Kap. 1. Chroatographie Zusaenfassung. Die Chroatographie ist eine analytische Methode zur Trennung von Stoffen. Sie ist also ein Trennverfahren und uss soit ier it eine Bestiungsverfahren gekoppelt sein. Der Nae Chroatographie geht auf das erste chroatographische Verfahren zurück, als Pflanzenblätter it Aceton extrahiert wurden und die Lösung durch eine Glassäule gefüllt it fein gepulverte Zucker fließen gelassen wurde. Auf der Säule traten ehrere grüne, orange und gelbe Zonen der getrennten Blattfarbstoffe auf. Deshalb auch der Nae (chroos: griech. Farbe). Diese (erste) Methode der Chroatographie heißt Säulen-Chroatographie. Alle chroatographischen Verfahren beruhen darauf, dass die Substanzgeische zwischen einer stationären (unbeweglichen) und einer obilen (beweglichen) Phase durch Adsorptions-, Verteilungsoder Austauschkräfte ehr oder inder aufgeteilt werden. Die stationäre Phase kann z.b. ein Feststoff (Adsorptions-Chroatographie, Austausch-Chroatographie) oder ein auf de Feststoff befindlicher dünner Flüssigkeitsfil (Verteilungs-Chroatographie) sein. Die obile Phase, gleichzeitig Träger der zu untersuchenden Substanzgeische, uss eine it der stationären Phase nicht ischbare Flüssigkeit oder ein indifferentes Gas (Gas-Chroatographie) sein. Eine Variante ist die Dünnschicht-Chroatographie (DC, engl. TLC). Dabei wird eine Paste der oben erwähnten Trägerstoffe in dünner Schicht auf Trägerplatten (aus Glas oder dicker Alu-Folie) aufgetragen und danach getrocknet. Einige μl der zu untersuchenden Lösung werden auf die Schicht gebracht und eingetrocknet. In eine verschlossenen Glasbehälter (Trennkaer) lässt an nun ein Laufittel (z.b. Wasser, schwache Säuren oder Basen, organische Lösungsittel, oder deren Geische) von unten nach oben wandern. Die eingetrockneten Substanzen werden aufgenoen, verschieden weit itgeführt und so getrennt. Die Papier-Chroatographie (PC) arbeitet it Streifen aus spezielle Filterpapier, ebenfalls eist aufsteigend. Die Arbeitsethode entspricht der der Dünnschicht-Chroatographie. Mit ilfe der Gas-Chroatographie (GC) werden Substanzen von eine inerten Trägergas transportiert, vo Säulenaterial unterschiedlich stark zurück gehalten und koen soit zu unterschiedlichen "Retentionszeiten" a Detektor a Ende der Kapillare ("Säule") an. Man verwendet entweder Glas- oder Stahl-Säulen (gepackte Säulen) it eine i. D. von 2 4. Sie sind it der stationären Phase (de "Säulenaterial") z.b. Silicagel gefüllt oder aber sog. Kapillarsäulen (i. D. 0.2 0.75 ) aus synthetische Quarz (Fused Silica), die auf ihrer Innenseite it eine sehr dünnen Fil (0.1 0.8 u) an stationärer Phase (eist Polysiloxane) beschichtet sind. Für die Entwicklung chroatographischer Methoden erhielten die Briten Martin und Synge 1952 den Nobelpreis für Cheie. Bei der ochdruck-flüssigkeits-chroatographie (PLC) werden eist Edelstahlsäulen (ID 2-4 ) verwendet. Darin befindet sich die sehr dicht gepackte stationäre Phase (2-5 μ Partikel). Dadurch sind sehr leistungsfähige und schnelle Trennungen bzw. Analysen öglich. Dies erfordert allerdings relativ hohe Drücke der flüssigen obilen Phase (150 400 bar). Bei Verwendung von Partikeldurchessern < 2 u werden sogar Drücke von 600-1000 bar benötigt, u die obile Phase durch die stationäre Phase zu bewegen. Man spricht hier von sog. UPLC = Ultra- igh-perforance-lc). Detektionsethoden: In der GC verwendet an zur Detektion u. a. die Wäreleitfähigkeit des Trägergases, die elektrische Leitfähigkeit eines Brenngases (Flaen-Ionisations-Detektor; FID), oder leitet das Eluat in ein Massenspektroeter. In der DC verwendet an fluoreszierende Platten (deren Fluoreszenz durch den Spot unsichtbar wird, sodass dieser i UV-Licht als dunkler Fleck erscheint), des Weiteren Sprühreagenzien (für chroogene Reaktionen) sowie zur quantitativen Auswertung Reflektoeter ("Scanner"), die die Spots optisch abtasten. Daneben verwendet an in der DC Methoden wie z. B. Eluieren und Wiederauflösen, Abtötung von aufgebrachten Bakterien (bei Nachweise von getrennten Antibiotika) und die Autoradiographie bei der Trennung radioaktiver Stoffe. Die Eluate der Flüssig-Chroatographie werden photoetrisch, fluorietrisch, refraktoetrisch oder elektrocheisch detektiert, und können ebenfalls it anderen Verfahren kobiniert werden, z. B. it der Massen- Spektroetrie (GC-MS-Kopplung). Die Chroatographie in ihren vielseitigen Erscheinungsforen ist die wichtigste Trennethode für organische Verbindungen. 52
1.1. Grundlagen Der Botaniker M. Tswett (1872 1919) gilt als Entdecker der Chroatographie. I Jahr 1906 beschrieb er die für die Adsorptions-Chroatographie grundlegende flüssig-chroatographische Trennung von Blattfarbstoffen (Ber. Dtsch. Botan. Ges. 24, 1906, S.384-393). Blattextrakte wurden ittels Petrolether durch kleine, it Calciucarbonat gefüllte Glassäulen gedrückt. Inspiriert von den dabei beobachteten Farbzonen (chroos = griech.: Farbe) gab er der Methode auch ihren Naen. Mit de Ausdruck Chroatographie bezeichnet an heute einen Trennprozess, bei welche die Koponenten eines Probengeisches zwischen zwei nicht iteinander ischbaren Phasen i sog. chroatographischen Bett (Trennsäule oder Ebene) verteilt werden. Eine ilfsphase (stationäre Phase) ruht dabei, während die andere ilfsphase (obile Phase) an ihr vorbei ströt. Die heutige Bedeutung des Begriffs Chroatographie ist sehr allgeein. Sie ist eines von vielen physikalisch cheischen Trennverfahren. Die Trennung erfolgt ohne Stoffuwandlung und ohne Phasenuwandlung, aber unter Verwendung von so genannten ilfsphasen. 1.1.1. Die stationäre Phase Zu einer chroatographischen Trennung von Substanzen kot es, wenn die zu trennenden Substanzen unterschiedliche Wechselwirkungen zwischen zwei nicht iteinander ischbaren Phasen zeigen, wobei die eine Phase ruht (stationäre Phase), während die andere (die obile Phase) an der stationären Phase vorbei ströt. Bei den eisten Ausführungsarten der Chroatographie ist die stationäre Phase fest (das Chroatographie-Bett). Nur selten ist die stationäre Phase flüssig (dann aber als unbeweglicher "stationärer", flüssiger Fil auf der Oberfläche eines Feststoffes aufgebracht, wie z.b. als adsorbierter Wasserfil auf Cellulose), oder aber als unbewegliche, flüssige, sog. quasistationäre Phase i Inneren von porösen Kugeln (Gel-Pereations-Chroatographie; GPC) oder auf der Innenwand von GC- Kapillarsäulen. Von besonderer Bedeutung sind feste Phasen (zb. SiO 2 ), deren Oberflächen cheisch odifiziert sind, z. B. durch Belegen it Alkylketten unterschiedlicher Länge (siehe PLC). 1.1.2. Die obile Phase Die obile Phase auf de üblicherweise festen Träger kann flüssig ("Liquid Chroatography"; = LC) oder gasförig sein (Gas Chroatography; GC). Sie trägt die Analyte weiter. 1.1.3. Grundbegriff: Der Verteilungskoeffizient K Die unterschiedliche Verteilung der Substanzen zwischen stationärer und obiler Phase kann durch den Verteilungskoeffizienten beschrieben werden. Er ist wie folgt definiert: 53
