10 Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit wurden neuartige Ir III und Rh III Organometallkomplexe der Verbindungsklassen [(η 5 -Cp*)ML(XX )] n+, [(η 5 -Cp*)M(XX X )] n+ und fac-[ircl 3 (DMSO)(pp)] synthetisiert und spektroskopisch charakterisiert. Die räumliche Struktur ausgewählter Komplexe wurde mittels Röntgenstrukturanalyse bestimmt. Nach Variation des bi- bzw. tridentaten Chelatliganden XX und XX X, des monodentaten Liganden L und des Zentralmetalls wurden 1 H-NMR-kinetische Studien hinsichtlich der Substitutionsgeschwindigkeit der Komplexe mit Biomolekül modellierenden Verbindungen vorgenommen, sowie Methoden zur Bestimmung ihrer DNA-Bindungseigenschaften angewandt. Die dabei gewonnenen Informationen geben entscheidende Hinweise für eine mögliche Zytotoxizität der Komplexe. Die Chloro- Komplexe können in guter Ausbeute durch Fällung zweier Chloride der Ausgangsverbindungen [{(η 5 -Cp*)IrCl(μ-Cl)} 2 ] bzw. [{(η 5 -Cp*)RhCl(μ-Cl)} 2 ] und anschließender Umsetzung mit dem jeweiligen Chelatliganden XX erhalten werden. Durch Fällung des verbleibenden Chloro-Liganden und Umsetzung mit einem monodentaten Liganden L sind die weiteren Komplexe in Ausbeuten zwischen 66 % und 86 % zugänglich. Dies lässt sich auch für die Komplexe bestätigen, bei denen von den Ausgangsverbindungen alle Chloride stöchiometrisch gefällt wurden, und die Umsetzung mit tridentaten Liganden XX X erfolgte. Die Trichloroiridium(III)- Komplexe fac-[ircl 3 (DMSO)(pp)] konnten durch stöchiometrische Reaktion mit den jeweiligen Polypyridylliganden (pp) in guter Ausbeute erhalten werden. Die Pentamethylcyclopentadienyl-Komplexe weisen eine für Halbsandwichverbindungen typische Piano-Stool -Konformation auf. UV/Vis-spektroskopischen Studien zeigen, dass die Gleichgewichtseinstellung bei der Umsetzung der Komplexe mit CT-DNA im Verhältnis r = [Komplex]/[DNA] von 0.1 und T = 293 K sehr rasch erfolgt. Die dabei ermittelten Zeiten für die Chloro-, Tetramethylthioharnstoff- und Thiolat-Komplexe, reichen von weniger als fünf Minuten für die Chloro-Komplexe [(η 5 -Cp*)RhCl(dpq-κ 2 N)](CF 3 SO 3 ) und [(η 5 -Cp*)RhCl(dppz-κ 2 N)](CF 3 SO 3 ) bis hin zu 20 bis 30 Minuten für die Tetramethylthioharnstoff Komplexe [(η 5 -Cp*)Rh(dppzκ 2 N){(NMe 2 ) 2 SC-κS}](CF 3 SO 3 ) 2 und [(η 5 -Cp*)Rh(dppn-κ 2 N){(NMe 2 ) 2 SC-κS}] 2+ (CF 3 SO 3 ) 2. Die schnellen Gleichgewichtseinstellungen weisen auf einen eindeutig bevorzugten Bindungsmodus hin. Bei einer Konkurrenz zwischen kovalenter Bindung, - 153 -
