Mikroskopie für Fortgeschrittene

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1 Mikroskopie für Fortgeschrittene Für Studierende der Fakultät Umweltwissenschaften und Verfahrenstechnik Fisch/Haut und Schuppen, Übersichtsfärbung, V 1:1000, Phasenkontrast-Durchlicht Einleitung Der mikroskopische Aufbaukurs gibt die Möglichkeit, Fähigkeiten und Erfahrungen in lichtmikroskopischen Techniken für biologische Objekte im Rahmen unseres Ausstattungsgrades zu erwerben. Dieses Skript ist auf die Anwendung im Praktikum ausgerichtet. Für Forschungsarbeiten ist entsprechende mikroskopische und histologische Fachliteratur heranzuziehen. Einige Quellen werden im Literaturverzeichnis aufgeführt. Es ist eine Begrenzung auf maximal 15 Teilnehmer erforderlich, um allen Teilnehmern Zugang zu den Arbeitsmitteln zu ermöglichen. Für die Teilnahme am Kurs wird ein Schein ausgestellt. Eine Prüfung findet nicht statt. Gute fotografische Ergebnisse des Kurses werden als Poster im Außenbereich vorgestellt. Das Skript ist entsprechend der Blockabfolge im Kurs aufgebaut. 1 von 72

2 Gliederung Seite 1 Grundlagen der Mikrofotografie Grundlagen und Voraussetzungen 1.2 Praktische Fotografie Aufbau der mikrofotografischen Einrichtung Arbeitsschritte Filmmaterial Verwenden von Filtern Dokumentation 1.3 Material und Methoden 1.4 Literatur 2 Präparation von mikrobiologischen und tierischen Materialien Zur Wahl der Präparationstechnik 2.2 Untersuchung von Kleinlebewesen in Feuchtpräparaten Herstellung verschiedener Typen von Feuchtpräparaten 2.3 Untersuchungen von Ausstrichen Ausstrichtechniken 2.4 Aufbereitung größerer Objekte Betäubungsmittel Fixiermittel Mittel zur Vorbehandlung, Aufhellung und Konservierung Färbungen Herstellung von Dauerpräparaten durch Paraffineinbettung Fertigstellung des Präparates 2.5 Material und Methoden 2 von 72

3 2.5.1 Material und Methoden für Block Material und Methoden für Block Literatur 3 Herstellen und Untersuchen pflanzlicher Präparate Wahl der Präparate Frischpräparate 3.2 Färbung der Präparate 3.3 Material und Methoden Material und Methoden für Block Material und Methoden für Block Literatur 4 Quantitative Mikroskopie Mikroskopisches Messen Bestimmung der Zellkonzentration mit der Zählkammer Arbeit mit dem Objekt- und Okularmikrometer Geschwindigkeitsmessungen Fotografieren mit anschließender Bildvermessung Verwendung von Videotechnik Computergestützte Bewegungsanalyse (CMA) 4.2 Vergleichsmessungen mit dem Zellcounter CASY TT 4.3 Intrazelluläre Konzentration von Ionen 4.4 Elementverteilungen 4.5 Material und Methoden Material und Methoden für Block Material und Methoden für Block Literatur 5 Ausgewählte Spezialtechniken Polarisationsmikroskopie Theoretische Grundlagen Anwendungsgebiete 5.2 Interferenzmikroskopie 5.3 Fluorenszenzmikroskopie Theoretische Grundlagen Praktische Anwendung von Farbstoffen in der Fluoreszenzmikroskopie 5.4 Konfokale Mikroskopie Theoretische Grundlagen Praktische Anwendung der konfokalen Mikroskopie 5.5 Elektronenmikroskopie Grundlagen der Elektronenmikroskopie Das Transmissionselektronenmikroskop 3 von 72

4 5.5.3 Das Rasterelektronenmikroskop 5.6 Material und Methoden 5.7 Literatur 6 Anhang Liste der Abbildungen 6.2 Liste der Tabellen 6.3.Rezepturen und allgemeine Hinweise 6.4 Allgemeine Hinweise zur Laborordnung 7. Termine und organisatorische Hinweise 66 1 Grundlagen der Mikrofotografie Block 1 des Praktikums In diesem Block werden die Grundlagen der Mikroskopie wiederholt und eine Einführung in die mikrofotografische Technik gegeben. 1.1 Grundlagen und Voraussetzungen - Aufbau und Funktionsweise eines Lichtmikroskops (aus dem Grundkurs) - Bildentstehung im Mikroskop - Prinzip des Okulars und Okulartypen - Prinzip des Objektivs und Objektivtypen - Beleuchtungsprinzip nach KÖHLER - mikroskopische Grundtechniken (aus dem Grundkurs) - Hellfeld - Durchlicht - Dunkelfeld - Durchlicht - Phasenkontrast - Durchlicht - Filtereinsatz (Dämpfung, Farbfilter) 4 von 72

5 1.2 Praktische Fotografie Aufbau der mikrofotografischen Einrichtung mit analoger Kamera Dargestellt am Beispiel des Demonstrationsmikroskops der Baureihe CH 2 von OLYMPUS. Es verfügt über einen binokularen Fototubus (BH-TR-45-w), der die Ankopplung der verschiedenen optischen Systeme ermöglicht (Abb.1). Abb. 1: Optische Systemankopplung Manuelles Mikrofoto- System PM-10M Mikrofotokamera BH2-PM-6 OM- Systemkamera Automatisches Mikrofotosystem der PM- 10A Serie L-OM Mikroskopadapter NFK- Okular PM-ADF Adapter Fototubus BH-TR45 Für die Arbeit im Aufbaukurs Mikroskopie wird derzeit eine Spiegelreflexkamera OM-1 vom Typ Olympus SC 35 verwendet. Außerdem ist eine digitale Kamera hinzugekommen. Hierbei handelt es sich um ein auf mikroskopische Fotografie ausgerichtetes System mit verschiedenen Bauteilen. In den folgenden Abbildungen sind die einzelnen Bauteile beschrieben: Abb.2: Bauteile für die analoge Mikrofotografie 1. Adapter mit Projektiv 2. Spiegelreflexkamera SC 35 Photoadapter L 3. Fernauslöser 4. Winkelsucher M Remote Cord 5 von 72

