5 ZELLATMUNG BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN Im aeroben Metabolismus gebildetes ATP wird zum großen Teil in Mitochondrien synthetisiert und im Cytosol verbraucht. Bei der mitochondrialen ATP-Synthese wird die Oxidation von Substraten wie NADH und Succinat durch Sauerstoff mit der Phosphorylierung von ADP gekoppelt; dieser Prozess heißt oxidative Phosphorylierung. Er wird von Enzymen der inneren Mitochondrienmembran katalysiert, wobei die Energie für die Bildung von ATP von den Oxidationsvorgängen bereitgestellt wird. Die Energieübertragung geschieht durch Ionen-Pumpen, die Protonen ohne begleitende Anionen durch die innere Mitochondrien-Membran transportieren (elektrogener Protonentransport). Dabei entstehen gleichzeitig ein Protonengradient und ein Membranpotential (außen positiv); beide können als Komponenten eines "elektrochemischen Protonengradienten" aufgefasst werden. Bei der NADH-Oxidation verschwinden Protonen aus der Matrix: NADH + H + + ½ O 2 NAD + + H 2 O Der Beitrag dieser skalaren (nicht elektrogenen) Protonen ist gering, da sie bei der Reduktion von NAD + wieder freigesetzt werden, und soll hier nicht weiter besprochen werden. Protonenpumpen, die durch Elektronentransport getrieben werden, sind in den Komplexen I, III und IV enthalten; sie transportieren Protonen in den Intermembran-Raum. Die ATP- Synthase ist eine Protonenpumpe, die diese Protonen zurück in die mitochondriale Matrix fließen lässt und dadurch die Energie für die ATP-Synthese erhält. Auch dieser Protonentransport ist elektrogen, d.h. er findet ohne begleitende Anionen statt. Dieser Mechanismus der oxidativen Phosphorylierung basiert auf der 1961 zuerst formulierten "chemiosmotischen Theorie" des Engländers Peter Mitchell, für die er 1979 den Nobelpreis bekam. Da ATP in der Mitochondrienmatrix synthetisiert, aber in der Regel im Cytosol verbraucht wird, sind Transportvorgänge für Substrat und Produkt der oxidativen Phosphorylierung wichtig. ADP und Phosphat werden in die Matrix und ATP wird in das Cytosol transportiert. Dies geschieht durch zwei Transportsysteme. 1. Die Adeninnukleotid-Translokase ermöglicht den Austausch von Matrix-ATP gegen cytosolisches ADP: Cytosol Matrix ADP -3 ADP -3 ATP -4 ATP -4
6 Dieser Prozess ist elektrogen und wird durch das Membranpotential getrieben: beim ADP/ATP-Austausch wird durch ATP eine negative Ladung mehr in das Cytosol transportiert, als durch ADP in die Matrix gelangt. 2. Der Phosphat-Transporter katalysiert den Austausch von Matrix-OH - gegen cytosolisches Phosphat: Cytosol Matrix ) ) H 2 PO 4 H 2 PO 4 OH ) OH ) oder, davon nicht unterscheidbar, den Kotantransport von Phosphat und Protonen: Cytosol Matrix ) ) H 2 PO 4 H 2 PO 4 H + H + Dieser Prozess ist elektroneutral und wird durch den ph-gradienten getrieben. Die Stöchiometrie der ATP-Bildung bei der Oxidation von NADH oder Succinat wird durch das P/O-Verhältnis (oder ATP/O- oder ADP/O-Verhältnis, je nachdem, welche Reaktion betrachtet wird) ausgedrückt. Theoretisch hängt das ATP/O-Verhältnis von der Zahl der elektrogenen Protonen ab, die 1. im Elektronentransport produziert, 2. bei der ATP-Synthese und 3. während des Substrat- und Produkt-Transports verbraucht werden. Das ATP/O-Verhältnis für die Oxidation von NADH oder Succinat wird gewöhnlich mit 3 bzw. 2 angegeben. Experimentell werden häufiger Werte um 2,5 für NADH und 1,5 für Succinat gefunden. Aus energetischen Gründen kann ATP nicht ohne gleichzeitig ablaufende Redoxvorgänge synthetisiert werden. Umgekehrt würde die Oxidation von NADH oder Succinat ohne gleichzeitige Phosphorylierung nur Wärme erzeugen. Eine kinetische Kontrolle, die Atmungskontrolle, verhindert dies und lässt nennenswert schnelle Oxidation in der Atmungskette nur zu, wenn die Möglichkeit der ATP-Synthese durch Anwesenheit von ADP gegeben ist.