groove binding und Intercalation kann es mehrere Stunden dauern, bis keine zeitabhängigen Extinktionsänderungen im UV/Vis-Spektrum zu beobachten sind. Die UV/Vis-spektroskopische Untersuchung von Komplex [(η 5 -Cp*)RhCl(dppzκ 2 N)](CF 3 SO 3 ) mit CT-DNA zeigt eine starke Abnahme der Absorption des charakteristischen π-π*-übergangs bei λ = 364 nm von -47 % mit einer bathochromen Verschiebung der Banden von 5 nm. Die analoge Extinktionsabnahme für den Komplex [(η 5 -Cp*)Rh(dppz-κ 2 N){(NMe 2 ) 2 SC-κS}](CF 3 SO 3 ) 2 beträgt ΔA/A = -41 % mit einer Rotverschiebung von 3 nm. Dies ist typisch für eine Intercalation in die DNA. Für den Komplex [(η 5 -Cp*)RhCl(dppn-κ 2 N)](CF 3 SO 3 ) beträgt die Abnahme der Extinktion bei λ = 323 nm den Wert von ΔA/A = -46 % und [(η 5 -Cp*)Rh(dppn-κ 2 N){(NMe 2 ) 2 SCκS}](CF 3 SO 3 ) 2 zeigt bei der UV/Vis-Untersuchung mit CT-DNA eine signifikante Abnahme der Extinktion von ΔA/A = -38 % und eine Rotverschiebung um 9 nm bei einer Wellenlänge von λ = 327 nm. Abbildung 10.1 UV/Vis-Spektrum des Komplexes [(η 5 -Cp*)RhCl(dppz-κ 2 N)](CF 3 SO 3 ) vor und nach Inkubation mit CT-DNA Die (η 5 -Cp*)Rh III -Komplexe weisen bei den Untersuchungen zur thermischen Denaturierung der CT-DNA unterschiedliche Schmelztemperaturänderungen ΔT m (DNA) bei einem Verhältnis r = [Komplex]/[DNA] von 0.1 auf. Diese Unterschiede können zum einen durch die unterschiedliche Ladung von +1 bei den Thiolat- - 154 -
Komplexen im Gegensatz zu einer zweifach positiven Ladung bei den Tetramethylthioharnstoff-Komplexen sowie bei den durch einen schnelle Chlorid- Austausch erhaltenen Aqua-Komplexe [(η 5 -Cp*)Rh(H 2 O)(pp)] 2+ erklärt werden. Zum anderen geben sie Hinweise über unterschiedliche Bindungsmodi. Auf diese Art kann zwischen einer intercalativen und einer kovalenten bzw. Oberflächen-Bindung unterschieden werden. Die deutliche Erhöhung der ΔT m -Werte der Intercalatoren, mit pp = dpq und dppz im Vergleich zu denen der anderen Verbindungen, kommt durch eine zusätzliche Stabilisierung der DNA-Doppelhelix über π-π-stapelwechselwirkungen zustande. Die dppn-komplexe gehen eine Oberflächenstapelung an der DNA ein. Die ermittelten Schmelztemperaturänderungen (Tabelle 10.1) stehen in Übereinstimmung mit den UV/Vis-spektroskopischen Untersuchungen. Fragment L en bpy phen dpq dppz dppn (η 5 -Cp*)Rh III Cl -4-5 -1 6 12 7 {SC(NMe 2 ) 2 } - - - 8 12 6 Tabelle 10.1 Schmelztemperaturerhöhungen ΔT m (± 1 C) für die Wechselwirkung der Metallkomplexe (16) (24) mit CT-DNA Die Verbindungen mit den kleineren Chelatliganden pp = en, bpy, phen weisen hingegen eine kovalente DNA-Wechselwirkung und negative ΔT m -Werte auf. Bei den neutralen Trichloroiridium(III)-Komplexen wird keine signifikante Veränderung der DNA-Schmelztemperatur beobachtet, was das Fehlen einer DNA-Intercalation anzeigt. - 155 -
Abbildung 10.2 CD-Spektren von CT-DNA mit [(η 5 -Cp*)RhL(dppz-κ 2 N)](CF 3 SO 3 ) n nach 24 h Inkubation bei 25 C Diese Interpretationen werden durch die CD-spektroskopischen Untersuchungen gestützt, da induzierte CD-Signale für die Chloro- und Tetramethylthioharnstoff- dpqund dppz-komplexe nachgewiesen werden. Ein DNA-Konformationswechsel wurde aber nicht beobachtet. Der sterische Anspruch und die Wahl der Liganden zeigen auch, dass eine Intercalation durch intramolekulare Wechselwirkungen unterdrückt werden kann. So bevorzugen die Thiolatkomplexe eine π-π-eigenstapelung ihrer Ligandsysteme, die dppn-rh III -Komplexe hingegen eine Oberflächenstapelung an der DNA. Abbildung 10.3 Molekülstruktur von [(η 5 -Cp*)Rh(dppz-κ 2 N){C 10 H 7 S-κS}] + - 156 -