6 1.2m / 5m Montage: Der Adapter (1.) wird auf den Zwischentubus aufgesetzt, in dem ein spezielles Fotookular (Projektiv) eingesetzt ist. Das Fotookular ist für Projektion auf den Film korrigiert (verzerrungsarme Abbildung). Die Kamera (2.) besitzt einen Innenlichtmesser und ist auf manuellen oder automatischen Betriebsmodus einstellbar. Zur besseren Betrachtung der Objekte wird ein Winkelsucher (4.) an der Kamera angebracht. Er weist eine eigene Nachvergrößerung auf von 1,2x auf 2,5x umschaltbar, die eine bessere Schärfeneinstellung ermöglicht, sich jedoch nicht auf die fotografische Aufnahme auswirkt. Der Fernauslöser (3.) dient der erschütterungsarmen Auslösung der fotografischen Aufnahme Arbeitsschritte - Einstellen des Präparates am Mikroskop Olympus BH 2 Dieses Mikroskop weicht in einigen Bauteilen vom Kursmikroskop- Typ: "OLYMPUS CHK" ab: Höhenverstellbarer Revolverkondensor für Hellfeld, Dunkelfeld und Phasenkontrast mit Zentriereinrichtung und Irisblende (wurde im Grundkurs behandelt) Regelbare Leuchtfeldblende Regelbare Lichtquelle (wurde im Grundkurs behandelt) Arbeitsschritte: a) a) Zentrieren und Justieren der Leuchtfeldblende: Diese Blende verhindert störende Überstrahlung am Objekt. Zunächst wird die Leuchtfeldblende mit dem Rändelring verschlossen. Nun wird durch Heben und Senken des Kondensors mit dem Antrieb das Bild so scharf wie möglich abgebildet. Mit Hilfe der beiden Zentrierschrauben wird das Bild in die Mitte des Sehfeldes gebracht. Die Leuchtfeldblende langsam öffnen und dabei beobachten, ob die Abbildung das Sehfeld gleichmäßig ausfüllt. Die Leuchtfeldblende so weit öffnen, bis ihre Begrenzung gerade aus dem Sehfeld verschwindet. Abb.3: Zentrieren der Leuchtfeldblende Leuchtfeld- Blendenbild Abb.4: Notwendige Teile zum Zentrieren Sehfeld Leuchtfeldblende; 2. Kondensorantrieb; Zentrierschrauben 6 von 72

7 b) Einstellungen der Lichtquelle (Helligkeitsregler, rechts unten am Mikroskopstativ): Maximalstellung bzw. empfohlene Fixeinstellung zum Fotografieren, sonst das Licht abschwächen (Mittelbereich) und Dämpfungsfilter benutzen. Zum Fotografieren von mikroskopischen Objekten ist neben einer optimalen Einstellung des Mikroskops, (siehe Grundkurs) die Wahl des geeigneten Bereiches erforderlich. Er muß kontrastreich und vor allem flächig - dünn vorliegen, um Unschärfen zu vermeiden. c) Die Einstellung und Auswahl des Objektes erfolgt zunächst durch den binokularen Einblicktubus (Berücksichtigung von Augenfehlern): - Augenabstandskorrektur: Der rechte und linke Okularstutzen wird in beide Hände genommen und die Stutzen so lange langsam nach innen geschoben, bis ein rundes Sehfeld entsteht. Der eigene Augenabstand ist zwischen den Okularstutzen einstellbar. - Dioptrienkorrektur Mit dem rechten Auge in das rechte Okular schauen und das Objekt scharf einstellen. Mit dem linken Auge durch das linke Okular sehen und das Präparat mit dem Dioptrienausgleichsring fokussieren, ohne die Antriebe zu benutzen. d) Geprüft und nachgeregelt wird der Gesichtsfeldausschnitt für das Fotogramm nochmals über den Kameraeinblick Filmmaterial Grundsätzlich sind DX-Filme zu verwenden, um die Automatik der Kamera nutzen zu können. Gewöhnlich werden Dias erstellt, die in Farbbilder umkopiert werden können. Außerdem besteht die Möglichkeit, die Dias zu scannen. Die Empfindlichkeit richtet sich nach dem zu fotografierenden Objekt, sowie der gewählten Beleuchtungsart und dem Vergrößerungsmaßstab. Mit zunehmender Feinstruktur nimmt die Empfindlichkeit des Filmes ab. Gewöhnlich genügen Empfindlichkeiten von ISO (z.b. T 160, ein Kunstlichtfilm von KODAK). Da mit Kunstlicht gearbeitet wird, sollten Kunstlichtfilme bzw. kombinierte Filme für Tages- und Kunstlicht verwendet werden. Tageslichtfilme sind bei Blitzlicht oder bei Halogenlampen höherer Farbtemperatur zu benutzen. Filme sind generell im Kühlschrank zu lagern und müssen ca. 2 Stunden vor Verwendung auf Raumtemperatur gebracht werden. Die Hülse ist zu öffnen Verwenden von Filtern Filter dienen der Kontraststeigerung von Farben aber auch zu deren Abschwächung. Die verschiedenen Möglichkeiten ihres Einsatzes sind in Tabelle 1 unter Punkt 1.3 erklärt. 7 von 72

8 1.2.5 Dokumentation Auf eine ausführliche Dokumentation ist zu achten. Folgende Angaben sind unbedingt festzuhalten: - Objekt/ Färbung - Vergrößerung (Objektiv, Fotookular), Belichtungszeit, Filmtyp - mikroskopische Methode, Filter - Name des Fotografen - Datum der Aufnahme - Mikroskop- und Objektivtyp 1.3 Material und Methoden Block 1 des Praktikums Kursmikroskope incl. Zubehör (Phasenkontrasteinrichtung, Dunkelfeldblende, Filter, Immersionsöl) Fertigpräparate Einfache Frischpräparate (Algen etc.) Demonstrationsmikroskop incl. Zubehör (Foto- und Videoeinrichtung, Film, Vorlage für die fotografischen Aufnahmen) Filtereinsätze, entsprechend nachfolgender Tabelle: Tabelle 1: Filteranwendung in der Mikroskopie Filterfarbe Gelb* Wirkung besonders für blaue und violette Farbtöne kontraststeigernd; sonst Wirkung wie Grünfilter Gelbgrün viel verwendeter Universalfilter für die gebräuchliche Doppelfärbungen (z.b. Hämalaun-Eosin), sonst wie Grünfilter; minimiert bei Schwarz/weiß -Fotografie die Rotanteile. Somit ist die Verwendung sehr feinkörniger Filme möglich (z.b. Phasenkontrastaufnahmen) Grün* Orange Dämpfung der Wirkung des Restspektrums von Achromaten, Schärfesteigerung; rote, blaue und violette Farben werden dunkler wiedergegeben heben blaue und violette Farbtöne gegen Rot hervor, für Azan Färbung und Giemsa-Färbung gut geeignet 8 von 72