K = cs(x) c (X) (Gl. 1) ierin ist: K der Verteilungskoeffizient C S (X) die Stoffengenkonzentration der Substanz X in der festen Phase C (X) die Stoffengenkonzentration der Substanz X in der obilen Phase. 1.1.4. Grundbegriff: Kapazitäts- oder Retentionsfaktor k Setzt an für die Stoffengenkonzentration in Gleichung (1) die Stoffenge der Substanz X ein, so erhält an den sog. Kapazitätsfaktor k (auch Retentionsfaktor) genannt: n n s k = (X) (X) (Gl. 2) ierin ist: k der Kapazitäts- oder Retentionsfaktor n S (X) die Stoffenge der Substanz X in der festen Phase n (X) die Stoffenge der Substanz X in der obilen Phase Diese Definition des Retentionsfaktors gilt streng genoen nur, solange die Verteilung der Substanz X auf die beiden Phasen unabhängig ist von der eingesetzten Stoffenge bzw. von der sich ergebenden Konzentration. Bei höheren Konzentrationen (Überladung eines Chroatographiesystes) kann es in einer Phase z.b. zur Bildung von Aggregaten koen, bei zu niedrigen Konzentrationen z.b. zu Dissoziationsvorgängen. Auf Grund der unterschiedlichen Verteilungen von Substanzen in zwei iteinander nicht ischbaren Phasen ergibt sich eine Vielzahl von unterschiedlichen Ausführungsforen der Chroatographie. Sie sollen i Folgenden besprochen werden. 1.2. Ausführungsforen der Chroatographie 1.2.1. Unterschiedliche Löslichkeit: Verteilungschroatographie In der Flüssig-Flüssig-Verteilungschroatographie werden die Probekoponenten, ähnlich wie bei Ausschütteln i Scheidetrichter, zwischen zwei nicht iteinander ischbaren, flüssigen Phasen verteilt. In einer Säule erfolgt dieser Prozess, d.h. die Gleichgewichtseinstellung ehrere tausend Mal. Die eine der beteiligten Flüssigkeiten ist die obile Phase, die andere befindet sich z.b. als dünner Fil auf der Oberfläche oder in den Poren eines körnigen, in die Säule gefüllten Trägeraterials. Bei dieser Art der Säulenflüssig-Chroatographie wird also ein Phasensyste benutzt, das aus einer flüssigen obilen und einer flüssigen stationären Phase besteht. In der klassischen Verteilungschroatographie verwendet an z.b. Flüssig-Flüssig-Systee wie Di-2-cyanoethylether und n-eptan, Acetonitril und Cyclohexan oder n-octanol und Pufferlösungen. 54
1.2.2. Unterschiedliches Adsorptionsverhalten: Adsorptionschroatographie In der Adsorptions-Chroatographie kot die Verzögerung der Probensubstanzen dadurch zustande, dass die Probenoleküle an der stationären Phase unterschiedlich stark adsorbiert werden. Die Stärke der Adsorption bestit das Ausaß der Verzögerung. Bei der Adsorptions-Chroatographie kann an je nach stationärer Phase zwischen zwei prinzipiellen Kategorien von Phasensysteen unterscheiden, nälich * de Noralphasensyste (= NP-Chroatographie) * de Ukehrphasensyste (= RP-Chroatographie) Das NP-Syste enthält eine polare stationäre Phase und eine unpolare obile Phase, bei RP-Syste verhält es sich genau ugekehrt, daher auch der Nae Reversed-Phase-Chroatographie. Sie ist ittlerweile die wohl a häufigsten angewendete For der Flüssig-Chroatographie. Die folgende Tabelle gibt Beispiele für stationäre und obile Phasen für die NP- und die RP- Chroatographie. Stationäre und obile Phasen in der NP-Chroatographie. Die stationären Phasen sind eist unpolar geacht (durch "end-capping"), die obilen Phasen sind relativ polar. Phasensyste Stationäre Phase Mobile Phase Noral-Phase (NP) SiO 2, Al 2 O 3 SiO 2 ~(C 2 ) n -N 2 * SiO 2 ~(C 2 ) n -CN * * diese stationären Phasen konnen sowohl i NP-als auch i RP-Modus eingesetzt werden. eptan/exan; Cyclohexan; Chlorofor; Dichlorethan Dioxan; Methanol Die folgende Tabelle gibt eine Übersicht über gängige stationäre und obile Phasen in der RP- Chroatographie. Frage: Was ist der Unterschied zu den Materialien in der obigen Tabelle? Phasensyste Stationäre Phase Mobile Phase Reversed-Phase (RP) SiO 2 ~(C 2 ) n -C 3 (z.b. C 4, C 8, C 12, C 18 ) SiO 2 ~Phenyl SiO 2 ~(C 2 ) n -CN * Methanol/Wasser; Methanol/ Puffer; Acetonitril/Wasser; Acetonitril/Puffer + Zusätzen von Trifluoressigsäure (TFA), von TF oder Dioxan * diese stationären Phasen können sowohl i NP-als auch i RP-Modus eingesetzt werden. Wenn Ukehrphasen it unterschiedlichen Alkylkettenlängen (z.b. C 4, C 8, C 12, C 18 ) verwendet werden, steigt der hydrophobe Charakter dieser RP-Träger it steigender Kettenlänge bei gleicher Ligandendichte. Daher sind die Retentionszeiten z.b. auf RP 18 (= C 18 )-Trägern länger als z.b. auf RP 8 (= C 8 )-Trägern. Bei einer gegebenen RP-Säule wird die Verzögerung der zu trennenden Substanzen durch die Veränderung der Polarität des Fließittels (Eluens) reguliert. Dies geschieht i Wesentlichen durch die Veränderung des Wassergehalts. 55
1.2.3. Unterschiedliche elektrostatische Wechselwirkung: Ionenaustausch-Chroatographie In der Ionenaustausch-Chroatographie werden geladene Substanzen getrennt. Die Verzögerung der einzelnen Analyte kot durch elektrostatische Wechselwirkung it der stationären Phase zustande. Sollen kationische (anionische) Substanzen getrennt werden, benötigt an entsprechend Kationen (- Anionen)-austauscher. Generell kann der Ionenaustauschprozess durch folgende Beziehung dargestellt werden: - - SO 3 Na + + - + X - SO 3 X + + Na + Kationenaustausch: Anionenaustausch: + - NR 3 Cl - + Y - + - NR Cl 3 Y - + - Bei eine Ionenaustauscher sind ionische Gruppen (z.b. Sulfo oder Aoniu) über eine Abstandsgruppe kovalent an eine polyere Matrix gebunden (Polystyrolharz). Die Ladung der Festionen wird durch bewegliche Gegenionen kopensiert (eist Na + bei Sulfo und Cl - bei NR + 3 ). Während des Ionenaustauschprozesses wird dann das Gegenion z.b. Na + gegen das Proben-Ion X + ausgetauscht. Dieser Vorgang ist ein Gleichgewichtsprozess. Das Ausaß der Verzögerung des Kations X + richtet sich nach der Stärke der Bindung an die Austauschergruppe (Sulfo). Es werden daher Ionen it hoher Ladung stärker verzögert als solche it geringerer Ladung. Bei gleicher Ladung werden jene Ionen stärker verzögert, deren üllen leichter polarisierbar sind. Prüfungsfrage: Benennen Sie organische Anionen und Kationen, die ittels IC getrennt werden können (keine Ainosäuren). Da auch Ainosäuren ionisch sind (und zwar bei jede p-wert), sind auch sie ittels IC auftrennbar. Ainosäuren sind bekanntlich bei hohen p-werten (>9) anionisch, bei ittleren p-werten (~9 bis ~3) zwitterionisch, bei niedrigen p-werten (<3) kationisch. 