Eine Bestätigung für die Intercalation der dpq- und dppz-verbindung wird durch die Auswertung der viskosimetrischen Messungen gewonnen. So gibt die jeweils in Abhängigkeit von der Metallkomplexkonzentration aufgenommene Messung einen signifikanten Anstieg der Viskosität aufgrund einer deutlichen Verlängerung der DNA. Abbildung 10.4 Viskosimetrische Titrationen von CT-DNA mit den (η 5 -Cp*)-Rh-Chloro-Komplexen in 10 mm Phosphatpuffer (ph = 7.2) Im Gegensatz zu dieser signifikanten Verlängerung der DNA fällt auf, dass bei den Komplexen mit pp = en, bpy, phen, dppn durchgängig keine Änderung oder sogar eine Verkürzung der DNA-Länge auftritt. Dieses Phänomen ist ein Indiz für das Zustandekommen einer kovalenten Bindung (pp = en, bpy, phen) bzw. intermolekularer Oberflächenstapelung der Polypyridylliganden (pp = dppn). Die 1 H-NMR-spektroskopischen Untersuchungen zum Substitutionsverhalten der Organometallkomplexe haben gezeigt, dass durch die Designstrategie, über die Wahl der Liganden, Substitutionsraten erreicht werden können, die der Größenordnung schon bekannter zytotoxischer [(η 6 -aren)ru(ii)-komplexen entsprechen. Die bestimmten Geschwindigkeiten liegen somit in dem Zeitfenster einer möglichen kinetischen gesteuerten zytotoxisch relevanten Inertaktion mit der DNA. Allerdings konnte für die (η 5 -Cp*)Ir III - und (η 5 -Cp*)Rh III -Komplexe kein Zusammenhang zwischen der Geschwindigkeit der Reaktion mit Nukleobasen und der Zytotoxizität festgestellt werden. Für die Komplexe fac-[ircl 3 (DMSO)(pp)] konnte aber gezeigt werden, dass - 157 -
durch die Substitution des DMSO-Liganden durch schwefelhaltige Biomoleküle bevorzugte Wechselwirkungen mit weiteren Targets möglich sind. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass der dppz-ligand die optimal Größe für eine Intercalation der (η 5 -Cp*)Rh III -Komplexe in die DNA besitzt. Eine Intercalation ist ebenso für die dpq-komplexe nachgewiesen worden. Der dppn-ligand geht aufgrund seines größeren aromatischen Systems bevorzugt eine Oberflächenwechselwirkung mit der DNA ein. Die Labilität der Iridium-Cl-Bindung und der Rhodium-Cl-Bindung führt für die kleineren Liganden pp = en, bpy, phen dazu, dass kovalente M-N(Nucleobase) Bindungen thermodynamisch begünstigt sind. Die Zellaufnahme durch die Membrane spielt eine bedeutendere Rolle bei dem Auslösen von zytotoxischen Mechanismen. Es wird festgestellt, dass durch die Modifikation der Polypyridylliganden pp bzw. des monodentaten Liganden L die Hydrophobizität von Komplexen so beeinflusst werden können, dass beachtliche intrazelluläre Komplexkonzentrationen (Zellaufnahmen) erhalten werden