9 Farbtemperatur- Interferenz-Filter* Rot* Blau* Grauwertfilter* (Neutralwertfilter) Farbtemperaturkorrektur für dunkle Chitinteile zur Kontraststeigerung bei gelben Farbtönen, sehr hellen Chitinteilen und farblosen Objekten (z.b, Diatomeen, Radiolarien); bei Verwendung von Tageslichtfilmen Blaufilter (z.b. 32.5C-2) zur Farbtemperaturkorrektur verwenden Zur Regulation der Lichtintensität. Durch ihren Einsatz (und nicht durch Drehen am Lichtregler!) erhält man bessere Brillianz. *Filter vorhanden 1.4. Literatur Beier, W. & Pliquett, F Kompendium der Physik Fischer Verlag, Stuttgart Beyer, H., Bergner, J Handbuch der Mikroskopie Verl. Technik, Berlin Gerlach, D Das Lichtmikroskop Thieme, Stuttgart Göke, G Moderne Methoden der Lichtmikroskopie Stuttgart: Franckh. (Kosmos-Wissenschaft) Kremer, B Mikroskopieren leicht gemacht Franckh-Kosmos, Stuttgart Nachtigall, W Mikroskopieren, Bd.3, Teil 2 BLV- Verl.- Ges., München Riesenberg, H Handbuch der Mikroskopie Verl. Technik, Berlin Robenek, H Mikroskopie in Forschung und Praxis GIT-Verlag, Darmstadt 9 von 72

10 Schade, K.-H Lichtmikroskopie Verlag Moderne Industrie Schlüter, W Mikroskopie Verlag Volk und Wissen, Berlin 10 von 72

11 2 Präparation von mikrobiologischen und tierischen Materialien Block 2 und 3 des Praktikums Ostracoda spec., Vitalpräparat ungefärbt, V 1:40, Hellfeld-Durchlicht 2.1 Wahl der Präparationstechnik Es können, je nach Fragestellung, Frisch -und/oder Dauerpräparate hergestellt werden. Frischpräparate sind schnell und vor allem häufig im relativ vitalen Zustand des Materials zu erzeugen. Sie sind allerdings nur begrenzt haltbar. Die Herstellung von Dauerpräparaten (mikroskopische Schnitte, Ausstriche) ist aufwendig, aber durch die Vielzahl von Färbemöglichkeiten und einer guten Haltbarkeit über Jahre häufig notwendig. Präparate für die Mikroskopie bedürfen im allgemeinen einer besonderen Vorbehandlung, um entsprechende Ergebnisse erzielen zu können. Für Details siehe Punkt 2.6 Literatur. Grundsätzlich ist frisches Material zu verwenden. Kleinere Lebewesen (Rotatorien, Amoeben u.ä.) oder Zellen bzw. Zellkulturen können direkt lebend als Feuchtpräparat untersucht werden. Dafür sind Pufferlösungen verschiedene physiologische Lösungen (Ringerlösung, physiologische Kochsalzlösung, Tyrodelösung etc.) zu verwenden. Zur Herstellung von Präparaten größerer Lebewesen, sind diese sachgerecht zu töten und die entsprechenden Teile einer raschen Fixierung zuzuführen. 11 von 72

12 2.2 Untersuchung von Kleinlebewesen in Feuchtpräparaten Block 2 des Praktikums Im Block 2 werden insbesondere einzellige Lebewesen bzw. Einzelzellen mikroskopisch betrachtet. Unter Punkt 2.5 ist die Gewinnung der notwendigen Materialien beschrieben. Folgende Untersuchungen können durchgeführt werden: - Herstellung von Feuchtpräparaten und Vitalfärbungen - Herstellen und Färben von verschiedenen Ausstrichen Herstellung verschiedener Typen von Feuchtpräparaten Neben der Herstellung einfacher Feuchtpräparate (siehe Grundkurs) werden folgende Methoden durchgeführt: - Aufkonzentrierung Zur Aufkonzentrierung von Protozoen o.ä. ist schonend zu zentrifugieren (ca U/min). Gut geeignet sind z.b. Zytozentrifugationskammern zur Anreicherung. Der Überstand wird dekantiert. Das Konzentrat kann mit einer schwachen Fixierlösung fixiert werden, um das Beobachten unter dem Mikroskop zu erleichtern. Eine weitere Möglichkeit, die Mobilität einzuschränken, ist die Zugabe von Glycerol oder einem Tropfen Essigsäure neben das Deckgläschen. - Hängender Tropfen Für Arbeiten mit dem hängenden Tropfen werden ein Objektträger mit Hohlschliff, ein Deckgläschen und säurefreie Vaseline bzw. Paraffin benötigt. Der Objektträger erhält einen Stützring aus Vaseline bzw. Paraffin. Ein Tropfen des vorbereiteten Konzentrats wird in die Mitte des gut gesäuberten Deckgläschens gebracht und in die Wölbung des Objektträgers gehangen. Abb.5: Hängender Tropfen" 1-2 mm 12 von 72

13 Schließt der Ring das Deckgläschen ab, entsteht eine feuchte Kammer, die über längere Zeit Untersuchungen zuläßt. Ebenso ist eine Beobachtung von Kleinlebewesen in einer Durchflußküvette (z.b. Micro Life, der Firma: Karl Hecht GmbH) möglich. Abb.6: Darstellung einer Durchflußküvette Micro Life Diese Beobachtungskammern funktionieren nach dem Prinzip kommunizierender Röhren. Hierbei sind zwei Gefäße mit einer Flachkapillare, die als Beobachtungsfeld dient, verbunden. Die Flüssigkeit mit den zu untersuchenden Partikeln wird in ein Gefäß gefüllt. Durch Aufdrehen des zweiten Verschlusses erfolgt ein Druckausgleich. Mikroorganismen können in dieser Weise über einen längeren Zeitraum beobachtet werden Empfohlene Mikroskopiertechnik: - Phasenkontrast - Dunkelfeld Empfohlene Färbungen: - Vitalfärbung: Neutralrot, Methylenblau, Eosin; - zur Beobachtung der Nahrungsaufnahme bei Pantoffeltierchen Kongorot und Neutralrot. (Versuchsbeschreibung siehe Punkt 2.5 ) - für kurzfristige Kernbeobachtung wird Methylgrün-Essigsäure mit Zellstoff durchgesogen. 2.3 Untersuchungen von Ausstrichen - Bock 2 des Praktikums Ausstrichtechniken Für diese Technik werden verschiedene Zellsuspensionen (siehe unter Punkt 2.5 ) verwendet. Blut, Spermien u.ä. 13 von 72

