Die automatische Pipette Die Pipette ist wohl das wichtigste Werkzeug bei der Laborarbeit. Ständig müssen kleine bzw. kleinste Flüssigkeitsvolumina im ml- bzw. μl-bereich dosiert werden. Dabei sind die verstellbaren Automatikpipetten ein geniales Hilfsmittel. Jede dieser Pipetten ist ein Präzisionsinstrument. Der Preis einer Pipette beträgt über 300,-. Im Umgang mit den Pipetten ist also Sorgfalt oberstes Gebot! Die Auswahl der richtigen Pipette Je nach dem Volumen, das pipettiert werden soll, muss die Auswahl der passenden Pipette erfolgen. Für große Volumina nimmt man eine größere Pipette, für kleinere Volumina eine kleinere. Es wäre theoretisch möglich, mit einer 1000 μl-pipette ein Volumen von 50 μl zu transferieren. Das macht aber keinen Sinn, weil großvolumige Pipetten bei sehr kleinen Volumina ungenau sind. Der Volumenbereich, für den eine Pipette geeignet ist, steht oben auf der Pipette aufgedruckt. Die korrekte Benutzung einer Pipette: Flüssigkeitsabgabe: Flüssigkeitsaufnahme: - Vor dem Pipettieren je nach Volumen die richtige Pipette auswählen. - Durch Drehen des Einstellringes wird das gewünschte Volumen eingestellt dabei werden die Ziffern der Anzeige von oben nach unten abgelesen. - Passende Pipettenspitze (blau oder gelb _ Farbcode der Pipette beachten) aufstecken. - Bedienknopf bis zum ersten Anschlag drücken (Messhub). - Pipettenspitze senkrecht ca. 3-5 mm in die Flüssigkeit eintauchen. - Bedienknopf langsam zurück gleiten lassen. - Spitze langsam aus der Flüssigkeit ziehen. - Spitze schräg an die Gefäßwandung anlegen. - Bedienknopf langsam bis zum ersten Anschlag drücken. - Bedienknopf zur vollständigen Entleerung der Spitze bis zum zweiten Anschlag durchdrücken. - Bedienknopf gedrückt halten und Spitze an der Gefäßwand hochziehen. - Bedienknopf langsam zurück gleiten lassen. Fakultatives Material 1
Achtung! Pipetten dürfen NIEMALS mit gefüllter Spitze abgelegt werden, weil sonst Flüssigkeit in den Kolben hineinlaufen kann. Deshalb Pipetten grundsätzlich in den Ständer stellen und nie auf den Tisch legen!!! Um Verschleiß und Korrosion zu verhindern, dürfen mit Automatikpipetten niemals konzentrierte oder leicht flüchtige Lösungen pipettiert werden!!! Kontroll: Kontrollieren Sie Ihre Pipetten regelmäßig auf ihre Genauigkeit. Pipettieren Sie dazu reines Wasser mit einem eingestellten Volumen mehrfach auf eine Analysenwaage. Zeigt die Analysenwaage das entsprechende Gewicht (Dichte von Wasser bei Raumtemperatur: 1g/ml), so arbeitet Ihre Pipette präzise. Die Mikrozentrifuge Im Labor verwendet man eine Mikrozentrifuge, um Feststoffe (z. B. Bakterien) zu sedimentieren, d. h. sie von einer Flüssigkeit zu trennen, oder um Flüssigkeiten am Boden eines Mikroreaktionsgefäßes zu sammeln (z. B. nach dem Mixen mit dem Vortexer). Eine Mikrozentrifuge kann Drehzahlen von bis zu 14000 min-1 erreichen, wobei immense Beschleunigungskräfte auf das zentrifugierte Material einwirken. Oft wird die benötigte Zentrifugalkraft in Vielfachen der Erdbeschleunigung angegeben (z. B. 1000 G = 1000 x 9,81 m/s²). Diese Beschleunigungswerte lassen sich mit folgender Formel leicht in die jeweils benötigte Drehzahl umrechnen: Umgekehrt kann man natürlich auch die relative Zentrifugalkraft (RZK) berechnen: Auch bei der Benutzung der Zentrifuge sind einige Sicherheitsregeln zu beachten: - Reaktionsgefäße in der Zentrifuge müssen immer verschlossen sein. - Vor dem Einschalten der Zentrifuge ist immer der Deckel auf den Rotor zu setzen. - Die Zentrifuge muss immer austariert sein, d. h. es müssen immer zwei Fakultatives Material 2
