Doping im Pferdesport. dopingrelevante Mittel und Futterzusätze. M. Kietzmann, Hannover

Doping im Pferdesport dopingrelevante Mittel und Futterzusätze M. Kietzmann, Hannover

Definition Doping Verboten ist die Verabreichung eines jeden Mittels, das geeignet ist, die aktuelle und natürliche Leistungsfähigkeit eines Pferdes zum Zeitpunkt des Rennens zu verändern. Die Verabreichung von Mitteln, welche den Nachweis solcher Substanzen beeinträchtigen können, ist ebenfalls verboten. Insbesondere verboten sind solche Substanzen, welche eine der in den Dopinglisten aufgeführten pharmakologischen Wirkungen direkt oder indirekt, als Haupt- oder Nebenwirkung entfalten. Wenn bei den Dopingkontrollen eine beliebige Menge einer verbotenen Substanz oder einer ihrer Metaboliten im Gewebe oder in den Körperflüssigkeiten nachgewiesen wird, ist das Pferd als gedopt zu bezeichnen.

Doping und Arzneimitteleinsatz Dopingsubstanzen (im eigentlichen Sinn) Verbotene Arzneimittel Ausnahmen Die Behandlung eines erkrankten Pferdes muss möglich sein, ohne gegen Dopingbestimmungen zu verstoßen. Diesbezüglich werden diskutiert: Nulllösung Grenzwerte Karenzzeiten

Dopingrelevante Substanzen Leistungsbeeinflussende Substanzen Stimulantia Sedativa und Narkotika Anabolika Diuretika Peptidhormone und Analoga Verbotene Arzneimittel (Substanzen, die als Arzneimittel eingesetzt werden, jedoch im Wettkampf verboten sind) Substanzen mit Wirkung auf Nervensystem, Herz-Kreislauf- System, Atmungssystem, Verdauungssystem, Harn-System, Geschlechtsorgane, Muskel- und Skelettsystem, Haut, Infektionserreger

Dopingrelevante Substanzen Ausnahmen (Anwendung/Verabreichung in zeitlichem Zusammenhang mit der Wettkampfteilnahme erlaubt) Impfstoffe Endoparasitika Paramunitäts-Inducer externe Desinfektionsmittel und Insektenschutzmittel

Nulllösung Zum Zeitpunkt des Wettkampfes darf sich keine körperfremde Substanz im Pferd befinden.

Grenzwertkonzept Blut/Harnspiegel 0,6 0,4 0,2 Wirkgrenze Unterschreiten der Wirkgrenze Bestimmungsgrenze Nachweisgrenze Bestimmungsgrenze (LOQ) Nachweisgrenze (LOD) 0 Zeit 0 6 12 18 24 RLOQ = empfohlene Bestimmungsgrenze

Grenzwertkonzept qualitative Bestimmung quantitative Bestimmung Grenzkonzentrationen ohne pharmakologischen Effekt nur für therapeutisch eingesetzte Substanzen geeigneter Analyt (Rückschluß auf Wirkung) Blutkonzentrationen korrelieren besser mit pharmakologischem Effekt als Urinkonzentrationen Grenzkonzentrationen im Blut teilweise kleiner als aktuelle Nachweisgrenzen Berechnung von Absetzfristen?

Grenzwertkonzept Blut/Harnspiegel 0,6 0,4 0,2 Bestimmungsgrenze (LOQ) Nachweisgrenze (LOD) 0 Bestimmungsgrenze Nachweisgrenze Zeit 0 6 12 18 24

Grenzwertkonzept qualitative Bestimmung quantitative Bestimmung Grenzkonzentrationen ohne pharmakologischen Effekt nur für therapeutisch eingesetzte Substanzen geeigneter Analyt (Rückschluß auf Wirkung) Blutkonzentrationen korrelieren besser mit pharmakologischem Effekt als Urinkonzentrationen Grenzkonzentrationen im Blut teilweise kleiner als aktuelle Nachweisgrenzen Berechnung von Absetzfristen?

