neoplasie der Prostata 42 S1200/12 DSH 4,25 wk 27,60 nekrotisierende Enteritis 43 S1213/12 Australian Shepherd 3,75 w 19,70 Hämangiosarkom 44 S1251/12 Labrador Retriever 45 S1276/12 Dobermann 8,84 mk 42,30 rundzelliges Blastom, Spondylosen 8,33 mk 26,80 Hämangiosarkom, Hämoperikard 46 S1327/12 Mischling 12,58 m 26,40 Karzinomatose, Spondylosen, Bandscheibenvorfall 47 S1377/12 Golden Retriever 2,92 mk 26,50 Herz- Kreislaufversagen unklarer Genese 48 S1411/12 Boxer 5,92 wk 29,70 Stammhirnneoplasie 49 S1441/12 Mischling 2,08 m 16,00 Aszites, fibrinöse Enteritis 50 S1451/12 Berner 6,17 mk 59,00 rundzelliges Blastom Sennen-hund 51 S1486/12 Rottweiler 4,92 wk 41,00 Multiple Frakturen 52 S1501/12 DSH 10,58 m 39,00 komplexes Karzinom rechte Bustwand, Karzinomatose 53 S30/13 Mastiff 8,00 wk 74,00 chronische Nephritis 54 S53/13 Malinois 6,00 wk 22,10 Kaumuskelatrophie 55 S56/13 DSH 4,08 w 32,50 hochgradige Leberzellnekrosen 56 S91/13 Bulldogge 0,75 wk 16,50 Myokardfibrosen 57 S152/13 Terrier 2,84 w 9,95 Krampfgeschehen Mischling 58 S177/13 Boxer 6,08 wk 29,00 rundzelliges Sarkom

55 3 Material und Methoden 43 Fall Nr. Unters.- nummer Rasse Alter (J.) Geschl. KGW (kg) Klinische/ Pathologische Diagnose bzw. Herkunft 59 S185/13 Großer 1,25 w 45,50 Meningoenzephalitis Schweizer Sennenhund 60 S186/13 Mischling 4,25 mk 34,00 Hämangiosarkom (Herz, Lunge, ZNS) 61 S303/13 DSH 5,17 wk 41,00 idiopathische Epilepsie 62 S569/13 Belgischer Schäferhund Mischling 1,00 w 16,00 Autounfall, Hämothorax 63 S636/13 Akita Inu 4,33 w 25,80 Meningoenzephalitis 64 S731/13 Boxer Mischling 65 S950/13 Husky Mischling 5,92 mk 39,70 Meningoenzephalitis, Insulinom 6,92 wk 27,50 Bandscheibenvorfall 66 S1389/13 Dt. Dogge 2,17 m 98,00 Dilatative Kardiomyopathie 67 S1445/13 Labrador Retriever 68 S991/13 Dogo Argentino Mischling 69 S1002/13 Korthals Griffon 70 S203/14 Schwarzer Russ. Terrier 3,84 m 43,45 Autoimmunhämolytische Anämie 9,33 mk 50,40 Insulinom 3,00 wk 23,70 ulzerative Gastritis 2,33 mk 46,70 Herz- Kreislaufversagen unklarer Genese 71 S205/14 Samojede 7,84 wk 24,75 intramedulläres, spindelzelliges Sarkom des Humerus 72 S286/14 Leonberger 3,92 w 53,00 Hämangiosarkom

56 44 3 Material und Methoden Abkürzungen: AB = Allgemeinbefinden; Amerik. Cocker = Amerikanischer Cocker; m = männlich; mk = männlich kastriert; w = weiblich; wk = weiblich kastriert; DSH = Deutscher Schäferhund; Dt. Drahthaar = Deutsch Drahthaar; Dt. Dogge = Deutsche Dogge; Geschl. = Geschlecht; J. = Jahre; KGW = Körpergewicht; PU/PD = Polyurie/Polydipsie; SH = Schäferhund; Schwarzer Russ. Terrier = Schwarzer Russischer Terrier; Unters.-nummer = Untersuchungsnummer; UV = Umfangsvermehrung; ZNS = Zentralnervensystem; 3.2 Probengewinnung und -aufbereitung Die Proben der Hunde wurden im Zeitraum von 2012 bis 2014 im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gewonnen. Bei allen Hunden wurde der linke und rechte Femur im distalen Drittel sowie der rechte und linke Unterschenkel (Tibia und Fibula) im proximalen Drittel mittels einer Bandsäge (Bandsäge K430, Paul KOLBE GmbH, Elchingen) durchtrennt. Anschließend wurden je nach Größe des Kniegelenks 2 bis 10 ml einer 10%igen, gepufferten Formalinlösung von proximal in die Articulatio femoropatellaris injiziert. Danach wurden die Gelenke nach der von SUSTA et al. (2012) beschriebenen Methode in toto in einer 10%igen, gepufferten Formalinlösung fixiert. Nach 72-stündiger Fixation wurden die Gelenke eröffnet und es wurde eine makroskopische Beurteilung (siehe 3.3) vorgenommen. Im Anschluss daran wurden die Kniegelenke systematisch beprobt. Es wurden pro Knie insgesamt 5 Proben aus der Synovialis entnommen, wobei eine Probe aus der Articulatio femoropatellaris, 2 Proben aus der lateralen Bucht der Articulatio femorotibialis und 2 Proben aus der medialen Bucht der Articulatio femorotibialis gewonnen wurden (Abbildung 3.1).

57 3 Material und Methoden 45 Abbildung 3.1: Darstellung der Entnahmestellen der Synovialmembranproben am eröffneten, formalinfixierten Kniegelenk eines Hundes (Fall Nr. 46).

58 46 3 Material und Methoden Lokalisation 1 = Articulatio femoropatellaris, parapatellar Lokalisation 2 = Articulatio femorotibialis, laterale Bucht, kranial Lokalisation 3 = Articulatio femorotibialis, laterale Bucht, Aussackung um Musculus extensor digitorum longus Lokalisation 4 = Articulatio femorotibialis, mediale Bucht, kranial Lokalisation 5 = Articulatio femorotibialis, mediale Bucht, kaudal P = Patella PK = Parapatellarer Knorpel (Cartilago parapatellaris mediale et laterale) KF = Kniefettkörper (Corpus adiposum infrapatellare) LM = lateraler Meniscus articularis MM = medialer Meniscus articularis Des Weiteren wurden von allen 72 Hunden die beiden kranialen Kreuzbänder vollständig entnommen. Bei 49 Hunden wurden (aus insgesamt 94 Kniegelenken) die kaudalen Kreuzbänder vollständig entnommen. Während der Entnahme wurden die Kreuzbänder so geschnitten, dass das proximale Ende des Bandes (glatte Schnittkante) vom distalen Ende (spitz zulaufende Schnittkante) im weiteren Verlauf der Bearbeitung und Beurteilung am mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbten Paraffinschnitt unterschieden werden konnte. Kreuzbänder mit einem Durchmesser von > 5 mm wurden aus technischen Gründen in der Medianen längs geteilt. Die Fixierung und Entwässerung aller gewonnenen Proben erfolgte in einem Gewebeeinbettautomaten (Shandon Pathcentre, Termo Fisher Scientific Inc., Dreieich). Die Proben durchliefen dabei eine dreistündige Spülung in Leitungswasser, eine aufsteigende Alkoholreihe (70%iges, 80%iges und 96%iges Ethanol, Isopropanol; Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe) zum Entwässern und ein Intermedium (Essigsäure-n-Butylester; Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe) zur Entfernung letzter Alkoholreste, um die Durchgängigkeit für Paraffin zu erleichtern. Im Anschluss wurden die Proben an einer Ausgießstation (Tissue-Tek TEC 5, Sakura Finetek Europe B.V., Alphen aan den Rijn) in Paraffin (Paraplast Plus, Shandon, Frankfurt) eingebettet. Hierbei wurde im Hinblick auf die spätere Anfertigung der Schnitte besonderes Augenmerk auf die Ausrichtung der Proben gelegt.

59 3 Material und Methoden 47 Bis zur Anfertigung der Schnitte wurden die Blöcke bei Raumtemperatur und unter Lichtausschluss gelagert. Von den Paraffinblöcken wurden mittels eines Rotationsmikrotoms (Leica RM 2035, Leica Biosystems, Nußloch) 2 bis 4 m dünne Paraffinschnitte angefertigt. Diese wurden in einem 40 C warmen Wasserbad gestreckt und für die HE-Färbung (siehe 3.4) auf unbeschichtete Objektträger (Engelbrecht GmbH, Edermünde) und für die immunhistochemische und enzymhistochemische Untersuchung auf Adhäsionsobjektträger (Superfrost Plus Menzel-Gläser, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham) aufgezogen. Im Anschluss wurden die Schnitte in einem Wärmeschrank (Heraeus UT 6120, Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold) für mindestens 90 Minuten bei 65 C getrocknet. 3.3 Makroskopische Beurteilung der Kniegelenke Vor der Entnahme der Synovialmembranproben und der Kreuzbänder wurden die fixierten und eröffneten Kniegelenke makroskopisch beurteilt. Dabei wurden die Kreuzbänder ebenso wie die Menisken hinsichtlich ihrer Unversehrtheit untersucht. Des Weiteren wurden die Kniegelenke im Hinblick auf arthrotische Veränderungen wie Osteophytenbildung oder Knorpeldefekte beurteilt. Bei der Untersuchung festgestellte Veränderungen wurden in Anlehnung an VERSET et al. (2013) klassifiziert und dokumentiert (Tabelle 3.2). Tabelle 3.2: Kriterien für die makroskopische Beurteilung der Kniegelenke nach VERSET et al. (2013) Osteophyten keine 0 geringgradig/klein 1 mittelgradig/deutlich 2 hochgradig/groß 3 Knorpeldefekte keine 0 Farbveränderungen 1 Knorpelverlust 2 tiefer und/oder großflächiger Knorpelverlust 3 Grad Grad

60 48 3 Material und Methoden 3.4 Hämatoxylin-Eosin-Färbung An Paraffinschnitten von allen Synovialmembranproben und Kreuzbandproben wurde eine Hämatoxylin-Eosin-Übersichtsfärbung nach einem standardisierten Laborprotokoll automatisiert in einem Färbecenter (Leica ST 4040, Leica Biosystems, Nußloch) durchgeführt. 3.5 Spezialfärbungen An Paraffinschnitten ausgewählter Kreuzbandproben wurde eine Alcianblau-Färbung zum Nachweis saurer Glykosaminglykane (chondroide Metaplasie) oder eine Von- Kossa-Färbung zum Nachweis mineralisierter Kreuzbandanteile nach einem standardisierten Protokoll durchgeführt. 3.6 Lichtmikroskopische Beurteilung Die histologische Beurteilung der Kreuzband- und Synovialmembranproben wurde mittels eines binokulären Lichtmikroskops (Zeiss Axioplan, Oberkochen) vorgenommen Beurteilung der Kreuzbandproben Die Beurteilung der degenerativen Kreuzbandveränderungen erfolgte mittels eines für die eigenen Untersuchungen in Anlehnung an VASSEUR et al. (1985) und BARETT et al. (2005) modifizierten Gradingsystems (Tabelle 3.3). Die Auswertung der histologischen Befunde der Kreuzbandproben erfolgte mit Hilfe eigens dafür erstellter Auswertungsbögen. Es wurden die Fibroblastenkerne hinsichtlich ihres Erscheinungsbildes beurteilt. Dabei wurde eine deutlich ovoide oder runde Form als frühe chondroide Metaplasie interpretiert. Das Vorhandensein von Chondronen zeigte eine chondroide Metaplasie der Fibrozyten an (Abbildung 4.3, Abbildung 4.4, Abbildung 4.6). Der Verlust von Fibrozyten und dadurch entstandene azelluläre Bereiche, ebenso wie der Verlust der Kollagenfaserstruktur wurden im

61 3 Material und Methoden 49 Hinblick auf ihr Ausmaß beurteilt. Des Weiteren wurde eine möglicherweise vorhandene Mineralisation dokumentiert (Abbildung 4.7, Tabelle 4.3). Tabelle 3.3: Beurteilungsschema für histologische Kreuzbandveränderungen (modifiziert nach VASSEUR et al., 1985 und BARRETT et al., 2005) Grad 0 = keine Veränderungen 1 = geringgradige Veränderungen 2 = mittelgradige Veränderungen 3 = hochgradige Veränderungen Kreuzbandveränderungen - fusiformes bis leicht ovoides Erscheinungsbild der Fibrozyten - leicht gekräuseltes Erscheinungsbild der Kollagenfaserbündel und regelrechte Anordnung der Kollagenfasern Kleine fokale oder multifokale Bereiche betroffen - Fibrozytenverlust - Verlust der Kollagenfaserbündelstruktur - azelluläre Bereiche - frühe chondroide Metaplasie - Mineralisation Größere Bereiche (bis zur Hälfte des Durchmessers des Ligaments) betroffen - Fibrozytenverlust - Verlust der Kollagenfaserbündelstruktur - azelluläre Bereiche - chondroide Metaplasie - Mineralisation Mehr als die Hälfte des Durchmessers des Ligaments betroffen - Fibrozytenverlust - Verlust der Kollagenfaserbündelstruktur - große azelluläre Bereiche - chondroide Metaplasie - Mineralisation Beurteilung der Synovialmembranproben Die histologische Auswertung der Synovialmembranproben (n = 705) erfolgte ebenfalls mittels eigens dafür erstellter Auswertungsbögen. Die HE-gefärbten Gewebeschnitte wurden in ihrer Gesamtheit bei 400facher Vergrößerung (10er Okular und 40er Objektiv) beurteilt. Es wurde die Synovialdeckzellschicht im Hinblick auf die Anzahl der Reihen von Synovialdeckzellen beurteilt. Die Synovialmembran zeigte sich oberflächlich glatt oder es war eine zottige Proliferation vorhanden, welche semiquantitativ als gering- bis hochgradig eingestuft wurde. Die Häufigkeit der Gefäße

62 50 3 Material und Methoden wurde als geringgradig ( 5 Gefäße pro Gesichtsfeld bei 400facher Vergrößerung), mittelgradig (5 bis 10 Gefäße pro Gesichtsfeld bei 400facher Vergrößerung) oder hochgradig (> 10 Gefäße pro Gesichtsfeld bei 400facher Vergrößerung) eingestuft. Der Synovialmembrantyp wurde in Anlehnung an KEY (1928) und WYSOCKI und BRINKHOUS (1972) als adipös, areolär, fibrös oder als Mischtyp eingestuft. Die Zahl der Hämosiderophagen wurde semiquantitativ beurteilt. Die Entzündungszellen wurden pro Gesichtsfeld bei 400facher Vergrößerung gezählt und der Grad der Entzündung wurde auf der Grundlage eines modifizierten und an die eigenen Befunde angepassten Gradingsystems (SUSTA et al., 2012) als gering-, mittel- oder hochgradig eingestuft (Tabelle 3.4). Tabelle 3.4: Beurteilungsschema für entzündliche Veränderungen der Synovialmembran (modifiziert nach SUSTA et al., 2012) Grad Entzündliche Veränderungen der Synovialmembran 0 = keine Entzündung 1 = geringgradige Entzündung 2 = mittelgradige Entzündung 3 = hochgradige Entzündung - keine Entzündungszellinfiltration - diffuse und/oder perivaskuläre Infiltration von 10 Lymphozyten, Makrophagen, Plasmazellen - diffuse und/oder perivaskuläre Infiltration von > 10 und 150 Lymphozyten, Makrophagen, Plasmazellen - diffuse und/oder perivaskuläre Infiltration von > 150 Lymphozyten, Makrophagen, Plasmazellen 3.7 Immunhistochemie Da die Untersuchungen an den HE-gefärbten Schnitten ergaben, dass entzündliche Veränderungen der Synovialmembran am häufigsten in den Lokalisationen 4 und 5