1.2.4. Unterschiedliche Größe oder Gestalt: Größen-Ausschluss-Chroatographie (SEC), wie z.b. Gel-Pereations-Chroatographie (GPC) Die SEC (= Size-Exclusion-Chroatography) unterscheidet sich grundsätzlich von allen bislang kennengelernten Methoden der Chroatographie. Die Packung der Säule besteht aus eine porösen Material. Den Analyten (vor alle Proteine), die zu groß sind, u in die Poren der Packung einzudiffundieren, steht lediglich das Voluen zwischen den einzelnen "Körnern" der stationären Phase zur Verfügung. Sie werden gleichsa "ausgeschlossen". Ihnen erscheint die Säule wie it assiven, undurchdringlichen Kugeln gefüllt. Diese Moleküle (z. B. große Proteine) werden von der obilen Phase auf de schnellstöglichen Weg durch die Säule transportiert, weil sie nicht in die ohlräue der stationären Phase eindiffundieren können. Sind dagegen auch kleinere Moleküle (kleine Proteine) anwesend, können diese in die Poren der 56
stationären Phase diffundieren. Soit werden diese gegenüber den großen Molekülen verzögert (da sie längere Wege wandern) und dait getrennt. Das Lösungsittel tritt nicht in Wechselwirkung it der stationären Phase, durchfließt aber alle Poren der stationären Phase und kann diese soit vollständig durchdringen (sog. totale Pereation). Deshalb erscheint das Lösungsittel bei der SEC i Gegensatz zu jede anderen säulenchroatographischen Verfahren nicht als erstes, sondern als letztes Signal i Detektor. Frage: Mit ilfe welcher Methode kann an die (farblosen!) Proteine erkennen, wenn sie a Ende der Säule austreten? Leider kann an hier nicht wirklich gut derivatisieren. 1.3. Der chroatographische Prozess Ein Verständnis des chroatographischen Prozesses ist vor alle deshalb erforderlich, u entscheiden zu können, welche Chroatographie für ein bestites Trennproble in Frage kot. Die Wahl der angeessensten Methode ist ein typischer Fall einer wichtigen Entscheidung i analytischen Gesatprozess (siehe bei diese unter Stufe 3: Wahl und Validierung der Methode)! 1.3.1 Der Trennvorgang Zeitlicher Verlauf einer chroatographischen Trennung (Adsorption) eines Probengeisches, das aus drei Einzelkoponenten (A, B, C) besteht. Mit steigender Verlaufszeit (von oben nach unten: nach 1, 2, 3, 4 und 5 in) der Trennung werden die Abstände der Banden größer, allerdings auch breiter. Die entsprechende graphische Auftragung der Größenwerte gegen die Zeit heißt Chroatogra. A B C nach 1 in nach 5 in 1.3.2. Definition eines Chroatogras Mit de Ausdruck "Chroatogra" bezeichnet an die graphische Auftragung der Größenwerte einer Größe (z.b. der Absorption in AU = illi-absorption-unit), die a Ende der stationären Phase, also z.b. a Säulenausgang, in der obilen Phase geessen werden, gegen die Zeit oder das Voluen der obilen Phase. 1.3.3. Definition der Retentionszeit und des Retentionsvoluens Die Retentionszeit ist wesentlich einfacher zu essen als etwa das Retentionsvoluen. Beide Größen hängen jedoch über folgende Beziehung it der sog. Voluenfließgeschwindigkeit F (kurz Fluss oder Flussrate) zusaen, die sich z. B. an einer PLC-Pupe leicht einstellen lässt und eist konstant gehalten wird: 57
Das Voluen der obilen Phase, das die stationäre Phase vo Moent der Probenaufgabe bis zu Erscheinen der Substanz X als Peak i Chroatogra passiert hat, nennt an das Retentionsvoluen der Substanz X: V R (X). Die zugehörige Zeit nennt an die Retentionszeit: t R (X). 1.3.3.1. Das Retentionsvoluen V R (X) ist definiert als V R (X) = F t R (X) (Gl. 3) ier ist V R (X) das Voluen der stationären Phase Retentionsvoluen [L]; F die Voluenfließgeschwindigkeit der obilen Phase [L/in], und t R (X) die Retentionszeit [in]. In der chroatographischen Praxis sind jedoch vor alle die linearen Wanderungs-Geschwindigkeiten (d. h. wo befindet sich die Koponente X nach einer gewissen Laufzeit in eine Syste?) die eigentlich interessanten Größen. Für den Zusaenhang zwischen linearer Fließgeschwindigkeit und Voluenfließgeschwindigkeit gilt: 1.3.3.2. Der Zusaenhang zwischen u und u(x) Es ist einzusehen, dass die lineare Wanderungsgeschwindigkeit u(x) der Substanz X, der linearen Wanderungsgeschwindigkeit der obilen Phase u direkt proportional sein uss, und dass u(x) ier kleiner als bzw. höchstens gleich u sein kann. u(x) = χ (X) u (Gl. 4) Bei de Proportionalitätsfaktor χ (X), der diensionslos sein und zwischen 0 und 1 liegen uss, kann es sich nur u den Stoffengenanteil der Substanz X in der obilen Phase handeln, denn die Substanz X wird it der Geschwindigkeit u nur dann transportiert, wenn sie sich in der obilen Phase aufhält. Dieser Stoffengenanteil ist i Folgenden definiert und hängt nach (2) it de Retentionsfaktor k zusaen. 1.3.3.3. Der Zusaenhang zwischen χ (X) und k χ (X) = n (X) 1 = s (X) + (X) s (X) = n n n + 1 n (X) 1 k + 1 Unter Berücksichtigung von (4) und (5) erhält an: u = χ u = (X) (X) 1 k + 1 u u = k + u(x) (Gl. 5) 1 (Gl. 6) 58
