Aus dem Institut für Pathologie an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil - Universitätsklinik - der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. K.- M. Müller Präneoplasien Pulmonaler Adenokarzinome Morphologische und immunhistochemische Befunde Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität zu Bochum vorgelegt von Annette Segeth aus Münster 2002
Dekan: Referent: Prof. Dr. med. G. Muhr Prof. Dr. med. K.-M. Müller Korreferent: Prof. Dr. med... Tag der mündlichen Prüfung:
Meinen Großeltern Frau Martha Segeth und Herrn Dr. Karl-Ernst Schulte Für ihr Vorbild
Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1 1.1 Allgemeine Einleitung 1 1.2 Charakterisierung präneoplastischer Epithelanomalien 2 1.2.1 Kuboide Metaplasie 2 1.2.2 Atypische Adenomatöse Hyperplasie (AAH) 5 1.2.3 Tumorlets 11 1.2.4 Bronchiolisation 14 1.3 Beschreibung der eingesetzten Tumormarker 16 1.3.1 PCNA 16 1.3.2 MiB1 17 1.3.3 P53 18 1.3.4 ErbB2 20 1.4 Normale Lungenhistologie 20 1.5 Lungentumoren 22 1.6 Fibrose 24 1.7 Tumorgenesetheorien 26 1.7.1 Sequentielle Entwicklung von Tumoren 26 1.7.2 Genetik 27 1.7.3 Field Canzerisation 27 1.7.4 Scar Cancer Narbenkrebs 28 1.8 Ziele der Arbeit 30 2 MATERIAL UND METHODEN 31 3 ERGEBNISSE 34 3.1 Präparatbeschreibungen 34 3.1.1 Beschreibung aller Präparate mit Tabelle 34 3.1.2 Auswertung der histopathologischen Befunde 36
3.1.2.1 E 3363/95-3H 36 3.1.2.2 E 7906/98-1H 37 3.1.2.3 E 25292/94 39 3.1.2.4 E 4501/95-4 40 3.1.2.5 E 19872/94 41 3.1.2.6 E 23779/94-2 42 3.1.2.7 E 3515/98-1g 43 3.1.2.8 S 28/96 rechts 46 3.1.2.9 S 35/96 47 3.1.2.10 S 282/96 S10 links 48 3.1.2.11 S 311/96 Spitze links 49 3.1.2.12 Wi 70/98 50 3.1.2.13 E 13906/98 52 3.1.2.14 S 215/96 Ml rechts 53 3.1.2.15 Wi 2155/97 54 3.1.2.16 Wi 2855/95 55 3.1.2.17 Wi 1777/97 56 3.1.2.18 Wi 1431/96 57 3.1.2.19 Wi 1893/98-4 58 3.1.2.20 E 21362/98 59 3.1.2.21 Wi 1367/98 61 3.1.3 Auswertung der histopathologischen Befunde 62 3.2 Ergebnisteil Immunhistochemische Befunde 64 3.2.1 Prozentualer Anteil der untersuchten Präparate mit fibrosierenden Lungenerkrankungen oder Adenokarzinomen, welche die Epithelveränderungen aufweisen 65 3.2.2 Vergleich der einzelnen immunhistochemischen Färbemethoden 66 3.2.3 Prozentuale Anzahl der für p53 und erbb2 positiven Epithelveränderungen in den untersuchten Tumorpräparaten 69 3.2.4 Korrelation der gruppenweise ermittelten Färbeindizes der Epithelveränderungen 74 3.2.4.1 Korrelation der Färbeindizes der Epithelanomalien in den vier analysierten Gruppen ohne Berücksichtigung der Grunderkrankung des Patienten (Mittelwert Gesamt) 76
3.2.4.2 Korrelation der Färbeindizes der vier untersuchten Gruppen von Epithelanomalien ausschließlich für Epithelläsionen in Präparaten mit Adenokarzinomen als Grunderkrankung ( Mittelwert Karzinom ) 80 3.2.4.3 Korrelation der Färbeindizes der vier untersuchten Gruppen von Epithelanomalien ausschließlich für Epithelläsionen in Präparaten mit interstitiellen Lungenerkrankungen ( Mittelwerte Fibrose ) 85 3.2.5 Analytische Auswertung der Befunde der Färbeindizes von Epithelalterationen im Vergleich von Präparaten mit fibrosierenden Lungenerkrankungen oder Adenokarzinomen 89 4 DISKUSSION 95 4.1 Inzidenz der ermittelten Epithelläsionen 96 4.1.1 Inzidenz präneoplastischer epithelialer Läsionen bei Adenokarzinomen 96 4.1.2 Inzidenz epithelialer Alterationen der bronchioloalveolären Endstrecke bei fibrosierenden Lungenerkrankungen 98 4.1.3 Vergleich der Inzidenz der untersuchten Epithelläsionen abhängig von der zugrundeliegenden Lungenerkrankung 99 4.2 Immunhistochemische Ergebnisse 101 4.2.1 Wertigkeit der verwandten Marker im Rahmen der Diagnostik von (Prä-) Neoplasien 101 4.2.2 Prozentuale Anzahl der für p53 und erbb2 positiven Epithelveränderungen in den untersuchten Tumorpräparaten 103 4.2.3 Korrelation der Färbeindizes 109 4.2.3.1 Mittelwert Karzinom-Verhältnis der Epithelalterationen in Karzinomen 110 4.2.3.1.1 Kuboide Hyperplasie 110 4.2.3.1.2 Atypische Adenomatöse Hyperplasie 110 4.2.3.1.3 Bronchioloalveoläre Tumorlets 111 4.2.3.1.4 Bronchiolisation 112 4.2.3.1.5 Vergleich der Epithelalterationen 114 4.2.3.2 Mittelwert Fibrose- Verhältnis der Epithelaltertionen in Fibrosen 118 4.2.3.3 Mittelwert Gesamt- Verhältnis der Epithelalterationen untereinander 119 4.2.4 Vergleich von Präparaten mit fibrosierenden Lungenerkrankungen und Karzinomen 121
4.3 Einordnung der histomorphologischen Ergebnisse 122 4.4 Einordnung der Befunde in die Konzepte der Karzinomentstehung 124 4.4.1 Sequentielle Karzinomentstehung 124 4.4.2 Theorie der Field Cancerisation 125 4.4.3 Narbenkrebs 126 5 ZUSAMMENFASSUNG 128 6 LITERATURVERZEICHNIS 131 7 DANKSAGUNG 145 8 LEBENSLAUF 146 9 ANHANG 147 1O VERZEICHNIS DER TABELLEN UND ABBILBUNGEN 161
Abkürzungsverzeichnis Abkürzung AAH B TL KH AC BAC SQC SCC LCC ASC CA F OP PE Bedeutung Atypische Adenomatöse Hyperplasie Bronchiolisation Tumorlet Kuboide Hyperplasie Adenokarzinom der Lunge Bronchioloalveoläres Karzinom der Lunge Plattenepithelkarzinom der Lunge Kleinzelliges Bronchialkarzinom Großzelliges Karzinom Adenosquamöses Karzinom Karzinom Fibrose Operationspräparat Probeexzision
1 EINLEITUNG 1.1 Allgemeine Einleitung Karzinome der Lunge gehören nach wie vor zu den führenden Ursachen für Krebstodesfälle in der Welt, wobei die 5 Jahres-Überlebensraten nach Diagnose mit etwa 10% ernüchternd sind (PARKIN et al, 1993, PARKER et al, 1996). Besonders das Interesse an der Gruppe der Adenokarzinome der Lunge, der Untereinheit der pulmonalen Malignome mit der größten Metastasierungsfrequenz und einem Überwiegen an Erkrankungen von Frauen hat zugenommen. Die Inzidenz der Adenokarzinome in Relation zu anderen Subtypen der Nicht- Kleinzelligen-Bronchialkarzinome (NSCLC) steigt in den letzen Jahren an (VALAITIS et al, 1981; SHIMOSATO et al, 1993; WU et al, 1997). Trotz Häufigkeitsangaben für diesen Karzinomtyp zwischen 18 und 40% der NSCLC, die denen der Plattenepithelkarzinome mit 31 bis 45% vergleichbar sind (MÜLLER et al, 1993), ist die Histopathogenese der Adenokarzinome noch wesentlich unklarer als bei den letzteren mit ihrer morphologisch relativ klar definierbaren Entwicklung von der Meta- über die Dysplasie und das Carcinoma in situ hin zum manifesten Tumor. Vermutungen über eine der Adenom-Karzinom-Sequenz im Kolon vergleichbare Entwicklung im Bereich der bronchioloalveolären Endstrecke liegen nahe (MILLER et al, 1988). Im Tierexperiment beobachteten MONOBE und MANABE 1995 kontinuierliche Veränderungen der Epithelarchitektur in diesem Bereich von der Hyperplasie über atypische hyperplastische Epithelstrukturen bis hin zum Karzinom. Die Schlußfolgerung aus ihren Untersuchungen, daß die bisher als hyperplastisch angesehenen Veränderungen durchaus schon Neoplasie Charakter besitzen und auch ohne den Nachweis zellulärer Atypien eine frühe Form der Malignität darstellen könnten, eröffnet für die pathologisch-anatomische Frühdiagnose von Adenokarzinomen der Lunge beim Menschen neue Aspekte (MONOBE et al, 1994; MONOBE und MANABE, 1995). 1