63 3 Material und Methoden 51 (Abbildung 4.27) vorhanden waren, wurden diese für die immunhistochemische und enzymhistochemischen Untersuchungen ausgewählt. Der Nachweis der Antigene erfolgte mit den in Tabelle 3.5 aufgeführten Primärantikörpern und mittels Avidin- Biotin-Komplex-Methode. Zur Visualisierung wurde das Chromogen 3,3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) eingesetzt. Bei der Verwendung des Antikörpers zur Darstellung von CD163 wurde mit der von VON WASIELEWSKI et al. (1997) beschriebenen Tyraminverstärkungsreaktion gearbeitet Primärantikörper Tabelle 3.5: Übersicht über die verwendeten Primärantikörper Bezeichnung oder Klon Klonalität des Antikörpers Spezifität Donor/ Isotyp Konz. Herkunft AM-3K monoklonal humanes CD163 Maus/IgG1 250 µg/ml BioLogo MAC387 monoklonal humanes Maus/IgG1 66 µg/ml Dako S100A8/S100A9 (MRP8/MRP14, Calprotectin) TAL.1B5 monoklonal humanes HLA- Maus/IgG1 24 µg/ml Dako DR (MHC II) A0452 polyklonal humanes CD3 Kaninchen 600 µg/ml Dako HM57 monoklonal humanes CD79a Maus/IgG1 100 µg/ml Abcam Abkürzungen: CD = cluster of differentiation; HLA = human leucocyte antigen; Ig = Immunglobulin; Konz. = Konzentration; MHC = major histocompatibility complex; MRP = myeloid-related protein Die Expression des Oberflächenantigens CD163 wurde mittels des Antikörper-Klons AM-3K (BioLogo, Kronshagen) detektiert. Der Klon MAC387 (Dako, Hamburg) ist spezifisch für Calprotectin, einem Heterodimer aus den Proteinen S100A8 (MRP8) und S100A9 (MRP14). Zur Darstellung von Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes der Klasse II stand der Klon TAL.1B5 (Dako, Hamburg) zur Verfügung. Zur Darstellung des CD3-Komplexes auf T-Lymphozyten wurde ein polyklonaler,

64 52 3 Material und Methoden gegen humanes CD3 gerichteter Antikörper (Dako, Hamburg) verwendet. Der gegen humanes CD79a gerichtete Antikörperklon HM57 (Abcam plc., Cambridge) wurde zur Detektion von B-Lymphozyten eingesetzt Sekundärantikörper Als Sekundärantikörper wurde in Reaktionen mit den monoklonalen Primärantikörpern biotinyliertes Ziege anti-maus IgG (H+L, Vector Laboratories Inc., Burlingame) und biotinyliertes Ziege anti-kaninchen IgG bei der Reaktion mit dem polyklonalen Primärantikörper gegen CD3 (H+L, Vector Laboratories Inc., Burlingame) eingesetzt. Beide Sekundärantikörper wurden in einer Konzentration von 1,5 mg/ml verwendet. Die empfohlene Arbeitskonzentration laut Angaben des Herstellers lag bei 2-10 µg/ml. Die Sekundärantikörper wurden 1:200 mit PBS verdünnt, was einer IgG- beziehungsweise IgG 1 Konzentration von 7,5 µg/ml entsprach Vorversuche Mit allen verwendeten Primärantikörpern wurden Vorversuche durchgeführt. Um die optimale Verdünnung der Primärantikörper zu ermitteln, wurden verschiedene Verdünnungsstufen an den Paraffinschnitten der zu untersuchenden Proben und den jeweiligen Positivkontrollen getestet. Bei der Darstellung von CD163 wurde, um ein gleichbleibendes Ergebnis bei einer höheren Verdünnung zu erzielen, eine Tyraminverstärkungsreaktion durchgeführt Durchführung der immunhistochemischen Reaktionen In Tabelle 3.6 sind das für die jeweiligen Antikörper verwendete Demaskierungsverfahren, das verwendete Blockserum, die Verdünnung der Primärantikörper und der Sekundärantikörper angegeben.

65 3 Material und Methoden 53 Die Durchführung der immunhistochemischen Reaktionen erfolgte unter der Verwendung von Shandon Coverplates TM und Shandon Sequenza Slide Racks (Thermo Electron GmbH, Dreieich). Tabelle 3.6: Durchführung der immunhistochemischen Reaktionen Primärantikörper Maus anti- CD163 1 Maus anti- S100A8/S100A9 Maus anti- HLA-DR/MHC II Kaninchen anti- CD3 Maus anti- CD79a Demaskierung Blockserum Verdünnung Primärantikörper Citratpuffer, 20 Min. kochen in der Mikrowelle Citratpuffer, 20 Min. kochen in der Mikrowelle Citratpuffer, 20 Min. kochen in der Mikrowelle Citratpuffer, 20 Min. kochen in der Mikrowelle Citratpuffer, 20 Min. kochen in der Mikrowelle Ziegenserum 1:5 verdünnt in PBS Ziegenserum 1:5 verdünnt in PBS Ziegenserum 1:5 verdünnt in PBS Ziegenserum 1:5 verdünnt in PBS Ziegenserum 1:5 verdünnt in PBS Verdünnung Sekundärantikörper 1:600 biotinyl. Ziege anti-maus 1:200 1:600 biotinyl. Ziege anti-maus 1:200 1:150 biotinyl. Ziege anti-maus 1:200 1:1000 biotinyl. Ziege anti-kaninchen 1:200 1:10000 biotinyl. Ziege anti-maus 1:200 biotinyl. = biotinyliert; CD = cluster of differentiation; HLA = human leucocyte antigen; MHC = major histocompatibility complex; PBS = Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (ph 7,4); 1 mit Tyraminverstärkungsreaktion (tyramine amplification technique, TAT) Vor der immunhistochemischen Reaktion durchliefen die Paraffinschnitte eine Behandlung mit Rotihistol (Roti -Histol, Carl Roth GmbH + Co. KG) zur Entparaffinisierung für je 5 Minuten, woran sich zur Rehydrierung eine absteigende Alkoholreihe mit Isopropanol (2-Propanol Rotipuran, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe), 96% Ethanol und 70% Ethanol (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe) anschloss. Zur Unterdrückung einer unspezifischen Farbstoffumsetzung durch den Avidin-Biotin- Peroxidase-Komplex wurde die gewebeeigene, endogene Peroxidase durch In-

66 54 3 Material und Methoden kubation der Schnitte in 0,5%igem Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) in 70%igem Ethanol kompetitiv gehemmt. Es folgte ein dreimaliges Spülen der Schnitte in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, ph 7,4). Durch die Fixierung der Proben in Formalin kommt es zur Maskierung der Antigene durch Quervernetzung der Proteine oder Veränderung der Gestalt des Antigens, was eine Demaskierung erforderlich macht. Daher erfolgte im nächsten Schritt eine Antigendemaskierung mittels kochendem Citratpuffer (Biocyc GmbH & Co. KG, Luckenwalde) für 20 Minuten in der Mikrowelle. Im Anschluss erfolgte wieder ein dreimaliges Spülen in PBS. Zur Unterdrückung einer unspezifischen Hintergrundfärbung durch hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen fand eine Inkubation mit 1:5 verdünntem Ziegen- Normalserum für 20 Minuten bei Raumtemperatur unmittelbar vor dem Auftragen des Primärantikörpers statt. Zu gleichem Zweck wurde dem in PBS verdünnten Primärantikörper 1%iges bovines Serumalbumin (BSA, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) zugesetzt. Die Inkubation des Primärantikörpers erfolgte über Nacht bei 4 C. Nach der spezifischen Bindung des Primärantikörpers an das Antigen wurde dreimal mittels PBS gespült. Im Anschluss wurden die Schnitte mit dem biotinylierten Sekundärantikörper, welcher gegen das Immunglobulin der Spezies gerichtet war, aus der der Primärantikörper stammte, überschichtet und für 30 Minuten inkubiert. Dann wurde der Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Vectastain ABC Kit Standard, Vector Laboratories Inc., Burlingame) zugefügt. Dieser bindet an das Biotin des Sekundärantikörpers. Nach 30 minütiger Inkubation fand wieder ein dreimaliges Spülen mit PBS statt. Bei der immunhistochemischen Reaktion mit dem Antikörper gegen CD163 wurde mit der Tyraminverstärkungsreaktion (tyramine amplification technique, TAT) gearbeitet. Hierbei bindet biotinyliertes Tyramin an den Avidin-Biotin-Peroxidase- Komplex, wodurch weitere Bindungsstellen entstehen, die wiederum von erneut hinzugefügtem ABC besetzt werden und damit das Signal verstärken (VON WASIELEWSKI et al., 1997). Nach erneutem Spülen mit PBS wurden die Schnitte für 5 Minuten mit 0,05%igem DAB inkubiert. Unter Zugabe von H 2 O 2 wird durch die Peroxidase das DAB in ein braunes, unlösliches Farbprodukt umgewandelt, wodurch indirekt das Antigen

67 3 Material und Methoden 55 sichtbar gemacht wird. Im Anschluss wurde für 30 Sekunden in Hämalaun nach Mayer (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe) gegengefärbt und für 10 bis 15 Min. unter Leitungswasser gebläut. Die Schnitte durchliefen eine aufsteigende Alkoholreihe (Ethanol, Isopropanol und Essigsäure-n-Butylester, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe) und wurden mit xylolhaltigem Eindeckmedium (Roti -Histokitt II, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe) eingedeckt Kontrollen Die in Tabelle 3.5 aufgeführten kommerziell erhältlichen Antikörper reagieren spezifisch mit kaninem CD163 (YAMATE et al., 2000), kaninem Calprotectin, MHC II- Antigen (VILAFRANCA et al., 1995) und T- und B-Lymphozyten (CHRISTGAU et al., 1998) in formalinfixiertem, Paraffin-eingebettetem Gewebe. Als Spezifitätskontrolle für die vorliegenden Untersuchungen dienten Paraffinschnitte eines aus dem Sektionsgut des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover stammenden, in 10%igem Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lymphknoten eines Hundes (CHRISTGAU et al., 1998). Als Negativkontrollen zur Beurteilung unspezifischer Bindungen und dadurch entstandener Hintergrundfärbungen wurden Schnitte mitgeführt, bei denen anstelle der monoklonalen Primärantikörper Balb/c Mäuseaszites (BioLogo, Kronshagen) und statt des poyklonalen Antikörpers gegen CD3 Kaninchen-Normalserum (Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) eingesetzt wurde. Die Verdünnung des Balb/c Mäuseaszites beziehungsweise des Kaninchen-Normalserums wurde auf der Grundlage der vom Hersteller angegebenen IgG 1 /IgG-Konzentration der Primärantikörper berechnet Auswertung und Dokumentation Die Beurteilung der immunhistochemischen Reaktionen erfolgte mittels eines binokulären Lichtmikroskops (Zeiss Axioplan, Oberkochen) unter Zuhilfenahme einer Strichplatte mit Netzteilung (10 mm x 10 mm, 1 mm Teilung, Zeiss, Oberkochen).

68 56 3 Material und Methoden Zur quantitativen Auswertung der immunhistochemisch positiven Zellen wurden die Schnitte der Synovialmembranproben in der 400fachen Vergrößerung mäanderförmig abgefahren. Die positiven Zellen wurden anhand ihrer Morphologie weitergehend eingeteilt, gezählt und tabellarisch erfasst. Zudem wurden die Schnitte mittels Flachbettscanner (CanoScan 9000F, Canon Inc., Tokio) erfasst und mit Hilfe der Fiji (Fiji Is Just ImageJ)-Software, einer frei zugänglichen Software zur Bildanalyse, vermessen (SCHINDELIN et al., 2012). Die Zellzahl konnte so auf die Fläche von einem mm² umgerechnet werden (Tabelle 9.2.). 3.8 Enzymhistochemischer Nachweis von Tartrat-resistenter saurer Phosphatase Zur Darstellung der Expression der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP) in Makrophagen wurde das kommerziell erhältliche Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) eingesetzt. Dieses dient laut Herstellerangabe zum Nachweis saurer Phosphatase-Aktivität in Leukozyten (B- Lymphozyten) aus Blut, Knochenmark und soliden Gewebepräparaten. Um das TRAP-Kit für die Anzahl (288) der zu untersuchenden, ausgewählten Proben (Lokalisationen 4 und 5) nutzen zu können, musste es zunächst für die Anwendung in der feuchten Kammer (Moisture chamber, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham) angepasst werden. Es wurden zudem zwei verschiedene Kupplungsreagenzien getestet. Dem TRAP-Kit liegt das Diazoniumsalz Fast Garnet GBC als Kupplungsreagenz bei. Laut Literatur wurde bei verschiedenen Untersuchungen vor allem hexazotiertes Pararosanilin als Kupplungsreagenz eingesetzt (SUZUKI et al., 1998; MUIR et al., 2002; MUIR et al., 2005a). Zur Herstellung des Diazoniumsalzes hexazotiertes Pararosanilin wurde eine Pararosanilin-HCl Lösung hergestellt und kurz vor Gebrauch durch Mischen mit 4%iger Natrium-Nitrit-Lösung in das Diazoniumsalz umgewandelt, welches dann in der weiteren Durchführung als Kupplungsreagenz zur Verfügung stand. Da mit beiden Diazoniumsalzen ein gleichwertiges Ergebnis erzielt wurde und zur Herstellung der Pararosanilin-HCL-Lösung mit konzentrierter Salzsäure gearbeitet werden musste, wurde für die Unter-

69 3 Material und Methoden 57 suchungen Fast Garnet GBC Salz verwendet. Die Methode mit Fast Garnet GBCSalz wird überdies als sensitiver gegenüber der Methode mit Pararosanilin beschrieben und lässt zudem auch eine quantitative Auswertung der TRAP-Expression zu (JANCKILA et al., 2007) Durchführung der enzymhistochemischen Reaktion Zunächst wurden die Schnitte entparaffiniert und dehydriert und durchliefen zu diesem Zweck eine absteigende Alkoholreihe mit Isopropanol (2-Propanol Rotipuran, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe), 96% Ethanol und 70% Ethanol (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe). Im Anschluss fand ein dreimaliges Spülen in Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer (TRIS-Puffer, ph 7,6) und zweimaliges Spülen in Aqua dest. statt. Für die enzymhistochemische Reaktion wurde die im Folgenden beschriebene Lösung im Wasserbad bei einer konstanten Temperatur von 37 C angesetzt. Es wurde auf 37 C vorgewärmtes Aqua dest. vorgelegt und anschließend folgende Substanzen des Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit der Reihe nach zugegeben: Azetat-Lösung, Naphthol-AS-BI-Phosphorsäurelösung und Tartrat-Lösung. Nach jeder zugegebenen Substanz wurde gemischt. Dann wurde das zuvor in Aqua bidest. gelöste und aliquotierte Fast Garnet GBC Salz zugegeben und die Lösung, um einen Wärmeverlust zu vermeiden, möglichst schnell durch einen Faltenfilter mit 11 µl Retention filtriert (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren). Vor dem Überschichten der Schnitte auf den in einer feuchten Kammer befindlichen Objektträgern wurde die Lösung im Wasserbad wieder auf 37 C erwärmt. Die Inkubation erfolgte bei 37 C für eine Stunde unter Lichtausschluss im Wärmeschrank (Heraeus B 5042, Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold).