14 Ein Tropfen der Flüssigkeit wird seitlich auf einen Objektträger getupft und schnell mit einem zweiten Objektträger dünn ausgezogen. Der Ausstrich wird luftgetrocknet (z.b. mit Ventilator oder Wärmeplatte, nicht mit Atemluft). Anschließend kann nach einer Methanolfixierung eine Färbung erfolgen. Färbungen sind unter Punkt 2.5 beschrieben. Ausstrich von Bakterien aus Kultur: Probematerial wird von einer entsprechenden Kultur mit einer Öse o.ä. abgenommen und auf einen sehr gut mit Alkohol (oder Salzsäure- Alkohol) gereinigten Objektträger aufgetragen. Abb.7: Ausstrichtechniken Der Belag wird mit einem Tropfen Wasser gut verrührt. Ein Tropfen dieser Flüssigkeit wird auf einen weiteren Objektträger übertragen und mit einem Deckgläschen dünn ausgestrichen. Zum Fixieren wird der Objektträger mit der Schichtdicke nach oben dreimal langsam durch die Spiritusbrennerflamme gezogen (Pinzette verwenden!) oder in Methanol fixiert. Fixierung und Färbungen sind unter Punkt 2.5. beschrieben 2.4 Aufbereitung größerer Objekte (Gewebeteile von Organen etc.) Block 3 des Praktikums Im Block 3 werden größere Gewebeteile untersucht. Diese werden dazu fixiert, entwässert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und gefärbt. Eine weitere Möglichkeit ist die Herstellung von Dauerpräparaten, die nicht entwässert werden müssen, z.b. Fischschuppen, Federn, Insektenflügel etc.. Die Untersuchung von luftgefüllten Tracheenästen eines Insektes ist unter Punkt 2.5 beschrieben. Im Ergebnis sollte jeder Praktikant mindestens ein Dauerpräparat erzeugt haben Betäubungsmittel Neben der Untersuchung von Organen, (Schlachthofmaterial: Leber, Herz, Blut etc.), sind vor allem kleine Objekte zur Mikroskopie geeignet, wie z.b. Regenwürmer, Schnecken, Polypen. Diese Tiere sind sachgemäß zu betäuben bzw. zu töten. Aus rechtlich-ethischen Gründen ist auf die Untersuchung größerer Tiere (Mäuse, Frösche u. ä.) zu verzichten (Tabelle 12: Betäubungsmittel, siehe unter Punkt 6.2 ) 14 von 72

15 2.4.2 Fixiermittel Biologische Objekte verändern sich innerhalb in kurzer Zeit post mortem sehr stark. Deshalb müssen Fixiermittel folgende Eigenschaften aufweisen: - Fixiermittel dienen zur strukturellen Konservierung der Struktur lebender Organismen durch Eiweißfällung (Denaturierung) - gutes und schnelles Eindringvermögen Beim Fixieren ist auf folgendes zu achten: - zu fixierende Objekte dürfen nicht zu groß sein (Kantenlänge maximal 1cm!) - Objekte müssen völlig untergetaucht und von allen Seiten vom Fixativ umgeben sein - Volumen des Fixativs im Verhältnis zum Volumen des Objektes ca. 100:1 - Fixiermittel wechseln, besonders bei stark wasserhaltigem Material Die gebräuchlichsten Fixiermittel sind: Ethanol, Formalin (ca. 10%, zur Aufbewahrung 4%, Ethanol-Formalin-Eisessiggemische Mittel zur Vorbehandlung, Aufhellung und Konservierung Für undurchsichtige Präparate ist die Durchlichtmikroskopie unbrauchbar. Diese Präparate müssen transparent gemacht werden. Dies gelingt mit verschiedenen Chemikalien, z.b. Kalilauge oder Salzsäure. Die Konservierung erfolgt meist in %igem Ethanol, Isopropanol oder Formalin (1:10 bis 1:15 verdünnt) Färbungen Viele Strukturen sind im ungefärbten Zustand nicht oder nur unvollkommen erkennbar. Sie treten erst dann deutlich hervor, wenn sie nach verschiedenen Methoden gefärbt werden. Man unterscheidet Vitalfärbungen am lebenden Objekt bzw. postvitale Färbung an Gewebe im abgetöteten und fixierten Zustand. Einige Methoden sind in den Tabellen 3 (Vitalfärbungen) und 4 (Postvitalfärbungen) unter Punkt 2.5 aufgeführt. Vitalfarbstoffe sind Farbstoffe, die Organismen oder Zellen ohne wesentliche Beeinträchtigung der Lebensfunktionen färben: Diese Farbstoffe sind häufig nicht beständig. Postvitalfärbungen werden an abgetöteten und fixierten Objekten durchgeführt. Gut durchfixierte Objekte nehmen die verschiedensten sauren oder basischen Farbstoffe schnell auf Herstellung von Dauerpräparaten durch Paraffineinbettung Wasserhaltige Präparate (also auch fixierte Proben) müssen für die mikroskopische Untersuchung entsprechend zubereitet werden. Dazu muß die Probe entwässert oder tiefgefroren und in Form von feinsten Schnitten von 5 bis 20µm Dicke präpariert werden. Dauerprärarate können durch Einbettung in Paraffin erzielt werden. Dies setzt das totale Entwässern des Präparates über eine sogenannte Alkoholreihe über Xylol (oder ungiftiges Alternativprodukt Histo-clear) bis zur Einbettung in Paraffin voraus. Das fixierte Material wird zunächst gewässert, um das Fixiermittel vollständig zu entfernen. Die Wässerungszeit richtet 15 von 72