Gefäße mit gleichem Gewicht genau gegenüber liegend eingesetzt werden - Will man nur eine Probe zentrifugieren, so ist als Gegengewicht ein Gefäß mit der entsprechenden Menge Wasser zu verwenden. Der Labormixer oder Vortexer Der Vortexer ist ein Gerät, mit dem Substanzen in Reagenzgläsern oder Mikroreaktionsgefäßen schnell und einfach durchmischt werden können. Normalerweise gibt es einen Automatik-Modus, der dafür sorgt, dass das Gerät beim Aufdrücken eines Gefäßes auf den Mischeraufsatz automatisch zu oszillieren beginnt. Zwei Dinge sind beim Umgang mit dem Vortexer sehr wichtig: - Es dürfen nur geschlossene Gefäße zum Mixen verwendet werden. - Die Gefäße müssen sehr gut festgehalten werden. Bunsenbrenner Der Bunsenbrenner wird im chemischen Labor häufig zum Erhitzen von Stoffproben oder Flüssigkeiten benutzt, Der Bunsenbrenner ist nach Robert Wilhelm Bunsen benannt (Robert Wilhelm Eberhard Bunsen ( 1811 in Göttingen; 1899 in Heidelberg) war ein deutscher Chemiker. Er entwickelte zusammen mit Gustav Robert Kirchhoff die Spektralanalyse, mit deren Hilfe chemische Elemente hochspezifisch nachgewiesen werden können. Er perfektionierte den nach ihm benannten Bunsenbrenner in Heidelberg., die ursprüngliche Erfindung stammt allerdings von Michael Faraday und wurde von Peter Desaga, dem Laborassistenten Bunsens entscheidend verbessert.) Der Brenner steht auf einem schweren Fuß, Senkrecht dazu ist eine Röhre angeordnet Am oberen Ende der Röhre wird das Gas gezündet und verbrannt. Die Flammenhitze kann zwischen 350 und etwa 1000 C reguliert werden. Die Flamme wird in Kern, Mantel und den fast unsichtbaren Flammensaum unterteilt. Im Kern herrscht eine Temperatur von etwa 250 550 C, Mantel (je nach Quelle zwischen 1000 C und 1200 C) und Saum (etwa 900 C) sind dagegen bedeutend heißer Durch den Bunsenbrenner werden zwei verschiedene Flammenarten unterschieden, die Sparflamme und leuchtende, die nichtleuchtende (entleuchtete) bzw. rauschende Flamme. Fakultatives Material 3
Grundprinzip Praktikum: Einleitung zu den technischen Geräten Gelelektrophorese Die Gelelektrophorese ist ein Elektrophorese-Verfahren, bei dem ein Gel als Trägermedium genutzt wird. Am häufigsten werden durch Gelelektrophorese Gemische von Proteinen, DNA oder RNA aufgetrennt. Die elektrophoretische Trennung wird durch die im Gel vorhanden Poren erreicht, die wie ein Sieb wirken und deren Größe die Wanderungsgeschwindigkeit der im Gel befindlichen Moleküle bestimmen. Die Porengröße des Gels wird durch die Konzentration des Gels festgelegt. Ein elektrisches Feld wird verwendet um die geladene Moleküle durch die Gelmatrix zu ziehen wobei die kleineren Moleküle sich schneller