70 58 3 Material und Methoden Abbildung 3.2: Schematische Darstellung der enzymhistochemischen Reaktion zum Nachweis von Tartrat-resistenter saurer Phosphatase (TRAP). Die Tartrat-resistente saure Phosphatase katalysiert die Hydrolyse eines Phosphatesters im sauren Milieu (Abbildung 3.2). Im Testansatz wird das Substrat Naphthol- AS-BI-Phosphat durch enzymatische Hydrolyse zu Naphthol-AS-BI (primary reaction product) umgesetzt. Das freie alpha-naphthol dient dann als Kupplungsreagenz und bildet durch eine Azokupplung mit einem Diazoniumsalz, in diesem Fall Fast Garnet GBC Salz, einen magentafarbenen Azofarbstoff (final reaction product). Dem Test wird Tartrat zugesetzt, um die Resistenz der Phosphatase gegenüber Tartrat nachzuweisen Kontrollen Als Positivkontrolle wurden Paraffinschnitte von murinem Femur- und Milzgewebe, (HAYMAN et al., 2000), von kaninem Femurgewebe und von entzündlich verändertem Synovialmembrangewebe von Hunden mit spontaner Kreuzbandruptur

71 3 Material und Methoden 59 (Tabelle 3.7, Abbildung 3.3) mitgeführt (MUIR et al., 2005a). Die murinen Gewebeproben stammten von einem Kontrolltier aus einem Tierversuch, dieser wurde von der zuständigen Behörde (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES), Oldenburg, Deutschland, Aktenzeichen: /0897) genehmigt. Die kaninen Femurproben stammten aus dem Obduktionsgut des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Bei den kaninen Synovialmembranproben handelte es sich um anlässlich einer Operation in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (V1515/03, V840/04) beziehungsweise in der Kleintierklinik Greven (E35/05) entnommene und zu diagnostischen Zwecken an das Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover eingesandte Proben von Hunden mit spontaner Kreuzbandruptur. Die Negativkontrolle wurde ohne Naphthol-AS-BI-Phosphorsäurelösung angesetzt. Tabelle 3.7: Kontrolltiere und -gewebe für die enzymhistochemische Untersuchung zum Nachweis von TRAP Untersuchungsnummer Rasse/ Tierart Alter (Jahre) Gewebe V386/14 Maus 0,92 Femur, Milz S547/14 Hovawart 0,025 Femur S548/14 Hovawart 0,025 Femur V1515/03 Berner Sennenhund 5,0 Synovialmembran V840/04 DSH 7,0 Synovialmembran E35/05 Berner Sennenhund Mischling 6,0 Synovialmembran DSH = Deutscher Schäferhund

72 60 3 Material und Methoden Abbildung 3.3: Synovialmembrangewebe eines Hundes mit hochgradiger Entzündungszellinfiltration (E35/05). Nachweis von Makrophagen mit positiver TRAP- Reaktion (magentafarbener Farbniederschlag) Auswertung und Dokumentation Die gesamte Fläche der Schnitte wurde mittels eines Lichtmikroskops (Zeiss Axioplan, Oberkochen) mäanderförmig auf TRAP + Zellen untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9.2. festgehalten. 3.9 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem SAS Enterprise Guide für Windows (Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., Cary, USA) mit Unterstützung durch Mitarbeiter des Instituts für Biometrie, Epidemiologie und

73 3 Material und Methoden 61 Informationsverarbeitung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Für die grafische Darstellung wurde die Grafik- und Statistiksoftware GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) für Windows verwendet. Zur statistischen Auswertung wurde aus den Werten für die Entzündung der Synovialmembran der Median pro Knie und pro Hund berechnet. Für die Werte der degenerativen Veränderungen der Kreuzbänder und die Werte der quantitativen Beurteilung der immunhistochemischen Ergebnisse wurde ebenso der Median berechnet. Bei der Berechnung einfacher Häufigkeiten für qualitative Merkmale und der Verteilungsanalyse für quantitative Merkmale wiesen die Werte eine nicht normale Verteilung auf. Auf Grund dessen wurden ausschließlich nichtparametrische Tests angewendet. Zur Ermittlung eines möglichen Zusammenhangs zwischen dem Grad der Entzündung der Synovialmembran und dem Alter oder Körpergewicht der Hunde wurde eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt. Um eine mögliche Abhängigkeit der Kreuzbanddegeneration des kranialen Kreuzbands und der Synovialmembranentzündung nachzuweisen, wurde eine Tabellenanalyse (Chi-Quadrat-Test) durchgeführt. Des Weiteren wurde zur Analyse eines möglichen Zusammenhangs zwischen Merkmalen wie Entzündungszellzahl und Grad der Entzündung oder zur Berechnung eines möglichen Zusammenhangs zwischen Entzündung der Synovialmembran und degenerativen Veränderungen des kranialen beziehungsweise kaudalen Kreuzbands der Korrelationskoeffizient nach Spearman berechnet. Bei Gruppenvergleichen von zwei Gruppen wurde der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test (auch Mann-Whitney-U-Test oder Wilcoxon-Rangsummentest genannt) verwendet. Bei mehr als zwei Gruppen kam der Kruskal-Wallis-Test zum globalen Gruppenvergleich und im Anschluss der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test zum paarweisen Vergleich zur Anwendung. Für gepaarte Stichproben (repeated measures) wurde der Wilcoxon Signed-Rank Test, auch als Wilcoxon Test für verbundene Stichproben bezeichnet, verwendet. Bei mehr als 2 verbundenen Stichproben, wie bei den 5 verschiedenen Lokalisationen der Synovialmembran, kam der Friedman- Test zur Anwendung. Das Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05 festgelegt.

74 62 4 Ergebnisse 4 Ergebnisse Das durchschnittliche Alter der untersuchten Hunde (n = 72) betrug 5,13 Jahre, wobei der jüngste Hund ein Alter von 0,17 Jahren und der älteste Hund von 16,5 Jahren aufwies. Der leichteste Hund hatte ein Körpergewicht (KGW) von 8,7 kg, der schwerste Hund ein Körpergewicht von 98 kg (durchschnittliches Körpergewicht 29,57 kg) (Tabelle 4.1). Tabelle 4.1: Alters- und Gewichtsverteilung der untersuchten Hunde Alter (Jahre) Körpergewicht (kg) Mittelwert 5,13 29,57 Median 4,16 26,65 Minimum 0,17 8,70 Maximum 16,5 98,00 Die Geschlechterverteilung stellte sich wie folgt dar: 26,39% (n = 19) der Hunde waren weiblich, 41,67% (n = 30) weiblich-kastriert, 13,89% (n = 10) männlich und 18,06% (n = 13) waren männlich-kastriert. 4.1 Makroskopische Befunde Es waren nur in einigen Fällen arthrotische Veränderungen (Osteophytenbildung, Knorpeldefekte) der Kniegelenke zu beobachten (Tabelle 9.1). Bei 7 Hunden (Fall Nr. 26, 36, 39, 41, 48, 50, 58) fand sich eine gering- oder mittelgradige Osteophytenbildung an den Kondylen des Femurs und zum Teil distal an der Patella. In 6 Fällen (Fall Nr. 18, 19, 22, 36, 37, 39) zeigten sich Farbveränderungen des Knorpels, was einem Knorpeldefekt vom Grad 1 (Tabelle 3.2) entspricht. Die Menisken waren in allen untersuchten Gelenken unauffällig.

75 4 Ergebnisse Histologische Befunde Histologische Befunde an den Kreuzbandproben Von den insgesamt 238 in Paraffin eingebetteten und HE-gefärbten, kranialen und kaudalen Kreuzbändern wiesen 128 (53,78%) histologische Alterationen auf. Die Veränderungen betrafen 75 (52,08%) der 144 kranialen Kreuzbänder und 53 (56,38%) der 94 kaudalen Kreuzbänder. Tabelle 4.2 zeigt einen Überblick über die Grade der histologischen, degenerativen Veränderungen der Kreuzbandproben. Tabelle 4.2: Grad der histologischen Veränderungen an den Kreuzbändern Fall Nr. Untersuchungsnummer Rasse Alter (Jahre) KB rechts kranial KB links kranial KB rechts kaudal KB links kaudal 1 V521/12 Beagle 1, n.b. n.b. 2 V522/12 Beagle 1, n.b. n.b. 3 V523/12 Beagle 1, n.b. n.b. 4 V524/12 Beagle 1, V525/12 Beagle 1, n.b. n.b. 6 V526/12 Beagle 1, n.b. n.b. 7 V527/12 Beagle 1, n.b. n.b. 8 V528/12 Beagle 1, n.b. n.b. 9 V529/12 Beagle 1, n.b. n.b. 10 V530/12 Beagle 1, n.b. 11 V531/12 Beagle 1, n.b. n.b. 12 V532/12 Beagle 1, n.b. n.b. 13 V535/12 Beagle 1, V536/12 Beagle 1, n.b. n.b. 15 V546/12 DSH 10, n.b. 16 V550/12 Shar Pei 6, n.b. n.b. 17 V551/12 Amerik. 15, n.b. n.b. Cocker Spaniel 18 V552/12 Dt. Dogge 2, n.b. n.b. 19 V553/12 Golden 13, n.b. 2 Retriever 20 V572/12 Mischling 16, V612/12 Rottweiler 2, n.b. n.b.

76 64 4 Ergebnisse Fall Nr. Untersuchungsnummer Rasse Alter (Jahre) KB rechts kranial KB links kranial KB rechts kaudal 22 V615/12 Neufundl. 6, Mischling 23 V822/12 Dt. Drahthaar 8, V882/12 Dobermann 8, V38/13 DSH 9, V186/13 Dt. Dogge 6, V382/13 Berner 7, Sennenhund Mischling 28 V383/13 Labrador 9, Retriever 29 V844/13 Beagle 2, V845/13 Beagle 2, KB links kaudal 31 V115/14 Berner 9, Sennenhund Mischling 32 S939/12 Labrador 0, n.b. n.b. Retriever 33 S966/12 Magyar Vizsla 9, n.b. n.b. 34 S984/12 DSH 3, n.b. n.b. 35 S1026/12 Mischling 1, n.b. n.b. 36 S1043/12 Staffordshire 13, n.b. 3 Mischling 37 S1051/12 Berger Blanc 8, n.b. n.b. Suisse 38 S1060/12 Holländischer 3, n.b. n.b. Schäferhund 39 S1100/12 DSH 8, n.b. n.b. 40 S1161/12 Dt. Drahthaar 0, n.b. n.b. 41 S1170/12 Mischling 11, S1200/12 DSH 4, S1213/12 Australian 3, Shepherd 44 S1251/12 Labrador 8, Retriever 45 S1276/12 Dobermann 8,

77 4 Ergebnisse 65 Fall Nr. Untersuchungsnummer Rasse Alter (Jahre) KB rechts kranial KB links kranial KB rechts kaudal 46 S1327/12 Mischling 12, S1377/12 Golden 2, Retriever 48 S1411/12 Boxer 5, S1441/12 Mischling 2, S1451/12 Berner 6, Sennenhund 51 S1486/12 Rottweiler 4, S1501/12 DSH 10, S30/13 Mastiff 8, S53/13 Malinois 6, S56/13 DSH 4, S91/13 Bulldogge 0, S152/13 Terrier 2, Mischling 58 S177/13 Boxer 6, S185/13 Großer 1, Schweizer Sennenhund 60 S186/13 Mischling 4, S303/13 DSH 5, S569/13 Belgischer 1, Schäferhund Mischling 63 S636/13 Akita Inu 4, S731/13 Boxer 5, Mischling 65 S950/13 Husky 6, Mischling 66 S1389/13 Deutsche 2, Dogge 67 S1445/13 Labrador 3, Retriever 68 S991/13 Dogo 9, Argentino 69 S1002/13 Korthals Griffon 3, KB links kaudal

78 66 4 Ergebnisse Fall Nr. Untersuchungsnummer Rasse Alter (Jahre) KB rechts kranial KB links kranial KB rechts kaudal KB links kaudal 70 S203/14 Schwarzer 2, Russischer Terrier 71 S205/14 Samojede 7, S286/14 Leonberger 3, Amerik. Cocker Spaniel = Amerikanischer Cocker Spaniel; DSH= Deutscher Schäferhund; Dt. = Deutsch(e); KB = Kreuzband; Neufundl. = Neufundländer; n.b. = nicht beurteilt; 0 = keine Veränderungen, 1 = geringgradige Veränderungen; 2 = mittelgradige Veränderungen; 3 = hochgradige Veränderungen

79 4 Ergebnisse 67 In 69 (47,92%) der 144 kranialen Kreuzbänder (33 aus rechten Kniegelenken und 36 aus linken Kniegelenken) und in 41 (43,62%) der 94 kaudalen Kreuzbänder (davon 20 aus rechten und 21 aus linken Kniegelenken) zeigte sich histologisch ein normaler, regelrechter Aufbau (Grad 0) mit dichten, parallel angeordneten Kollagenfaserbündeln und fusiformen bis leicht ovoiden Fibrozytenkernen (Abbildung 4.1). Abbildung 4.1: unverändertes, rechtes, kraniales Kreuzband (Fall Nr. 38) mit parallel angeordneten Kollagenfaserbündeln und langgestreckten, fusiformen Fibrozytenkernen; HE-Färbung.

80 68 4 Ergebnisse Von den 75 kranialen Kreuzbändern mit degenerativen Alterationen wiesen 57 (76%) Veränderungen vom Grad 1 auf (Abbildung 4.2). Von den 53 kaudalen Kreuzbändern zeigten 44 (83,02%) Veränderungen vom Grad 1 (Tabelle 4.2). Abbildung 4.2: verändertes, linkes, kraniales Kreuzband (Fall Nr. 22) mit teilweisem Verlust der Kollagenfaserstruktur (Stern) und rundem oder ovalem Erscheinungsbild der Fibrozytenkerne; HE-Färbung.