1.2 Charakterisierung präneoplastischer Epithelanomalien 1.2.1 Kuboide Metaplasie Unter Metaplasie versteht man per definitionem die reversible Umwandlung eines differenzierten Gewebes in ein anderes differenziertes Gewebe ähnlicher Bauart. Bei der kuboiden Metaplasie handelt es sich um das morphologische Substrat einer Regeneration bronchioloalveolärer Epithelien als unspezifische Reaktion auf verschiedene diffuse alveoläre Schäden. Es kommt hierbei zu einer Nekrose der Typ I Pneumozyten und darauf folgend zu einer regenerativen Proliferation der Typ II Pneumozyten zu pflastersteinähnlichen Zellverbänden. Da es sich folglich bei dem Prozeß der kuboiden Metaplasie eher um einen Gewebsersatz, als um die Umwandlung eines Gewebes in ein anderes handelt, erscheint der Begriff der Kuboiden Hyperplasie, wie er auch von vielen Autoren genutzt wird, als treffender und soll im Folgenden Verwendung finden. Häufig findet sich die alveoläre epitheliale Hyperplasie in Lungen von Patienten mit diffuser interstitieller Fibrose (NAKANISHI, 1990). Zu diesem Begriff für die Beschreibung von morphologischen Veränderungen der bronchioloalveolären Endstrecke gibt es Synonyme. So benennen z.b. MORI et al (1996) eine nicht-neoplastische reaktive Veränderung der bronchioloalveolären Zellen als adenomatöse Hyperplasie. STERNER et al (1997) definieren ihre nicht atypische Alveolarzellhyperplasie wie folgt: 1. eine einzelne Reihe von kubischen Zellen entlang der Alveolarwand, deren morphologische Kennzeichen von denen des normalen bronchioloalveolären Epithels abweichen 2. Fehlen von Entzündungszeichen 2
YOKOZAKI et al (1996) unterteilt die Kuboide Hyperplasie in zwei Bereiche, die wie folgt definiert werden: 1. Adenomatöse Hyperplasie (AH) mit kubischen oder niedrig zylindrischen Zellen mit wenig oder keiner Atypie entlang der Alveolarsepten mit gut definierten Grenzen 2. Typ II Pneumozyten Hyperplasie (HP), die durch kubische proliferierende Zellen mit Infiltration von kleinen Lymphozyten gekennzeichnet ist. Diese Unterteilung erscheint willkürlich, vor allem da die Ergebnisse der Untersuchungen keine signifikanten Unterschiede zwischen diesen beiden Stufen aufzeigen können, weder in der Kerngröße, noch beim Grad der Aneuploidie, die bei beiden nicht vorkommt. Aufgrund der vorliegenden Vielfalt der Begriffsbildung zeichnet sich die Notwendigkeit einer eigenen Definition ab: (siehe Abb.1) Der Begriff der Kuboiden Hyperplasie soll also wie folgt Verwendung finden: 1. Einreihiges kubisches Epithel entlang der bronchioloalveolären Endstrecke, deren Zellen keine atypischen Merkmale aufweisen 2. Abhängigkeit der Benennung allein vom Aspekt der epithelialen Auskleidung, nicht vom Zustand des Interstitiums 3
Abbildung 1: Schematische Darstellung einer Kuboiden Hyperplasie 4
1.2.2 Atypische Adenomatöse Hyperplasie (AAH) Als Atypische Adenomatöse Hyperplasie wird eine kleine Läsion mit klar definierten Grenzen entlang der Alveolarsepten bezeichnet, die eine einheitliche Proliferation von kubischen bis niedrig zylindrischen Zellen, in einer Reihe entlang der Alveolarsepten angeordnet (NAKANISHI, 1990, SUZUKI et al, 1997) zeigt und nicht nur solitär oder multipel in der Lunge, sondern auch in der Nähe und im direkten Zusammenhang mit Adenokarzinomen vorkommt. Etwas weiter geht die WHO in ihrer neuesten histologischen Klassifikation der Lungentumoren und ordnet die AAH bei den präinvasiven Läsionen mit folgender Definition ein: Eine fokale Läsion, häufig fünf Millimeter oder weniger im Durchmesser, innerhalb welcher die beteiligten Alveolen und Bronchioli respiratori von monotonen, geringfügig atypischen kubischen oder niedrig zylindrischen epithelialen Zellen mit dichtem nukleären Chromatin, unauffälligen Nukleoli und wenig Zytoplasma ausgekleidet werden (KITAMURA et al, 1997). Die Zellen ähneln nicht-zilientragenden bronchiolären Zellen (Clara-Zellen) oder Typ II Pneumozyten mit verschieden Graden von Kernhyperchromasie, -vergrößerung und pleomorphie. Mitosen sind selten, und die Zellen weisen eine veränderte Anordnung im Zellverband auf (KODAMA et al, 1986; MORINAGA und SHINOSATO, 1987; NAKAYAMA et al, 1990; OHSHIMA et al, 1994; SMITH et al, 1996; SUZUKI et al, 1997). YOKOZAKI et al (1996) beschreiben hierzu ein Aneinanderrücken der Zellen, allerdings nicht so kompakt wie in Adenokarzinomen. Da es sich bei der AAH um eine mikroskopisch kleine Läsion handelt, wird sie meist inzidentiell in resizierten Lungen entdeckt, bei Patienten mit Adenokarzinomen (MILLER et al, 1988; NAKANISHI, 1990; RAO und FRAIRE, 1995). 5
Im Bezug auf die Struktur der Alveolarsepten, denen diese Läsionen anliegen, besteht Uneinigkeit. Während in manchen Definitionen eine leichte Verdickung der Septen mit milder Infiltration von Entzündungszellen, aber ohne Narbenformationen als konform gesehen, bzw. ein Fehlen einer signifikanten Entzündungsreaktion oder Fibrose gefordert wird, sehen andere Autoren die Struktur des Interstitiums als weniger entscheidend für eine Benennung als AAH oder erklären eine milde interstitielle Fibrose als häufig auftretenden Faktor (NAKANISHI, 1990; MILLER et al, 1990; KITAMURA et al, 1995; SMITH et al, 1996; YOKOZAKI et al, 1996; STERNER et al, 1997; SUZUKI et al, 1997). Auch der direkte Kontakt der Epithelproliferate zum Tumor gilt für NAKANISHI (1990) und SUZUKI et al (1997) als Ausschlußkriterium. Mit der Aufdeckung dieser morphologischen Besonderheiten kam es zunächst zu einer Fülle von verschiedenen Namensgebungen, die unter anderem die noch nicht geklärte Dignität der Läsion aufzeigen: Synonyme für AAH: -Atypical alveolar cuboidal cell hyperplasia (AAH) (KODAMA et al, 1986) -Bronchioloalveolar cell adenoma (MILLER et al,1988; MILLER 1990) -Atypical bronchioloalveolar cell hyperplasia (ABH) (OHSHIMA et al, 1994) -Atypical alveolar hyperplasia (AAH) (KERR et al, 1994; WESTRA et al, 1996) -Atypical alveolar epithelial hyperplasia (atypical AEH) (NAKANISHI, 1990) -Atypical alveolar cell hyperplasia (AACH) (STERNER et al, 1997) -Alveolar adenoma (SMITH et al, 1996) 6