Berechnung irrelevanter Plasma- und Urinkonzentrationen PK/PD-Modell nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) EPC = Dosierung Clearance [ng/ml] Effektive Plasmakonzentration Ineffektive Plasmakonzentration IPC = EPC SF [ng/ml] SF = 500 IUC = IPC x R ss [ng/ml] R ss = durchschnittliche Urinkonzentration durchschnittliche Plasmakonzentration Ineffektive Urinkonzentration

Wirkungsdauer und Ausscheidungszeit beim Pferd Wirkstoff pharmakologische Ausscheidungszeit* [h] Wirkung [h] Blut Harn Fentanyl 0,5-1 2-3 96 Pentazocin 1 60 100 Apomorphin 1 1,5 48 Coffein 72 144 226 Acepromazin 3 8 Reserpin 240 120 Flunixin > 12 3-5 48 Phenylbutazon 12-36 216 336 Procain 4 >12 300 Furosemid 4 5-12 72 * in Abhängigkeit von der Analytik

Analytik Beispiel: Detomidin [Tobias, 2004] Nachweis von Detomidin im Plasma und Urin mittels HPLC/MS/MS Validierung der Methode bezüglich Selektivität und Spezifität, Linearität, Richtigkeit, Präzision, Stabilität und Wiederfindung. Bestimmungsgrenze im Plasma: 2,09 ng/ml im Urin: 10 ng/ml (3-Hydroxydetomidin) 50 ng/ml (Carboxydetomidin) Nachweisgrenze im Plasma: im Urin: 1,67 ng/ml 10 ng/ml (3-Hydroxydetomidin) 50 ng/ml (Carboxydetomidin)

Plasmakonzentrationsverlauf von Detomidin nach einmaliger intravenöser Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden LOQ

Plasmakonzentrationsverlauf von Detomidin nach einmaliger intravenöser Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden (halblogarithmische Darstellung) LOQ

Pharmakokinetische Daten nach einmaliger Applikation von 20 µg/kg Detomidin-Hydrochlorid bei 10 Pferden (Mittelwert, Standardabweichung, Variationskoeffizient)

Sedationsgrad (Score-System für Ptosis sowie Reaktion auf akustischen Reiz und visuellen Reiz) versus Plasmakonzentration nach einmaliger i.v. Gabe von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM LOQ

Konzentrationsverlauf von 3-Hydroxydetomidin im Urin nach einmaliger intravenöser Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bei 10 Pferden (Aufarbeitung mit Hydrolyse) LOQ

Kumulative Darstellung der im Urin ausgeschiedenen Menge 3-Hydroxydetomidin nach einmaliger intravenöser Applikation von 20 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM bis 48 Stunden p. a.

Ergebnisse der Berechnungen von EPC, IPC und IUC nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) (Dosierung 16,76 µg Detomidin-Hydrochlorid/kg KM, Dosierungsintervall 4 Stunden)

Ergebnis der Detomidin-Studie Nachweisgrenzen werden im Plasma nach 3 Stunden und im Urin nach 30 Stunden unterschritten. irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen für Detomidin liegen unterhalb der Nachweisgrenze (im PK/PD-Modell nach TOUTAIN und LASSOURD bei angenommenen Dosierungsintervallen von 4 Stunden) jeglicher Nachweis von Detomidin ist ein positiver Dopingbefund relativ geringe Anzahl von Versuchstieren (n = 10) und beachtenswerte interindividuelle Unterschiede keine auf die Gesamtpopulation übertragbare Aussage zu Ausscheidungs- oder Karenzzeiten möglich

Analytik Beispiel: Dembrexin [Massmann, 2004] Nachweis von Dembrexin im Plasma und Urin mittels HPLC/MS/MS Validierung der Methode bezüglich Selektivität und Spezifität, Linearität, Richtigkeit, Präzision, Stabilität und Wiederfindung. Bestimmungsgrenze im Plasma: 5 ng/ml im Urin: 5 ng/ml Nachweisgrenze im Plasma: im Urin: 50 ng/ml 50 ng/ml

concentration (ng/ml) concentration (ng/ml) 800 700 Plasma- und Urinkonzentration von Dembrexin beim Pferd nach einmaliger Gabe 800 600 600 "Lorbas" 500 400 300 200 400 200 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 "Bill" "Archi" "Wotan" "Bacculus" "Sinus" "Serjoscha" "Arnold" 15000 15000 Urin 100 12500 12500 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 time afer administration (h) Plasma 10000 7500 5000 10000 7500 5000 2500 0 0 10 20 30 2500 0 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 time after administration (h)

concentration (ng/ml) Ergebnis der Dembrexin-Studie [Massmann, 2004] IPC 0,1 ng/ml 800 700 800 IUC 4,1 ng/ml 600 500 600 400 "Lorbas" "Bill" "Archi" 400 200 "Wotan" "Bacculus" 300 0 "Sinus" 200 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 "Serjoscha" "Arnold" RLOQ 50,0 ng/ml 100 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 time afer administration (h) Ausscheidungszeit nach wiederholter oraler Gabe: 4 Tage