81 4 Ergebnisse 69 Von den 75 kranialen Kreuzbändern mit degenerativen Alterationen wiesen 13 (17,33%) Veränderungen vom Grad 2 auf (Abbildung 4.3 und 4.4). Von den 53 kaudalen Kreuzbändern zeigten 6 (11,32%) Veränderungen vom Grad 2 (Tabelle 4.2). Abbildung 4.3: verändertes, rechtes, kraniales Kreuzband (Fall Nr. 18) mit multifokalem Verlust der Kollagenfaserstruktur (Sterne) und chondroider Metaplasie der Fibrozyten (Chondronenbildung) (Pfeile); HE-Färbung.

82 70 4 Ergebnisse Abbildung 4.4: verändertes, linkes, kraniales Kreuzband (Fall Nr. 41) mit multifokalem Verlust der Kollagenfaserstruktur (Sterne) und chondroider Metaplasie der Fibrozyten (Chondronenbildung) (Pfeile) sowie Mineralisation (siehe auch Abbildung 4.7); HE-Färbung. Von den 75 kranialen Kreuzbändern mit degenerativen Alterationen wiesen 5 (6,67%) Veränderungen vom Grad 3 (Abbildung 4.5) auf. Von den 53 kaudalen Kreuzbändern zeigten 3 (5,66%) Veränderungen vom Grad 3 (Tabelle 4.2).

83 4 Ergebnisse 71 Abbildung 4.5: verändertes, linkes, kraniales Kreuzband (Fall Nr. 50) mit großflächigem Verlust der Kollagenfaserstruktur und azellulären Bereichen mit nur noch vereinzelten Fibrozyten (Pfeile); HE-Färbung.

84 72 4 Ergebnisse Abbildung 4.6: verändertes, linkes, kraniales Kreuzband (Fall Nr. 50) mit Nachweis von intrazellulärem und perinukleärem Alcianblau (AB)-positivem Material (chondroide Metaplasie) sowie geringgradig extrazellulärem AB-positivem Material; Alcianblau-Färbung. Unabhängig vom Grad der Degeneration wiesen 19 (7,98%) der insgesamt 238 Kreuzbänder eine fokale bis multifokale Mineralisation auf (Abbildung 4.4 und Abbildung 4.7) (Tabelle 4.3).

85 4 Ergebnisse 73 Abbildung 4.7: linkes, kraniales Kreuzband mit hochgradiger Mineralisation (Fall Nr. 41); Von-Kossa-Färbung. Tabelle 4.3: Kreuzbänder mit Mineralisation Fall Nr. Untersuchungsnummer KB rechts kranial KB links kranial KB rechts kaudal 16 V550/ V615/ V115/ S1170/ S1501/ S30/ S177/ S186/ S286/ KB = Kreuzband; + = Mineralisation; - = keine Mineralisation KB links kaudal

86 74 4 Ergebnisse Bei 5 jungen Hunden (Fall Nr. 29, 30, 56, 59, 62) waren im kranialen sowie kaudalen Kreuzband vom Bandansatz ins Kreuzband ziehende Knorpelzellen zu finden. Zudem wiesen die Kreuzbänder eine deutlichere Vaskularität als die der älteren Hunde auf. Bei einem Hund ohne degenerative Veränderungen der Kreuzbänder (Fall Nr. 5) und bei zwei Hunden (Fälle Nr. 23 und 64) mit degenerativen Veränderungen der Kreuzbänder (Grad 1 und 2) fanden sich im proximalen Teil des linken kranialen Kreuzbands (Fälle Nr. 5 und 64) beziehungsweise des linken kaudalen Kreuzbands (Fall Nr. 23) fokale, zystische, teils multilokuläre Hohlräume. Die zystischen Strukturen waren nicht von Synoviozyten ausgekleidet (Abbildung 4.8). Abbildung 4.8: linkes, kraniales Kreuzband (Fall Nr. 64) mit zystischem Hohlraum (Z) im proximalen Keuzbandgewebe; Intima des Epiligaments (Sternchen); HE- Färbung.

87 4 Ergebnisse 75 Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mehr als die Hälfte (53,78%) der makroskopisch intakten kranialen und kaudalen Kreuzbänder histologisch degenerative Veränderungen aufwiesen, wobei die Alterationen meist geringgradig (76%) waren Histologische Befunde an den Synovialmembranproben Insgesamt wurden 705 Hämatoxylin-Eosin- (HE-) gefärbte Paraffinschnitte von Synovialmembranproben aus 5 verschiedenen Lokalisationen untersucht. Dabei wurde in 231 (32,77%) Proben eine entzündliche Infiltration der Synovialmembran festgestellt. In 474 (67,23%) der 705 untersuchten Proben war keine Infiltration mit Entzündungszellen (Grad 0) festzustellen (Abbildung 4.9). Abbildung 4.9: unveränderte Synovialmembran (Grad 0), Lokalisation 5 des linken Knies (Fall Nr. 44) vom fibrösen Typ mit 1 bis 3 reihiger Synovialdeckzellschicht, geringgradig Zotten und geringgradig Gefäßen; HE-Färbung.

88 76 4 Ergebnisse Von den insgesamt 231 entzündlich veränderten Synovialmembranproben zeigten 164 (71%) Proben geringgradige Veränderungen (Grad 1). Dabei wurden meist perivaskulär gelegene Entzündungszellinfiltrate von 10 Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen gefunden (Abbildung 4.10). Abbildung 4.10: Synovialmembranveränderung (Grad 1), Lokalisation 5 des rechten Knies (Fall Nr. 38) mit geringgradiger, perivaskulärer Infiltration von Entzündungszellen sowie geringgradig Hämosiderin; HE-Färbung.

89 4 Ergebnisse 77 Von den insgesamt 231 entzündlich veränderten Synovialmembranproben zeigten 45 (19,48%) Proben Veränderungen vom Grad 2. In diesen Fällen waren multifokale, teils konfluierende, mittelgradige Entzündungszell-Aggregate von > 10 und 150 Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen vorhanden. Die Entzündungszellen lagen perivaskulär (Abbildung 4.11) oder waren diffus verteilt unterhalb der Synovialdeckzellschicht zu finden. Abbildung 4.11: Synovialmembranveränderung (Grad 2); Lokalisation 5 des linken Knies (Fall Nr. 49) mit mittelgradiger, multifokaler, teils konfluierender, perivaskulärer Infiltration mit Plasmazellen, Makrophagen und Lymphozyten; HE-Färbung.

90 78 4 Ergebnisse Von den insgesamt 231 entzündlich veränderten Synovialmembranproben zeigten 22 (9,52%) Proben Veränderungen vom Grad 3 (Abbildung 4.12.) Dabei fanden sich Entzündungszellinfiltrationen mit > 150 Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen. Abbildung 4.12: Synovialmembranveränderung (Grad 3); Lokalisation 5 des rechten Knies (Fall Nr. 68) mit hochgradiger, multifokaler, teils konfluierender, Entzündungszellinfiltration und mittelgradig Hämosiderophagen; HE-Färbung. Weitere histologische Beurteilungskriterien waren die Synovialdeckzellschicht, die Ausprägung der Zotten, die Häufigkeit der Gefäße, der Synovialmembrantyp sowie die semiquantitative Beurteilung des Vorkommens von Hämosiderophagen. Bei allen untersuchten Synovialmembranproben (n = 705) wies die Synovialdeckzellschicht 1 bis 3 Zellreihen auf. Die Ausprägung der Zotten wurde bei der Mehrzahl

91 4 Ergebnisse 79 der Synovialmembranproben (n = 493; 69,93%) als geringgradig eingestuft. 127 (18,01%) Synovialmembranproben waren glatt, also ohne Zotten. 81 (11,49%) der Synovialmembranproben wiesen eine mittelgradige und 4 (0,57%) eine hochgradige Ausprägung der Zotten auf. Eine hochgradige Ausprägung der Zotten fand sich ausschließlich in der Lokalisation 5 (Articulatio femorotibialis, mediale Bucht, kaudal). Die Häufigkeit der Gefäße wurde bei 381 (54,04%) Synovialmembranproben als geringgradig, bei 257 (36,45%) Proben als mittelgradig und bei 67 (9,51%) Proben als hochgradig eingestuft (Tabelle 9.1). Der Synovialmembrantyp entsprach in 415 (58,87%) Synovialmembranproben dem fibrösen Typ (Abbildung 4.13), in 110 (15,6%) Proben dem adipösen Typ (Abbildung 4.14) und in 99 (14,04%) Proben dem areolären Typ (Abbildung 4.15). In 81 (11,49%) der Synovialmembranproben lagen Mischtypen vor. 626 (88,79%) der Synovialmembranproben wiesen keine Hämosiderophagen auf. In 64 (9,08%) Proben waren geringgradig, in 13 (1,84%) Proben mittelgradig und in 2 (0,28%) Proben hochgradig Hämosiderophagen zu finden. 11 der 13 Proben mit mittelgradigem Vorhandensein von Hämosiderophagen und die beiden Proben mit hochgradig Hämosiderophagen stammten aus der medialen Bucht der Articulatio femorotibialis (Lokalisation 4 und Lokalisation 5). Zusammenfassend ist festzustellen, dass in der Mehrzahl der untersuchten Synovialmembranproben (67,23%) histologisch keine Entzündungszellinfiltrate vorlagen. 32,77% wiesen entzündliche Infiltrationen der Synovialmembran auf, wobei hauptsächlich (71%) geringgradige Veränderungen (Grad 1) vorlagen, während mittelgradige (Grad 2; 19,48%) oder hochgradige (Grad 3; 9,52%) entzündliche Veränderungen seltener anzutreffen waren.

92 80 4 Ergebnisse Abbildung 4.13: Synovialmembran vom fibrösen Typ; Lokalisation 5, Fall 44; HE-Färbung. Abbildung 4.14: Synovialmembran vom adipösen Typ; Lokalisation 2, Fall 38; HE-Färbung. Abbildung 4.15: Synovialmembran vom areolären Typ; Lokalisation 5, Fall 65; HE-Färbung.

93 4 Ergebnisse Statistische Ergebnisse Im Anschluss an die lichtmikroskopische Beurteilung der mit HE gefärbten Paraffinschnitte der Kreuzband- und Synovialmembranproben wurden, um zu überprüfen, ob statistisch signifikante Zusammenhänge zwischen den einzelnen Parametern (siehe 3.9) vorhanden waren, verschiedene statistische Tests durchgeführt Regressionsanalyse Bei der linearen Regression zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Synovitis und der Degeneration der kranialen Kreuzbänder (abhängige Variable) mit dem Alter und dem Körpergewicht (unabhängige Variablen) der Hunde. Die errechnete lineare Regression für die Synovitis in Abhängigkeit vom Alter ergab ein Bestimmtheitsmaß r 2 von 0,1448 (p = 0,001) (Abbildung 4.16) und in Abhängigkeit vom Körpergewicht von 0,08640 (p = 0,0122) (Abbildung 4.17). Das Bestimmtheitsmaß r 2 dient der Erklärung der Varianz (Schwankung) der abhängigen Variable von den unabhängigen Variablen. Liegt das Bestimmtheitsmaß r 2 bei 0 haben die unabhängigen Variablen, in diesem Fall Alter beziehungsweise Körpergewicht, keinen Einfluss auf die abhängige Variable. Liegt r 2 bei 1 bedeutet das, dass die unabhängigen Variablen die abhängige Variable bestimmen. Anhand der erhobenen Daten ist festzustellen, dass der Grad der Entzündung der Synovialmembran in geringem Maße von Alter und Körpergewicht der Hunde abhängt (Abbildung 4.16 und Abbildung 4.17).

94 82 4 Ergebnisse Abbildung 4.16: Ergebnis der linearen Regression; Grad der Entzündung der Synovialmembran (Grad 0-3) in Abhängigkeit vom Alter der Hunde (in Jahren), r 2 = 0,1448 (p = 0,001). Die durchgängige schwarze Linie gibt die Regressionsgerade an, die gepunkteten schwarzen Linien geben das 95%Konfidenzband an. Abbildung 4.17: Ergebnis der linearen Regression; Grad der Entzündung der Synovialmembran (Grad 0-3) in Abhängigkeit vom Körpergewicht (kg) der Hunde, r 2 = 0,0864 (p = 0,0122). Die durchgängige schwarze Linie gibt die Regressionsgerade, die gepunkteten schwarzen Linien geben das 95%Konfidenzband an.

95 4 Ergebnisse 83 Die durchgeführte lineare Regression ergab für den Zusammenhang der Degeneration des kranialen Kreuzbands in Abhängigkeit von Alter und Körpergewicht der untersuchten Hunde ein Bestimmtheitsmaß r 2 von 0,3959 (p < 0,0001) (Abbildung 4.18) beziehungsweise 0,2599 (p < 0,0001) (Abbildung 4.19). Demzufolge ist der Grad der Degeneration des kranialen Kreuzbands in höherem Maße von Alter und Körpergewicht abhängig als der Grad der Synovialmembranentzündung. Abbildung 4.18: Ergebnis der linearen Regression; Grad der Degeneration des kranialen Kreuzbands (Grad 0-3) in Abhängigkeit vom Alter der Hunde (in Jahren), r 2 = 0,3959 (p < 0,0001). Die durchgängige schwarze Linie gibt die Regressionsgerade, die gepunkteten schwarzen Linien geben das 95%Konfidenzband an.

96 84 4 Ergebnisse Abbildung 4.19: Ergebnis der linearen Regression; Grad der Degeneration des kranialen Kreuzbands (Grad 0-3) in Abhängigkeit vom Körpergewicht (kg) der Hunde, r 2 = 0,2599 (p < 0,0001). Die durchgängige schwarze Linie gibt die Regressionsgerade, die gepunkteten schwarzen Linien geben das 95%Konfidenzband an Tabellenanalyse Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war es, zu ermitteln, ob beziehungsweise in wie vielen Fällen der untersuchten Hunde entzündliche Veränderungen der Synovialmembran bei gleichzeitig histologisch unveränderten kranialen Kreuzbändern vorlagen. Von den insgesamt 72 (100%) untersuchten Hunden wiesen 27 (37,5%) Hunde weder eine entzündliche Veränderung der Synovialmembran noch degenerative Veränderungen der kranialen Kreuzbänder auf. 25 (34,72%) Hunde hatten sowohl eine Entzündung der Synovialmembran als auch eine Alteration der kranialen Kreuzbänder. Eine Degeneration des kranialen Kreuzbands ohne entzündliche Beteiligung der Synovialmembran wurde bei 15 (20,83%) Hunden gefunden. Bei 5 (6,94%) Hunden lagen entzündliche Veränderungen der Synovialmembran bei unveränderten kranialen Kreuzbändern vor (Abbildung 4.20).