Bei den meisten Autoren aber hat sich mittlerweile die Nomenklatur als Atypische Adenomatöse Hyperplasie (AAH) der bronchioloalveolären Endstrecke durchgesetzt, die in ihrem Namen die atypischen zytologischen Kriterien berücksichtigt, die Assoziation mit Adenokarzinomen andeutet und sich trotzdem nicht auf eine neoplastische Komponente festlegt, wie etwa das Bronchioloalveoläre Zell Adenom (MORINAGA und SHINOSATO, 1987; NAKAYAMA et al, 1990; KITAMURA et al, 1995; MORI et al, 1996; KITAMURA et al, 1996; YOKOZAKI et al, 1996; SUZUKI et al, 1997; KURASONO et al, 1998). Die Dignität der AAH ist trotz vieler Untersuchungen weiterhin umstritten und die Schlußfolgerungen in den Veröffentlichungen reichen von Präneoplasien Bronchioloalveolärer Karzinome (BAC) und Präneoplasien nur für Clara-Zelltyp und Typ II Pneumozyten Typ Adenokarzinome, über Präneoplasien für alle Adenokarzinome, bis hin zu Betrachtungsweisen, die in der AAH schon Adenome oder sogar extrem gut differenzierte bronchioloalveoläre Karzinom sehen (KODAMA et al, 1986; MORINAGA und SHINOSATO, 1987; MILLER et al, 1988; NAKAYAMA et al, 1990; MILLER et al, 1990; NAKANISHI, 1990; OHSHIMA et al, 1994; MORI et al, 1996; KITAMURA et al, 1995 u. 1996; YOKOZAKI et al, 1996; WESTRA et al, 1996; STERNER et al, 1997; KURASONO et al, 1998; NIHO et al, 1999). Die Notwendigkeit, Kriterien für eine klare Abgrenzung der AAH von anderen, morphologisch ähnlichen Veränderungen der bronchioloalveolären Endstrecke zu finden, ist somit einsichtig. 1. Unterscheidung AAH zu manifestem BAC (nach KITAMURA et al, 1995) Kriterien: - offensichtlich maligne zytologische und strukturelle Atypie - invasives oder destruktives Wachstum 2. Unterscheidung AAH zu reaktiver alveolärer Zellhyperplasie bei z.b. obstruktiver Pneumonie: (nach KITAMURA et al, 1995) Kriterien: - Uniformität der proliferierenden Zellen - Zelluläre Atypien und Pleomorphie (Kerngröße, Kernvariabilität, Hyperchromasie, Nukleolusform und größe, Dichte und Anordnung der Zellen) (auch MORI et al, 1996) 7
- Geringere entzündliche Zellinfiltration bei der AAH (auch MORI,1996) - AAH-Kerngröße doppelt so groß wie bei der angrenzenden reaktiven Hyperplasie (STERNER et al, 1997) 3. Unterscheidung AAH zu Epithelmetaplasie (nach KITAMURA et al, 1995): Kriterien: - Uniformität der proliferierenden Zellen - Zelluläre Atypie und Pleomorphie 4. Unterscheidung AAH und Adenokarzinom (AC) Kriterien: - Kerngröße Unterschiede: AAH = 38,52µm² ; AC = 51,12µm² (YOKOZAKI et al, 1996) - Aneuploidie ist bei AC häufiger als bei AAH: AAH-33%; AC-85% (YOKOZAKI et al, 1996) - Bei Fokus von dichter wachsenden Zellen mit leicht größeren Kernen als in der ebenfalls proliferierenden Nachbarschaft wurden diese als gut-differenzierte Adenokarzinome gedeutet, der Rest als AAH. (YOKOZAKI et al, 1996) - weniger deutliche Zellatypien in der AAH als beim AC (SUZUKI et al, 1997) Die Frage, ob das zusätzliche Auftreten von AAH einen Einfluß auf die Prognose der Patienten mit Adenokarzinomen hat, wurde von SUZUKI et al (1997) durch eine großangelegte Untersuchung an 1360 Lungen von Karzinompatienten beantwortet. Die Hauptaufgabe bestand darin, die intrapulmonalen Metastasen besonders der bronchioloalveolären Karzinome der Lungen von der AAH zu unterscheiden. Die Studie zeigt, daß bei gründlicher Differenzierung dieser beiden Läsionen kein Einfluß auf die 5-Jahres-Überlebensraten durch die AAH auszumachen ist. Sie verdeutlicht ferner, daß es sich bei der Subgruppe von Patienten mit intrapulmonalen Metastasen von pulmonalen Karzinomen mit einer deutlich besseren Prognose (NAKAJIMA et al, 1996) in anderen Untersuchungen am ehesten um Fehldiagnosen einer AAH als pulmonale Metastase handelt. 8
Der Versuch die differierenden Definitionen der AAH zu vereinheitlichen, nimmt den Kriterien ihre Schärfe, ermöglicht aber auch breiter angelegte Untersuchungen. Als AAH sollen gewertet werden: (siehe Abb. 2) 1) Eine einheitliche Epithelläsion entlang der bronchioloalveolären Endstrecke mit kubischer bis niedrig zylindrischer Proliferation der Zellen in einer Reihe 2) Die Zellen weisen deutliche Merkmale der Atypie auf, jedoch keine Invasivität 3) Keine Berücksichtigung findet die Beschaffenheit des Interstitiums oder der Abstand zum eventuell vorhandenen Tumor 9
Abbildung 2: Skiziertes Beispiel einer Atypische Adenomatöse Hyperplasie 10
1.2.3 Tumorlets Im Katalog der World Health Organisation von 1982 zum Histological Typing of Lung Tumours finden sich die Tumorlets unter 8.VII (Tumour-like Lesions) C. mit folgender Beschreibung: Ein mikroskopisches tumorähnliches Aggregat von epithelialen Zellen in der Lunge. Die Zellen sind schmal und hyperchromatisch und ähneln Oat-Zellen, aber sie sind gutartig. Tumorlets kommen normalerweise als multiple Läsionen in der Lungenperipherie vor. Es wird postuliert, daß die Mehrheit der Tumorlets, die in Narbenlungen auftreten, hyperplastisches bronchioloalveoläres Epithel darstellen, während die in normalen Lungen vorkommenden eine Form des Karzinoid-Tumors sind. Obwohl schon zuvor die Beschreibung der Läsion erfolgte (PAGEL, 1926; GRAY und CARDONNIER, 1929), prägte erst WHITWELL (1955) die Nomenklatur als Tumorlets. Diese hat sich heute im Vergleich mit den vielfältigen anderen verwendeten Begriffen (Bronchialadenom; periphere, multiple Bronchialadenome; kleinste periphere Lungentumoren; atypische Proliferation bronchiolären Epithels, noduläre epitheliale Proliferation; bronchiale Proliferation und Metaplasie; frühes bronchiogenes Karzinom; kleinste multiple Bronchialkarzinome (MIKAIL und SENDER, 1962)) durchgesetzt. Ihre Dignität ist, trotz der Festlegung als gutartig durch die WHO (1982), nach wie vor ungeklärt. Eine Rolle der Tumorlets vom Karzinoid-Typ (auch als spindelzellig-plattenepitheliale Form bezeichnet (MEYER und LIEBOW, 1965)) in der Entwicklung von kleinzelligen Bronchialkarzinomen von oat-cell-typ wird vermutet (RANCHOD, 1977). Die Frage der Dignität der Tumorlets vom azinären (MEYER und LIEBOW,1965) bzw bronchioloalveolärer Typ (HOFFMANN, 1962) gibt ebenfalls Anlaß zu Spekulationen. Die Möglichkeit der Entwicklung peripherer Lungenmalignome als ein kontinuierlicher Prozeß von der kuboiden Metaplasie der Pneumozyten über die Entwicklung von Tumorlets mit zunehmender Atypie bis hin zum Karzinom wurde von verschiedenen 11