Für jeden Stofftransport gilt: 0 χ( X ) 1. Daher erhält an für die beiden Grenzfälle: 1.) Für χ (X) = 0 ergibt sich u(x) = 0 d.h. es befindet sich keine Substanz X in der obilen Phase (n (X)=0), weil alles an die stationäre Phase gebunden ist, d.h. keine Wanderung des Analyten 2.) Für χ (X) = 1 ergibt sich u(x) = u d.h. es befindet sich die gesate Substanz X in der obilen Phase (n S (X)=0), d.h. Wanderungsgeschwindigkeit des Analyten entspricht der Wanderungsgeschwindigkeit der obilen Phase 1.3.4. Die Totzeit t 0 oder Durchbruchszeit t Die Zeit, die i zweiten Fall verstreicht, wenn also keine Wechselwirkung der Substanz X it der stationären Phase stattfindet bezeichnet an häufig als sog. "Totzeit" der Säule t 0. Analog dazu wird das zugehörige Voluen als sog "Totvoluen" V 0 der Säule bezeichnet. Der Gebrauch der Bezeichnungen "Totvoluen" oder "Totzeit" wird von der IUPAC wegen vieler Verwechslungsöglichkeiten heute nicht epfohlen. So ist it de sog. "Totvoluen" oft nicht nur das eigentliche Totvoluen der Säule geeint, sondern zusätzlich auch das "Totvoluen" das durch die apparative Beschaffenheit des gesaten Gerätes verursacht wird (z. B. durch die Innenvoluina sehr langer Verbindungskapillaren oder nicht ideal angepasster Anschlüsse bzw. Konnektoren). Vo Sachverhalt sind daher die Begriffe Durchbruchszeit oder Durchbruchsvoluen angeessener. Die Definition von Durchbruchvoluen und zeit: Als Durchbruchsvoluen V bzw. -zeit t wird dasjenige Voluen (bzw. die dazu korrespondierende Zeit) bezeichnet, das benötigt wird, u eine nicht-retardierende Substanz (Durchbruchszeitarker) von der Eingabe bis zur Detektionsstelle zu befördern. Dieses Voluen ufasst also genau genoen zusätzlich zu Voluen der obilen Phase i Säulenbett V ob die Totvoluina des Gerätes z.b. i Einspritzventil, in den Verbindungskapillaren, i Detektor etc. Ein "Durchbruchszeitarker" darf keinesfalls retardierend sein und uss vo Detektor erkannt werden. Die Durchbruchszeit repräsentiert die für alle zu trennenden Substanzen gleiche Zeit (kürzest ögliche Zeit), die sie in der obilen Phase des chroatographischen Systes zubringen üssen. Die Auftrennung der Substanzen kot dadurch zustande, dass sich die Substanzen je nach Stärke der WW unterschiedlich lange in der stationären Phase aufhalten und so verzögert werden. 59
Musterchroatograit der entsprechenden Durchbruchszeit t, den Retentionszeiten der Koponenten t R (X 1 ) und t R (X 2 ), sowie t s (X) als Aufenthaltszeit der Koponente X in der stationären Phase. Absorption [ [Au Au] t R (X 2 ) t R (X 1 ) t R(X) = t S (X) + t t t S (X 1 ) t S (X 2 ) Zeit [s] Wovon sind nun Durchbruchszeit und Retentionszeit abhängig? Diese Frage wird i Folgenden beantwortet: Die Retentionszeit und die Durchbruchszeit hängen natürlich von den Abessungen der verwendeten Säule (Länge: L) und von den Wanderungsgeschwindigkeiten u (X) bzw. u(x) ab. Ebenso wie Retentionsvoluen und Durchbruchsvoluen von der Voluenfließgeschwindigkeit F abhängen. Dait ergeben sich folgende Beziehungen und Verhältnisse: Durchbruchsvoluen Retentionsvoluen t L V = = (7) t u F R L VR (X) (X) = = u(x) F (8) Bildet an den Quotienten aus Retentions- und Durchbruchszeit, so erhält an: t R (X) Unter Berücksichtigung von Gl. (6) erhält an Gl. 9: tr (X) VR (X) t die wichtige Beziehung: t VR (X) u = = (Gl 9) V u(x) = = k +1 (Gl. 10) V t R (X) = t (k + 1) (Gl. 11) aus der an den Kapazitätsfaktor k berechnen kann, wie i Folgenden beschrieben. 1.3.5. Berechnung des Kapazitätsfaktors k U "Chroatograe", die an Geräten it unterschiedlicher Totzeit (Durchbruchszeit) geessen 60
wurden, vergleichen zu können, bedient an sich einer diensionslosen Größe, de Kapazitäts- (Retentions)faktor k. Der Kapazitäts-(Retentions)faktor k einer Substanz X ist soit eine auf die Durchbruchszeit "norierte Elutionsgröße". k = t R t (x) 1 (Gl. 12) Der Kapazitätsfaktor ist dait für verschiedene Substanzen bei eine gegebenen Syste (Festphase und obile Phase) unittelbar vergleichbar und unabhängig von den Säulendiensionen. Ein Wert von z.b. k = 5 für eine Substanz bedeutet, dass diese Substanz it der sechsfachen Durchbruchszeit der Säule eluiert wird. Für optiale Trennungen liegt k zwischen 1,5 und 5. Wenn k = 0, wird die Retentionszeit gleich der Durchbruchszeit, was bedeutet, dass eine solche Substanz praktisch unretardiert durch die Säule wandert. Bei Werten von k < 1,5 findet i Allgeeinen zu wenig Wechselwirkung zwischen Substanz und stationärer Phase statt, was zu eine ungenügenden Trennergebnis führt. Bei k > 5 sind eist die Analysenzeiten zu lange, was zu breiten Peaks führen kann. Der Quotient aus den Retentionsfaktoren k 2 und k 1 zweier benachbarter Peaks wird als Selektivität (oder Trennfaktor) α bezeichnet und gibt Aufschluss über die Güte einer Trennung (Gl. 13): k2 ts α= = (X 2 ) it k k k t 1 s (X 1 ) 2 1 1.3.6. Die Theorie der Böden ("theoretisches Trennstufenodell") Dieses Modell ist eine Übertragung der Theorie der fraktionierten Destillation auf die Säulenchroatographie und übernit das dort verwendete Konzept der theoretischen Böden it einer zugehörigen Bodenhöhe und Bodenzahl. Daher stat auch die zwar anschauliche, aber nur näherungsweise richtige (die wiederholte Einstellung separater Gleichgewichte ist bei der bewegten obilen Phase eher unrealistisch) Vorstellung von einer Trennstufenhöhe und einer Trennstufenzahl N z in der Säulenchroatographie. 61
Abb. rechts: Beispiel eines Destillations-Turs Bodenzahl Bodenhöhe Boden Definition: Die Trennstufenhöhe (die öhe eines Theoretischen Bodens), oder ETP (height equivalent to one theoretical plate) ist die Strecke, auf der sich bei Fließen der obilen Phase das Gleichgewicht einal einstellt. Es stellt sich nun als nächstes die Frage, wovon Trennstufenhöhe und Trennstufenzahl abhängig sind. Beide Größen hängen natürlich in erster Linie it der Länge L der Chroatographiesäule zusaen geäß Gleichung (13). L L = N z = (Gl. 14) N z Wird inial und N z axial, so wird die chroatographische Trennung optial. N z ist soit ein Charakteristiku für die Leistungsfähigkeit einer Trennsäule. Je besser z.b. eine Säule gepackt wurde (kleine Trennstufenhöhe) und je länger sie ist (große Trennstufenzahl), desto besser ist die dait zu erzielende Trennleistung. Wie wirkt sich nun der Einfluss von und N z auf die lineare Fließgeschwindigkeit der obilen Phase aus? Macht an die Fließgeschwindigkeit der obilen Phase ier größer, kot es dazu, dass für die Gleichgewichtseinstellung nicht ehr genug Zeit bleibt und die Trennung wird sich verschlechtern. Reduziert an hingegen die Fließgeschwindigkeit ier ehr, so koen zunehend z.b. Diffusionsvorgänge it ins Spiel und auch in diese Extrefall würde sich die Trennung verschlechtern. Wo liegt also der optiale Flussbereich, bei de die beste Trennleistung erzielt wird? Diese wichtige Inforation erhält an aus de sog. /u-diagra: 62