konnten. Dieses Verhalten erhöht nachweisbar das zytotoxische Potenzial der ausgewählten Verbindungen. Komplexe des Typs fac-[ircl 3 (DMSO-κS)(pp)] zeigen sehr gute antiproliferative Eigenschaften bei niedrigen Zellaufnahmen. Offensichtlich reichen schon nur geringe Konzentrationen innerhalb der Zelle, um eine signifikante Zytotoxizität auszulösen. IC 50 HT-29 [µm] MCF-7 [µm] [(η 5 -Cp*)RhCl(phen-κ 2 N)] + 8.0 ±1.6 4.7 ±0.1 [(η 5 -Cp*)RhCl(dpq-κ 2 N)] + 8.5 ±0.3 5.1 ±0.2 [(η 5 -Cp*)RhCl(dppz-κ 2 N)] + 4.3 ±0.2 1.5 ±0.4 [(η 5 -Cp*)RhCl(dppn-κ 2 N)] + 3.2 ±0.5 0.8 ±0.0 [(η 5 -Cp*)Rh(dppz-κ 2 N){C 6 H 5 S-κS}] + 6.1 ±0.5 0.64 ±0.08 [(η 5 -Cp*)Rh(dppz-κ 2 N){C 10 H 7 S-κS}] + 3.3 ±0.2 0.56 ±0.25 Tabelle 10.2 IC 50 -Werte für [(η 5 -Cp*)RhL(pp-κ 2 N)] + an den Zelllinien HT-29 und MCF-7 Bei den Rhodium(III)-Polypyridyl-Komplexen ist eindeutig erkennbar, dass der Trend eines gesteigerten zytotoxischen Potenzials mit der Größe der aromatischen Liganden in Zusammenhang steht. Je ausgedehnter das aromatische System des Liganden ist, umso bessere IC 50 -Werte werden erzielt. - 158 -
Abbildung 10.5 Graphische Darstellung der IC 50 -Werte für [(η 5 -Cp*)RhL(pp-κ 2 N)] + an den Zelllinien HT-29 und MCF-7 Zellaufnahme HT-29 MCF-7 [ng Rh/mg Protein] 100µM 100µM [(η 5 -Cp*)RhCl(phen-κ 2 N)] + 10.1 ± 1.9 11.9 ± 2.9 [(η 5 -Cp*)RhCl(dpq-κ 2 N)] + 4.1 ± 1.7 11.3 ± 0.5 [(η 5 -Cp*)RhCl(dppz-κ 2 N)] + 42.2 ± 4.4 45.0 ± 2.5 [(η 5 -Cp*)RhCl(dppn-κ 2 N)] + 378.1 ± 66.0 189.3 ± 15.5 1µM 1µM [(η 5 -Cp*)Rh(dppz-κ 2 N){C 6 H 5 S-κS}] + 20.7 ± 9.0 59.2 ± 2.8 [(η 5 -Cp*)Rh(dppz-κ 2 N){C 10 H 7 S-κS}] + 17.8 ± 2.2 76.1 ± 29.2 Tabelle 10.3 Ergebnisse der Zellaufnahmetests für [(η 5 -Cp*)RhL(pp-κ 2 N)] + an den Zelllinien HT-29 und MCF-7 Die Daten zu den Zellaufnahmeexperimenten bestätigen eindeutig, dass mit zunehmender Größe der Polypyridylliganden die Hydrophobizität der Komplexe gesteigert wird, was eine verbesserte Migration durch die Zellmembrane begünstigt. Für die dppz-komplexe werden mit monodentaten aromatischen Thiolatliganden Zellaufnahmen bei einer Inkubationskonzentration von nur 1 µm schon 20.7 ng Rh/mg Protein für Komplex [(η 5 -Cp*)Rh(dppz-κ 2 N){C 6 H 5 S-κS}] + und - 159 -
17.8 ng Rh/mg Protein für Komplex [(η 5 -Cp*)Rh(dppz-κ 2 N){C 10 H 7 S-κS}] + an HT-29 Zellen nachgewiesen, was einer 40-fachen, bzw, 34-fachen höheren Konzentration in der Zelle entspricht. An MCF-7 Zellen beträgt die interne Komplexkonzentration von [(η 5 -Cp*)Rh(dppzκ 2 N){C 6 H 5 S-κS}] + dem der 65-fachen der externen Inkubationskonzentration. Bei Komplex [(η 5 -Cp*)Rh(dppz-κ 2 N){C 10 H 7 S-κS}] + wird sogar eine 85-fache Anreicherung in der Zelle nachgewiesen. Abbildung 10.6 Graphische Darstellung der Zellaufnahme für die Komplexe [(η 5 - Cp*)Rh(dppz-κ 2 N){C 6 H 5 S-κS}] + und [(η 5 -Cp*)Rh(dppz-κ 2 N){C 10 H 7 S-κS}] + an den Zelllinien HT-29 und MCF-7 bei Inkubation mit 1µM und 10 µm - 160 -