Autoren in Erwägung gezogen (MEYER und LIEBOW, 1965; MÜLLER et al, 1988; GRÜNE, 1993; THEILE und MÜLLER, 1996). Andere hingegen sehen Tumorlets als epitheliale Hyperplasie oder Metaplasie, aber nicht als Neoplasie, als bronchiales Adenom oder als Karzinoma in situ, mit später möglichen Metastasen (WATSON und SMITH, 1951; PRIOR und JONES, 1952; WHITWELL, 1955; MIKAIL und SENDER, 1962). In diesem Zusammenhang erwähnenswert erscheint die Beobachtung von CHUGHTAI et al (1997), der eine signifikant schlechtere Prognose von Patienten mit Karzinoiden der Lunge bei zusätzlichem Vorhandensein von Tumorlets aufzeigt und im übrigen das schon vorher beschriebene Überwiegen von Frauen in der Tumorlet-Population bestätigt. Bei der bronchioloalveolären (bzw. nach MEYER und LIEBOW, 1965 azinären) Form der Tumorlets handelt es sich um ein atypisches Epithelwachstum in den distalen luftführenden Bereichen der Lunge, das vorwiegend drüsenähnliche Formen aufweist (MEYER und LIEBOW, 1965). Die soliden Nester bei teils polypoidem Wachstum der kuboidalen und zylindrischen Epithelien mit Kernhyperchromasie und -polymorphie können Anzeichen einer squamösen Metaplasie, z.t. Stratifikation aufweisen (HOFFMANN, 1962). Dahingegen bestehen die Karzinoid-Tumorlets aus den typischen Nestern uniformer neuroendokriner Zellelemente mit spindelförmiger, polygonaler oder gemischter Kernkonfiguration und einer variablen Menge an Zytoplasma (RESL et al, 1996). Bei den meisten der beobachteten Tumorlets handelt es sich um inzidentielle Befunde, die klinisch symptomlos sind. Besonders häufig finden sie sich im Rahmen interstitiell fibrosierender Lungenerkrankungen (MIKAIL und SENDER, 1962), aber auch in der Peripherie von Adenokarzinom-Lungen (THEILE und MÜLLER, 1996). Definition der BronchioloalveolärenTumorlets: (siehe Abb. 3) 1) Mehrschichtig und mehrreihig wachsende Epithelproliferate der bronchioloalveolären Endstrecke 2) mit einem differierenden Maß an Merkmalen der Atypie. 12
Abbildung 3: Schematische Darstellung der bronchioloalveolären Endstrecke ausgekleidet mit Tumorlets 13
1.2.4 Bronchiolisation Nach NETTESHEIM und SZAKAL (1972) bezeichnet man als Bronchiolisation der bronchioloalveolären Endstrecke das dortige Vorkommen von Zellen, die bronchialem Epithel ähneln. Gelegentlich können auch zilientragende Zellen beobachtet werden. Es wird angenommen, daß es sich hierbei um eine ektope Lokalisation von bronchiolären Zellen handelt (NETTESHEIM und SZAKAL, 1972; MARTINEZ et al, 1996). Bei einer Vielzahl von pathologischen Prozessen der Lunge ist das Auftreten von Bronchiolisation als Folge der Irritation der die alveolären Räume auskleidenden Zellen beschrieben worden. So können pulmonale Infektionen (BELL, 1943), Exposition gegenüber chemischen Noxen (EVANS et al, 1973) sowie interstitielle Fibrosen und narbige Veränderungen der Lunge (NETTESHEIM und SZAKAL, 1972) ausschlaggebend sein. Definition der Bronchiolisation: (siehe Abb. 4a,b) 1) Vorkommen von Zilien tragenden, zylindrischen und plattenepithelial metaplastischen Zellen im Bereich der bronchioloalveolären Endstrecken 14
Abbildung 4: Bronchiolisationsphänomene im Bereich der bronchioloalveolären Endstrecke, schematisch 15
1.3 Beschreibung der eingesetzten Tumormarker Im Rahmen dieser Arbeit wurden nun die oben beschriebenen Epithelalterationen pathoanatomisch mit Hilfe der im folgenden gekennzeichneten Proliferations- und Tumormarker untersucht. 1.3.1 PCNA Das Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) ist ein Kernpolypeptid, das direkt in die Synthese der DNA eingreift. Es handelt sich um ein 36 Kilo Dalton schweres, saures Nicht-Histon Molekül, welches auch unter den Namen Cyclin oder Hilfsprotein der DNA Polymerase delta bekannt ist (BRAVO et al, 1987; JASKULSKI et al, 1988). Da die DNA Polymerase delta für die DNA Replikation nötig ist, trifft dieses für PCNA als Co-Faktor somit ebenfalls zu (BRAVO et al, 1987). Die Induzierbarkeit von PCNA durch Wachstumsfaktoren in vitro und in vivo mag der Grund für die gelegentlich beobachtete PCNA Expression in normalen Zellen in Tumornähe sein (THEILE und MÜLLER, 1996). Lokalisiert ist das Gen für PCNA auf dem Chromosom 20, wobei die Existenz von Pseudogenen auf dem X und Chromsom 6 vermutet wird (KU et al, 1989). Immunhistochemische Untersuchungen konnten zeigen, daß PCNA wähend des normalen Zellzyklus in unterschiedlicher Menge im Zellkern vorhanden ist, mit einem Anstieg in der späten G1 Phase, einem deutlichen Maximum während der S-Phase, Abfall im Verlauf der G2 Phase und einem Minimum zur Zeit der Mitose (CELIS und CELIS, 1985). Dieser Bezug zur Zellproliferation macht die PCNA-Immunhistochemie als Proliferationsmarker besonders wertvoll, vor allem da das Protein in unterschiedlichen Mengen in normalen und transformierten proliferierenden Zellen vorhanden ist (CELIS et al, 1984). 16
Ein weiterer großer Vorteil von PCNA als Proliferationsmarker ist die Resistenz gegenüber Fixierung, so daß PCNA-Färbungen auch an formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben möglich sind (THEILE und MÜLLER, 1996). Üblicherweise werden alle Zellen mit rot bis braun gefärbten Kernen als PCNAimmunopositiv gewertet (KAWAI et al, 1994; WIETHEGE et al, 1995). 1.3.2 MiB1 Ki 67 ist ein muriner monoclonaler Antikörper, der ein Nicht-Histon-Protein der nukleären Matrix von mehr als 300 kd bindet, das in allen Phasen des Zellzyklus, mit Ausnahme von G0 und eventuell der frühen G1 Phase, zu finden ist. Die Expression beginnt in der Mitte der G1-Phase, steigt im Laufe der S- und G2-Phase an und erreicht ihr Maximum während der M-Phase; danach erfolgt der rasche Abbau (GERDES et al, 1984; BRAUN et al, 1988). An dasselbe Ki 67 Antigen bindet auch MiB1, ein monoklonaler Mäuse Antikörper (KURASONO et al, 1998), der im Gegensatz zu den Prototypen den Vorteil hat, nach Mikrowellenvorbehandlung auch an fixiertem Material anwendbar zu sein (CATTORETTI et al, 1992). Es hat sich gezeigt, daß der Anteil an MiB1 positiven Zellen in einem Gewebe ein gutes Maß für die Wachstumsfraktion dieses Gewebes darstellt (KITAMURA et al, 1995). Weitergehend läßt sich sogar eine gute Korrelation zwischen der mitotischen Aktivität der meisten Tumoren und der MiB1 Immunoreaktivität feststellen, auch wenn der prozentuale Anteil der MiB1 positiven Zellen den Anteil der Mitosen um etwa den Faktor 10 bis 20 übersteigt (WEIDNER et al, 1994). Das Verhältnis zwischen einem positiven MiB1-Immunstatus und der Prognose von erkrankten Patienten ist noch ungeklärt (TUNGEKAR et al, 1991). 17