7 Abb. 1: Schematische Darstellung der oxidativen Phosphorylierung Abb. 1 zeigt die wichtigsten Prozesse der oxidativen Phosphorylierung, die in der Mitochondrienmatrix und an der inneren Mitochondrienmembran ablaufen. (I-IV) Komplex I-IV der Atmungskette; (F 1 /F 0 ) ATP-Synthase; (Q) Coenzym Q; (C) Cytochrom c; (T) Adeninnukleotid-Translokase; (P) Phosphat-Transporter; (EH/E - ) Entkoppler im protonierten bzw. dissoziierten Zustand; (dick gestrichelter Pfeil) Elektronenfluss; (dünn gestrichelter Pfeil) Protonentransport. Einige Teilschritte der oxidativen Phosphorylierung lassen sich durch spezifische Inhibitoren hemmen. 1. Der Elektronentransport wird gehemmt a) zwischen NADH und Coenzym Q (Komplex I) durch Rotenon und Barbiturate b) Succinat und Coenzym Q (Komplex II) durch Malonat c) zwischen Coenzym Q und Cytochrom c (Komplex III) durch Antimycin, d) zwischen Cytochrom c und Sauerstoff (Komplex IV) durch Cyanid und Sulfid. 2. Die ATP-Synthese wird durch Oligomycin und DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) direkt gehemmt. Arsenat wirkt indirekt: es wird anstelle von Phosphat mit ADP verknüpft; das so gebildete Arsenyl-ADP hydrolysiert spontan und bildet ADP und Arsenat zurück. 3. Der ADP/ATP-Austausch wird durch Atractylosid gehemmt. 4. Der "elektrochemische Protonengradient" wird durch Entkoppler wie 2,4-Dinitrophenol (DNP) kurzgeschlossen. DNP ist eine schwache Säure, die cytosolische Protonen elektrogen in die Matrix transportiert, indem sie in neutraler Form (EH) in die Matrix diffundiert, dort ein Proton an das alkalischere Milieu abgibt und dann als lipophiles
8 Anion (E - ) vom Membranpotential zurück in das Cytosol (bzw. den Intermembranraum) gezogen wird, wo der Zyklus erneut beginnen kann Cytosol Matrix H + + E ) EH EH H + + E ) E ) E ) Carbonylcyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP), eine schwache Base, ist ebenfalls ein sehr effektiver Entkoppler, dessen Wirkungsmechanismus sich in analoger Weise beschreiben lässt. Cytosol Matrix H + + E ) EH + EH + H + + E ) E E ALLGEMEINE FRAGESTELLUNGEN Zentrale Stoffwechselprozesse: Glykolyse, alkoholische Gärung, Glykogenstoffwechsel und dessen Regulation, Citratzyklus, Atmungskette; Prinzipien und Mechanismen der Stoffwechselregulation; Unterschiedliche Mechanismen der ATP-Bildung; Struktur und Funktion der Mitochondrien; Chemiosmotische Theorie; Membranstruktur; Ionentransport durch die Mitochondrienmembran; Ionen-Pumpen und Ionophore; Prinzipien der Entkopplung; Gruppenübertragungspotentiale; Wasserstoffübertragende Coenzyme; Funktionen von Nucleosidtriphosphaten