16 sich nach der Dauer der Fixierung. Um Schrumpfungen zu vermeiden, ist eine langsame und stufenweise Entwässerung über einzelne Alkoholverdünnungen (Alkoholreihe) bis hin zur Paraffineinbettung notwendig. Der Übergang vom Ethanol zum Paraffin erfolgt mit einer Zwischenflüssigkeit (Intermedium), günstig mittels Optal (Isopropylalkohol) oder auch mit Benzol oder Xylol bzw. Histoclear. Die Einbettung in Paraffin kann nur dann erfolgen, wenn das Präparat völlig wasserfrei ist. Als Gefäße eignen sich Färbekästen o.ä.. Günstig ist die Verwendung von kleinen Einbettmatrizen, in die zu entwässernden Proben eingelegt und schrittweise entwässert werden. (siehe Punkt 2.5) Herstellen des Paraffinblocks: Ergebnis der Paraffineinbettung von ungefärbten Präparaten ist der Paraffinblock. In ein geeignetes Gefäß, z.b. ein mit Glycerol ausgewischtes Blockschälchen, ein Papierschächtelchen, industriell hergestellte Blockmatrizen o.ä. wird eine kleine Menge des erwärmten Paraffins eingegossen. Das nunmehr völlig entwässerte, paraffindurchtränkte Präparat wird mit der Schnittfläche nach oben vorsichtig mit einem erwärmten Instrument (Pinzette o.ä.) eingesetzt und völlig mit Paraffin bedeckt. Der Block muß nun langsam abkühlen und kann im Kühlschrank (nicht im Gefrierfach!) aufbewahrt werden. Nach dem Abkühlen wird er auf ein Holzblöckchen oder die Matrize geklebt und passend geschnitten. Nun erfolgt das Schneiden des Paraffinblocks am Microtom. Die feinen Schnitte werden auf einen mit Eiweiß- Glycerin vorbehandelten Objektträger aufgezogen. Um das Präparat färben zu können, muß es wiederum stufenweise in die alkoholische bzw. wässrige Phase überführt werden. Alkoholreihe zum Färben von Paraffinschnitten Für die Alkoholreihe eignen sich Glasküvetten oder Färbekästen. Sie besteht in der Regel aus mehreren Stufen (siehe Punkt 2.5) Alle Küvetten müssen gekennzeichnet sein, sind stets in gleicher Reihenfolge zu benutzen und verschlossen zu halten. Verschmutzte oder lange benutzte Reihen sind zu erneuern; Xylol löst nach längerem Gebrauch das Paraffin langsamer heraus. Im Durchschnitt bleibt der Schnitt 3-5 Minuten in einer Stufe und wird dann vorsichtig in die nächste überführt. Der letzte Schritt, das Einbetten in Balsam, erfordert eine nochmalige Entwässerung des geschnittenen und gefärbten Präparates. Dazu wird die Alkoholreihe in umgekehrter Reihenfolge bis zum Xylol verwendet Fertigstellung der Präparate Verdeckeln der Präparate Paraffinschnittpräparate sind auf dem Objektträger fixiert und werden zum Eindeckeln mit einem Tropfen eines entsprechenden Eindeckmediums (Kanadabalsam, Entellan) versehen. 16 von 72

17 Für Frischpräparate werden auf einen sauberen Objektträger einige Tropfen Untersuchungsflüssigkeit, meist Wasser gebracht (mit Pipette oder Glasstab) und das zu untersuchende Objekt wird mit Nadel, Pinzette o.ä. in den Flüssigkeitstropfen überführt. Anschließend erfolgt das Eindeckeln mit einem sauberen Deckglas, dabei können verschieden Fehler auftreten (siehe Anhang) Sind die zu untersuchenden Objekte von Natur aus wasserfrei, kann auch ohne Paraffineinbettung direkt eingedeckelt werden. Beschriftung: links vom Objekt: Bezeichnung des biologischen Objektes, Versuchsnummer z.b. Gallus dom. Embryo, 5.Tag rechts vom Objekt: Färbung, Datum, Bearbeiter z.b. Giemsa, Bearbeiter, Material und Methoden Material und Methoden für Block 2 - Kursmikroskope mit Zubehör - - Demonstrationmikroskop mit Zubehör (Foto- und Videokamera) - - Zentrifuge mit Zubehör - - Mikrolife - Küvetten - - Verschiedene Fixier- und Färbelösungen - - Färbebottiche, Pipetten, Glasstäbe Material: Vom Lehrstuhl gestellt: - Blut (Warmblüter, Kaltblüter) - Sperma (gefrierkonserviertes Bullensperma, Fisch - und Insektensperma) Folgende Materialien sind vorzubereiten bzw. mitzubringen: Heuaufgüsse Ciliaten können in verschiedenen Heuaufgüssen gezüchtet werden. Der jeweilige Ansatz sollte 3-4 Wochen vor seiner Benutzung erfolgen. Dazu verwendet man große Einmachgläser, in die verschiedenes Pflanzenmaterial eingebracht wird. Besonders geeignet sind: Heu, möglichst von nassen Sumpfwiesen, Stroh, welkes Laub, Salatblätter (speziell für Paramaecium caudatum), faulende Schilfstengel, faulende Wasserpflanzen. Optimal ist die Zugabe von Tümpel- oder Teichwasser, das durch ein feines Gazesieb gefiltert werden muß (Entfernung von Kleinkrebsen etc.). Der Standort möglichst mehrerer Ansätze sollte warm und nur leicht sonnig sein. Zunächst bildet sich eine Kahmhaut aus Bakerien. Durch Auflegen kleiner Fleischstückchen oder einer Fliege wird die Entwicklung der Wimperntierchen gefördert. Nach einigen Tagen treten die ersten Protozoen auf, der Entwicklungszyklus ist nach ca. 4 Wochen beendet, 17 von 72