Eine Färbung der Zellkerne, ungeachtet der Färbeintensität, wird von KITAMURA et al (1995) als Zeichen für MiB1-Antigen-Expression durch die Zellen gewertet. 1.3.3 P53 Die Mutation des p53 Tumorsuppressorgens ( Protein 53 000 Dalton) ist eine der am häufigsten beobachteten Mutationen in malignen Tumoren des Menschen (HOLLSTEIN et al, 1991). Verschiedene Autoren konnten in ihren Untersuchungen sogar die Expression des Gens in prämalignen Bronchialläsionen zeigen und vermuten somit, daß die p53 Expression ein frühes Ereignis bei der Entwicklung der von ihnen untersuchten Bronchialkarzinome sei (BENNETT et al, 1993; NUORVA et al, 1993). Das p53 Gen, das auf dem kurzen Arm von Chromosom 17 (17p31) lokalisiert ist, kodiert das 53-kDa Phosphoprotein p53, ein nukleäres Protein, das seine Funktion in der Regulation des Zellwachstums und der Zellteilung hat (FIELDS und JANG, 1990; WIETHEGE et al, 1995). Der Wildtyp des p53-gens wirkt als Transkriptionsfaktor und beeinflußt das Tumorwachstum über Interaktionen mit anderen Genen (FARMER et al, 1992; PICKSLEY und LANE, 1993; WU et al, 1993). Die Mutationen sind in den meisten Fällen mit Allelverlusten verbunden. Die Lokalisation der Punktmutationen variiert, ist jedoch in über 70% der Fälle im Bereich der hochkonservativen Exons 5 bis 8 des p53 Gens zu finden (CARON DE FROMENTEL und SOUSSI, 1992). Die Mutationen inaktivieren dann die Wirkung des P53 Proteins auf die Promotoren anderer Gene und untergräbt damit die Tumorsuppressorfunktion des Gens. Von besonderem Interesse scheint die Tatsache, daß nur die mutierte Form des Proteins durch eine Verlängerung der Halbwertzeit- im Zellkern durch die Immunhistochemie nachgewiesen werden kann, während das Wildtyp Protein p53 diese Stabilität und damit die Konzentration für eine Anfärbbarkeit nie erreicht (IGGO et al, 1990). Dieser Umstand gewährleistet, daß durch die üblichen Färbungen nur die mutierte und damit 18
wissenschaftlich interessante- Form des Proteins sichtbar dargestellt wird (IGGO et al, 1990). Allerdings mit Ausnahmen: 1. Inaktivation eines Abbauweges für p53, 2. Komplexbildung des normalen p53 mit zellulären Onkoproteinene, wie mdm2 (murine double iminute 2), oder mit DNA Tumor-Virus-Protein, 3. Verlängerung der Protein-Halbwertzeit durch posttranslationale Modifikation durch DNA-Schäden, 4. Veränderung der p53-gen-expression durch zelluläre Transskriptions- Regulatoren und 5. physiologische p53 Akkumulation während der späten G1 und S Phase des Zellzyklus führen zu einer erhöhten intranukleären Konzentration des normalen p53-proteins und damit zu seiner Nachweisbarkeit (Zusammenfassung durch BENNETT et al; 1993). Im Bezug auf eine Überexpression und damit immunhistochemische Nachweisbarkeit- von p53 in NSCLC beschreiben einige Autoren signifikante Unterschiede in der Menge an p53 positiven Malignomen im Bezug auf den histologischen Tumortyp. Nach Untersuchungen von DALQUEN et al (1996) finden sich unter den Plattenepithel- und Großzelligen Karzinomen etwa 53% p53 positive Tumoren, während bei den Adenokarzinomen nur in 34% und bei den Bronchioloalveolären Karzinomen sogar nur in 6 % der Fälle eine Anfärbbarkeit nachzuweisen war. Ähnliche Ergebnisse einer höheren Rate an p53 positiven Tumoren unter den Plattenepithelkarzinomen als unter den Adenokarzinomen konnten die Autoren in sechs weiteren Studien aufzeigen (CHIBA et al, 1990 ; KISHIMOTO et al, 1992 ; McLAREN et al, 1992 ; SOINI et al, 1992; EBINA et al, 1994; WIETHEGE et al, 1995). Gleiche Raten postulierten drei Publikationen (CAAMANO et al, 1991; BRAMBILLA et al, 1993 ; HORIO et al, 1993). DALQUEN (1996) beschreibt die Prognose von Patienten mit positivem p53 Status als deutlich schlechter als bei Patienten mit negativem Status (ebenso: EBINA et al, 1994; HORIO et al, 1993), während andere keine signifikante Assoziation zwischen diesen Größen sehen (McLAREN et al, 1992; BRAMBILLA et al, 1993). 19
Immunhistochemisch als positiv zu betrachtende Zellen zeigen eine rote, bzw braune Kernfärbung (nach WIETHEGE et al, 1995). 1.3.4 ErbB2 Das erbb-2-proto-onkogen (Erythroblastosis Virus), welches auch unter den Namen neu oder HER2 bekannt ist, findet sich auf dem langen Arm von Chromosom 17 (17q21-q22) und zeigt stellenweise Ähnlichkeiten mit dem erbb-1-gen, das für den Epidermal Growth Factor Receptor (EGRF) kodiert. Für beide ist eine Überexpression in bestimmten Karzinomtypen bekannt, wobei dieses Phänomen für erbb-2 auf eine erhöhte Stabilität der mrna in Adenokarzinomen zurückzuführen ist. Dabei ist von einem positiven erbb-2-immunstatus in etwa 57% bis 67% der untersuchten Adenokarzinome auszugehen (TATEISHI et al, 1991; KERR et al, 1994). Eine negative Beeinflussung der Prognose von Adenokarzinompatienten mit positiven erbb-2-status gilt als wahrscheinlich (MÜLLER et al, 1995; TATEISHI et al, 1991). Gewöhnlich wird nur die Zellmembran-Färbung als wirklich positives Resultat für eine erbb-2-immunohistochemie angesehen (KERNOHAN et al, 1991). 1.4 Normale Lungenhistologie Der Luftweg verzweigt sich fortlaufend durch dichotome Teilungen, wodurch der Bronchialbaum entsteht. Ausgehend von der Trachea nimmt die eingeatmete Luft ihren Weg von den Hauptbronchien (Bronchi principales), Lappenbronchien (Bronchi lobares) und Segmentbrochien (Bronchi segmentales) über kleinere Bronchien bis hin zu den Bronchiolen. Die aus den Bronchioli terminales hervongehenden Bronchioli respiratorii teilen sich schließlich in die aus Alveolen bestehenden Ductus alveolares. 20