Typisches /u-diagra, in de die Trennstufenhöhe in Abhängigkeit von der Fließgeschwindigkeit u der obilen Phase graphisch dargestellt ist. Es existiert eine optiale Fließgeschwindigkeit, bei der die Trennstufenhöhe inial ist und die Trennleistung optial wird. Trennstufenhöhe [μ] 50 30 10 /u-kurve Miniu bei LC ca. 0.2-0.5 0.5 c/s (GC: 1-31 3 c/s) 0,5 1,0 1,5 Fließgeschwindigkeit u [ c/s ] 1.3.7. Die van-deeter-gleichung I vorangegangenen Kapitel wurde das sog. /u-diagra als wichtiges ilfsittel vorgestellt, das benötigt wird, u gute Trennungen in relativ kurzen Analysenzeiten durchführen zu können. Doch woraus resultiert diese For der Kurve? U das Zustandekoen dieser Kurvenfor besser verstehen zu können, wird i Folgenden die zu Grunde liegende, epirische van Deeter-Gleichung näher erläutert, die it ihren verschiedenen Teren obigen Kurventyp additiv erzeugt: Wie bereits angeerkt handelt es sich hierbei u eine epirische Gleichung it folgenden Größen: B = A + + C u u (Gl. 15) Was bedeuten nun die einzelnen Größen in der van-deeter-gleichung? Der A-Ter: die Eddy-Diffusion (Wirbeldiffusion) Der A-Ter ist in erster Näherung von der Fließgeschwindigkeit unabhängig und beschreibt die Bandenverbreiterung. Sie resultiert aus der unterschiedlichen Geoetrie der Festphasenteilchen und aus der unterschiedlichen Packung dieser Teilchen in der Trennsäule. Dieser Beitrag, den an Eddy-Diffusion (Wirbeldiffusion) nennt, beruht darauf, dass statistisch gesehen einige Analytoleküle einen relativ kurzen Weg durch die Partikel der stationären Phase finden, während andere gezwungen sind, einen ehr oder weniger großen Uweg zu achen. Der A-Ter der van Deeter-Gleichung wird i /u- Diagra durch eine zur u-achse parallele Linie repräsentiert (siehe die Abb.). Der B-Ter: die Longitudinal-Diffusion Der B-Ter berücksichtigt zwei Beiträge zur sog. Longitudinaldiffusion der Probenoleküle vo Peakzentru weg in bzw. entgegengesetzt zur Ströungsrichtung, die der Fließgeschwindigkeit ugekehrt proportional sind: (a) die Ströungsverteilung: Die lainare Ströung der obilen Phase und dait der Transport der Moleküle ist in der Mitte zwischen zwei Partikeln schneller, als nahe a Rand dieser Partikel. 63
(b) Diffusion der Probenoleküle: Dieser Beitrag hängt i Wesentlichen von den Eigenschaften der Probenoleküle (Diffusionskoeffizient in der obilen Phase), und den Eigenschaften der obilen Phase (z.b. Viskosität, Teperatur) sowie von der Fließgeschwindigkeit ab. Der B-Ter ist unabhängig vo Partikeldurchesser. Er spielt in der LC, anders als in der GC, keine große Rolle, weil die Diffusion in der flüssigen Phase i Vergleich zur Gasphase stark eingeschränkt ist. I /u-diagra wird der B-Ter durch eine yperbel repräsentiert. Der C-Ter: der Stoffaustauschanteil Der C-Ter berücksichtigt verschiedene kinetische Beiträge, die direkt proportional der Fließgeschwindigkeit sind. Man kann diese zusaenfassen unter de Oberbegriff "Geschwindigkeit des Stoffaustausches der Probenoleküle zwischen stationärer und obiler Phase" und ugekehrt. Wenn die stationäre Phase, wie in der LC ein Festkörper ist, gehören dazu: (a) Die Geschwindigkeit für die Gleichgewichtseinstellung der Adsorption u. Desorption. Dieser Beitrag ist unabhängig vo Partikeldurchesser. (b) Geschwindigkeit des Massentransportes in die Poren hinein und wieder heraus: 95% aller stationären Phasen bestehen aus kugelförigen (sphärischen) Partikeln, wobei der Partikeldurchesser ca. 500-al größer ist als der Porendurchesser. (c) Geschwindigkeit des Massentransportes in den Poren: In den Poren koen die zu trennenden Probenoleküle nur durch Diffusion voran. Zusaenfassend kann an feststellen, dass der C-Ter i Wesentlichen von der Partikelgröße beeinflusst wird. I /u-diagra wird der C-Ter durch eine Gerade it ehr oder weniger starker Steigung repräsentiert. (siehe S. 17). Nach Addition aller drei Tere, die it ihre jeweiligen Einzelkurvenverlauf in nebenstehender Grafik abgebildet sind, erhält an das bekannte /u-diagra, in de die Trennstufenhöhe in Abhängigkeit von der Fließgeschwindigkeit u der obilen Phase graphisch dargestellt ist. Trennstufenhöhe [μ] 50 30 10 B-Ter /u-kurve C-Ter A-Ter 0,5 1,0 1,5 Fließgeschwindigkeit u [c/s] /u-diagra und Tere der van-deeter-gleichung Man ist natürlich bestrebt, öglichst gute Trennungen in relativ kurzer Zeit durchzuführen. U eine iniale Trennstufenhöhe bei öglichst flacher /u-kurve zu erreichen, verwendet an: (a) geringe Korngrößen (Einfluss auf A-Ter und C-Ter) (b) enge Korngrößenverteilung bzw. dichte Packung (Einfluss auf B-Ter) (c) geringe Säulendurchesser (Einfluss auf A-Ter und B-Ter) 64
1.4. Das Chroatogra Die Begriffe Chroatogra bzw. Retentionszeit und Retentionsvoluen wurden bereits in vorigen Kapiteln definiert. Darüber hinaus soll nun i Folgenden auf weitere wichtige Kenngrößen und Aussagen eingegangen werden, die aus eine Chroatogra entnoen werden können. 1.4.1. Qualitative Aussagen Die wichtigsten qualitativen Aussagen, die an aus eine Chroatogra entnehen kann, sind die Zuordnung einer Substanz z.b. über ihre spezifische Retentionszeit bzw. die erhaltenen Spektren (bei Verwendung eines DAD oder MS-Detektors). 1.4.2. Quantitative Aussagen Die Fläche eines Peaks ist der eingespritzten Stoffenge proportional. Dadurch hat jede Substanz für jede Chroatographiebedingung ihren eigenen Proportionalitätsfaktor KF i. Diese Faktoren können durch Injektion von Kalibriergeischen, die die Analyte in bekannter Konzentration enthalten, erittelt werden. Diese Methode wird auch als die Methode des Internen Standards bezeichnet (siehe Praktikusskript). 1.4.2.1 Die Methode des Internen Standards Bei Verfahren des Internen Standards gibt an sowohl der zu untersuchenden Probenlösung, als auch jeder Stalösung eine weitere Koponente, den sog. Internen Standard (Tracer) zu. Eine Substanz, die als interner Standard eingesetzt werden soll, uss aber unbedingt einige wichtige Bedingungen erfüllen: sie darf nicht von vornherein in der zu untersuchenden Realprobe vorkoen. sie uß cheisch stabil bzw. inert sein gegenüber den restlichen Koponenten in der Probe, sowie gegenüber de Packungsaterial der Säule und der verwendeten obilen Phase. sie sollte in öglichst hoher Reinheit vorliegen. sie sollte über öglichst ähnliche physikalisch-cheische Eigenschaften (Retentionszeit, Detektorverhalten, Löslichkeit, etc.) wie die zu bestiende Substanz verfügen. sie sollte von allen in der Realprobe enthaltenen Substanzen unter den chroatographischen Bedingungen gut getrennt werden und in vergleichbarer Konzentration zugesetzt werden. Der Kalibrierfaktor KF i lässt sich durch Analyse einer Eichlösung beschreiben (siehe unten). Man bereitet eine Stalösung it (a) einer genauen Einwaage des Analyten, der als reine Substanz verfügbar sein uss, und (b) eine internen Standard in ähnlichen Konzentrationsverhältnissen wie später in der Realprobe. Dann lässt sich für jede Substanz i ein sog. Kalibrierfaktor KF i aus den Response-Faktoren f Tr und f i nach folgenden Zusaenhängen eritteln: 65