Grenzwertkonzept qualitative Bestimmung quantitative Bestimmung Grenzkonzentrationen ohne pharmakologischen Effekt nur für therapeutisch eingesetzte Substanzen geeigneter Analyt (Rückschluß auf Wirkung) Blutkonzentrationen korrelieren besser mit pharmako-logischem Effekt als Urinkonzentrationen Grenzkonzentrationen im Blut teilweise kleiner als aktuelle Nachweisgrenzen Ermittlung von Nachweiszeiten Berechnung von Absetzfristen?

Nachweiszeiten (EHSLC) Substanz Dosierung (mg/kg) Appl.-Art Nachweiszeit (Std., Tage) Phenylbutazon 4,4-8,8 oral, i.v. 168 (7) Flunixin 1 i.v. 144 (6) Carprofen 0,7 i.v. 264 (11) Ketoprofen 2,2 i.v. 96 (4) Meloxicam 0,6 oral, i.v. 72 (3) Eltenac 0,5 i.v. 192 (8) Metamizol 30 i.v. 72 (3) Vedaprofen 2 i.v. 96 (4) Furosemid 1 i.v. 48 (2) Das EHSLC übernimmt keinerlei Haftung oder Verantwortung für mittelbare oder unmittelbare Folgen für die Anwendung der veröffentlichten Daten.

Wichtige Aspekte bezüglich der Festsetzung von Absetzfristen Dosierung Pharmakokinetik: Elimination (Clearance, Halbwertszeit) Verteilung (tiefe Kompartimente) Nachweisgrenze der Analytik

Dosisabhängiger Effekt von starken Analgetika auf die spontane Lokomotion beim Pferd UNNAMED EXP.DRUG

Prednisolonkonzentration und Cortisolsuppression nach oraler Behandlung beim Pferd

Dexamethasone plasma concentration and cortisol suppression ng/ml 2.0 1.6 1.2 0.8 Dexamethasone plasma concentration 6 horses, treatment with Voren Suspension 20 µg/kg i.v. Treatment with Voren Suspension, 20 µg/kg, i.v. (mean ± S.D., 6 horses) ng/ml 0.4 0.0 120 100 80 60 40 LOQ (0.25 ng/ml) 0 48 96 144 192 240 288 336 384 hours Cortisol plasma concentration 6 horses, treatment with Voren Suspension, 20 µg/kg i.v. 20 0 0 48 96 144 192 240 288 336 384 hours

Dexamethasone urine concentration and cortisol suppression ng/ml 60 50 40 30 Dexamethasone urine concentration 6 horses, treatment with Voren Suspension, 20 µg/kg i.v. Treatment with Voren Suspension, 20 µg/kg, i.v. (mean ± S.D., 6 horses) 20 10 0 120 100 80 LOQ (1.0 ng/ml) 0 96 192 288 384 480 hours Cortisol plasma concentration 6 horses, treatment with Voren Suspension, 20 µg/kg i.v. ng/ml 60 40 20 0 0 96 192 288 384 480 hours

Dexamethasone plasma concentration and cortisol suppression Treatment with Voren Depot, 60 µg/kg, i.v. (mean ± S.D., 6 horses) ng/ml 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 120 100 80 Dexamethasone plasma concentration 6 horses, treatment with Voren Depot, 60 µg/kg i.m. LOQ (0.25 ng/ml) 0 48 96 144 192 240 288 336 384 432 480 hours Cortisol plasma concentration 6 horses, treatment with Voren Depot, 60 µg/kg i.m. ng/ml 60 40 20 0 0 48 96 144 192 240 288 336 384 432 480 hours

