Proteine in wässriger Lösung Struktur von Proteinen in wässriger Lösung: außen hydrophobe Bereiche, im Inneren hydrophobe Bereiche, hydrophobic collapse
Proteine in wässriger Lösung - + + - Hydrathülle (fest gebunden) + - + hydrophober Kern hydrophile Oberfläche H-Brücken, ionische Wechselwirkungen H-Brücken, hydrohobe Wechselwirkungen
entfaltete Peptidkette: hydrophobe Bereiche exponiert hydrophobe Region gefaltete Peptidkette: hydrophobe Bereiche im Inneren
Clustering Nur die Lipidmoleküle an der Seite erzwingen eine höhere Ordnung Dispersion von Lipiden in Wasser jedes Lipid-Molekül zwingt die Wassermoleküle, einen höheren Ordnungszustand einzunehmen
Proteine in wässriger Lösung Struktur von Proteinen in wässriger Lösung: außen hydrophobe Bereiche, im Inneren hydrophobe Bereiche, hydrophobic collapse Denaturieren Übergang zur random coil Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten
Denaturieren von Proteinen entfalten hydrophobe und hydrophile Bereiche exponiert random coil Aggregation über hydrophobe Bereiche Stabilisierung von Monomeren durch Lösungsmittel/ Zusatz von Additiven, die mit hydrophoben Oberflächen energetisch günstige Wechelwirkungen eingehen können
hydrophobe Region Bereich mit einer geordneten Wasserstruktur gefaltete Peptidkette: hydrophobe Bereiche im Inneren entfaltete Peptidkette: hydrophobe Bereiche exponiert Aggregation über hydrophobe Bereiche
Denaturieren von Proteinen Übergang zur random coil Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten Methoden zur Stabilisierung der hydrophoben Bereiche: Hitze, Säure (führt meist zur Aggregation) Harnstoff, Guanidin-Hydrochlorid (für wasserlösliche Proteine) Detergenzien, vor allem SDS (auch für die meisten Membranproteine geeignet Bei extrazellulären Proteinen müssen Disulfidbrücken reduziert werden, damit eine vollständige Denaturierung möglich ist (gängige Reduktionsmittel: Mercaptoethanol, DTT); Die SH-Gruppen müssen blockiert werden, um zu verhindern, dass bei der Reoxidation mit O 2 intermolekulare Disulfidbrücken ausgebildet werden ( Aggregation); gängige Blockierungsagenzien: Iodacetamid, Iodacetat
wichtige Detergenzien SDS (Natrium-dodecylsulfat) Na O O S O CH 3 O Triton X-100 CH 3 CH 3 HO O O O C C CH 3 n CH 3 CH 3
Denaturieren von Proteinen Übergang zur random coil Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten Methoden zur Stabilisierung der hydrophoben Bereiche: Hitze, Säure (führt meist zur Aggregation) Harnstoff, Guanidin-Hydrochlorid (für wasserlösliche Proteine) Detergenzien, vor allem SDS (auch für die meisten Membranproteine geeignet Bei extrazellulären Proteinen müssen Disulfidbrücken reduziert werden, damit eine vollständige Denaturierung möglich ist (gängige Reduktionsmittel: Mercaptoethanol, DTT); Die SH-Gruppen müssen blockiert werden, um zu verhindern, dass bei der Reoxidation mit O 2 intermolekulare Disulfidbrücken ausgebildet werden ( Aggregation); gängige Blockierungsagenzien: Iodacetamid, Iodacetat
Harnstoff, Mercaptoethanol
Proteine in wässriger Lösung Struktur von Proteinen in wässriger Lösung: außen hydrophobe Bereiche, im Inneren hydrophobe Bereiche, hydrophobic collapse Denaturieren Übergang zur random coil Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten Methoden: Hitze, Säure (führt meist zur Aggregation) Harnstoff, Guanidin-Hydrochlorid (für wasserlösliche Proteine) Detergenzien, vor allem SDS (auch für die meisten Membranproteine geeignet Aussalzen: Konkurrenz von Proteinen und Salzen um Wasser, nicht alle Salze sind gleich gut geeignet (Hofmeister Serie) Einsalzen durch niedrigere Salzkonzentrationen
Hofmeister-Serie Klassifizierung von Ionen in der Reihenfolge ihrer Fähigkeit, Proteine auszusalzen (bzw. in Lösung zu halten) Aussalzen 4 2-2 4-3 - - - - SO > H PO > CH COO > Cl > Br > I > ClO > SCN 4 - - NH + > K + > Na + > Li + 4 > Mg 2+ > Ca 2+ > Guanidinium Löslichkeit Destabilisierung der Tertiärstruktur
Wirkung von Additiven auf die Hydrathülle von Proteinen Eindringen in die Hydrathülle Wechselwirkung mit Proteinen Wasser Additiv Aussschluss aus Hydrathülle ungestörte Wechselwirkung zwischen Protein und Hydrathülle nach Creighton