18 weshalb neue Aufgüsse rechtzeitig aus den ursprünglichen angesetzt werden müssen. Die Proben werden von der Kahmhaut, der mittleren Schicht und der Bodenschicht genommen und getrennt untersucht. Planktonfänge.(diverse Protozoen und Algen) Mit einem Planktonnetzes oder einfach einem feinmaschigen Netzes (optimale Maschenweite Nr. 18, Maschenweite 40-70x40-100µm)) können Gewässer (Seen, Teiche, Bäche, Pfützen etc.) langsam mindestens 20x durchzogen werden. Der Inhalt wird getrennt in saubere Gläser überführt und sollte so schnell wie möglich untersucht werden. Moosbeläge von Dachrinnen (Tardigrada = Bärtierchen) Erdabkochungen- und Milchkulturen (Beschreibung siehe Literatur: Mayer, M.(1962) und Streble, H. (1988)) Aquarienwasser, alte Blätter, Filterinhalt Bakterienkulturen (von Lebensmitteln etc.) Pilzkulturen (Hefen, Schimmelpilze) Methoden Alle Rezepturen der beschriebenen Lösungen (Färbelösungen, Puffer) usw sind im Anhang unter Punkt 6.3 beschrieben 2.1. Färbung fixierter Präparate Färbung mit Methylenblau: Fixierung: 5 min in Methanol,100%ig Der Ausstrich wird mit 1 ml unverdünnter Methylenblaulösung bedeckt. Nach 2-5 min gibt man 1 ml neutrales VE-Wasser hinzu und bewegt die Lösung vorsichtig. Nach 3-4 min wird mit VE*- Wasser gut gespült Eosinfärbung: Fixierung: 5 min in Methanol,100%ig Aufträufeln von Tropfen Eosinlösung. Nach 10 min wird mit Leitungswasser abgespült und luftgetrocknet Giemsafärbung (für Blut geeignet): Fixierung: 5-10 min in Methanol,100%ig Nach Fixierung werden Tropfen frisch angesetzte verdünnte Giemsalösung aufgetragen. Bei Raumtemperatur sind 30 min Reaktionszeit notwendig. Es wird mit Pufferlösung** abgespült und luftgetrocknet. Ergebnis: Erythrozyten = rosa Lymphozyten/ Protoplasma = hellblau eosinophile Granulozyten = rot bis rotbraun 18 von 72

19 basophile Granulozyten neutrophile Granulozyten Thrombozyten Zellkerne = dunkelblau = rotviolett = blau-rotviolett = rötlich violett *VE-Wasser = vollentsalztes Wasser Beachte: das Spülen mit Wasser muß vorsichtig erfolgen, am besten mehrfach in einem Becherglas mit Wasser leicht schwenken Färbung nach Pappenheim (Blut, Spermien): Fixierung: 5 min in Methanol,100%ig Chemikalien: - - May-Grünwald-Lösung - - Giemsa-Lösung - - 5%Essigsäure - - S rensen-phosphatpuffer, ph 7 Vorschrift: Auf die fixierten Ausstriche etwa 1 ml May-Grünwald-Lösung 3 min auf den Objektträger geben, etwa die gleiche Menge VE-Wasser aufschichten und nach 1 min über Filterpapier abfließen lassen, Eintrocknen vermeiden. Gleich darauf 20 min in Giemsa-Lösung (100 ml Pufferlösung* in ein Becherglas + 3 ml Giemsa-Stammlösung langsam eintropfen lassen, Glas dabei schwenken) einbringen, anschließend gut mit VE-Wasser spülen (optimal mit Pufferlösung) Bei starker Blaufärbung mit Essigsäure differenzieren. Trocknen und Eindeckeln mit Entellan Ergebnis: Blut: Zellkerne rötlich-violett Plasma der Lymphozyten hellblau Neutrophile Granulozyten bräunlich- bis bläulich-pink Eosinophile Granulozyten orange bis backstein-rot Basophile Granulozyten ultramarin bis bläulich-violett Erythrozyten pink Spermien: Acrosomen pink Postacrosomen dunkelblau 19 von 72

20 Ausdifferenzierung von Bakterien mit der GRAM- Färbung Differenzierung nach GRAM-positive und GRAM-negative Bakterien Prinzip der Färbung: Bei dem Färbevorgang werden Anilinfarbstoffe in der Zellwand von Bakterien bei nachfolgender Jodeinwirkung zu einem Farbe-Jod-Komplex gebunden. Bei grampositven Bakterien läßt sich der Farbe-Jod-Komplex nicht mehr durch Entfärbemittel aus der Zelle herauslösen, die Zelle bleibt blauviolett angefärbt. Bei gramnegativen Bakterien wird der Komplex gelöst und die Zelle muß mit Karbolfuchsin oder mit Safranin orange in einem 2. Färbegang angefärbt werden. Durchführung: Der Ausstrich wird zunächst fixiert (Hitzefixierung - 3x durch die Flamme ziehen oder 5 min Methanolfixierung). Danach wird auf der Färbebank wie folgt gefärbt: 1. Fixierten Ausstrich mit Lösung 1 (= Kristallviolettlösung) bedecken, 1 Minute färben 2. Lsg. 1 abgießen und mit Lösung 2 (= Lugolsche Lösung) nachwaschen 3. Mit Lösung 2 nochmals bedecken und 1 Minute beizen 4. Mit Leitungswasser spülen 5. In der Lösung 3 ( Ethanol oder Methanol = Entfärbelösung) 1 Minute schwenken 6. Mit Wasser spülen 7. Mit Lösung 4 (= Safraninlösung) 1 Minute nachfärben 8. Mit Wasser spülen und trocknen Ergebnis: grampositive Bakterien: dunkelviolett gramnegative Bakterien: orange Alle beschriebenen Präparate können z.b. mit Neutralbalsam oder Entellan eingebettet werden Vitalfärbungen Färbung von Kleinlebewesen zur Beobachtung Tabelle 2: Farbstoffe für Vitalfärbungen zoologischer Präparate Name des Farbstoffes geeignet für Was und wie wird gefärbt 1.Methylenblau Zoologische Präparate, kleine Wassertiere, Bakterien Zellkerne, Nervenzellen, Nervengewebe, blau Färbung: einige Minuten bis 3 h 2.Methylgrün- Wassertiere Farb-Fixier-Schnellmethode, Zellkerne, 20 von 72