Während die Bronchien mit einem mehrreihigen, Becherzellen enthaltenden Flimmerepithel ausgekleidet sind, das ferner Bürstensaumzellen, endokrine Zellen und die Glandulae bronchiales aufweist, beginnt mit den Bronchioli terminales die bronchioloalveoläre Endstrecke des Gasaustausches, die sich auch durch eine besondere Epithelauskleidung dieses Raumes demarkiert. In den Bronchioli wird das respiratorische Epithel einreihig, Becherzellen und Drüsen finden sich nicht mehr. Im Epithelverband der Bronchioli terminales kommen Clara-Zellen vor, nicht zilientragende bronchioläre Epithelzellen, welche an ihrer lumenseitigen Oberfläche zytoplasmatische Ausläufer aufweisen. KÖLLIKER (1881) und CLARA (1937) identifizierten die Clarazellen als den primär sekretorischen Zelltyp dieses Lungenabschnittes, auf Grund von Beschreibungen apikaler sekretorischer Granula. Während sich auch im Bronchiolus respiratorius noch kinozilientragende Zellen finden, sind die Alveolen ausgekleidet durch die nicht zilientragenden Pneumozyten. Die flachen, weit ausgebreiteten Pneumozyten Typ I (=Alveolardeckzellen) bedecken den größten Teil der alveolären Oberfläche (ca. 95%), während die kuboiden oder rundlich hohen Pneumozyten Typ II (=Nischenzellen) das Regenerationsreservoir der alveolären Zellen darstellen und für die Surfactantproduktion verantwortlich zeichnen. Sie sind etwa 1,5-2 mal häufiger als die ausgereiften Typ I Zellen und liegen in der Regel einzeln oder höchstens in Gruppen von zwei oder drei im Alveolarbereich vor, wodurch sie eine Fläche von nur 4-7% der alveolären Oberfläche bedecken. Im Rahmen ihrer Veröffentlichung 1997 geben TEN HAVE-OPBROEK et al eine gute morphologische Charakterisierung der Typ II Pneumozyten, die für alle Reifegrade dieser Zellen gültig ist. Sie beschreiben Zellen mit einer annähernd kuboiden Form, großen und runden Zellkernen, Anfärbbarkeit des Zytoplasmas mit Surfactant Protein A und der Präsenz von multilamellären Körperchen, oder deren Vorläufern. Die Entsorgung des alten Surfactant und partikulärer Verunreinigungen der respiratorischen Endstrecke besorgen die Alveolarmakrophagen. 21
1.5 Lungentumoren Bei der Betrachtung der Einteilung der Neoplasien der Lunge sollen sowohl die 1982 von der Welt Gesundheitsorganisation (WHO) veröffentlichten Richtlinien über die Histologische Typisierung von Lungentumoren Erwähnung finden, als auch die 1999 publizierte Revision, da in der betrachteten Literatur beide Verwendung finden. Während in der täglichen Diagnostik bösartiger Tumoren weiterhin entscheidend die histologisch-phänotypisch führende Tumorvariante ist, zeigen immunhistochemische und molekularbiologische Untersuchungen immer deutlicher die Tumorvielfalt maligner Lungentumoren (MÜLLER, 1999-2; WIETHEGE et al, 2000). In der Fassung von 1982 fanden sich an dritter Stelle (3.) in der Untergruppe C (Maligne Tumoren) der Epithelialen Tumoren (I.) die Adenokarzinome mit folgender Definition: Ein maligner Tumor mit tubulärem, azinärem oder papillärem Wachstumsmuster und/oder Schleimproduktion durch die Tumorzellen. Das Grading der Adenokarzinome erfolgt nach den allgemein gültigen Kriterien in hoch, mittel und niedrig differenzierte Malignome, für deren zelluläre Differenzierung die WHO folgende Beschreibung gibt. Tabelle 1: Grading der Adenokarzinome Differenzierungsgrad Beschreibung Hoch Mittel Niedrig Die Zellen zeigen typische Eigenschaften von Epithelzellen Die Zellen haben abgerundete Kerne, grobkörniges Chromatin und große prominente Nukleoli; mäßig viel Zytoplasma, das Muzin ähnliche Vakuolen enthalten kann Die Zellen sind pleomorph und können nicht ohne weiteres von großzelligen Karzinomen unterschieden werden 22
Bei der Festlegung der weiteren Unterteilungen betont die Fassung von 1982 eine räumlich unterschiedliche Häufung der Neoplasietypen: Tabelle 2: WHO Adenokarzinomeinteilung 1982 (Abkürzungen sieheverzeichnis) Adenokarzinomtyp Vorwiegende Histologische Beschreibung Lokalisation Azinäres AC Größere Bronchien Predominanz von drüsigen Strukturen, z.b. Azini oder Tubuli mit oder ohne papilläre oder solide Areale Papilläres AC Lungenperipherie Predominanz von papillären Strukturen Bronchioloalveoläres Karzinom Lungenperipherie Zylindrische Tumorzellen wachsen auf vorbestehenden Alveolarwänden Solides Karzinom mit Schleim Formation Niedrig differenziertes Adenokarzinom ohne Azini, Tubuli und Papillen aber mit schleimenthaltenden Vakuolen in vielen Zellen Unter Verlust der Betonung dieses Aspektes beschreibt die revidierte Version folgende Hauptgruppen von Adenokarzinomen: Tabelle 3:WHO Adenokarzinomeinteilung 1999 (TRAVIS et al, 1999; Abkürzungen siehe Abkürzungsverzeichnis) Adenokarzinomtyp Definition Azinäres AC Ein AC mit Azini und Tubuli, häufig zusammengesetzt aus Muzin produzierenden Zellen, die bronchialen Drüsen oder epithelialen Zellen ähneln. Papilläres AC Ein AC mit einer Dominanz der papillären Strukturen, das die zugrundeliegende alveoläre Architektur ersetzt. BAC Ein AC mit einem echten bronchioloalveolären Wachstumsmuster und keinem Anzeichen für Stroma-, Gefäß- oder Pleurainvasion. Solides AC mit Muzin Ein AC ohne Azini, Tubuli und papilläre Strukturen aber mit häufig Muzin enthaltenden Tumorzellen (fünf oder mehr muzin-positive Zellen in mindestens zwei High Power Fields). AC mit gemischten Subtypen Diese sollten als Adenokarzinome unter Aufzählung der Subtypen benannt werden. 23
In der Reihe der Adenokarzinome nimmt das Bronchioloalveoläre Karzinom (sog. Alveolarzellkarzinom) mit Sicherheit eine Sonderstellung ein (MÜLLER et al, 1995; CAGLE et al, 1996), so daß eine genauere Beschreibung der heutigen diagnostischen Kriterien sinnvoll erscheint (SCHRAUFNAGEL et al, 1982): I. Kein Hinweis auf extrathorakale primäre Adenokarzinome II. Keine Quelle in den zentralen Bronchien III. Periphere Lokalisation IV. Keine Beteiligung des pulmonalen Interstitiums V. Neoplastische Zellen wachsen entlang der Alveolarsepten Eine andere Einteilung der Adenokarzinome schlägt 1987 EDWARDS vor. Er sieht Vorteile vor allem in der signifikanten prognostischen Relevanz dieser Differenzierung in: 1) parenchymale AC: Pleomorphe Tumoren, die aus Zellen bestehen, die denen ähneln, die die distalen Luftwege auskleiden. 2) bronchiale AC: Tumoren der größeren zentralen Bronchien 3) AC unklaren Ursprungs: Dabei waren die bronchialen AC generell mit kurzen postoperativen Überlebenszeiten korreliert. Eine Bestätigung findet diese Einteilung der Adenokarzinome durch Untersuchungen von COOPER er al (1997), die k-ras Mutationen nur in parenchymalen Adenokarzinomen nachweisen konnten.zusätzlich stellten sie fest, daß auch die mituntersuchten AAH mutiert waren. 1.6 Fibrose Bei der Lungenfibrose handelt es sich um das Endstadium der Mehrzahl aller entzündlichen interstitiellen Lungenerkrankungen, sie wird deshalb von einigen Autoren auch als chronische interstitielle Pneumonie bezeichnet (MEYER und LIEBOW, 1965). Nach einer vorwiegend mononukleär-zelligen Infiltration in der Frühphase, kommt es zu einer Proliferation von Histiozyten und Fibroblasten. 24