(16) f i = ai i f i = Response-Faktor der Koponente i a i = Fläche der Substanz i = Masse der Koponente i i (17) KF i = f Tr f i = K i K Tr a a K Tr K i KF i = Kalibrierfaktor der Koponente i f Tr = Response-Faktor destracers i K = Masse der Koponente i in der Kalibrierlösung (K) K Tr K a Tr a i K = Masse des Tracers in der Kalibrierlösung (K) = Fläche des Tracers in der Kalibrierlösung (K) = Fläche der Koponente i in der Kalibrierlösung (K) (18) x i a x i x Tr = KF i a Tr i x = Masse der Koponente i in der Probenlösung (X) Tr x = Masse des Tracers in der Probenlösung (X) a x i = Fläche der Koponente i a x Tr = Fläche des Tracers Da jeder Probenlösung der interne Standard in exakt gleicher Menge und gleicher Konzentration (Masse Tr ) zugesetzt wird, lassen sich it ilfe der aus der Eichung erittelten KF-Werte die Massen der gesuchten Koponenten nach Forel (17) eritteln. 1.4.3. Weitere Kenngrößen des Chroatogras I Idealfall sollten die Peaks eines Chroatogras als syetrische Gauss-Kurven eluieren. Aus eine solchen idealen Musterchroatogra lassen sich dann weitere wichtige Größen, wie die diffuse Bandenverbreiterung σ (X) sowie t w (X) als Basisbreite ablesen. 66
Rechts: Muster-Chroatogra it den wichtigen Kenngrößen σ (X) und t w (X) Detektorsignal t R (X 1 ) t R (X 2 ) 2 σ τ (X 1 ) t 2 σ τ (X 2 ) 0,61 h p h p h p 0,61 h p 15 s 40 s 80 s Zeit [ s ] Probenaufgabe 4σ τ (X 1 )= t w (X 1 ) 4σ τ (X 2 ) = t w (X 2 ) t s (X 1 ) t s (X 2 ) Die Auflösung zweier benachbarter Peaks hängt natürlich nicht nur von deren Trennfaktoren, sondern auch von der jeweiligen Peakbreite ab. Das kann an sich an nebenstehende Chroatogra klar achen: Die Retentionszeiten der beiden benachbarten Peaks und dait der Trennfaktor α (Gleichung 13) bleiben gleich, aber die Peakbreiten und dait die Auflösung ändern sich. Die Abb. rechts zeigt ehr oder weniger schlecht aufgelöste Peaks. t R (X 1 ) t R (X 2 ) 1.5. Die ochdruck-flüssig-chroatographie (PLC) 1.5.1. Was bedeutet "PLC"? PLC ist die Abkürzung für igh Pressure/Perforance Liquid Chroatography, = ochleistungs- / bzw. ochdruck-flüssig-chroatographie. Zwischen PLC und klassischer Säulen-Flüssig- Chroatographie bestehen folgende Unteschiede: (a) Durch die PLC wird eine wesentlich höhere Auflösung bei der Trennung erreicht. Es können oft bis zu 100 Koponenten und ehr aus eine Geisch gleichzeitig getrennt werden. (b) Die Analysenzeiten bei der PLC sind drastisch verkürzt und zwar von Stunden (in der klassischen Chroatographie) in den Bereich von Minuten. (c) Die Epfindlichkeit bei Nachweis der getrennten Substanzen ist deutlich besser. Mittels oderner PLC können heute Mengen von bis zu 10-10 g bestit werden. 67
1.5.2. Wann und wo wird die PLC angewendet? Notwendige Voraussetzung für eine Untersuchung ittels PLC ist die ausreichende Löslichkeit der zu analysierenden Substanz in eine geeigneten Solvens. Ist diese Voraussetzung gegeben, wird die PLC überwiegend eingesetzt, wenn: (a) die Analyte schwerflüchtig oder nichtflüchtig sind (für flüchtige Substanzen bietet sich als Alternative die Gas-Chroatographie an), (b) die Analyte hohes Molekulargewicht aufweisen (MW> 500), (c) die Analyte therisch instabil bzw. leicht zersetzlich sind. Die Entwicklung chroatographischer Analysenverfahren wurde in den letzten Jahren enor beschleunigt. I Folgenden werden daher einige wichtige Einsatzgebiete der PLC genannt: * Reinheits- und Produktkontrolle cheischer Substanzen * Analyse von Arzneistoffen * Trennung von Metall-Chelat-Koplexen (Schweretall-Analytik) * Bestiung von Wirkstoffen in biologischen Matrizes * Bestiung von Schadstoffen (Uweltanalytik) * Analytik und Aufreinigung von Biopolyeren (Enzye, Nukleinsäuren, Peptide etc.) * Standardethode in fast allen cheischen Laboratorien. 1.5.3. Wie wird die PLC durchgeführt? Flüssig-Chroatographie bedeutet, dass ein Löseittel(geisch) verwendet wird, in de die Probe, d. h. das Substanzgeisch, gelöst ist. Die Probe wird vo Fließittel (= Eluent) durch das chroatographische Syste transportiert und dabei in Einzelkoponenten aufgetrennt. Rechts: Scheatische Darstellung einer PLC- Anlage. Für die PLC benötigt an eine Apparatur (= chroatographisches Syste), bestehend aus obiler Phase (Eluent), Versorgungseinheit (Pupe), Injektionseinheit (Probengeber), Trennsäule, Detektor und Auswerteeinheit (coputergesteuerte Auswertesoftware oder Integrator). Die Probe wird ittels einer Dosiervorrichtung aufgegeben und it de Fließittel (Eluent) durch die Säule it eist konstanter Voluenfließgeschwindigkeit gefördert. In der Säule findet die Trennung in die Einzelkoponenten statt. Die Analyte werden in der Säule i Vergleich zu Fließittel verzögert transportiert. Entsprechend ihren physikalischen und cheischen Eigenschaften werden sie unterschiedlich stark zurückgehalten und verlassen das Säulenende in der Reihenfolge zunehender Verzögerung. 68
1.5.4. Die Noralphasen-Chroatographie (NP-PLC) Die a häufigsten eingesetzten stationären Phasen in der NP-Chroatographie sind Aluiniuoxid und Silica-Gel. An den unterschiedlichen stationären NP-Phasen werden überwiegend nichtionische, sowie unpolare bis ittelpolare Substanzen getrennt. Die Retention steigt it zunehender Polarität. Bei der NP-Chroatographie nehen die Kapazitätsfaktoren k bei vergleichbarer Molekülgröße in folgender Reihenfolge zu: gesättigte Kohlenwasserstoffe < Olefine < Aroaten < alogenide < Sulfide < Ether < Nitroverbindungen < Ester < Aldehyde < Ketone < Alkohole < Aine < Sulfone < Sulfoxide < Aide < Carbonsäuren. 