21 Essigsäure 3.Eosinfärbung Tierische Gewebe, Ausstriche grün Färbung: ca. 10 min Plasmafarbstoff, sehr guter Vitalfarbstoff, z.b. für Lebend-Tot-Differenzierung beim Hefeausstrich, rosa 4.Mayers Hämalaun Tierisches Gewebe, Ausstriche Färbung: 5-15 min selektive, starke Kernfärbung, Knorpel dunkelblau, Färbung: ca. 5 min, mit Wasser spülen (Umschlag von rot nach blau) Lebend- Tot- Färbung Färbung mit Eosin (Plasmafarbstoff) zur Bestimmung von lebenden und toten Zellen (Blutzellen, Spermatozoen oder Hefezellen) Ein Tropfen der Probe wird mit einem Tropfen Eosinlösung (in 150 mmol NaCl, entspricht einer physiologischen Kochsalzlösung für Warmblüter) versetzt und ca.5 min mit diesem Farbstoff vermischt. Danach kann direkt in der Lösung ausgezählt werden oder es wird ein einfacher Ausstrich durchgeführt und sehr schnell luftgetrocknet Nachweis der Partikelaufnahme und der Verdauung am Beispiel des Pantoffeltierchens (Paramecium caudatum) 10 ml VE-Wasser werden mit ca. 1 g Hefe und einer Messerspitze Neutralrot oder mit Kongorot als ph-indikator min bis auf den Siedepunkt erhitzt. Einige µl der abgekühlten Suspension werden in einen Tropfen Kulturflüssigkeit gebracht. Nach kurzer Zeit sind die Vakuolen der Tiere gefärbt. Innerhalb des Verdauungszyklusses verändert sich der ph-wert ph-wert der Vakuole(=Medium) ph 3 ph 7-9 ph ca.9 Färbung mit Kongorot blau blau oder rot rot Färbung mit Neutralrot rot gelb gelb bis farblos Empfohlene Mikroskopiertechnik: 10-40fache Objektivvergrößerung, Hellfeld-Durchlicht Material und Methoden zu Block 3 1. Material: - Mikrotom, Paraffin, Ethanol, Optal, Xylol (bzw. Histoclear), Eindeckmittel, Färbemittel - Färbebottiche, Objektträger und Deckgläschen - frisches Gewebe (Leber, Niere, Herz etc. von Schwein oder Rind aus dem Schlachthof) 21 von 72

22 - Kleintiere (Regenwürmer, Schnecken o.ä.) Diese Materialien müssen außerhalb der regulären Praktikumszeit fixiert und in Paraffin überführt werden. Zur Herstellung von Dauerpräparaten ohne Entwässerung und Paraffineinbettung: - - Insekten für Tracheenuntersuchung, - - Insektenflügel, Federn etc. 2. Methoden 2.1. Herstellung eines Dauerpräparates (Paraffineinbettung, Entwässerung, Färbung) Tabelle 3: Paraffineinbettung Entwässerung mit Ethanol, Handeinbettung - (Gewebescheiben 3-5 mm dick) - 1. Fixieren (5-10 %ige Formalinlösung) 12 Std Auswaschen in fließendem Wasser 3 Std % Ethanol 2 Std % Ethanol 2 Std % Ethanol 3 Std % Ethanol 6 Std % Optal 4 Std % Xylol 4 Std. (Abzug benutzen) - 9. Xylol-Paraffingemisch (60 C) 12 Std.(Achtung, Xylolverdunstung beachten, Abzug benutzen Paraffin (60 C) 8 Std. Aus gesundheitlichen Gründen sollte Xylol generell durch Optal besser noch durch Histoclear ersetzt werden. Tabelle 4: Alkoholreihe 22 von 72

23 absteigende Alkoholreihe nach Färbung, aufsteigende Alkoholreihe - Xylol vollentsalztes Wasser - Optal 60%iger Alkohol - 96%iger Alkohol 80%iger Alkohol - 80%iger Alkohol 96%iger Alkohol - 60%iger Alkohol Optal - Wasser Xylol Der Färbeprozeß erfolgt entweder in der alkoholischen oder wässrigen Phase, je nach Farbstoff. Tabelle 5: Farbstoffe für Postvitalfärbung zoologischer Präparate Name des Farbstoffes Eosin (G) Orange G Mayers Hämalaun Doppelfärbung Hämalaun/ Eosin Kernechtrot- Aluminiumsulfat Was und wie wird gefärbt Plasmafarbstoff Färbung: ca 5 Minuten färben, schnell entwässern Plasmafarbstoff Färbung: 5-10 Minuten Selektive starke Knorpelfärbung, Knorpel dunkelblau Färbung: ca. 5 min, mit Wasser spülen, Umschlag von rot nach blau erst Hämalaunfärbung (5 min, mit Wasser spülen), danach Gegenfärbung mit Eosin (5 min, kurz mit Wasser spülen), Alkoholstufen schnell durchlaufen Kernfärbung, Nachweis von Eisen Färbung: 10 min - - vor der Entwässerung ist der Farbstoff mit Wasser vorsichtig abzuspülen 2.2. Herstellung eines Dauerpräparates von luftgefüllten Tracheenästen 23 von 72

24 Gewebestückchen von getöteten Insekten werden auf einem Objektträger ausgebreitet. Sie sollten an der Luft antrocknen. Danach wird etwas Aceton auf das Präparat getropft und abgesogen. Dieser Vorgang wird 2-3x wiederholt. Nachdem das Präparat getrocknet ist, wird es mit Chloroform benetzt. Das Chloroform wird ebenfalls mehrfach aufgeträufelt und abgesaugt. Nun ist die Entwässerung vollzogen. Nach einigen Minuten Trocknung wird das Präparat mit einem Eindeckmittel eingeschlossen. Die luftgefüllten Tracheen lassen sich bis in die feinsten Verzweigungen verfolgen. 2.6 Literatur Barnett, I.A., Payne, R.W., Yarrow, D Yeasts: Characteristics and identification Cambridge University press, Cambridge, 2. Aufl. Böck, P Romeis Mikroskopische Technik Urban und Schwarzenberg, München Burck, H.-Ch Histologische Technik. Georg Thieme Verlag Stuttgart Dittrich, H Bakterien, Hefen, Schimmelpilze Kosmos-Verlag, Stuttgart Drews, G Mikrobiologisches Praktikum Springer-Verlag, Berlin Eikelboom, D.H Handbuch der mikroskopischen Schlammuntersuchungen Hirthammer, München Fiedler, K. & Lieder, J Mikroskopische Anatomie der Wirbellosen Gustav Fischer Verlag, Jena Hausmann, K., Bradbury, Ph.C Ciliates Cells as organisms. Fischer, Stuttgart Kuhn, K., Probst, W Biologisches Grundpraktikum, Band I. Fischer, Stuttgart Mayer, M Kultur und Präparation der Protozoen Kosmos-Verlag, Stuttgart Röttger, R Praktikum der Protozoologie 24 von 72

25 Fischer, Stuttgart Sauer, F Tiere und Pflanzen im Wassertropfen Fauna-Verlag Dr. F. Sauer, Eichenweg 8, Karlsfeld, 2. Auflage Schlüter, W Mikroskopie Verlag Volk und Wissen, Berlin Sprenger, B Umweltmikrobiologische Praxis Springer, Berlin Streble,H.,Krauter,D.1988.Das Leben im Wassertropfen Kosmos Naturführer, Frankh.-Kosmos Verlags GmbH Stuttgart (UB) Stresemann, E., Exkursionsfauna von Deutschland, 1-4 Verlag Volk und Wissen, Berlin Wiedemann, R., Winkler, G Paramecium caudatum (Pantoffeltierchen) Landeshauptstadt Hannover, Schulamt/Schulbiologiezentrum, 1. Auflage 25 von 72