Dexamethasone urine concentration and cortisol suppression ng/ml 20 16 12 8 Dexamethasone urine concentration 6 horses, treatment with Voren Depot, 60 µg/kg i.m. Treatment with Voren Depot, 60 µg/kg, i.v. (mean ± S.D., 6 horses) 4 0 120 100 80 LOQ (1.0 ng/ml) 0 96 192 288 384 480 576 672 768 864 hours Cortisol plasma concentration 6 horses, treatment with Voren Depot, 60 µg/kg i.m. ng/ml 60 40 20 0 0 96 192 288 384 480 576 672 768 864 hours

Studie mit Betamethason-Formulierungen Celestan solubile (Betamethasondihydrogenphosphat) intravenös Celestovet (Betamethasondihydrogenphosphat-Dinatrium, Betamethasonacetat) intramuskulär Celestan V (Betamethasonvalerat) dermal Betagentam Augensalbe (Betamethasondihydrogenphosphat- Dinatrium, Gentamycinsulfat) konjunktival

Nachweis- und Bestimmungsgrenze von Betamethason Methodik: HPLC-MS/MS, validiert 0,6 0,4 LOQ LOD 0,2 0 LOQ = Bestimmungsgrenze LOD = Nachweisgrenze 0 6 12 18 24 Matrix Nachweisgrenze (ng/ml) (= LOD) Bestimmungsgrenze (ng/ml) (= LOQ) -MS2 (451.19) CE (-55): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Betamethason_HOAc-Addukt_InitProduct_Neg.wiff (Turbo Spray) 100% 95% 90% 85% 80% 361.0 Max. 1.9e7 cps. Plasma 0,02 0,1 R e l. I n t. ( % ) 75% 70% 65% 60% 55% 50% 45% 40% Urin 0,01 0,05 35% 30% 25% 20% 15% 292.0 307.2 277.0 325.2 451.0 59.0 10% 310.0 345.0 391.0 264.8 5% 247.0 121.2 260.2 149.0 175.0 194.2 279.2 293.0 223.0 327.0 143.0 274.0 343.0 106.2 219.0 305.0 54.8 81.0 93.0 373.2 71.2 378.8 359.0 414.8 393.4 420.8432.6 400 420 440 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 m/z, amu

Betamethasonkonzentration [ng/ml] Betamethasonkonzentration [ng/ml] Plasmakonzentration von Betamethason bei sechs Pferden nach intravenöser Applikation von Betamethasondihydrogenphosphat (0,04 mg/kg) 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Zeit p.a. [h] 100 10 1 0.1 0.01 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Zeit p.a. [h]

Betamethasonkonzentration [ng/ml] Urinkonzentration (logarithmisch) bei sechs Pferden nach intravenöser Applikation von Betamethasondihydrogenphosphat (0,04 mg/kg) 1000 100 10 1 0.1 0.01 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 LOQ LOD Zeit p.a. [h]

Plasmakonzentration von Betamethason bei sechs Pferden nach intramuskulärer Applikation eines Gemisches von Betamethasondihydrogenphosphat und Betamethasonacetat (0,04 mg/kg) Betamethasonkonzentration [ng/ml] Betamethasonkonzentration [ng/ml] 10 8 6 4 2 0 0 100 200 300 400 500 600 Zeit [h] 10 1 0.1 0.01 0 100 200 300 400 500 600 Zeit [h]

Betamethasonkonzentration [ng/ml] Urinkonzentration von Betamethason bei sechs Pferden nach intramuskulärer Applikation eines Gemisches von Betamethasondihydrogenphosphat und Betamethasonacetat (0,04 mg/kg) 70 60 50 40 30 20 10 0 0 100 200 300 400 500 600 Zeit [h]

Betamethasonkonzentration [ng/ml] Urinkonzentration von Betamethason bei sechs Pferden nach intramuskulärer Applikation eines Gemisches von Betamethasondihydrogenphosphat und Betamethasonacetat (0,04 mg/kg) 100 10 1 0.1 0.01 0.001 0 100 200 300 400 500 600 Zeit [h] LOQ LOD

Betamethasonkonzentration [ng/ml] Urinkonzentration (logarithmisch) bei sechs Pferden nach dermaler Applikation von 4,88 mg Betamethasonvalerat auf eine Fläche von 10 x 10 cm 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 50 100 150 200 Zeit [h]