9 ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE Mitochondrien, die auf schonende Weise aus frischer Rattenleber isoliert wurden, besitzen die Fähigkeit zur ATP-Synthese. Diese läuft unter Verbrauch von Sauerstoff ab und ist abhängig vom Vorhandensein von ADP und Phosphat. In den folgenden Versuchen sollen - das ADP/O-Verhältnis und der Atmungskontrollkoeffizient unter Verwendung der beiden Substrate 3-Hydroxybutyrat und Succinat ermittelt werden; - der Einfluss von Oligomycin, eines Inhibitors der ATP-Synthase und von Atractylosid, das den ATP/ADP-Austausch hemmt, sowie des Entkopplers 2,4-Dinitrophenol auf die oxidative Phosphorylierung untersucht werden; - der Elektronenfluss der Atmungskette durch selektive Inhibitoren der Komplexe I bis IV gehemmt werden. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL Mitbringliste: Kittel, Lineal, Taschenrechner Für den Versuch werden folgende Lösungen benötigt: - Mitochondriensuspension (20 mg Protein/ml) in isotonischer Pufferlösung - Testpuffer "H" (10 mm K-Phosphat ph = 7.4; 5 mm MgCl 2 ; 20 mm KCl; 0,25 M Mannit) mit 20 mm 3-Hydroxybutyrat - Testpuffer "S" (10 mm K-Phosphat ph = 7.4; 5 mm MgCl 2 ; 20 mm KCl; 0,25 M Mannit) mit 20 mm Succinat - 0,25 M ADP ( auf ph = 7.4 eingestellt) - 0,1 M Succinat - 0,5 M 3-Hydroxybutyrat - 10 mm 2,4-Dinitrophenol (auf ph = 7.4 eingestellt) - 0,5 mm CCCP *) in Ethanol - Oligomycin *) (1 mg/ml in Ethanol) - Atractylosid *) (1 mg/ml in Ethanol) - Rotenon *) (1 mg/ml in Ethanol) - 1,0 M Malonat - Antimycin A *) (2 mg/ml in Ethanol) Formel s. Anlage - 1 M Kaliumcyanid
10 VERSUCHSANORDNUNG: Als Messzelle für alle Versuche dient ein thermostatisierbares Glasgefäß, das eine Sauerstoffelektrode enthält (Abb. 2). Diese besteht aus einem Silber/Platin-Elektrodenpaar, das sich in einer Elektrolytlösung befindet und durch eine gasdurchlässige Teflonmembran umschlossen wird. Ein Verstärker versorgt die Elektroden mit einer Polarisationspannung, wobei Sauerstoff, der sich zwischen den Elektrodenflächen befindet vollständig reduziert wird. Dadurch fließt zwischen den Elektroden ein Strom, der in einem direkten stöchiometrischen Verhältnis zum verbrauchten Sauerstoff steht. Bei ausreichender Durchmischung des Probevolumens (Magnetrührer!) erfolgt über die gasdurchlässige Teflonmembran ein rascher Sauerstoffaustausch zwischen der Probe in der Messzelle und der Elektrolytlösung der Elektrode, so dass der zwischen den Elektroden fließende Strom der jeweiligen Sauerstoffkonzentration in der Probe proportional ist. Dieser Strom wird vom Verstärker in eine Spannung umgewandelt und so verstärkt, dass sich eine Messgröße im Voltbereich ergibt, die mit Hilfe eines A/D-Wandlers und eines PCs in ihrem zeitlichen Verlauf dargestellt werden kann. Auf diese Weise können zeitliche Änderungen der Sauerstoffkonzentration registriert werden; die Steigung einer aufgezeichneten Linie entspricht der Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs. Abb. 2: Versuchsanordnung zur Messung des Sauerstoffverbrauchs von Mitochondrien Messung der Atmungskontrolle und des ADP/O-Verhältnisses mit den Substraten 3- Hydroxybutyrat und Succinat EICHUNG DER SAUERSTOFFELEKTRODE Das Reaktionsgefäß wird mit Wasser gefüllt, das bei Raumtemperatur mit Luft gesättigt ist und daher etwa 250 nmol O 2 /ml enthält. Das Gefäß wird sofort mit einem Glasstopfen
