Möglichkeiten moderner mikrobiologischer Diagnostik Univ. Prof. Dr. Andrea Grisold, MBA Institut für Hygiene, Mikrobiologie und Umweltmedizin
Mikrobiologie Bakteriologie Virologie Parasitologie Bakteriologie Mykologie Klass. Virologie Serologie Molekulare Erregerdiagnostik Ektoparasiten Endoparasiten Mikrobiom 2
Mikrobiologie Diagnostik Neu Automatisation MaldiTOF Multiplex PCRs Whole genome sequencing NGS (Next Generation Sequencing) CIDTs (Culture independent diagnostic kits) Klassisch Kultureller Nachweis PFGE MLST Diversilab Erreger MRSA x 3 3 MRGN/ 4 MRGN MDR Variants ESBL VRE PRP Themen MDR und Patient MDR und Umwelt Mikrobiom 3
4 http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/bacteriaantibiotics-needed/en/
5 http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/bacteriaantibiotics-needed/en/
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7 http://edition.cnn.com/2016/01/19/travel/internationaltourists-2015/
Distribution of areas by type of Zika virus transmission, worldwide, as of 27 March 2017 8
2016 UK IT FR BG RO DE other s 2015 2012 2013 2014 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Number of cases Measles cases by month of reporting in selected EU/EEA Member States, Jan 1998- Oct 2016 6000 5000 UK IT FR BG RO DE others Bulgaria : > 24,300 Cases 24 Deaths 4000 3000 2000 1000 France: >20,000 Cases 10 Deaths 0 Italy: > 30,000 Cases 3 Deaths Source: ECDC, TESSy Wales: > 1,200 Cases 1 Death Netherlands: Bible belt >2,700 Cases 1 Death Germany: >2,300 Cases 1 Death Romania: >2,300 Cases 15 Deaths
Measles: Occurence of different genotypes 10
Anzucht und Identifizierung von Mikroorganismen bisher Einfache Testsysteme Gramfärbung Oxidase Reaktion Katalase Reaktion Coagulase Reaktion Gramfärbung Einsatz von verschiedenen Medien (Chromagar) Vermehrung für weitere Reaktionen NH-Api Diverse biochemische Tests wie API oder Vitek II Je nach Keimgruppe Auswahl der richtigen Methode Kombination aus verschiedenen phänotypischen Methoden sowie Erfahrungswerten Vitek II
Anzucht und Identifizierung von Mikroorganismen bisher Nachteile der herkömmlichen v.a. biochemische Methoden Teilweise viel Koloniematerial für weitere Testungen notwendig Je nach Test dauern Identifizierungen ca. 6-48 h Manche Mikroorganismen lassen sich sehr schwer nach Morphologie und Stoffwechselleistungen einteilen
Automatisation in der klin. Mikrobiologie- warum so spät? 13
Anforderungen Vereinheitlichung der Probenmaterialien bzw. Einsendung mit Universal Flüssigkeitsmedien (z.b. Eswab) 14
Identifizierung von Mikroorganismen 15
Neue Methode zur Identifizierung von Mikroorganismen Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation- Time Of Flight MassenSpektromety (MALDI-TOF MS) Kommt aus dem Bereich der Proteomik Das Massenspektrum einer Molekülverbindung kommt durch Ionisation der (neutralen) Moleküle und nachfolgender Bestimmung der Molekülmasse der beim Ionisationsprozeß gebildeten primären Ionen und deren Zerfallsprodukten im Hochvakuum zustande. Dr. Markus Wunderlin
Arbeitsablauf 1. Probe auftragen 2. Matrix dazugeben 3. Massenspektrum aufnehmen 4. Datenbankvergleich
Positive Aspekte durch MALDI-TOF Genaue, schnelle Identifizierung von vielen Mikroorganismen Staphylokokken auf Spezies-Ebene Schnellere Teilbefunde möglich Haemophilus influenzae Moraxella catarrhalis Schnellere Endbefund-Ergebnisse durch schnellere Anaerobier Diagnostik Bacteriodes spp., Prevotella spp., Propionibacterium spp., am Tag der Erst-Befundung der Anaerobier Schneller relevante Befunde möglich Campylobacter fetus im Kniegelenkspunktat Corynebacterium diphtheriae im Rachenabstrich Verbesserte Diagnostikansätze Actinobaculum schaalii im Harn bei chron. rez. HWI