Betamethasonkonzentration [ng/ml] Urinkonzentration von Betamethason bei sechs Pferden nach konjunktivaler Applikation von Betamethasondihydrogenphosphat (in Kombination mit Gentamicinsulfat) 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Zeit [h] LOQ LOD = Applikation von Betagentam AS

Nachweiszeiten (Betamethason) Grenze Matrix intravenös intramuskulär dermal 10x10 cm konjunktival Zeit in Stunden (Tagen) LOD Plasma 42 (2) 448 (19) --- --- LOD Urin 120 (3) 506 (21) 212 (9) 93 (4) LOQ Plasma 24 (1) 264 (11) --- --- LOQ Urin 120 (3) 480 (20) 136 (6) 50 (2)

FEI List of Detection Times Dexamethasone 10 mg i.v. Detection time: 48 hours (2 days) Triamcinolone acetonide 12 mg one joint i.a. Detection time: 168 hours (7 days)

Einfrieren von Nachweisgrenzen (auf heutigem Stand) Parallelen zu Grenzwertkonzept kein Bezug zu pharmakologischer Wirkung nur für therapeutisch eingesetzte Substanzen

Ausnahmen für bestimmte Substanzgruppen Kann strenggenommen nur für Substanzen gelten, die prophylaktisch (bei gesunden Pferden) eingesetzt werden No medication periods vor dem Wettkampf Kontrolle?

Controlled Medication Vorteil: Flexibilität, Entscheidungsfreiheit vor Ort entsprechend Einzelfall Nachteil: Flexibilität, Entscheidungsgremium überfordert, Schiedsrichtersyndrom

Modellüberlegung zur Festlegung von Karenzzeiten Umrechnung der Dosis (z.b. mg/tier) auf Anzahl der Moleküle (Moleküle/Tier) bei Unterschreiten der Quantifizierungs- oder Nachweisgrenze noch signifikante Wirkstoffmengen im Organismus vollständige Ausscheidung des Wirkstoffs theoretisch (dosisabhängig ) z.b. nach >65 Halbwertzeiten abgeschlossen Moleküle im Organismus 10 20 10 18 10 16 10 14 10 12 10 10 10 8 10 6 10 4 10 2 "Nulltoleranz" Quantifizierungs- bzw. Nachweisgrenze Abnahme der Molekülzahl 0 10 20 30 40 50 60 70 Halbwertzeiten

Moleküle im Organismus 10 20 10 18 10 16 10 14 10 12 10 10 10 8 10 6 10 4 10 2 Variabilität der Ausscheidungszeit Einfluss der interindividuellen Streuung LOD Abnahme der Molekülzahl 0 10 20 30 40 50 60 70 Halbwertzeiten

Abhängigkeit des Konfidenzintervalls von der Streuung der Messwerte in der Stichprobe 300 Beispiel Liegen Mittelwert und Standardabweichung bei 100 ± 50, so können die Einzelwerte erwartet werden im Bereich: 95 % zwischen 2 und 198 99 % zwischen 0 und 229 99.9 % zwischen 0 und 265 oberes Konfidenzintervall 250 200 150 100 50 0 Mittelwert = 100 0 10 20 30 40 50 Standardabweichung in der Stichprobe 99.9 % 99 % 95 %

Ausblick Überlegungen zu Grenzwerten und Ausscheidungszeiten haben Kenntnisse der Pharmakodynamik und pharmakokinetischer Parameter als Basis. Da Untersuchungen nur an begrenzten Tierzahlen möglich sind, müssen interindividuelle Unterschiede berücksichtigt werden. Generelle und völlige Sicherheit bietende Aussagen zu Karenzzeiten sind daher nicht möglich. Voraussetzung für Berechnung von Absetzfristen sind einheitliche analytische Grenzwerte. Konfidenzintervall-Berechnungen bieten eine zusätzliche Sicherheit bei der Abschätzung von Karenzzeiten. Die sog. Nulllösung muss für Stoffe gelten, für die nach Toutain und Lassourd (2002) berechnete ineffektive Urinkonzentration (IUC) unter der Nachweisgrenze liegt.