1.5.5. Die Reversed-Phase-Chroatographie (RP-PLC) Die Chroatographie an cheisch gebundenen Ukehr-Phasen (RP-PLC) gehört heute zu den fast ausschließlich verwendeten Techniken in der PLC. Das Phasensyste in der Reversed-Phase-PLC besteht aus einer unpolaren stationären und einer polaren obilen Phase. Die stationären RP-Phasen gehören zu den sog. cheisch odifizierten Silicagel-Phasen. Bei RP-Phasen wird die Oberfläche des Silica-Gels durch kovalent gebundene, hydrophobe Reste (z.b. C-18-Ketten [RP- 18], C-12-Ketten [RP12], C-8-Ketten [RP8] usw.) unpolar geacht (sog. "endcapping"). Die Abbildung rechts zeigt eine scheatische Darstellung eines RP18-Materials. O Si Si O Si C18-Ketten O Si O Si Si O Si Cl N C 3 C 3 O O O O O O O Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si N O O Si Si Si O Si RP-PLC-Phasen haben gegenüber NP-PLC-Phasen eine Reihe von Vorteilen. Neben der öfteren Wiederverwendbarkeit liegt der wesentliche Vorteil in der schnelleren Einstellung des Gleichgewichts bei Eluentenwechsel und der deutlich erhöhten Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten. I RP-Modus werden Analyten it zunehend hydrophobe Charakter verzögert, d. h. die Retention steigt in der Regel it abnehender Polarität an. Bei der RP-Chroatographie nehen soit die Kapazitätsfaktoren k bei vergleichbarer Molekülgröße in der Reihenfolge: Säuren < Aine < Alkohole < Phenole < Ester < Ether < Aldehyde < Ketone < Aroaten < Aliphaten zu. 1.5.6. Die obile Phase (der Eluent) in der PLC In der Noral-Phasen-Chroatographie besteht die obile Phase aus eine unpolaren organischen Lösungsittel(-geisch), de in bestiten Fällen etwas polares Lösungsittel oder gar Wasser (in geringen Mengen) zugesetzt wird. 69
Definition der Eluotropen Reihe: Die Elutionskraft oder "Stärke" der verschiedenen Eluenten ist eine epirische Größe. Sie wurde für jeden Eluenten als Zahlenwert bestit. Als Sybol dafür verwendet an E 0 oder 0. Die so gefundene Reihenfolge von schwachen zu ittleren bis hin zu starken Eluenten nennt an die Eluotrope Reihe. Es zeigt sich, dass in der Eluotropen Reihe die Eluenten nach ihrer Polarität geordnet sind. Ein (in der NP- Adsorptionschroatographie) starker Eluent ist polar, ein schwacher ist unpolar: Eluotrope Reihe in der NP-Chroatographie (Auszug) Eluent Polarität [E 0 ] UV-Grenze [n](a) n-exan 0,00 190 Toluol 0,29 285 Chlorofor 0,40 245 Dichlorethan 0,42 230 Aceton 0,56 330 Essigsäureethylester 0,58 260 Diethylsulfoxid 0,62 270 Diethylain 0,63 275 Acetonitril 0,65 190 Ethanol 0,88 210 Methanol 0,95 205 Wasser >1,11 <190 (a) Ab dieser Wellenlänge ist das Lösungsittel nicht ehr für UV-Licht durchlässig. Darin gelöste Analyte könen soit nicht ehr it UV-Licht detektiert werden. In der RP-Chroatographie ist es ugekehrt: Stark polare Eluenten (z.b. Wasser) verzögern die Elution. Beiengungen von dazu schwächer polaren Eluenten (z.b. MeO, Acetonitril) beschleunigen sie. Frage: Welche der Lösungsittel in der Tabelle oben sind it Wasser ischbar? 1.5.7. Die Elution In der PLC unterscheidet an zwischen isokratischer Elution und Gradientenelution. Bei der isokratischen Elution ändert sich die Zusaensetzung der obilen Phase während der Trennung nicht. Bei der Gradienten-Elution dagegen ändert sich die Zusaensetzung der obilen Phase während der Trennung laufend! Sind dabei 2 unterschiedliche Eluenten beteiligt, spricht an von binären Gradienten, bei einer Beteiligung von 3 oder sogar 4 Eluenten, von ternären bzw. quaternären Gradienten. 1.5.8. ardware 1.5.8.1. Pupen Die in der PLC verwendeten Pupen üssen eine konstante und reproduzierbare Fließgeschwindigkeit gewährleisten können. Von der Fließgeschwindigkeit sind die Retentionszeiten der Peaks und dait die Reproduzierbarkeit der Messung abhängig. 70
1.5.8.2. Die Injektionseinheit Für die Probenaufgabe werden praktisch nur noch Dosierschleifen (z.b. in 6-Port-Ventilen) oder davon abgeleitete Ventile verwendet (siehe Vorlesung). Moderne PLC-Anlagen sind fast ausschließlich it einer autoatischen Probengeber-Einheit ausgestattet. Die Vorteile liegen vor alle in der außerordentlichen Reproduzierbarkeit und Präzision des Einspritzvorganges. 1.5.8.3. Detektoren Der a häufigsten eingesetzte Detektor ist der photoetrische Detektor. Es gelten die Gesetze der Photoetrie (Labert-Beer etc.). Die Durchflusszelle wird als Küvette angesehen. Die gängigsten Lichtquellen sind die Deuteriulape (UV-Bereich) bzw. die Wolfra Lape (VIS-Bereich). Aber auch andere Detektoren sind weit verbreitet. In der klinischen und pharazeutischen Analytik ist dies der elektrocheische Detektor. ier wird eine Spannung von z.b. 50 500 V angelegt und der Stro geessen (einige icro- oder nano-apere), der als Folge der elektrocheischen Oxidation oder Reduktion des Analyten fließt. Er ist proportional zur Konzentration des Analyten. Fluoreszenz-Detektoren bestechen durch unerreichte Nachweisstärke, vor alle bei Laser-Anregung der Fluoreszenz. Sie können aber nur auf fluoreszierende Substanzen angewendet werden. Die Detektion über den Brechungs-Index (RI) bei Analyten, die schlecht oder gar nicht absorbieren, nicht oxidierbar oder reduzierbar sind, und auch nicht fluoreszieren (z.b. Fette, organische Polyere und Weichacher, Polyalkohole wie Zucker, Sorbit vieler Kauguis etc.) ist leider wenig nachweisstark, zude sehr teperaturepfindlich und nicht für Gradientenelution geeignet. Organische Ionen wiederu können idealerweise it eine Leitfähigkeits-Detektor nachgewiesen werden. Die folgende Tabelle beschreibt häufig eingesetzte PLC-Detektoren. Detektor Anwendung Nachweisgrenze Linearität UV/VIS selektiv für UV-aktive ca. 0,3 ng/l 1 x 10 4 DAD (Diodenarray-Detektor); Analyte (190-950 n) RI (refractive index detector = Analyte it unterschiedliche ca. 0,7 μg/l 3 x 10 3 Brechungs-Index-Detektor) Brechungsindex zu Eluenten (teperaturabhängig, keine Gradientenelution, wenig epfindlich) FLD (Fluoreszenz-Detektor, selektiv nur für fluoreszierende 0,2 pg/l (!) 10 3-10 4 auch it Laser-Anregung) Analyte ECD (elektrocheischer selektiv, nur für oxidierbare oder ca. 1,0 pg/l (!) - Detektor) reduzierbare Analyte CD (Leitfähigkeitsdetektor) Ionen a) ca. 10 5 a) kann bis zu ca. 0,2% Unterschied in der Leitfähigkeit nachweisen. Frage: Welche Gruppen von (bio)organischen Verbindungen liegen bei p 7.0 als Ionen vor und können soit it de Leitfähigkeitsdetektor nachgewiesen werden? Antwort: Ainosäuren, Proteine, DNA/RNA; Fettsäuren, alle Carbonsäuren. Nicht ionisch sind hingegen: Zucker, Fette, Alkohole, etc. 71
