Medizinische Fakultät Auswertestrategien von Microarrays Einführung PD Dr. Knut Krohn IZKF Leipzig Dr. Markus Eszlinger Med. Klinik III Forschungslabor
DNA RNA Hintergrund Charakteristisches Muster der Genexpression Gendefekte Veränderte Genexpression Protein Charakteristisches Proteinmuster Verändertes Proteinmuster Ordnung Information Normale Physiologie Pathophysiologie
Der Genotyp, die Gesamtheit der Gene eines Organismus stellt den Bauplan dar. Der Phänotyp ist das fertige Gebäude. Die mrna Expression liefert kleine Teilpläne für einzelne Bauelemente. Veränderungen in diesen Teilplänen sind häufig Ursachen für Baufehler am Gebäude
RNA Extraktion Gewebe/Zellen gesamt RNA (mrna, trna, rrna) 2 Stufen-Reinigung - Phenol/Chloroform Säulenreinigung 28 S rrna 18 S rrna +
Gewebe Aufschließen/Homogenisieren Tiefgefrorenes Gewebe mörsern
Gewebe Aufschließen/Homogenisieren Gemörsertes Gewebe homogenisieren
RNA Extraktion (klassisch) Prinzip: Verteilungsgleichgewicht in Phasen Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln und Wasser Gewebepulver Zugabe von Phenol Phasentrennung nach Zugabe von Chloroform/Zentrifugation
RNA Extraktion (klassisch) RNA wird nach Entnahme der wässrigen Phase mit Ethanol gefällt und zentrifugiert
RNA Extraktion (alternativ) Prinzip: RNA-adsorbierende Silica- oder Glaßmaterialien Verwendung von Säulen zur besseren Handhabung
Nach der RNA Aufreinigung RNA liegt in wässriger Lösung vor. Agarose- Gelelektrophorese - Bemerkungen zu den Methoden: Nach klassischer Methode gute bis sehr gute RNA Qualität ohne DNA Kontamination aber mit Phenolspuren; 28 S rrna 18 S rrna Nach alternativer Methode sehr gute RNA Qualität meist mit DNA Kontamination aber ohne Phenolspuren und Salze; +
Abschätzung der RNA Qualität und Quantität Wie sauber ist die RNA (Proteine, DNA, Salze...) Wie intakt ist die RNA (Degradation/Abbau der RNA) Wieviel RNA-Ausbeute habe ich? Messung des UV-Spektrum, Gelelektrophorese und optischer Nachweis mittels Fluoreszensfarbstoff oder durch UV Absorbtion bei 260 nm,
UV-Spektrum RNA/DNA Protein
Agarose Gelelektrophorese
Agarose Gelelektrophorese
Agarose Gelelektrophorese Agarose: Polysaccharid aus Rotalgen, wird in Puffer geschmolzen und erstarrt zu einer Matrix, deren Porengröße von der Agarose Konzentration abhängt - +
Agarose Gelelektrophorese Agarose- Gelelektrophorese Elektrophoretisch getrennte Produkte werden durch den interkallierenden Farbstoff Ethidiumbromid im UV-Licht angefärbt. Ein Größenvergleich erfolgt durch eine DNA- oder RNA-Leiter. mgl. DNA Verunreinigungen 28 S rrna 18 S rrna Bezeichnung Größe Funktion trna transfer RNA 80-90 Nukleotide (nt) Aminosäuretransport zum Ribosom rrna ribosomale RNA 4 Arten, 120, 150 1700 (18S) und 3500 Struktureinheiten der Ribosomen nt (28S) mrna messenger RNA wenige 100 bis über 10000 nt Abschriften der Gene als Vorlage der Proteinsynthese
RNA Analyse mit einem Chip
Probentrennung im Agilent Bioanalyser
Synthese der crna Sonden RNA DNA crna Markierung Amplifikation Herstellung von Einzelsträngen Bindung RNA/DNA stärker als DNA/DNA
Zellen/Gewebe RNA oligo dt T7, dntps ss cdna Reverse Transkriptase Herstellung der Microarray Sonden dntps DNA Polymerase ss crna T7 RNA Polymerase Fragmentierung NTPs biotin NTPs ds cdna Hybridisierung Waschen Färben Messen