97 4 Ergebnisse 85 Der im Rahmen der Tabellenanalyse durchgeführte Chi-Quadrat-Test ergab, dass die Kreuzbanddegeneration des kranialen Kreuzbands und die Synovialmembranentzündung voneinander abhängig sind (siehe hierzu auch Korrelationskoeffizient nach Spearman). a) Synovialmembranentzündung JA (Grad 1-3) Synovialmembranentzündung NEIN (Grad 0) Total Degeneration crkb NEIN (Grad 0) n = 5 n = 27 n = 32 Degeneration crkb JA (Grad 1 3) n = 25 n = 15 n = 40 b) Total n = 30 n = 42 n = 72 Abbildung 4.20 (a, b): Gestapeltes Säulendiagramm (a) und Kontingenztafel (b); absolute und relative Häufigkeiten der Hunde mit und ohne Synovialmembranentzündung und mit und ohne Degeneration eines oder beider kranialen Kreuzbänder; crkb = kraniale Kreuzbänder; SM-Entz. = Synovialmembranentzündung

98 86 4 Ergebnisse In der Tabelle 4.4 sind die 5 Hunde aufgeführt, die zwar entzündliche Läsionen der Synovialmembran aufwiesen, bei denen jedoch keine degenerativen Veränderungen der kranialen Kreuzbänder vorlagen. Tabelle 4.4: Hunde mit entzündlichen Läsionen der Synovialmembran und histologisch unveränderten kranialen Kreuzbändern SM- Entzündung Degeneration krkb Fall Nr. Rasse Alter (Jahre) 1 Beagle 1,00 geringgradig keine keine 8 Beagle 1,00 geringgradig keine keine Degeneration kdkb 38 Holländischer 3,00 geringgradig keine keine Schäferhund 42 DSH 4,25 geringgradig keine keine 60 Mischling 4,25 geringgradig keine geringgradig DSH = Deutscher Schäferhund; kdkb = kaudale Kreuzbänder; krkb = kraniale Kreuzbänder Korrelationsanalyse nach Spearman Mittels Korrelationsanalyse nach Spearman wurde untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen dem Grad der Entzündung der Synovialmembran und dem Grad der Degeneration des kranialen beziehungsweise kaudalen Kreuzbands besteht (Tabelle 4.5). Der Korrelationskoeffizient nach Spearman kann Werte zwischen 1 = hohe Korrelation, 0 = keine Korrelation und -1 = negative Korrelation annehmen. Der Korrelationskoeffizient r liegt für die Korrelation von Synovialmembranentzündung und Kreuzbanddegeneration des kranialen Kreuzbands bei r 0,60701 (p < 0,0001) und für die Korrelation Synovialmembranentzündung mit der Degeneration des kaudalen Kreuzbands bei r 0,50872 (p = 0,0002). Demnach liegt eine signifikante, positive Korrelation der Variablen vor. Laut Korrelationskoeffizient nach Spearman besteht also ein deutlicher Zusammenhang zwischen dem Grad der Entzündung der Synovialmembran und dem Grad der Degeneration des kranialen beziehungsweise kaudalen Kreuzbands.

99 4 Ergebnisse 87 Tabelle 4.5: 16-Felder-Tafel; Verteilung/Korrelation von Degeneration des kranialen/kaudalen Kreuzbands und der Synovialmembranentzündung bei den 72 untersuchten Hunden Synovialmembranentzündung keine Synovialmembranentzündung ggr. Synovialmembranentzündung mgr. Synovialmembranentzündung hgr. Total Degeneration krkb/kdkb hgr. n = 0 a /1 b n = 1 a /1 b n = 1 a /0 b n = 0 a /0 b n = 2 a /2 b Degeneration krkb/kdkb mgr. n = 1 a /0 b n = 5 a /4 b n = 3 a /1 b n = 1 a /0 b n = 10 a /5 b Degeneration krkb/kdkb ggr. n = 14 a /13 b n = 12 a /10 b n = 2 a /2 b n = 0 a /1 b n = 28 a /26 b Degeneration krkb/kdkb keine n = 27 a /14 b n = 5 a /1 b n = 0 a /1 b n = 0 a /0 b n = 32 a /16 b Total n = 42 a /27 b n = 23 a /16 b n = 6 a /5 b n = 1 a /1 b n = 72 a /49 b a = kraniale Kreuzbänder; b = kaudale Kreuzbänder; ggr. = geringgradig; hgr. = hochgradig; kdkb = kaudale Kreuzbänder; krkb = kraniale Kreuzbänder; mgr. = mittelgradig Kruskal-Wallis-Test und Wilcoxon-Mann-Whitney-Test Für die weiteren statistischen Tests (Gruppenvergleiche) wurden die Hunde nach Alter, Körpergewicht und Rasse in Gruppen eingeteilt. Die Hunde wurden in folgende Altersgruppen eingeteilt: 1,6 Jahre, 1,7-6 Jahre und > 6 Jahre eingeteilt. Die Verteilung der Hunde nach Altersgruppen ist in Abbildung 4.21 dargestellt. Auf die Altersgruppe der Hunde 1,6 Jahre entfielen 20 (27,78%) Tiere. Jeweils 26 (36,11%) Hunde gehörten der Altersgruppe 1,7-6 Jahre und > 6 Jahre an.

100 88 4 Ergebnisse Abbildung 4.21: Verteilung der Hunde (n = 72) nach dem Alter; Altersgruppe 1,6 Jahre, n =20; Altersgruppe 1,7-6 Jahre, n =26; Altersgruppe > 6 Jahre, n = 26. Es wurden zwei Gewichtsgruppen festgelegt, eine Gewichtsgruppe mit 15 kg Körpergewicht und eine Gewichtsgruppe mit > 15 kg Körpergewicht. Die Gewichtsgruppe von 15 kg Körpergewicht bestand aus 19 (26,39%) Hunden, die Gruppe mit > 15 kg Körpergewicht bestand aus 53 (73,61%) Hunden (Abbildung 4.22).

101 4 Ergebnisse 89 Abbildung 4.22: Verteilung der Hunde (n = 72) nach dem Körpergewicht; Gewichtsgruppe 15 kg Körpergewicht, n = 19; Gewichtsgruppe > 15 kg Körpergewicht, n = 53. Des Weiteren wurden die untersuchten Hunde nach den in der Literatur angegebenen Rassedispositionen (Tabelle 2.1) in Gruppen eingeteilt. Hierbei wurden die Beagle, die aus einer Versuchstierhaltung stammten, für die Gruppenvergleiche als eine eigene Gruppe geführt. Die Gruppe der disponierten und nicht disponierten Hunderassen bestand aus je 28 (38,89%) Hunden. Die Gruppe der Beagle bestand aus 16 (22,22%) Tieren (Abbildung 4.23).

102 90 4 Ergebnisse Abbildung 4.23: Verteilung der Hunde (n = 72) nach Rassen; Gruppe der disponierten Hunde, n = 28; Gruppe der nicht disponierten Hunde, n = 28; Gruppe der Beagle, n = 16. Bei der biometrischen Analyse der verschiedenen Gruppen mittels Kruskal-Wallis- Test und/oder Wilcoxon-Mann-Whitney-Test hinsichtlich der Synovitis ergaben sich folgende Ergebnisse. Der Grad der Synovialmembranentzündung der Hunde der Altersgruppe 1,6 Jahre war signifikant niedriger im Vergleich mit den anderen beiden Altersgruppen (Abbildung 4.24). Der Mittelwert der Entzündung bei den Hunden der Altersgruppen lag bei 0,04 für die Gruppe der 1,6 Jahre alten Tiere. In dieser Gruppe lagen der Minimalwert bei 0,0 und der Maximalwert bei 0,5. Der Mittelwert lag in der Gruppe der 1,7-6 Jahre alten Hunde bei 0,42, der Minimalwert lag bei 0,0 und der Maximalwert bei 3,0. Die Hunde der > 6 Jahre alten Altersgruppe wiesen einen Mittelwert von 0,62, einen Minimalwert von 0,0 und einen Maximalwert von 2,0 auf.

103 4 Ergebnisse 91 Abbildung 4.24: Gruppenweise und paarweise Vergleiche der Synovialmembranentzündung (Grad 0-3) nach Altersgruppen mittels Kruskal-Wallis-Test und Wilcoxon- Mann-Whitney-Test; 1,6 Jahre (n = 20), 1,7-6 Jahre (n = 26), > 6 Jahre (n = 26); die horizontalen Linien geben den Mittelwert an. Der Grad der Synovialmembranentzündung der Hunde 15 kg Körpergewicht war im Vergleich mit den Hunden der Gruppe 15 kg Körpergewicht signifikant niedriger (Abbildung 4.25). Der Mittelwert der Entzündung bei den Hunden der Gewichtsgruppe mit 15 kg Körpergewicht lag bei 0,04 und für die Gewichtsgruppe mit > 15 kg Körpergewicht bei 0,51. Der Minimalwert lag in beiden Gewichtsgruppen bei 0,0. Der Maximalwert lag bei 0,5 für die Gruppe der Hunde mit 15 kg Körpergewicht und bei 3,0 für die Gruppe der Hunde mit > 15 kg Körpergewicht.

104 92 4 Ergebnisse Abbildung 4.25: Paarweiser Vergleich der Synovialmembranentzündung (Grad 0-3) nach Gewichtsgruppen mittels Wilcoxon-Mann-Whitney-Test; 15 kg Körpergewicht (n = 19), > 15 kg (n=53); die horizontalen Linien geben den Mittelwert an. Die Hunde der disponierten Rassen wiesen im Vergleich mit den Hunden der nicht disponierten Rassen zwar einen Unterschied hinsichtlich der Synovialmembranentzündung auf, dieser war jedoch nicht signifikant. Die beiden Gruppen zeigten hinsichtlich des Grads der Entzündung jedoch einen signifikanten Unterschied gegenüber der Gruppe der Beagle (Abbildung 4.26). Der Mittelwert der Entzündung bei den Hunden in der Gruppe der disponierten Rassen lag bei 0,56, der Minimalwert bei 0,0 und der Maximalwert bei 3,0. Der Mittelwert der Entzündung bei den Hunden in der Gruppe der nicht disponierten Rassen lag bei 0,05, der Minimalwert bei 0,0 und der Maximalwert bei 0,5.

105 4 Ergebnisse 93 Abbildung 4.26: Gruppenweise und paarweise Vergleiche der Synovialmembranentzündung (Grad 0-3) nach Rassegruppen; mittels Kruskal-Wallis-Test und Wilcoxon-Mann-Whitney-Test; Gruppe der disponierten Hunde (n = 28); Gruppe der nicht disponierten Hunde (n = 28); Gruppe der Beagle (n = 16); die horizontalen Linien geben den Mittelwert an Wilcoxon Signed-Rank Test und Friedman-Test Ein Vergleich des linken und rechten Knies hinsichtlich der Synovialmembranentzündung mittels Wilcoxon Signed-Rank Test ergab keinen signifikanten Unterschied. Die Mittelwerte waren annähernd gleich. Der Mittelwert für das linke Knie lag bei 0,47, der für das rechte Knie bei 0,45. Der Minimalwert lag bei beiden Knien bei 0,0 und der Maximalwert bei 3,0. Der Vergleich der 5 verschiedenen Synovialmembranlokalisationen nach dem Friedman-Test für gepaarte Stichproben (repeated measures) ergab einen signifikanten Unterschied zwischen den Lokalisationen hinsichtlich des Grads der Entzündung (Abbildung 4.27).

106 94 4 Ergebnisse Abbildung 4.27: Vergleich der Synovialmembranentzündung (Grad 0-3) der verschiedenen Synovialmembranlokalisationen (1-5) mittels Friedman-Test für gepaarte Stichproben (repeated measures); LOK = Lokalisation. Mit einem Mittelwert von 0,71 für Lokalisation 4 und 0,55 für Lokalisation 5 waren diese beiden, aus der medialen Bucht der Art. femorotibialis stammenden Lokalisationen am stärksten betroffen. Der Grad der Entzündung in Lokalisation 4 war signifikant höher als in den Lokalisationen 1, 2 und 3. Der Grad der Entzündung in Lokalisation 5 war lediglich gegenüber dem der Lokalisation 1 signifikant höher. Der Minimalwert lag bei allen Lokalisationen bei 0,0 und der Maximalwert bei 3, Immunhistochemische und enzymhistochemische Ergebnisse an den Synovialmembranproben Die immun- und enzymhistochemischen Untersuchungen der Synovialmembranproben der Lokalisationen 4 und 5 ergaben die im Folgenden geschilderten Befunde. Alle Ergebnisse der immunhistochemischen und enzymhistochemischen Auswertung finden sich im Anhang in Tabelle 9.2.

107 4 Ergebnisse Immunhistochemische und statistische Ergebnisse zu CD163 Bei der immunhistochemischen Untersuchung der Synovialmembranproben (Lokalisation 4 und 5) mit dem monoklonalen Antikörper AM-3K waren CD163 + Makrophagen in der Subintima und auch in der Synovialdeckzellschicht (Intima synovialis) nachweisbar. Die positiven Makrophagen stellten sich als runde bis polygonale Zellen mit reichlich Zytoplasma und rundem Zellkern dar (Abbildung 4.28). Im tieferliegenden subsynovialen Gewebe fanden sich teils spindelförmige CD163 + Zellen (Abbildung 4.29). Diese Zellen besaßen nur wenig Zytoplasma, einen runden Zellkern und ein bis zwei Zellausläufer. Die CD163 + Synovialdeckzellen besaßen die gleiche Zellmorphologie wie subintimale CD163 + Makrophagen (Abbildung 4.28). Abbildung 4.28: CD163 exprimierende Zellen in einer hochgradig entzündlich infiltrierten Synovialmembran, Lokalisation 4 des rechten Knies (Fall Nr. 41). Es sind zahlreiche CD163 + Makrophagen in der Subintima vorhanden. Des Weiteren exprimiert ein Teil der Synovialdeckzellen CD163; ABC-Methode.

108 96 4 Ergebnisse Abbildung 4.29: CD163 exprimierende spindelförmige Zellen (Pfeile) im Stratum subsynoviale der Synovialmembran, Lokalisation 4 des linken Knies (Fall Nr. 50); ABC-Methode.