MALDI-TOF: Weiterentwicklungen (?) Identifikation der Keime direkt aus Urin Identifikation direkt ab gewachsener Blutkultur Stammtypisierung Bestimmung bestimmter Resistenzgene: PB2a für MRSA Carbapenemasen bei MRGN Bestimmung bestimmter Virulenzfaktoren (z.b. Toxine)
Limitation Keimzahl Limitation polymikrobiell Limitation Gender (?) 20
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Keywords: MRSA, Phage amplification, Antibiotic resistance, MALDI + 5 Stunden 22 Aures Bericht 2015
PCR`s 23
PCR`s- automatisiert 24
PCR`s- automatisiert 658 Tests 97.6% übereinstimmende Ergebnisse 16 Fälle, die überprüft werden mussten 25
PCR`s- automatisiert 26
PCR`s- automatisiert 27
PCR`s- automatisiert 28
C. difficile Toxin-EIAs Enzym Immunoassays in unterschiedlichen Formaten Assay muss Toxin B detektieren, da auch Toxin A neg./toxin B pos. Stämme pathogen sind GDH-EIAs Glutamat-Dehydrogenase Alle CD auch nicht toxigene und auch C. sporogenes etc. reagieren hier Weist nur Erreger - nicht Toxin nach PCR Weisen die Gene für das Toxin oder deren Regulation nach (tcdb, tcda, tcdc) In der Diagnostik sollte ein 2 Stufen Verfahren angewendet werden Erster Test sollte einen hohen Negativen Vorhersagewert haben EIA auf GDH, EIA Toxine A&B, PCR tcdb Zweiter Test sollte die Positivität bestätigen
FilmArray Gastrointestinal (GI) Panel for the simultaneous detection of 22 different enteric pathogens directly from stool specimens. Panel`s
Panel`s Respiratory panel: 20 targets GI- panel: 22 targets MP- panel: 14 targets
33 Bacteria isolated in culture but not included in the panel were C. diverus, Klebsiella pneumoniae und P. stuartii, as well as S. epidermidis, S. haemolyticus and S. warneri.
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Whole genome sequencing (WGS) 36
Whole genome sequencing (WGS) 37
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41 KEY WORDS: viral microbiome next-generation sequencing viral dark matter bacteriophages
Mikrobiomanalysen- auch aus Mischkulturen möglich Keine Spezies, aber Gattung bzw. Phylum- Hinweis auf die Vielfalt 42
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Recently the paradigm that the healthy lung is sterile was challenged and it is now believed that the lungs harbor a diverse microbiota also contributing to the pathogenesis of various diseases..we need to proceed with elucidation of the role of mycobiota in healthy LRT and LRT diseases to hopefully improve patient care. 46
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CIDT`s: Culture independent diagnostic testing 49
CIDT`s: Culture independent diagnostic testing 50
CIDT`s: Culture independent diagnostic testing 51
SF: 125+ (26.6%) und 98/120 potential pathogens BC: 71+ (15.1%) und 63/120 potential pathogens False negative rate of SF: 3.7% 52
Zusammenfassung Diagnostik Neu Automatisation MaldiTOF Multiplex PCRs Whole genome sequencing NGS (Next Generation Sequencing) CIDTs (Culture independent diagnostic kits) Klassisch Kultureller Nachweis PFGE MLST Ergebnisse Schneller, umfangreicher,??? Interpretation..further studies have to be conducted Herzlichen Dank für ihre Aufmerksamkeit! 53