Doppelstrang G A G AC T G T T G C G GAT GG T A C T C T G A C A ACG C C T A C C A T Wärme Schmelzen der DNA Hybridisierung Einzelstränge G A G AC T G T T G C G GAT GG T A C T C T G A C A ACG C C T A C C A T Abkühlen
A 40 C B 80 C B A B A A schmelzen Wärme A A A B A B B B B A B B 50 C B waschen A B Abkühlen hybridisieren B B 40 C B A Wärme A B A A A A
Pufferlösung Markierung mit Biotin spezifische Hyb. hybridisieren 45 C 16h hohe Salzkonzentration unspezifische Hyb. Microarray Microarray waschen 50 C 3x5min niedrige Salzkonzentration Microarray
Hybridisierung Die Hybridisierung eines Doppelstrangs aus zwei komplementären Einzelsträngen ist ein reversibler Prozess. Dieser ist abhängig von folgenden Parametern: - prozentualer Gehalt der Basen Guanin und Cytosin (%GC), - die Länge des DNA-Doppelstranges (n), - die Konzentration monovalenter Kationen (z. B. [Na+]) - Lösungsmittel (z.b. Formamid - destabilisiert des Doppelstrang) Empirische Berechnung der Hybridisierungstemperatur (nach Meinkoth und Wahl 1984): Tm = 81,5 C + 0,41 * (%GC) + 16,6 log [Na+] - 500/n - 0,61 * (%Formamid)
Früher: Microarrays/Biochips Die Umkehrung der traditionellen Molekularbiologie Spezifische Sonde unspezifisches Target cdna, Oligo-DNA Array of unknown Northern oder Southern Blot genomische oder cdna Bank Heute: Spezifische Targets bekannte Gene oder Sequenzen auf Macro- oder Microarrays unspezifische Sonde reverse-transcribed RNA
Northern Blot (klassisch) RNA (Target) fest gebunden an Träger, Sonde (markierte synthetische Nukleinsäure) frei in Lösung Agarose- Gelelektrophorese Northern Blot Nitrozellulose RNA Hybridisiert mit der Sonde gegen ein Gen 28 S rrna 18 S rrna 3,0 kb 1,5 kb 1,0 kb 0,5 kb RNA Färbung
Microarray Target (synthetische Nukleinsäure) fest gebunden an Träger, Sonde (RNA) frei in Lösung Synthetische Oligonukleotide bekannter Sequenz in einem bestimmten Planquadrat Markierte RNA an den Oligos hybridisiert und mit Farbstoff markiert
Affymetrix GenChip
Auflösung des Scanners Größe des Spots eines synthetisierten Oligos
Design der GeneChips Affymetrix Gene Expression Arrays Exon Arrays Tiling Arrays
Design der GeneChips Affymetrix mrna Sequence of interest 5 3 Probe Set 25 bp oligonucleotide Target Sequence 5 - TTACCCAGTCTA G CTAGTAGCTGGA 3 IIIIIIIIIIII I IIIIIIIIIIII 3 - AATGGGTCAGAT C GATCATCGACCT - 5 Perfect match probe Mismatch probe 5 - AATGGGTCAGAT C GATCATCGACCT 3 5 - AATGGGTCAGAT G GATCATCGACCT 3 Probe pair
Design der GeneChips Affymetrix Cell Whole Chip PM MM Probe pair 1,28 cm Probe Set
Auswertestrategien der GeneChips Einzelanalyse Probe Set 210342_s_at Array1 Signal array1 Signal array2 Probe Set 210342_s_at Array2
Einzelanalyse Signal Detection call Detection p-value
Discrimination Score R = (PM-MM)/(PM+MM) One-sided Wilcoxon Signed Rank test aller R eines Probesets Führt zum Detection p-value
Das Signal für ein ProbeSet wird summiert aus den ProbePairs. Es wird ein One-step Tukey s biweight estimate verwendet.
Auswertestrategien der GeneChips Vergleichsanalyse Probe Set 210342_s_at Array1 Signal Log Ratio Probe Set 210342_s_at Array2 Baseline
Vergleichsanalyse Signal Log Ratio Difference Call Difference p-value Es werden erst die ProbePairs zweier Chips ins Verhältnis gesetzt und dann für das ProbeSet eine Summe (Signal Log Ratio) gebildet. (PM-MM) array1 / (PM-MM) array2
Einzelanalyse Vergleichsanalyse Gruppenanalyse Preprocessing MAS5 MAS5 RMA GC-RMA Plier Statistik