109 4 Ergebnisse 97 Für die statistische Auswertung wurden CD163 + Makrophagen in der Subintima und CD163 + Synovialdeckzellen quantitativ erfasst (Tabelle 9.2). Bei der Korrelation nach Spearman ergaben sich folgende Korrelationskoeffizienten. Die Korrelation der Anzahl CD163 + Makrophagen in der Subintima und dem tieferliegenden subsynovialen Gewebe mit der Synovialmembranentzündung ergab einen Korrelationskoeffizienten von r 0,33767 (p 0,0037). Der Korrelationskoeffizient r lag für die Korrelation zwischen der Anzahl CD163 + Makrophagen und dem Alter der Hunde bei r 0,30452 (p 0,0093) und für die Anzahl CD163 + Makrophagen mit dem Körpergewicht der Tiere bei r 0,40657 (p 0,0004). Demnach lagen ein schwacher positiver Zusammenhang der Zahl CD163 + Makrophagen mit der Synovialmembranentzündung und dem Alter der Hunde und ein mäßiger positiver Zusammenhang von CD163 + Makrophagen mit dem Körpergewicht der Hunde vor. Für die Anzahl CD163 + Synovialdeckzellen ergab sich kein signifikanter Korrelationskoeffizient für die Korrelation mit der Synovialmembranentzündung und dem Alter der Hunde. Der Korrelationskoeffizient für die Korrelation der Anzahl CD163 + Synovialdeckzellen mit dem Körpergewicht der Hunde lag bei r 0,30550 (p 0,0091), womit ein schwacher, positiver Zusammenhang bestand. Der Kruskal-Wallis-Test und der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test führten beim Vergleich der Altersgruppen hinsichtlich subintimaler CD163 + Makrophagen und CD163 + Synovialdeckzellen zu folgenden Ergebnissen. Es fanden sich signifikant mehr CD163 + Makrophagen in der Synovialmembran von Hunden > 6 Jahre als bei Hunden 1,6 Jahre. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied dieser Gruppen gegenüber den Hunden zwischen 1,7 Jahren und 6 Jahren (Abbildung 4.30 und Tabelle 4.6).

110 98 4 Ergebnisse Abbildung 4.30: Anzahl der Makrophagen mit Expression von CD163 + pro mm 2 Synovialmembran in den Altersgruppen 1,6 Jahre, 1,7-6 Jahre und > 6 Jahre (Box- Whisker-Plot mit Minimum, Quartil P25, Median, Quartil P75 und Maximum). Tabelle 4.6: Kennwerte des Box-Whisker-Plots für CD163 + Synovialmembran nach Altersgruppen Altersgruppe 1,6 Jahre Altersgruppe 1,7-6 Jahre Makrophagen in der Altersgruppe > 6 Jahre Minimum 0,0100 0,0 0,1140 Quartil P25 0,3323 0,4910 1,829 Median 1,276 5,179 3,509 Quartil P75 3,069 7,520 8,457 Maximum 8,022 22,79 32,02

111 4 Ergebnisse 99 Die Gewichtsgruppe der > 15 kg schweren Hunde wies signifikant höhere Werte für Makrophagen mit Expression von CD163 gegenüber den Hunden von 15 kg auf (Abbildung 4.31 und Tabelle 4.7). Abbildung 4.31: Anzahl der Makrophagen mit Expression von CD163 + pro mm 2 Synovialmembran in den Gewichtsgruppen 15 kg und > 15 kg Körpergewicht (Box- Whisker-Plot mit Minimum, Quartil P25, Median, Quartil P75 und Maximum). Tabelle 4.7: Kennwerte des Box-Whisker-Plots für CD163+ Makrophagen in der Synovialmembran nach Gewichtsgruppen Gewichtsgruppe 15 kg Gewichtsgruppe > 15 kg Minimum 0,0 0,0890 Quartil P25 0,1390 1,349 Median 0,7740 4,095 Quartil P75 2,123 7,676 Maximum 10,48 32,02

112 100 4 Ergebnisse Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschieden Altersgruppen hinsichtlich der Anzahl CD163 + Synovialdeckzellen (Abbildung 4.32 und Tabelle 4.8). Abbildung 4.32: Anzahl der Synovialdeckzellen mit Expression von CD163 + pro mm 2 Synovialmembran in den Altersgruppen 1,6 Jahre, 1,7-6 Jahre und > 6 Jahre (Box- Whisker-Plot mit Minimum, Quartil P25, Median, Quartil P75 und Maximum). Tabelle 4.8: Kennwerte des Box-Whisker-Plots für CD163 + Synovialdeckzellen der Synovialmembran nach Altersgruppen Altersgruppe 1,6 Jahre Altersgruppe 1,7-6 Jahre Altersgruppe > 6 Jahre Minimum 0,0 0,0 0,0630 Quartil P25 0,3378 0,3340 0,7978 Median 0,6520 2,596 1,787 Quartil P75 2,574 5,957 3,411 Maximum 8,783 12,59 20,99

113 4 Ergebnisse 101 Ebenso wie bei den subintimalen CD163 + Makrophagen fanden sich signifikant höhere Werte von CD163 + Synovialdeckzellen in der Gewichtsgruppe der > 15 kg schweren Hunde gegenüber der Gewichtsgruppe mit den Hunden 15 kg (Abbildung 4.33 und Tabelle 4.9). Abbildung 4.33: Anzahl der Synovialdeckzellen mit Expression von CD163 + pro mm 2 Synovialmembran in den Gewichtsgruppen 15 kg und > 15kg Körpergewicht (Box- Whisker-Plot mit Minimum, Quartil P25, Median, Quartil P75 und Maximum). Tabelle 4.9: Kennwerte des Box-Whisker-Plots für CD163 + Synovialdeckzellen der Synovialmembran nach Gewichtsgruppen Gewichtsgruppe 15 kg Gewichtsgruppe > 15 kg Minimum 0,0 0,0 Quartil P25 0,0290 0,5880 Median 0,4700 2,581 Quartil P75 1,210 4,518 Maximum 11,70 20,99

114 102 4 Ergebnisse Immunhistochemische und statistische Ergebnisse zu S100A8/S100A9 (Calprotectin) Bei der immunhistochemischen Untersuchung mit dem Antikörper MAC387 waren positive Makrophagen im subsynovialen Gewebe sowie eine positive Reaktion intravaskulär gelegener Zellen festzustellen. In entzündlich veränderten Bereichen fanden sich vermehrt S100A8/S100A9 + Makrophagen (Abbildung 4.34 und Abbildung 4.44). Die gesamten Werte finden sich im Anhang (Tabelle 9.2.) Abbildung 4.34: S100A8/S100A9 (Calprotectin) exprimierende Makrophagen in einer hochgradig entzündlich infiltrierten Synovialmembran der Lokalisation 4 des rechten Knies (Fall Nr. 41); ABC-Methode.

115 4 Ergebnisse 103 Die Korrelation nach Spearman ergab einen deutlichen Zusammenhang von S100A8/S100A9 + Makrophagen mit dem Grad der Synovialmembranentzündung (r 0,52976; p <0,0001) und mit dem Alter der Hunde (r 0,5348; p <0,0001) sowie einen mäßigen positiven Zusammenhang S100A8/S100A9 + Makrophagen mit dem Körpergewicht der Hunde (r 0,43564; p <0,0001). Die Ergebnisse aus Kruskal-Wallis-Test und Wilcoxon-Mann-Whitney-Tests stellen sich wie folgt dar. Die Altersgruppen unterschieden sich signifikant in der Expression von S100A8/S100A9 (Calprotectin). Dabei fanden sich bei Hunden in den Altersgruppen 1,7-6 Jahre und > 6 Jahre signifikant mehr S100A8/S100A9 + Makrophagen gegenüber der Altersgruppe < 1,6 Jahre. Die Hunde der Altersgruppe > 6 Jahre wiesen signifikant mehr S100A8/S100A9 + Makrophagen gegenüber den Hunden der Altersgruppe 1,7-6 Jahre auf (Abbildung 4.35 und Tabelle 4.10). Abbildung 4.35: Anzahl der Makrophagen mit Expression von S100A8/S100A9 (Calprotectin) pro mm 2 Synovialmembran in den Altersgruppen 1,6 Jahre, 1,7-6 Jahre und > 6 Jahre (Box-Whisker-Plot mit Minimum, Quartil P25, Median, Quartil P75 und Maximum).

116 104 4 Ergebnisse Tabelle 4.10: Kennwerte des Box-Whisker-Plots für S100A8/S100A9 + Makrophagen der Synovialmembran nach Altersgruppen Altersgruppe 1,6 Jahre Altersgruppe 1,7-6 Jahre Altersgruppe > 6 Jahre Minimum 0,0810 0,0380 0,0230 Quartil P25 0,1488 0,2353 0,5623 Median 0,2485 0,5535 1,071 Quartil P75 0,5953 1,171 1,819 Maximum 4,048 5,605 6,136 Die Gewichtsgruppe der > 15 kg schweren Hunde wies gegenüber der Gewichtsgruppe mit den Hunden 15 kg signifikant mehr S100A8/S100A9 + Makrophagen auf (Abbildung 4.36 und Tabelle 4.11). Abbildung 4.36: Anzahl der Makrophagen mit Expression von S100A8/S100A9 (Calprotectin) pro mm 2 Synovialmembran in den Gewichtsgruppen 15 kg und > 15 kg Körpergewicht (Box-Whisker-Plot mit Minimum, Quartil P25, Median, Quartil P75 und Maximum).

117 4 Ergebnisse 105 Tabelle 4.11: Kennwerte des Box-Whisker-Plots für S100A8/S100A9 + Makrophagen der Synovialmembran nach Gewichtsgruppen Gewichtsgruppe 15 kg Gewichtsgruppe > 15 kg Minimum 0,0380 0,0230 Quartil P25 0,1480 0,4720 Median 0,2350 0,8700 Quartil P75 0,3440 1,314 Maximum 4,048 6,136

118 106 4 Ergebnisse Immunhistochemische und statistische Ergebnisse zu MHC Klasse II Antigen Bei der immunhistochemischen Untersuchung zur Darstellung von MHC (major histocompatibility complex) Klasse II Antigen mit dem monoklonalen Antikörperklon TAL.1B5 zeigten sich deutlich positive Zellen in der Subintima und der Intima synovialis (Deckzellschicht) mit unterschiedlicher Zellmorphologie (Abbildung 4.37). Die positiven Zellen wurden als MHC II + Zellen mit Makrophagenmorphologie, MHC II + Synovialdeckzellen, MHC II + Zellen mit Lymphozytenmorphologie und MHC II + Zellen mit Morphologie Dendritischer Zellen quantitativ erfasst. Die Einzelwerte befinden sich im Anhang in Tabelle 9.2. Abbildung 4.37: MHC II + Zellen mit Lymphozyten- (Pfeilköpfe) und Makrophagenmorphologie (Pfeile) in der Subintima der Synovialmembran des linken Knies (Lokalisation 5) und vereinzelt MHC II + Zellen in der Synovialdeckzellschicht (graue Pfeilköpfe). Bild im Bild: MHC II + Zelle mit dendritischer Zellmorphologie in der Subintima (kurzer Pfeil); Fall Nr. 36; ABC-Methode.

119 4 Ergebnisse 107 Die statistische Auswertung der MHC II + Makrophagen in der Subintima ergab einen mäßigen positiven Zusammenhang ihrer Anzahl mit der Synovialmembranentzündung (r 0,40276; p = 0,0005). Die Korrelation der Anzahl subintimal gelegener MHC II + Makrophagen in der Synovialmembran mit dem Alter und Körpergewicht der Hunde sowie die Korrelation von MHC II + Synovialdeckzellen mit der Synovialmembranentzündung und dem Alter der Hunde ergab kein signifikantes Ergebnis. Der Kruskal-Wallis-Test ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Altersgruppen 1,6 Jahre, 1,7-6 Jahre und > 6 Jahre hinsichtlich der Anzahl von MHC II + Makrophagen (Abbildung 4.38 und Tabelle 4.12). Abbildung 4.38: Anzahl der Makrophagen mit Expression von MHC II pro mm 2 Synovialmembran in den verschiedenen Altersgruppen 1,6 Jahre, 1,7-6 Jahre und > 6 Jahre (Box-Whisker-Plot mit Minimum, Quartil P25, Median, Quartil P75 und Maximum).

120 108 4 Ergebnisse Tabelle 4.12: Kennwerte des Box-Whisker-Plots für MHC II + Synovialmembran nach Altersgruppen Makrophagen der Altersgruppe 1,6 Jahre Altersgruppe 1,7-6 Jahre Altersgruppe > 6 Jahre Minimum 0,6870 0,8710 0,6440 Quartil P25 1,973 1,822 1,819 Median 3,009 2,893 3,582 Quartil P75 4,913 7,618 9,637 Maximum 10,40 34,34 48,50 Der Kruskal-Wallis-Test ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Altersgruppen 1,6 Jahre, 1,7-6 Jahre und > 6 Jahre hinsichtlich der Anzahl von MHC II + Synovialdeckzellen (Abbildung 4.39 und Tabelle 4.13). Abbildung 4.39: Anzahl der Synovialdeckzellen mit Expression von MHC II pro mm 2 Synovialmembran in den verschiedenen Altersgruppen 1,6 Jahre, 1,7-6 Jahre und > 6 Jahre (Box-Whisker-Plot mit Minimum, Quartil P25, Median, Quartil P75 und Maximum).

121 4 Ergebnisse 109 Tabelle 4.13: Kennwerte des Box-Whisker-Plots für MHC II + Synovialdeckzellen der Synovialmembran nach Altersgruppen Altersgruppe 1,6 Jahre Altersgruppe 1,7-6 Jahre Altersgruppe > 6 Jahre Minimum 1,460 0,1470 0,7220 Quartil P25 3,444 2,067 2,555 Median 5,317 3,506 3,855 Quartil P75 8,143 11,90 9,324 Maximum 11,97 23,71 19,25 Der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test ergab ebenfalls keine signifikanten Werte hinsichtlich der Unterschiede von MHC II + Makrophagen (Abbildung 4.40 und Tabelle 4.14) und MHC II + Synovialdeckzellen zwischen den beiden Gewichtsgruppen (Abbildung 4.41 und Tabelle 4.15). Abbildung 4.40: Anzahl der Makrophagen mit Expression von MHC II pro mm 2 Synovialmembran in den beiden Gewichtsgruppen 15 kg und > 15 kg Körpergewicht (Box-Whisker-Plot mit Minimum, Quartil P25, Median, Quartil P75 und Maximum).