durch das Gel bewegen können. DNA-Gelektrophorese Die DNA-Gelelektrophorese dient der Auftrennung von DNA-Molekülen unterschiedlicher Größe und Konfiguration. Unter Elektrophorese versteht man die Bewegung geladener Teilchen in einem Medium unter Einfluß eines elektrischen Felds. Ein solches elektrisches Feld wird durch Anlegen von Spannung an ein Elektrolyt, also den Elektrophoresepuffer, erzeugt. Aufgrund der durch die Phosphatreste vermittelten negativen Ladung der DNA bewegt sich diese in einem elektrischen Feld von der Kathode zur Anode. Da auch DNA-Moleküle unterschiedlicher Größe die gleiche Ladungsdichte aufweisen, würden sie in freier Lösung in einem elektrischen Feld gleich schnell laufen. Um eine Auftrennung verschiedener DNA- Moleküle zu erreichen, wird die Elektrophorese in porösen Matrizen durchgeführt, die als Molekularsiebe dienen. Sie bestehen hier aus Agarose und Bei Agarose handelt es sich um ein Polymer aus Galactose. Die Porengröße wird durch die Agarosekonzentration variiert (0,3 2 %), wobei die Porengröße mit steigender Konzentration sinkt. In diesem Konzentrationsbereich der Agarose können DNA-Fragmente von ca. 70 bp bis zu etwa 50 kbp[1] aufgetrennt werden. Polyacrylamid (PAA). PAA wird aus einem Gemisch aus Acrylamid und N,N -Methylendiacrylamid, in dem die Moleküle miteinander vernetzt sind, hergestellt. Die Porengröße wird durch die PAA-Konzentration (3 20 %) und den Vernetzungsgrad bestimmt. Die Auftrennung erfolgt abhängig von der PAA-Konzentration in einem Bereich von 1 bis ca. 1.000 bp. Die Wahl der Matrizen ist bei der Gelelektrophorese abhängig von der Größe der DNA-Fragmente, die aufgetrennt werden sollen. Vor der elektrophoretischen Auftrennung von DNA wird diese mit einem sog. Farbmarker (Färbemittel) versetzt. Hierbei kommen Bromphenolblau und Xylencyanol zum Einsatz. Beide sind blaue Farbstoffe, deren Laufverhalten in Gelen unterschiedlicher Porengröße bekannt ist: Während Bromphenolblau in einem 1 %igen Agarosegel wie DNA- Fragmente von etwa 600 bp Länge wandert, wandert Xylencyanol unter gleichen Voraussetzungen ca. 3.000 bp weit. Sie dienen während des Gellaufs als Anhaltspunkt, wie weit die DNA-Fragmente in einem Gel bereits aufgetrennt sind. Fakultatives Material 4
Neben dem Farbstoff und der DNA wird noch Glycerin in die Proben gegeben. Es hat eine höhere Dichte als Wasser, so daß die DNA-Probe schwerer ist als der Elektrophoresepuffer und beim Beladen des Gels in die Taschen absinkt. Bei der Elektrophorese erfolgt also eine Auftrennung der DNA-Moleküle nach ihrer Länge in Basenpaaren. Nach der elektrophoretischen Auftrennung wird die DNA in der Gelmatrix optisch nachgewiesen. Die DNA-Färbung erfolgt mit Ethidiumbromid (EtBr) oder mit GelRed, welche aufgrund ihrer planaren Struktur zwischen den Basen der DNA interkaliert. Bei Bestrahlung mit UV- Licht fluoresziert Ethidiumbromid und GelRed im sichtbaren Bereich rosa bis lila. Anode Kathode Tank Gel Elektrophoresepuffer http://www.biostudies.de/ http://www.uni-protokolle.de/ http://commons.wikimedia.org/ http://chsweb.lr.k12.nj.us/ Fakultatives Material Fakultatives Material 5