11 verschlossen und der Magnetrührer wird eingeschaltet. Durch Betätigen des Start-Buttons im Programm wird der Messvorgang gestartet. Sobald die auf dem Monitor dargestellte Spannungslinie einen waagerechten oder nur geringfügig abfallenden, linearen Verlauf anzeigt wird dem Wasser etwas Natrium-Dithionit (Reduktionsmittel) zugesetzt: dadurch wird der im Wasser gelöste Sauerstoff verbraucht, und die registrierte Spannung fällt rasch ab, um sich nach kurzer Zeit bei einem niedrigen Wert zu stabilisieren. Die Messung wird durch Anklicken des Stopp-Buttons beendet. Die graphische Darstellung der Messwerte wird dann ausgedruckt. Die Differenz der Spannung vor und nach Zugabe von Dithionit entspricht einer Sauerstoffkonzentration von 250 nmol/ml. BESTIMMUNG DES ATMUNGSKONTROLLKOEFFIZIENTEN UND DES ADP/O-QUOTIENTEN Vor Versuchsbeginn wird die Zelle mit Hilfe einer Vakuumvorrichtung (Pipettenspitze) entleert und dreimal mit Wasser nachgespült. Dabei ist drauf zu achten, dass das Wasser der letzten Spülung möglichst vollständig entfernt wird. Entsprechend dem folgenden Versuchsplan werden dann die Suspension von Rattenlebermitochondrien sowie der jeweils erforderliche Testpuffer in die Messzelle pipettiert. Diese wird sofort mit einem Glasstopfen verschlossen, der mit einer kapillaren Öffnung versehen ist, und der Magnetrührer wird eingeschaltet. Durch Betätigen der Start-Taste im Programm wird der Messvorgang gestartet, und die Sauerstoffkonzentration in der Messzelle kann am Monitor unmittelbar verfolgt werden. Nach Erreichen einer konstanten Geschwindigkeit der Sauerstoffabnahme wird mit Hilfe einer Mikroliterspritze durch die Kapillare des Glasstopfens ADP-Lösung, entsprechend dem Versuchsplan, zugegeben. Nun wird der aktive Zustand der Mitochondrien erreicht und eine erhöhte Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs beobachtet, die so lange anhält, bis das zugegebene ADP nahezu vollständig in ATP umgewandelt ist. Der Sauerstoffverbrauch nimmt wieder ab, die Mitochondrien befinden sich im Ruhezustand. Die erneute Zugabe einer größeren Menge von ADP ergibt das gleiche Bild. Lediglich die Dauer des aktiven Zustandes und damit die Höhe des Sauerstoffverbrauches verändern sich entsprechend der größeren Menge an zugegebenem ADP. Nach Erreichen des Ruhezustandes wird die Messung durch Drücken des Stopp- Buttons beendet. Der Quotient aus den Geschwindigkeiten im aktiven und im Ruhezustand wird als Atmungskontrollkoeffizient bezeichnet. Aus der zugegebenen ADP-Menge und der im aktiven Zustand verbrauchten Sauerstoffmenge lässt sich der ADP/O-Quotient errechnen (siehe Rechenbeispiel).