122 110 4 Ergebnisse Tabelle 4.14: Kennwerte des Box-Whisker-Plots für MHC II + Synovialmembran nach Gewichtsgruppen Makrophagen der Gewichtsgruppe 15 kg Gewichtsgruppe > 15 kg Minimum 0,6870 0,6440 Quartil P25 1,797 1,952 Median 2,659 3,179 Quartil P75 4,486 8,015 Maximum 13,90 48,50 Abbildung 4.41: Anzahl der Synovialdeckzellen mit Expression von MHC II pro mm 2 Synovialmembran in den beiden Gewichtsgruppen 15 kg und > 15 kg Körpergewicht (Box-Whisker-Plot mit Minimum, Quartil P25, Median, Quartil P75 und Maximum). Tabelle 4.15: Kennwerte des Box-Whisker-Plots für MHC II + Synovialdeckzellen der Synovialmembran nach Gewichtsgruppen Gewichtsgruppe 15 kg Gewichtsgruppe > 15 kg Minimum 1,460 0,1470 Quartil P25 3,293 2,234 Median 3,944 3,982 Quartil P75 7,976 10,37 Maximum 12,72 23,71

123 4 Ergebnisse Statistische Ergebnisse des Vergleichs von CD163 +, S100A8/S100A9 + und MHC II + Makrophagen in Synovialmembranproben mit und ohne histologisch festgestellten entzündlichen Alterationen Bei dem Vergleich der Anzahl CD163 +, S100A8/S100A9 + und MHC II + Makrophagen in den Synovialmembranproben ohne histologisch festgestellte entzündliche Alterationen (Abbildung 4.42) und mit histologisch festgestellten entzündlichen Alterationen (Abbildung 4.43) miteinander ergab sich sowohl für die Synovialmembranproben ohne als auch mit Entzündungszellinfiltration ein signifikanter Unterschied zwischen S100A8/S100A9 + Makrophagen und MHC II + Makrophagen sowie CD163 + Makrophagen (Abbildung 4.42 und 4.43). Die Anzahl der S100A8/S100A9 + Makrophagen war signifikant niedriger als die der MHC II + Makrophagen und der CD163 + Makrophagen. Abbildung 4.42: Anzahl S100A8/S100A9 + Makrophagen, MHC II + Makrophagen und CD163 + Makrophagen in Synovialmembranproben ohne histologisch festgestellte entzündliche Alterationen (Box-Whisker-Plot mit Minimum, Quartil P25, Median, Quartil P75 und Maximum).

124 112 4 Ergebnisse Abbildung 4.43: Anzahl S100A8/S100A9 + Makrophagen, MHC II + Makrophagen und CD163 + Makrophagen in Synovialmembranproben mit histologisch festgestellten entzündlichen Alterationen (Box-Whisker-Plot mit Minimum, Quartil P25, Median, Quartil P75 und Maximum).

125 4 Ergebnisse 113 Bei der Analyse der drei Marker hinsichtlich der Unterschiede zwischen nicht entzündlich infiltrierten Synovialmembranproben (n = 158) und entzündlich infiltrierten Synovialmembranproben (n = 126) zeigte sich eine signifikant höhere Anzahl S100A8/S100A9 + Makrophagen und CD163 + Makrophagen in der entzündlich infiltrierten Synovialmembran. Die Anzahl MHC II + Makrophagen war nicht signifikant erhöht (Abbildung 4.44 und Tabelle 4.16). Siehe hierzu auch Korrelation der CD163 + Makrophagen, S100A8/S100A9 + Makrophagen und MHC II + Makrophagen mit dem Grad der Entzündung (4.3.1, 4.3.2, 4.3.3). Abbildung 4.44: Anzahl S100A8/S100A9 + Makrophagen, MHC II + Makrophagen und CD163 + Makrophagen in histologisch nicht entzündlich infiltrierten Synovialmembranproben (a) gegenüber entzündlich infiltrierten Synovialmembranproben (b) (Box- Whisker-Plot mit Minimum, Quartil P25, Median, Quartil P75 und Maximum); Entz. = Entzündung.

126 114 4 Ergebnisse Tabelle 4.16: Kennwerte des Box-Whisker-Plots für S100A8/S100A9 + Makrophagen, MHC II + Makrophagen und CD163 + Makrophagen der Synovialmembran ohne und mit histologisch festgestellter Infiltration von Entzündungszellen S100A8/S100A9 + Makrophagen MHC II + Makrophagen CD Makrophagen Entzündung Minimum 0,0230 0,1080 0,6870 0,6440 0,0 0,0890 Quartil P25 0,1583 0,5313 1,774 2,514 0,4043 1,359 Median 0,3410 1,101 2,689 5,584 1,939 5,064 Quartil P75 0,8685 1,528 4,168 12,98 5,439 10,85 Maximum 4,048 6,136 13,90 48,50 15,58 32,02 - = Synovialmembran ohne histologisch festgestellte entzündliche Infiltration; + = Synovialmembran mit histologisch festgestellter entzündlicher Infiltration

127 4 Ergebnisse Enzymhistochemische Ergebnisse zum Nachweis Tartrat-resistenter saurer Phosphatase Bei der enzymhistochemischen Untersuchung der Synovialmembranproben waren in keiner der untersuchten Synovialmembranproben Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) + Zellen nachweisbar. Es waren also weder in den Proben ohne histologisch festgestellte entzündliche Veränderungen, noch in Synovialmembranproben mit Entzündung TRAP + Zellen vorhanden (Abbildung 4.45). Abbildung 4.45: Synovialmembranprobe der Lokalisation 5 des rechten Knies (Fall Nr. 68) mit hochgradiger Entzündungszellinfiltration und Hämosiderophagen ohne enzymhistochemisch nachweisbare TRAP + Zellen.

128 116 4 Ergebnisse Immunhistochemische und statistische Ergebnisse zu CD3, CD79a Bei der immunhistochemischen Untersuchung zur Darstellung von T- und B-Lymphozyten waren sowohl CD3 + T-Lymphozyten (Abbildung 4.46) als auch CD79a + B- Lymphozyten (Abbildung 4.47) in der Synovialmembran nachweisbar. Abbildung 4.46: CD3 + T-Lymphozyten in der Subintima einer hochgradig entzündlich infiltrierten Synovialmembran; Fall Nr. 68. Abbildung 4.47: CD79a + B-Lymphozyten in der Subintima einer hochgradig entzündlich infiltrierten Synovialmembran; Fall Nr. 68.

129 4 Ergebnisse 117 Vor allem CD3 + T-Lymphozyten, aber auch CD79a + B-Lymphozyten fanden sich sowohl in Synovialmembranproben ohne als auch in Proben mit histologisch festgestellter Infiltration von Entzündungszellen (Tabelle 4.17). Tabelle 4.17: Kennwerte für CD3 + Lymphozyten und CD79a + Lymphozyten der Synovialmembran ohne und mit histologisch festgestellter Infiltration von Entzündungszellen CD3 + CD79a + Entzündung Minimum 0,0 0,0 0,0 0,0 Quartil P25 0,023 0,1305 0,0 0,0060 Median 0,0735 0,7105 0,0 0,0360 Quartil P75 0,1898 2,741 0,0 1,072 Maximum 0,89 53,21 0,107 12,93 - = Synovialmembran ohne histologisch festgestellte entzündliche Infiltration; + = Synovialmembran mit histologisch festgestellter entzündlicher Infiltration Bei der Korrelationsanalyse nach Spearman zeigte sich ein deutlicher positiver Zusammenhang zwischen der Anzahl der CD3 + T-Lymphozyten mit dem Grad der Synovialmembranentzündung und dem Alter der Hunde sowie ein schwacher positiver Zusammenhang der Anzahl der CD3 + T-Lymphozyten mit dem Körpergewicht der Hunde. Die Korrelationsanalyse der Anzahl CD3 + Lymphozyten mit dem Grad der Synovialmembranentzündung ergab eine deutliche positive Korrelation (r 0,60639; p<0,0001). Es zeigte sich ebenfalls eine deutliche positive Korrelation der Anzahl CD3 + Lymphozyten mit dem Alter der Hunde (r 0,57795; p<0,0001), die positive Korrelation mit dem Körpergewicht der Hunde war hingegen nur mäßig (r 0,34212; p = 0,0033). Für die Anzahl CD79a + B-Lymphozyten ergab sich eine deutliche positive Korrelation mit dem Grad der Synovialmembranentzündung. Der Korrelationskoeffizient lag bei r 0,71077 (p<0,0001). Es zeigte sich eine mäßige positive Korrelation der Anzahl CD79a + B-Lymphozyten mit dem Alter der Hunde (r 0,48920 (p<0,0001) und eine

130 118 4 Ergebnisse schwache positive Korrelation der Anzahl CD79a + Körpergewicht der Hunde (r 0,27392; p 0,0199). B-Lymphozyten mit dem

131 5 Diskussion Diskussion Bei 50 bis 67% der Hunde mit spontaner, kranialer Kreuzbandruptur ist zum Zeitpunkt der operativen Behandlung eine lymphoplasmazelluläre Synovitis vorhanden (ERNE et al., 2009; GALLOWAY und LESTER, 1995). Obwohl die Ruptur des kranialen Kreuzbands bei den meisten Hunden mit einer Entzündung der Synovialmembran assoziiert ist, ist bislang unklar, ob die Synovitis die Ursache oder Folge der degenerativen Kreuzbandalterationen darstellt. Derzeit existieren im einschlägigen veterinärmedizinischen Schrifttum zur Rolle der Synovitis bei der Entstehung der kranialen Kreuzbandruptur zwei Hypothesen. Zum einen wird postuliert, dass eine Entzündung der Synovialmembran im Kniegelenk das primäre Geschehen darstellt und zur fortschreitenden Degeneration des Kreuzbands mit Kollagenfaserzerreißungen und letztendlich zur Kreuzbandruptur führt (DOOM et al., 2008; MUIR et al., 2002, 2005a, b). Zum anderen wird angenommen, dass Faktoren wie Alter, Geschlecht, Rasse, Körpergewicht (BENNETTT et al., 1988; HARASEN, 2003, 2008; VASSEUR et al., 1985; WHITEHAIR et al., 1993) und besondere anatomische Gegebenheiten (COMERFORD et al., 2006b; INAUEN et al., 2009; LEWIS et al., 2008; SMITH 2011, 2012, 2014) zur Degeneration und zu minimalen Zerreißungen von Kollagenfasern führen, wodurch es zur Freisetzung von Kollagenfragmenten oder anderen Matrixbetandteilen aus dem Kreuzband und sekundär zur Entzündung der Synovialmembran kommt. Bislang gibt es in der Literatur nur Ergebnisse über Untersuchungen, in denen die Synovialmembran beziehungsweise Synovitis der bereits an einer Kreuzbandruptur erkrankten Hunde, das heißt im Endstadium der Erkrankung untersucht wurde. Abgesehen von wenigen in der Literatur von VASSEUR et al. (1985) und BLEEDORN et al. (2011) beschriebenen Befunden sind konkrete Informationen über Art, Verteilung und Ausmaß der in der Synovialmembran der Kniegelenke von Hunden mit nicht rupturierten beziehungsweise degenerierten Kreuzbändern vorkommenden entzündlichen Veränderungen nicht verfügbar. In dieser Arbeit wurde daher erstmals eine grundlegende, systematische, histologische Analyse nicht rupturierter kranialer (und auch kaudaler) Kreuzbänder einer größeren Anzahl von

132 120 5 Diskussion Hunden zwecks Korrelation degenerativer Kreuzbandveränderungen mit entzündlichen Veränderungen der Synovialmembran durchgeführt. 5.1 Histologische Alterationen Bei der histologischen Untersuchungen der kranialen und kaudalen Kreuzbänder mittels eines in Anlehnung an VASSEUR et al. (1985) und BARRETT et al. (2005) modifizierten Gradingsystems wurden bei insgesamt mehr als der Hälfte der nicht rupturierten kranialen (52,08%) und kaudalen (56,38%) Kreuzbänder degenerative Veränderungen unterschiedlichen Schweregrades gefunden. Die degenerativen Läsionen waren durch Verlust der Kollagenfaserstruktur, frühe chondroide Metaplasie der Fibrozyten bis hin zu deutlicher Chondronenbildung und durch Vorhandensein größerer, azellulärer Bereiche gekennzeichnet. Der histomorphologische Charakter der degenerativen Kreuzbandalterationen ähnelt weitgehend den von anderen Autoren (VASSEUR et al., 1985; ZAHM, 1964) an den Kreuzbändern von Hunden ohne Ruptur beschriebenen Veränderungen. Die histologische Beurteilung der insgesamt 144 in dieser Arbeit untersuchten kranialen Kreuzbänder zeigte, dass in den 75 veränderten kranialen Kreuzbändern, mehrheitlich (76%) geringgradige degenerative Alterationen vorlagen, während mittelgradige (17,33%) oder hochgradige (6,67%) degenerative Veränderungen seltener vorkamen. Bei 5 Hunden im Alter bis zu 2 Jahren wurden Knorpelzellen am Bandansatz kranialer und kaudaler Kreuzbänder sowie eine deutlichere Vaskularität der Kreuzbänder beobachtet. Diese Befunde sind laut ZAHM (1964) beim jungen Hund als Normalbefunde zu interpretieren. Weiterhin wiesen 3 Hunde im kranialen beziehungsweise kaudalen Kreuzband fokale, zystenartige, teils multilokuläre Hohlräume auf. Gleichartige Befunde wurden von VASSEUR et al. (1985) in degenerativ veränderten Kreuzbändern von 4 Hunden beschrieben. Die genannten Autoren gehen davon aus, dass diese zystenartigen Hohlräume in der entzündlich veränderten Subsynovialis des Epiligaments entstehen. Da in der vorliegenden

133 5 Diskussion 121 Arbeit 2 der Hunde zwar degenerative Veränderungen der betroffenen Kreuzbänder zeigten, aber nur einer dieser Hunde im betreffenden Kniegelenk eine geringgradige Entzündung der Synovialmembran aufwies, ist die Vermutung von VASSEUR et al. (1985), dass entzündliche Veränderungen der Synovialmembran die Ursache für diese Hohlraumbildungen sind, eher als unwahrscheinlich anzusehen. Möglicherweise handelt es sich bei den zystenartigen Hohlräumen um kongenitale Läsionen, die bei der Entstehung der Kreuzbanddegeneration oder der entzündlichen Alterationen der Synovialmembran vermutlich keine Rolle spielen. Von insgesamt 705 in dieser Arbeit untersuchten, von 72 Hunden stammenden Synovialmembranproben wiesen 231 (32,77%) entzündliche Alterationen auf, wobei es sich in der Mehrzahl der Fälle (71%) um geringgradige entzündliche Veränderungen handelte. Die an diesen Hunden vorgenommene Analyse des Grades der histologischen Alterationen der Kreuzbänder und des Grades entzündlicher Synovialmembranveränderungen zeigte, dass bei 25 von 72 (34,72%) untersuchten Hunden sowohl eine Synovitis als auch degenerative Veränderungen eines oder beider kranialen Kreuzbänder vorhanden waren. Auf der Basis dieser Studie bleibt zwar unklar, ob bei den betroffenen Hunden jemals eine Ruptur oder Teilruptur der kranialen Kreuzbänder aufgetreten wäre. Anhand der Ergebnisse kann jedoch vermutet werden, dass bei Hunden mit nicht rupturierten, aber degenerierten Kreuzbändern, jedenfalls zumindest in einem Teil der Fälle, diese mit entzündlichen Veränderungen der Synovialmembran assoziiert sind. Diese Befunde bestätigen somit auch bereits von anderen Autoren geäußerte Vermutungen (VASSEUR et al., 1985; BLEEDORN et al., 2011). Die durchgeführte statistische Korrelationsanalyse nach Spearman ergab für die Synovialmembran- und Kreuzbandproben der 72 untersuchten Hunde eine positive Korrelation zwischen dem Grad der Entzündung der Synovialmembran und dem Grad der Degeneration der kranialen beziehungsweise kaudalen Kreuzbänder. Diese Ergebnisse unterstützen die Ansicht mehrerer Autoren (BLEEDORN et al., 2011; DOOM et al., 2008; MUIR et al., 2002, 2005a, b), dass entzündliche Veränderungen in der Synovialmembran von Kniegelenken des Hundes eine wichtige Rolle bei der