Histologisch überwiegt in Spätstadien der Lungenfibrose die starke Zunahme kollagener Fasern. Die ehemalige Alveolarstruktur ist durch den bindegewebigen Umbau größtenteils zerstört, die Bronchiolen ektasiert. Das gesamte Lungengewebe zeigt einen Volumenverlust, die Menge der luftführenden Räume ist vermindert (HEPPLESTON, 1956). Die Wabenlunge (=Honeycombing, bronchiektatische Fibrose) wird dann als Endstadium aller chronisch fibrosierenden Lungenerkrankungen angesehen (DALQUEN et al, 1978). MEYER und LIEBOW (1965) geben eine eingängige histologische Beschreibung dieses Begriffes:...das Zusammenfließen der distalen luftführenden Räume zusammen mit Verdickung und Kondensation der Septen dazwischen, das in einer Vergröberung des Lungengewebes und in einem Anstieg seiner im großen und ganzen sichtbaren Porösität mündet, kann als Honeycombing beschrieben werden. Es existieren viele Grade dieser Veränderung. Die ätiologische Zuordnung dieses Endstadiums zur Grunderkrankung ist in den meisten Fällen ohne zusätzliche Informationen allein auf der Grundlage der Morphologie nicht möglich. Ausnahmen bilden hier z.b. die Ablagerung von noch sichtbaren Staubpartikeln in der Lunge (z.b. Asbestkörperchen) (DALQUEN et al, 1978) sowie Residuen spezifischer Entzündungen, wie Granulome. 25
Eine neue Einteilung der ideopathischen interstitiellen Pneumonien lieferten 1998 KATZENSTEIN et al: Tabelle 4: Einteilung der idiopathischen interstitiellen Pneumonien nach Katzenstein et al (1998); Abkürzungen: - UIP = gewöhnliche interstitielle Pneumonie - DIP = desquamative interstitelle Pneumonie - RBILD= respiratorische Bronchiolitis assoziiert mit interstitieller Lungenerkrankung - AIP = akute interstitielle Pneumonie - NSIP = unspezifische interstitielle Pneumonie Name Beschreibung UIP Ideopathische Lungenfibrose DIP/RBILD Vorkommen bei Rauchern mit guter Prognose AIP Akute fulminante Form, früher Hamman-Rich-Syndrom NSIP Histopathologisch zu keiner anderen Gruppe gehörig 1.7 Tumorgenesetheorien 1.7.1 Sequentielle Entwicklung von Tumoren Als Präneoplasien werden Gruppen von Zellen bezeichnet, die morphologisch veränderte Aspekte aufweisen und denen die Möglichkeit der Entwicklung zur echten Malignität zugeschrieben wird, auch wenn diese nicht zwangsläufig erfolgen muß. Tumoren der Lunge entstehen sowohl im zentralen Bereich (ausgehend von den Bronchien) als auch in der Lungenperipherie (ausgehend von den Bronchiolen und Alveolen). Wegen der besseren Erreichbarkeit ist die Entwicklung der zentralen Malignome wesentlich besser erforscht und eine Sequenz von der Präneoplasie über die präinvasive Läsion zum Karzinom konnte dokumentiert werden. Diese beinhaltet die Epithelhyperplasie, Plattenepithelmetaplasie und Dysplasie bis hin zum Karzinoma in situ (SACCOMANNO et al, 1974; AUERBACHet al, 1979). 26
Ähnliche, aber weniger gut dokumentierte Abläufe mögen sich im Epithel der bronchioloalveolären Endstrecke abspielen und zur Entstehung von peripheren Karzinomen führen (NAKANISHI, 1990; WENG et al, 1990). Dabei sollte nicht übersehen werden, daß die meisten präneoplastischen Läsionen nicht zu invasiven Neoplasien führen und manche sogar reversibel sein könnten (FROST et al, 1986). Diejenigen morphologischen Läsionen im Bereich der bronchioloalveolären Endstrecke zu finden, die eine Rolle in dieser Theorie übernehmen könnten, gehört zur aktuellen Forschung (THEILE und MÜLLER; 1996). 1.7.2 Genetik Mit den meisten Tumoren sind multiple genetische Abnormalitäten, die eine Aktivierung oder Überexpression von dominanten Onkogenen und eine Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen bedeuten können, verbunden (MINNA, 1993). Bis jetzt gibt es nur wenig wirkliches Wissen über die molekularen Ereignisse bei der Pathogenese der Lungenkarzinome und ihre Relation zur Morphologie. Die Untersuchungen stützen sich in diesem Bereich vorwiegend auf Chromosomenanalysen, sowie auf die Auswertung von bekannten Tumorsuppressorgenen und Onkogenen (SUNDARESAN et al, 1992; HUNG et al, 1995). Von besonderem Interesse ist hier der Zeitpunkt bestimmter Mutationen im Rahmen der Tumorgenese, der allerdings für viele Tumormarker umstritten ist (LI et al, 1994, SUGIO et al, 1994). 1.7.3 Field Canzerisation Unter dem 1953 von SLAUGHTER et al geprägten Begriff der Field Cancerisation, am ehesten zu übersetzen mit flächendeckende Krebsinitiation, ist der Versuch einer ätiologischen Erklärung für die morphologische Beobachtung zu sehen, daß Malignome des oberen Gastrointestinal- und Atemtraktes häufig multipel auftreten. Die Theorie beschreibt ein erhöhtes Risiko für eine Krebsentwicklung auf Grund einer Mutagenisierung des Epithels des gesamten Bereichs durch Exposition zu einem Kanzerogen, wie zum Beispiel dem Tabakrauch. 27