12 Versuchsplan Versuchsnummer 1.2.1 1.2.2 Benutztes Substrat 3-Hydroxybutyrat Succinat Testpuffer "H" 1,7 ml - Testpuffer "S" - 1,75 ml Mitochondriensuspension 100 µl 50 µl Warten bis eine konstante Abnahme des Sauerstoffverbrauchs erreicht ist! ADP 0,25 M 1 µl 0.5 µl Warten bis der Sauerstoffverbrauch wieder abnimmt und der Ruhezustand erreicht ist! ADP 0,25 M 2 µl 1 µl
13 HEMMUNG DER ATP-BILDUNG DURCH INHIBITOREN UND ENTKOPPLER 2.1 Hemmung der ATP-Synthese und des ADP/ATP-Austausches / Entkopplung durch 2,4-Dinitrophenol Wie in den vorherigen Versuchen (1.2.1 und 1.2.2) wird einer Suspension von Rattenlebermitochondrien in Testpuffer, der 20 mmol/l 3-Hydroxybutyrat enthält, zunächst ADP-Lösung zugesetzt. Nach Erreichen der Ruhephase werden die jeweiligen Inhibitoren und etwa 1 min später weiteres ADP zugegeben, das nun keinen Effekt mehr zeigt. Erst die Zugabe des Entkopplers 2,4-Dinitrophenol stimuliert den Sauerstoffverbrauch. Versuchsplan Versuchsnummer 2.1.1 2.1.2 Benutzter Inhibitor Oligomycin Atractylosid Testpuffer "H" 1,7 ml 1,7 ml Mitochondriensuspension 100 µl 100 µl Warten bis eine konstante Abnahme des Sauerstoffverbrauchs erreicht ist! ADP 0,25 M 1 µl 1 µl Warten bis der Sauerstoffverbrauch wieder abnimmt und der Ruhezustand erreicht ist! Oligomycin (1 mg/ml) 1 µl - Atractylosid (1 mg/ml) - 1 µl ca. 1 min warten ADP 0,25 M 1 µl 1 µl ca. 1 min warten 2,4-Dinitrophenol (10 mm) 2 µl 2 µl
14 2.2 Hemmung des Elektronentransports Rattenlebermitochondrien werden in den jeweils angegebenen Substrat-Pufferlösungen suspendiert. Sobald ein konstanter Sauerstoffverbrauch zu beobachten ist, wird die Atmung durch Anwendung des Entkopplers CCCP aktiviert. Die Zugabe von Inhibitoren und weiteren Substraten erfolgt entsprechend dem Versuchsplan. Versuchsplan Versuchsnummer 2.2.1 2.2.2 benutztes Substrat 3-Hydroxybutyrat Succinat benutzte Inhibitoren Rotenon / Antimycin A Malonat / Canidé Testpuffer "H" 1,7 ml - Testpuffer "S" - 1,75 ml Mitochondriensuspension 100 µl 50 µl Warten bis eine konstante Abnahme des Sauerstoffverbrauchs erreicht ist! CCCP 0,5 mm 1 µl 1 µl ca. 40 sec warten Rotenon (1 mg/ml) 1 µl - Malonat 1,0 M - 10 µl ca. 2 min warten Succinat 0,1 M 10 µl - 3-hydroxybutyrat 0,5 M - 10 µl ca. 40 sec warten Antimycin A (2mg/ml) 1 µl - Kaliumcyanid 1M - 1 µl
15 AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION 1. Berechnung des ADP/O-Verhältnisses und des Atmungskontrollkoeffizienten Die Auswertung der Versuche erfolgt entsprechend den Abbildungen 3a und 3b. Entnehmen Sie die Resultate dem bei der Versuchsdurchführung ausgedruckten Diagramm und übertragen Sie diese in die entsprechenden leeren Kästchen der Abb. 4 (Messdaten). 1) Berechnen Sie aus den Ergebnissen der Versuche 1.1, 1.2.1 und 1.2.2 folgende Größen: a) die ADP/O-Quotienten für die Substrate 3-Hydroxybutyrat und Succinat b) die Reaktionsgeschwindigkeiten (nmol O/(min mg Protein)) für den aktiven Zustand und den Ruhezustand mit beiden Substraten c) die Atmungskontrollkoeffizienten für beide Substrate. 2. Vergleichen Sie die Geschwindigkeiten des Sauerstoffverbrauchs im aktiven Zustand, die Atmungskontrollkoeffizienten und die ADP/O-Quotienten für die Substrate 3- Hydroxybutyrat und Succinat. Warum verwenden wir bei Mitochondrienversuchen 3- Hydroxybutyrat statt NADH? 2. Einfluss von Inhibitoren und Entkoppler auf den Sauerstoffverbrauch von Rattenlebermitochondrien 1) zu Versuch 2.1.1 und 2.1.2: a) Welches sind die Angriffspunkte für die Inhibitoren Oligomycin und Atractylosid? b) Warum lässt sich in Anwesenheit dieser Inhibitoren die Aktivität der Atmung zwar durch Entkoppler, nicht aber durch ADP steigern? 2) zu Versuch 2.2.1 und 2.2.2 a) Worin unterscheidet sich die Wirkung der in dieser Versuchsgruppe benutzen Inhibitoren von derjenigen der im vorherigen Experiment (2.1.1 und 2.1.2) eingesetzten Hemmstoffe? b) Ordnen Sie die einzelnen Inhibitoren den entsprechenden Enzymen zu! Inwieweit lässt sich diese Zuordnung durch das Versuchsergebnis bestätigen?