1.6. Die Gas-Chroatographie (GC) 1.6.1. Was bedeutet GC? Unter de Begriff der Gas-Chroatographie (GC) werden physikalisch-cheische Trennethoden zusaengefasst, bei denen, eine Stoffenge durch Verteilung zwischen einer ruhenden ("stationären") und einer sich bewegenden ("obilen") Phase erfolgt. Ein GC-Syste besteht also wiederu aus zwei nicht iteinander ischbaren Phasen, von denen die eine sich an der anderen vorbeibewegt. Die GC ufasst alle chroatographischen Methoden, bei denen die obile Phase ein Gas ist. Bei der Flüssig-Chroatographie (LC) ist an der Selektivität des chroatographischen Systes sowohl die stationäre als auch die obile Phase beteiligt. Bei der GC wird die Selektivität ausschließlich durch der stationären Phase bestit. I Gegensatz zur LC, die eine allgeein anwendbare und schonende Methode zur Analyse unbekannter gelöster Substanzgeische darstellt, beschränkt sich die GC auf Substanzen, die i Wesentlichen unzersetzt in den Gaszustand überführt werden können. Rechts: GC einer Mischung aliphatischer Kohlenwasserstoffe. Die Zeitskala verläuft von rechts nach links. Derartig wirksae und schnelle Trennungen von Flüssigkeitsgeischen waren vor der Erfindung der GC-Analytik (Anfänge 1943 1947; Nobelpreis 1946) undenkbar. Luft n-eptan Isooctan Cyclohexan 2,4-Diethyl-pentan n-exan 3-Methylpentan 2,3-Diethyl-butan n-pentan Isopentan 40 30 20 10 0 Retentionszeit in in 1.6.2. Wann und wo wird die GC angewendet? Notwendige Voraussetzung für eine Untersuchung ittels GC ist ein ausreichender Dapfdruck des Analyten bei höchstöglicher Arbeits-(Injektions)teperatur, die jedoch noch unterhalb der Zersetzungsteperatur der Substanz liegen uss (ca. 250-300 C). Ist diese Voraussetzung gegeben, kann die GC eingesetzt werden zur Analyse von: * Gasen (Injektion z.b. ittels Gasschleifen) * Flüssigkeiten (Injektion ittels Mikroliterspritzen bzw. Autosaplern) * Feststoffen (Injektion als Lösung oder it Feststoffdosiersyste) Da it der Gaschroatographie, ähnlich wie bei der PLC, eine sehr selektive und vollständige Trennung von Stoffgeischen öglich ist, ergeben sich vielfältigste Anwendungsgebiete: * Qualitative Analyse (Substanzidentifizierung) * Quantitative Analyse (Konzentrationsbestiung vieler Koponenten gleichzeitig) * Reinheits- und Produktkontrolle cheischer Substanzen Typische Beispiele: 72
* Analytik von Arzneistoffen * Analytik von Parfus * Analytik von alkohol. Getränken * Analytik von eiz- und Treibstoffen * Analytik von Autoabgasen * Analytik von Luftschadstoffen * u.v.a. 1.6.3. Wie wird die GC durchgeführt? Eine GC-Trennung wird in folgenden, kontinuierlich nacheinander ablaufenden Teilschritten durchgeführt. Zunächst wird das Gas bzw. die verdapfbare Substanz über einen Injektor in eine Trennsäule gegeben. Dort werden die Analyte it ilfe eines Trägergases (z.b. e od. 2 ) durch die therostatisierte Säule transportiert, wo der eigentliche Trennvorgang stattfindet. Rechts: Scheatische Darstellung einer GC-Anlage. Die getrennten Analyte passieren dann nacheinander einen geeigneten Detektor, der jeden einzelnen Bestandteil anzeigt. Der Detektor ist an einen Rechner angeschlossen, die die erzeugten Chroatograe aufzeichnet und auswertet. Der GC setzt sich also i Wesentlichen zusaen aus Probenaufgabeeinheit, Pneuatik, Ofen it Teperatursteuerung, Trennsäule und Detektor. Detektor (FID oder WLD) 1.6.4. Die stationäre Phase in der GC In der GC werden als stationäre Phasen entweder adsorbierende Festkörper oder adsorbierende Flüssigkeiten eingesetzt. Man unterscheidet daher grundsätzlich zwischen zwei Säulentypen: * Gepackte Säulen (packed coluns): Diese bestehen aus eine Glas- oder Metallrohr (2-4 Innendurchesser, Länge: 0.5 4 ), das it eine Säulenaterial gefüllt ist. Als stationäre Phasen werden hierbei entweder feste Adsorbentien oder Trennflüssigkeiten, die auf eine Träger (z.b. Kieselgur) aufgebracht sind, verwendet. Feste Adsorbentien werden häufig eingesetzt bei der Bestiung von Gasen oder kleinen organischen Molekülen. Als Adsorbentien dienen hierbei u.a. z.b. Silicagel, Al 2 O 3 oder Aktivkohle. * Kapillarsäulen (open tubular coluns): bestehen aus langen (ca. 30 100 ) und sehr dünnen (0,1-0,5 ) Glas- oder Quarzröhren. Bei den Kapillarsäulen werden als stationäre Phasen sehr häufig Silikonöle und Polyethylenglycole eingesetzt. Bei den Silikonölen (Polysiloxanen) hängt die Polarität von der Zusaensetzung ab: Die Kapillarenwand ist in der Regel aus synthetische Quarz (engl. fused silica ) hergestellt und auf der Innenseite it der Trennflüssigkeit beschichtet. Bei Kapillaren it 0.2 Innendurchesser liegen die Schichtdicken der Trennflüssigkeit (Fil) bei 0.1 0.8 μ. Bei Kapillaren it größere Innendurchesser beträgt die Schichtdicke bis zu 5 μ. Je größer die Schichtdicke der Trennflüssigkeit ist, desto größer ist zwar die Beladbarkeit (Kapazität) der Säule, je geringer ist aber auch ihre Trennleistung (waru?) 73
Rechts: Querschnittsansicht einer gepackten GC-Säule (Ausschnitt rechts) i Vergleich zu einer odernen Dünnfil-GC- Kapillarsäule. Der aufgebrachte Fil ist gelb dargestellt. Da it Kapillarsäulen außerordentlich hohe Auflösungen erzielt werden, spricht an hier auch von sog. RGC (igh Resolution GC). Die folgende Tabelle gibt eine Übersicht über häufig eingesetzte GC-Säulen. In der odernen Kapillar- Gaschroatographie werden fast ausschließlich Säulen vo WCOT-Typ eingesetzt. Kenngröße konventionelle, gepackte Säule Dünnfil Kapillarsäulen Säulenlänge (ca.) 0,5-4 30 100 Säulendurchesser (ID) 2-4 0,1-0,5 Säulenaterial Glas, Edelstahl Synthetischer Quarz (fused silica) Stationäre Phase SiO 2, Al 2 O 3, Aktivkohle bzw. auf z.b. Diatoeenerde* (SiO 2 ) aufgebrachte dünne Trennflüssigkeiten Belastung it Probe groß (1 g)* klein (< 1 g)* Trägergasgeschwindigkeit 60 L/in* 1 L/in* Anzahl der theoret. 3.000* 150.000* Böden N Z Bodenhöhe 0,7 * ca. 0,3 * Quelle: http://www.analytik.ethz.ch/praktika/phys_anal/gc/gcskript2011.pdf sehr dünner Fil (0,1-0,8 u) aus z.b. Polydiethylsiloxanen auf Innenseite der Kapillarwand 1.6.5. Die obile Phase (Trägergas) in der GC Als Trägergas wird in den eisten Fällen eliu bzw. Wasserstoff verwendet. Die Trägergase üssen von besonderer Reinheit sein. Von der obilen Phase wird außerde gefordert, dass sie bei hohen Teperaturen weder it den Analyten noch it de Trägeraterial (d. h. it de stationären Flüssigkeitsfil) reagiert. Bei der isotheralen GC wird die Säulenteperatur während der Trennung konstant gehalten. Bei der teperatur-prograierten GC wird die Säulenteperatur während der Trennung linear it der Zeit verändert. 1.6.6. ardware 1.6.6.1. Die Injektionseinheit Der Injektor dient zur Einbringung der Probe in das Trennsyste. Wichtig dabei ist, dass bei Einspritzvorgang eine öglichst schale Startbande produziert wird, d.h. dass die Probe auf öglichst 74