Während die primären Beobachtungen sich nicht auf pulmonale Malignome bezogen, konnten andere Autoren (HEYNE et al, 1992) das Konzept erweitern und eine Gültigkeit auch für diesen Bereich aufzeigen. SMITH et al (1996) finden in eigenen Untersuchungen schließlich multiple Foci von aneuploiden Zellen, besonders in histomorphologisch als präneoplastisch eingestuften Arealen der Lunge von Patienten mit NSCLC, deren Tumorzellen ebenfalls Aneuploidie zeigen. Die multiple Lokalisation der präneoplastischen Läsionen sowie die positive Korrelation ansteigender Grade der Aneuploidie und morphologischen Entartung der Läsionen ist ein neuerlich deutlicher Hinweis auf die Bedeutung der Theorie der Field Cancerization. Zu einer ähnlichen Schlußfolgerung gelangen auch WESTRA et al (1996), die in nur einer von 18 untersuchten AAHs dieselbe K-ras Mutation nachweisen konnten, wie im zugehörigen Adenokarzinom des Patienten. 1.7.4 Scar Cancer Narbenkrebs Eine der Charakteristiken peripherer Lungenkarzinome ist die Fibrosierung des Tumorzentrums oder der subpleuralen Anteile (SHIMOSATO et al 1980). Diese Foki können unterteilt werden in diejenigen, die vor dem Malignom- und diejenigen, die nach dem Malignomwachstum entstehen. Erstere bedingen das Konzept des Narbenkrebses ( scar cancer ), das zuerst von FRIEDRICH (1939) und RÖSSLE (1943) vertreten wurde. Ihre Theorie der Entwicklung von der regenerativen Hyperplasie der bronchioloalveolären Zellen über atypische Hyperplasie zum Adenokarzinom auf der Grundlage fibrotischer Veränderungen der Lungen wird auch von MEYER und LIEBOW (1965) unterstützt. Heute vertritt die Mehrzahl der Autoren die Meinung von SHIMOSATO et al (1980), daß in den meisten Adenokarzinomen die zentrale Fibrose, bzw die fibrotischen Foki mit Anthrakose nicht vor, sondern nach der Karzinomentwicklung entstehen (Literaturübersicht siehe FISSELER-ECKHOFF, 1998). 28
Durch eine Ungleichverteilung des Blutflusses im Tumor kommt es zur Degeneration und zum Tod von Tumorzellen, die zuvor die Alveolen ausgekleideten und damit zu einem Kollaps der Alveolen. Dieser bedingt den narbigen und damit fibrotischen Umbau innerhalb des Tumors durch Proliferation fibroblastischer Zellen und Kollagenisierung. Besonders die Beobachtung, daß in frühen Stadien von Adenokarzinomen fibrotische Foki normalerweise nicht zu finden sind, unterstützt diese Tatsache. FISSELER-ECKHOFF (1998) analysierte hierzu ausführlich die Entwicklung des Tumorstromas in Lungenkarzinomen in drei Phasen. In der Schlußfolgerung wird beschrieben, wie zentrale Fibrosen und Vernarbungen mit vermehrter Einlagerung von Mischstaubpigmenten, Angioinvasionen, Gefäßobstuktionen mit daraus resultierenden Tumornekrosen und sekundären Verkalkungen sowie nabelartigen Pleuraeinziehungen bei peripherer Lage vielfach zur falschen Bezeichnung im Sinne von Narbenkarzinomen führen. 29
1.8 Ziele der Arbeit Das Ziel dieser Arbeit ist die Charakterisierung von Epithelveränderungen im Bereich der bronchioloalveolären Endstrecke insbesonderer bezüglich einer (prä-) neoplastischen Potenz in Abgrenzung zu möglichen reaktiven Veränderungen. 1. Erarbeitung einer histomorphologischen Definition der Läsionen 2. Prävalenz der Atypischen Adenomatösen Hyperplasie in Präparaten von Patienten mit Adenokarzinomen 3. Histologische Charakterisierung: a) Gibt es Zeichen der Invasivität? b) Wie ist das Verhältnis der Veränderungen zu benachbarten Tumoren? c) Gibt es Übergänge von einer Epithelalteration in die nächste? 4. Immunhistochemische Befunde: a) Einordnung der Relevanz der eingesetzten immunhistochemischen Methoden b) Wieviel Prozent der Epithelalterationen sind für p53 und erbb2 positiv? c) Bewertung des Proliferationsverhaltens, sowie auftretender genetischer Anomalien der Epithelläsionen. d) Ist das immunhistochemisch dokumentierbare Verhalten der Epithelläsionen in Präparaten mit Adenokarzinomen anders als in solchen mit fibrosierenden Lungenerkrankungen? 5. Einordnung dieser Ergebnisse in die dargestellten Konzepte der Tumorgenese. 30
2 MATERIAL UND METHODEN Untersucht wurden insgesamt 85 Fälle von Adenokarzinomen und 7 fibroseassoziierten Veränderungen der Lunge, bei denen in 21 Fällen das Vorliegen von Epithelveränderungen der bronchioloalveolären Endstrecke festgestellt wurde (siehe Tabelle 7). Die untersuchten Präparate stammten aus Sektionsmaterial und operativ gewonnenen Resektaten aus dem laufenden Untersuchungsgut des Pathologischen Instituts an den Berufsgenossenschaftlichen Krankenanstalten Bergmannsheil Bochum. Von den formalinfixierten Präparaten wurden nach Paraffineinbettung 3-4µm dicke Schnittpräparate angefertigt und zunächst zur Erhebung der primären histomorphologischen Befunde nach Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Immunhistochemische Untersuchungen Für die anschließenden immunhistochemischen Untersuchungen wurden die Präparate auf einen speziellen Kapillarobjektträger der Firma DAKO aufgezogen. Danach erfolgte über Nacht die Trocknung bei 37 Grad Celsius im Wärmeschrank. Nach Entparaffinierung in Xylol, Rehydrierung in absteigender Alkoholreihe und anschließender Spülung in Tris-Puffer (ph 7,2; für 10 min) wurden die Schnitte in Puffer (EDTA-Puffer, 1mMol, ph=8,0) in der Mikrowelle gekocht (3 mal 5 min bei 600 Watt), sowie danach nochmals 15 min im warmen Puffer stehen gelassen. Die weitere Bearbeitung erfolgte im Automaten Chem Mate 500 der Firma DAKO. Nach Verdünnung des Primärantikörpers mit Hilfe eines Diluents (Fa.DAKO,Tris ph 7,2) wurden die Präparate in der so hergestellten Gebrauchslösung für 25 min bei Raumtemperatur inkubiert. 31
Es wurden folgende Verdünnungen verwandt: Tabelle 5: Antikörperverdünnungen Antikörper Verdünnung PCNA 1:1000 MiB1 1:60 P53 1:2500 ErbB2 1:200 Die Durchführung der Negativkontrollen erfolgte durch Auslassen des primären Antikörpers bzw. durch Ersatz desselben durch Normalserum. Für die Färbungen mit polyklonalen Antikörpern (erb2, p53) wurde nach Spülung in Puffer (Puffer-Kit K5006, Fa. DAKO) ein MAR (mouse-anti-rabbit)-serum (1:300 in Diluent verdünnt, Fa. DAKO) zugegeben und nochmals 25 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die mit monoklonalen Antikörpern (MIB1, PCNA) gefärbten Schnitte wurden nur in Puffer gespült. Nach der folgenden 25 minütigen Inkubation mit dem Sekundärantikörper (APAAP-Kit K5000, Fa. DAKO, gebrauchsfertig), erneuter Spülung und der ebenfalls bei Raumtemperatur erfolgten Inkubation mit einem APAAP-Komplex (APAAP-Kit K5000, Fa. DAKO, gebrauchsfertig) für die Dauer von nochmals 25 min, wurden nach Spülung mit Puffer wiederholt LINK (Sekundärantikörper) und APAAP-Komplex für 10 min bei Raumtemperatur aufgegeben. Beim Sekundär- oder Brückenantikörper handelt es sich um Kaninchen-Anti-Maus Immunglobuline aller Isotypen, während der APAAP-Komplex aus monoklonalen Maus Ig G1 Antikörpern besteht, welche spezifisch an die alkalische Phosphatase aus Kälberdarmmukosa gebunden ist. Zur Farbentwicklung kam dann das maximal 10 min vor Gebrauch angesetzte Chromogen des APAAP-Kits (APAAP-Kit K5000, Fa. DAKO, gebrauchsfertig, Farbstoff Neufuchsin) zur Anwendung. 32