16 Rechenbeispiel zu Aufgabe 1.1a) Der ADP/O-Quotient gibt das Verhältnis von ADP-Einsatz und Sauerstoffverbrauch, bezogen auf atomaren Sauerstoff, an. nmol ADP ADP/O 2 nmol O 2 Der Sauerstoffverbrauch wird aus dem ausgedruckten Diagramm ermittelt, wie in Abb. 3.dargesellt. Dazu werden im Bereich des 2. und 3. Ruhezustandes der Sauerstoffverbrauchskurve (Abb. 3b) Tangenten angelegt. Die Strecke x entspricht dem Sauerstoffverbrauch für die vorgegebene Menge an ADP. Die Strecke y in Abb. 3a gibt die Differenz der Sauerstoffkonzentration von Wasser, welches bei Raumtemperatur mit Luft gesättigt wurde, und von praktisch sauerstofffreiem Wasser an und entspricht somit einer O 2 -Konzentration von 250 nmol/ml. Abb. 3a: Abb. 3b: Eichung der Sauerstoffelektrode Berechnung des Sauerstoffverbrauchs
17 Für den Sauerstoffverbrauch gilt dann: Sauerstoffverbrauch 250 nmol y ml V T x Im folgenden Beispiel beträgt das Volumen des Testansatzes (V T ) 1,8 ml; y entspricht 7,2 cm und x = 2,6 cm. Sauerstoffverbrauch 250 nmol 1,8 ml 2,6 cm 7,2 cm ml = 162 nmol O 2 Die Aktivierung der mitochondrialen ATP-Synthese erfolgte durch Zugabe von 2 µl 0,25 M ADP-Lösung, das entspricht 500 nmol ADP. Daraus ergibt sich: ADP/O 500 nmol 2 162 nmol 1,54 zu Aufgabe 1b) Reaktionsg eschwindigkeit Sauerstoffverbrauch/min = mg Protein im Ansatz Der Sauerstoffverbrauch pro Minute wird entsprechend dem Sauerstoffverbrauch in Beispiel 1a) berechnet. Dabei wird jedoch der Ausdruck x (= Sauerstoffverbrauch) durch x/min (= Sauerstoffverbrauch pro Minute) ersetzt. (Beachten Sie bitte, dass die eingesetzten Proteinmengen (20 mg/ml) bei den einzelnen Versuchsansätzen differieren können!) zu Aufgabe 1c) Atmungskoeffizient Reaktionsgeschwindigkeit im aktiven Zustand Reaktionsgeschwindigkeit im Ruhezustand
18 Ergebnisse zu Versuch 1.2.1 und 1.2.2 Substrat 3-Hydroxybutyrat Succinat Sauerstoffverbrauch in der aktiven Phase (nmol O 2 ): Eingesetzte Menge an ADP (nmol): ADP/O-Quotient: Sauerstoffverbrauch/min in der Ruhephase (nmol O 2 /min): Sauerstoffverbrauch/min in der aktiven Phase (nmol O 2 /min): Eingesetzte Menge an Protein (mg): Reaktionsgeschwindigkeit in der Ruhephase (nmol O/(min mg Protein)): Reaktionsgeschwindigkeit in der aktiven Phase (nmol O/(min mg Protein)): Atmungskontrollkoeffizient:
19 zu Versuch 2.1.1 und 2.1.2 zu Versuch 2.2.1 und 2.2.2
SCHLUSSFOLGERUNGEN 20
F. ANHANG 21
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