134 122 5 Diskussion Entstehung und Progression degenerativer Läsionen insbesondere der kranialen Kreuzbänder zukommt. Die in dieser Arbeit durchgeführten Regressionsanalysen ergaben einen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen dem Grad der Synovitis und dem Grad der Degeneration des kranialen Kreuzbands mit dem Alter und dem Körpergewicht der untersuchten Hunde. Dabei war der Einfluss insbesondere des Alters und in geringerem Maße des Körpergewichts auf die Kreuzbanddegeneration höher als deren Einfluss auf die Synovialmembranentzündung. Aufgrund dieser Ergebnisse stellt zunehmendes Alter bei Hunden demnach einen wesentlichen Faktor hinsichtlich des Auftretens degenerativer Kreuzbandveränderungen dar. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit denen von VASSEUR et al. (1985), die beschrieben, dass Hunde über 15 kg bereits ab dem Alter von 5 Jahren degenerative Veränderungen des kranialen und kaudalen Kreuzbands aufwiesen, während Hunde unter 15 kg Körpergewicht nur geringgradige Veränderungen zeigten. Auch WHITEHAIR et al. (1993) berichten über eine Zunahme der kranialen Kreuzbandrupturen mit dem Alter. Diese Ergebnisse unterstützen insbesondere die Vermutungen verschiedener Autoren (DE BRUIN et al., 2007a; KUROKI et al., 2010; NIEBAUER et al., 1987), dass es mit zunehmendem Alter und durch höheres Körpergewicht der Hunde möglicherweise zu einer Schädigung von Kollagenfasern der Kreuzbänder mit Freisetzung von Kollagenfragmenten oder Hyaluronsäurebestandteilen und in der Folge zu entzündlichen Läsionen der Synovialmembran kommt. Die sich vermutlich sekundär entwickelnde Synovitis ist durch Freisetzung von kollagenolytischen Enzymen, wie z.b. TRAP, Kathepsine und MMPs durch aktivierte Entzündungszellen am Voranschreiten der degenerativen Alterationen der Kreuzbänder beteiligt (BARRETT et al., 2005; LITTLE et al., 2014; MUIR et al., 2002; MUIR et al., 2005a; MUIR et al., 2005b) (Abbildung 5.1).

135 5 Diskussion 123 Abbildung 5.1: Pathogenese der Kreuzbanddegeneration und Synovialmembranentzündung. Die Abbildung zeigt einen Circulus vitiosus, bei dem es initial zur Freisetzung von Bestandteilen der extrazellulären Matrix (EZM) des Kreuzbands im Rahmen der Kreuzbanddegeneration kommt, was zu einer Aktivierung des angeborenen und erworbenen Immunsystems und damit zu einer Reihe entzündlicher Veränderungen führt, die ein Voranschreiten der Kreuzbanddegeneration fördern. Beim Vergleich der in Rassegruppen unterteilten Hunde zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen disponierten und nicht disponierten Rassen gegenüber der Gruppe der Beagle, wobei die Hunde disponierter und nicht disponierter Rassen gegenüber den Hunden aus der Gruppe der Beagle einen signifikant höheren Grad der Synovialmembranentzündung aufwiesen. Da die Beagle ausnahmslos ein geringes Alter hatten, ist dieser Befund vermutlich eher auf den oben genannten Einfluss des Alters der Tiere als auf die Rassenzugehörigkeit zurückzuführen.

136 124 5 Diskussion Wie bereits erläutert wird die Rolle der Synovitis im Rahmen der Entstehung degenerativer Veränderungen der kranialen Kreuzbänder des Hundes in der Literatur kontrovers diskutiert. Demnach besagt eine Hypothese, dass die Synovitis das primäre Ereignis darstellt, während bei der anderen Hypothese davon ausgegangen wird, dass es primär zu degenerativen Veränderungen im Kreuzband kommt, woraufhin sich sekundär eine Entzündung der Synovialmembran einstellt (BLEEDORN et al., 2011; DOOM et al., 2008; ERNE et al., 2009). Da nur bei 5 (6,94%) von insgesamt 72 untersuchten Hunde eine geringgradige Synovitis bei histologisch unveränderten kranialen Kreuzbändern vorhanden war, ist es auf der Basis dieser Befunde eher unwahrscheinlich, dass eine Synovitis der Kniegelenke das primäre Geschehen hinsichtlich der Entstehung degenerativer Alterationen der Kreuzbänder darstellt. Die in dieser Arbeit durchgeführte Auswertung der histologischen Befunde ergab zudem, dass bei 15 (20,83%) Hunden eine Degeneration des kranialen Kreuzbands bei fehlender Synovitis vorlag. Diese Resultate unterstützen demnach die von mehreren Autoren (DE BRUIN et al., 2007a; ERNE et al., 2009; KUROKI et al., 2010; NIEBAUER et al., 1987) formulierte Hypothese, dass bei der Entstehung degenerativer Veränderungen des kranialen Kreuzbands die Synovitis ein sekundäres Geschehen darstellt. Die bei 30 (41,67%) der insgesamt 72 untersuchten Hunde vorhandene Synovitis stellte sich histologisch als graduell variierende, chronische, lymphoplasmazelluläre Synovitis unter Beteiligung von Makrophagen dar. Diese Entzündungsreaktion ähnelte hinsichtlich ihrer zellulären Zusammensetzung und ihrer Verteilung im Synovialmembrangewebe derjenigen, wie sie für Hunde mit manifester kranialer Kreuzbandruptur beschriebenen wurde (GALLOWAY und LESTER, 1995; ERNE et al., 2009; HEWICKER-TRAUTWEIN et al., 1999; KLOCKE et al., 2005; LEMBURG et al., 2004; MUIR et al., 2005a, 2011a). In der vorliegenden Arbeit wurden 5 verschiedene Synovialmembranlokalisationen hinsichtlich des Vorhandenseins entzündlicher Veränderungen histologisch untersucht. Dabei wurde in 2 Lokalisationen, und zwar in den aus dem kranialen

137 5 Diskussion 125 Bereich (Lokalisation 4) und in den aus dem kaudalen Bereich (Lokalisation 5) der medialen Bucht der Articulatio femorotibialis stammenden Proben ein statistisch signifikant höherer Grad der Entzündung festgestellt. Insbesondere die aus dem kranialen Bereich der medialen Bucht der Articulatio femorotibialis entnommenen Proben (Lokalisation 4) wiesen einen statistisch signifikant höheren Grad der Entzündung gegenüber allen anderen Lokalisationen auf. Bei den in der Literatur angegebenen Entnahmestellen der Synovialmembranproben bei manifester Ruptur des kranialen Kreuzbands wurden die mediale Bucht der Gelenkkapsel des Kniegelenks (ERNE et al., 2009; GALLOWAY und LESTER, 1995) und die laterale Bucht der Gelenkkapsel des Kniegelenks (GALLOWAY und LESTER, 1995; LEMBURG et al., 2004; SUSTA et al., 2012) zur Probengewinnung angegeben. Häufig wurden jedoch keine genaueren Angaben hinsichtlich der Probenentnahmestelle gemacht. Der in dieser Arbeit festgestellte höhere Grad der Entzündung in den aus der medialen Bucht des Kniegelenks stammenden Synovialmembranproben entspricht den von GALLOWAY und LESTER (1995) bei Hunden mit manifester Kreuzbandruptur beschriebenen Befunden. Dieses Ergebnis ist insofern von Bedeutung, wenn es um die histologische Beurteilung entzündlicher Veränderungen an aus diagnostischen Gründen oder für wissenschaftliche Untersuchungen entnommenen Synovialmembranbioptaten geht und sollte bei der Auswahl der Entnahmestelle beachtet werden. 5.2 Immunhistochemische und enzymhistochemische Ergebnisse In mehreren Veröffentlichungen wurden die bei Hunden mit kranialer Kreuzbandruptur in der Synovialmembran vorhandenen Entzündungszellen charakterisiert und phänotypisiert (GALLOWAY und LESTER, 1995; ERNE et al., 2009; HEWICKER- TRAUTWEIN et al., 1999; KLOCKE et al., 2005; LEMBURG et al., 2004; LITTLE et al., 2014; MUIR et al., 2005a, 2011a). Dabei wurden mehrheitlich CD4 + T- Lymphozyten, B-Lymphozyten, Plasmazellen, MHC II + Dendritische Zellen sowie CD11b + /CD18 + und TRAP + Makrophagen beschrieben. Hinsichtlich der an der Synovitis beteiligten Makrophagen gibt es bisher nur Veröffentlichungen, in denen

138 126 5 Diskussion das Vorkommen CD11b + /CD18 + (KLOCKE et al., 2005), MHC II + Makrophagen (LEMBURG et al., 2004) oder TRAP + Makrophagen (MUIR et al., 2002, 2005a) beschrieben wurde. Das Ziel der immun- und enzymhistochemischen Untersuchungen dieser Arbeit war es, bei Hunden mit nicht rupturierten Kreuzbändern die in der Synovialmembran vorhandenen Entzündungszellen unter besonderer Berücksichtigung von Makrophagen zu phänotypisieren und zu quantifizieren und die Ergebnisse insbesondere mit dem Grad der Synovitis sowie auch mit dem Alter und dem Körpergewicht der untersuchten Hunde zu korrelieren. Bei der Auswertung der immunhistochemischen Untersuchungsbefunde wurde beobachtet, dass auch in der Synovialis von Hunden ohne histologisch feststellbare Synovitis nicht nur CD3 + und CD79a + Lymphozyten vorhanden waren, sondern dass auch CD163 +, MHC II + und vereinzelt S100A8/S100A9 + (MAC387 + ) Makrophagen vorkamen. Über das Vorkommen von MHC II + Zellen in der Synovialdeckzellschicht sowie T- und B-Lymphozyten in der Subintima histologisch unveränderter Synovialmembranproben aus den Kniegelenken von Hunden, die als Kontrollgewebe dienten, gibt es in der Literatur nur einzelne Beschreibungen (HEWICKER-TRAUTWEIN et al., 1999; LEMBURG et al., 2004). Darüber hinausgehend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erstmals, dass beim Hund in der Synovialdeckzellschicht der histologisch nicht entzündeten Synovialmembran nicht nur MHC II + Zellen in der Synovialdeckzellschicht, sondern auch CD163 exprimierende Zellen vorhanden sind und dass Letztere zudem auch in der Subintima der histologisch unveränderten Synovialmembran anzutreffen sind. Da CD163 eine regulatorische, antiinflammatorische Rolle zugesprochen wird (ETZERODT und MOESTRUP, 2013), handelt es sich bei diesen CD163 + Makrophagen vermutlich um reife, residente Gewebemakrophagen mit antiinflammatorischem Potential. Im Gegensatz zu CD163 + Makrophagen waren S100A8/S100A9 + Makrophagen in der Subintima der histologisch nicht entzündlich veränderten Synovialmembran nur vereinzelt zu finden. S100A8/S100A9, auch bekannt als Calprotectin oder L1 Antigen, stellt bei Menschen

139 5 Diskussion 127 einen Marker für aus dem Blut stammende, unreife, proinflammatorische Makrophagen (M1) dar (STRÍZ und TREBICHAVSKÝ, 2004). Das könnte, sofern man diese aus der Literatur stammenden Angaben auf den Hund übertragen kann, erklären, warum S100A8/S100A9 + Makrophagen in der unveränderten Synovialmembran nur vereinzelt nachweisbar waren. Die statistische Auswertung der quantifizierten Makrophagen in den untersuchten Synovialmembranproben zeigte, dass in den histologisch entzündlich veränderten Proben die Anzahl der subintimal gelegenen CD163 + und S100A8/S100A9 + Makrophagen gegenüber den histologisch nicht entzündlich veränderten Proben signifikant höher war. Die Auswertung der Ergebnisse zeigte zudem eine schwache positive Korrelation der Anzahl CD163 + Makrophagen und eine deutliche positive Korrelation der Anzahl S100A8/S100A9 + Makrophagen sowie einen mäßig positiven Zusammenhang der Anzahl MHC II + Makrophagen mit dem Grad der Synovialmembranentzündung. Die in dieser Arbeit in histologisch entzündlich infiltrierten Synovialmembranproben von 30 der insgesamt 72 untersuchten Hunde nachgewiesene, signifikant höhere Anzahl von CD163 + und S100A8/S100A9 + Makrophagen lässt die Vermutung zu, dass diesen Makrophagen-Subtypen, zumindest bei den 25 Hunden, die histologisch gleichzeitig eine Synovitis und degenerative Kreuzbandveränderungen aufwiesen, eine Rolle bei der Entstehung und/oder Unterhaltung der Synovitis im Rahmen der Pathogenese der Kreuzbanddegeneration zukommt. Möglicherweise kommt es durch die Freisetzung von Kollagen- oder Hyaluronsäurefragmenten (VENABLE et al., 2008) (DAMPs, damage-associated molecular patterns) aus der extrazellulären Matrix (EZM) der Kreuzbänder oder anderer Gelenksstrukturen oder auch durch das von aktivierten Makrophagen freigesetzte Alarmin S100A8/S100A9 (Calprotectin) zur Aktivierung des angeborenen Immunsystems (KUROKI et al., 2010). Über die Bindung an Toll-like-Rezeptoren (Toll-like receptors, TLRs) auf antigenpräsentierenden Zellen, wie MHC II + Makrophagen könnte es dann zur Aktivierung eines intrazellulären TLR-Signaltransduktionswegs

140 128 5 Diskussion und damit zur vermehrten Produktion und Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen (Abbildung 5.2) und in Folge dessen zu einer entzündlichen Reaktion in der Synovialmembran kommen (KUROKI et al., 2010; VOGL et al., 2014). Zudem könnte eine intrazelluläre Bindung und nachfolgende Präsentation des Pathogens durch MHC Klasse II eine Aktivierung des erworbenen Immunsystems in Gang setzen (Abbildung 5.2). Abbildung 5.2: Schematische Darstellung eines Makrophagen; Aktivierung des angeborenen und erworbenen Immunsystems über den TLR-Signaltransduktionsweg und MHC Klasse II vermittelte Antigenpräsentation, ausgelöst durch Bestandteile eines degenerierten Kreuzbands in Anlehnung an DOOM et al. (2008) und KUROKI et al. (2010); DAMPs = damage-associated molecular patterns; MHC = major histocompatibility complex; TLR-4 = Toll-like Rezeptor 4. KUROKI et al. (2010) wiesen mittels Immunfluoreszenz eine erhöhte Expression von Toll-like Rezeptor 4 (TLR-4) in der Synovialmembran der Kniegelenke von Hunden mit Kreuzbandruptur und sekundärer Arthrose nach. TLR-4 dient der Erkennung