26 3 Herstellen und Untersuchen pflanzlicher Präparate Block 4 und 5 des Praktikums Rheum rhabarbarum, Vitalpräparat, V.: 1:100 (Objektivvergrößerung),Hellfeld-Durchlicht 26 von 72

27 3.1 Wahl der Präparate: Je nach Fragestellung fertigt man sich Dauerpräparate (prinzipiell wie unter Punkt 3.4 beschrieben) oder Frischpräparate an. Während des Praktikums werden hauptsächlich Frischpräparate hergestellt Frischpräparate: - Totalpräparat: z.b. Algen, zarte Pflanzenteile (z.b. von Moosen) etc. - Schabepräparat: Von Objekten, bei denen nur kleine Gewebepartikel, Einzelzellen oder Zellbestandteile untersucht werden sollen, werden kleine Proben abgeschabt und in ein geeignetes Medium übertragen. - Schnittpräparat: Pflanzenteile, z. B. Stengel o.ä. werden mit der Rasierklinge oder einem Handmikrotom in dünne Scheiben geschnitten (Vorsicht beim Umgang mit Skalpell oder Rasierklinge!). Als Hilfsstoffe können Paraffin, Holundermark oder Sonnenblumenmark verwendet werden. Je feiner die Schnitte, um so besser die Auflösung! - Zupfpräparat: Material mit spitzer Pinzette von dem Objekt trennen, abgezupftes Material in einem Tropfen Wasser einlegen, mit zwei Präpariernadeln zerzupfen. - Epidermisabzug: Vorsichtiges Abziehen von festen Epidermisarealen mit Hilfe einer Pinzette und eines Skalpells (Arbeitsschutz beachten!) - Erzeugung von Abdrücken: Die Oberfläche des Pflanzenteiles wird mit einem aushärtenden Material bestrichen (z.b. Kleber o.ä.), nach dessen Aushärtung kann die Oberfläche betrachtet werden 3.2 Färbung der Präparate Im Block 4 des Praktikums soll sich zunächst mit dem Material vertraut gemacht und einfache Färbungen durchgeführt werden. Auswahl des Pflanzenmaterials: Tabelle 6 unter Punkt Die Färbungen richten sich nach der Art des Präparates (Frisch- oder Dauerpräparat) und nach der darzustellenden Komponente. Gebräuchliche Färbemethoden bzw. Nachweismethoden und deren Anwendung für die unterschiedlichen Zellen und Gewebe sind in Tabellen 7 und 8 unter Punkt beschrieben. Die in der Tabelle 9 (Punkt 3.3.1) dargestellten Methoden für Postvitalfärbungen können aus Zeitgründen nicht innerhalb des Praktikumszeitraumes durchgeführt werden. Gefärbt wird entweder in einem Blockschälchen: Einlegen des geschnittenen oder ganzen Präparates in den Farbstoff für einige Minuten und anschließendes vorsichtiges Ausschwenken in Wasser; oder direkt auf dem Objektträger: indem ein bis zwei Tropfen des Farbstoffes auf den mit dem geschnittenen Präparat bestückten Objektträger gegeben werden und mittels Fließstoff o.ä. der Farbstoff wieder abgezogen wird. Danach wird mit Wasser nachgespült (ebenfalls mit Fließstoff abziehen), dann eingedeckelt. Es darf kein überschüssiger Farbstoff im Präparat bleiben. 27 von 72

28 Im Block 5 des Praktikums werden spezielle Untersuchungen nach Vorschrift durchgeführt. Unter Punkt sind diese Vorschriften für die Untersuchung verschiedener pflanzlicher Gewebe sowie eine Vorschrift zur Darstellung von Oxalaten zusammengestellt. 3.3 Material und Methoden - Kursmikroskope mit Zubehör - Demonstrationsmikroskop mit Zubehör - Handmikrotome, Rasierklingen - Färbemittel, Eindeckmittel - Färbebottiche - Objektträger und Deckgläschen Material und Methoden für Block 4 1. Material Für das Praktikum ist diverses Pflanzenmaterial entsprechend Tabelle 6 mitzubringen. Tabelle 6: Auswahl verschiedener Pflanzenteile für den Nachweis von Gewebearten Gewebeart: Epidermis Korkgewebe Stengelquerschnitt Sklerenchymzellen Leitgewebe Sproßachse Wurzeln Pollen Sporen geeignetes Material: Blatt der Tulpe, Lilie, Tradeskantie, Porree, Alpenveil-chen, Innenhäutchen der Zwiebel mehrjähriger Holunder Efeu, Greiskräuter, Nesseln, Clematis Birkenrinde, Stengel der Wachsblume Mais, Adlerfarn Iris, Tulpe, Lilie, Taubnessel, junge Holundertriebe Iris, Maiglöckchen, Lupine verschiedene Blüten, Honig Lamellen von Pilzen, z.b. Champignons Holundermark, Möhrenstücke oder auch Paraffinwachs zum Schneiden und Festklemmen der Präparate beim Schneiden 28 von 72

29 Für den Stärkenachweis eignen sich Kartoffelknollen, Mais, Getreidekörner Stengel der Clematis 2. Methoden Tabelle 7: Spezifische Färbung von pflanzlichem Gewebe bzw. Pflanzenstoffen Zellstruktur Zellkerne unverholzte Zellwände (Cellulose) Färbemethode - Karminessigsäure - Hämalaun nach Mayer - Gentianaviolett - Safranin - Methylenblau - Methylgrün-Essigsäure - Astrablau, Anilinblau verholzte Zellwände (Lignin), Steinzellen Verkorkte bzw. kutinisierte Zellwände Kallose - Safranin - Phloroglycin- Salzsäure - Sudan III - Anilinblau Plasma - Eosin (G) mit Anilin als Doppelfärbung Stärke - Lugolsche Lösung Tabelle 8: Farbstoffe für Vitalfärbungen pflanzlicher Präparate Name des Was und wie wird gefärbt 29 von 72

30 Farbstoffes Astrablau Safranin unverholzte Zellwände, leuchtend klar und blau Färbung: Sekunden bis wenige Minuten besonders verholzte Zellwände, schwächer oder stärker rot Färbung: min, in HCl-Ethanol auswaschen Doppelfärbung mit Astrablau/ Safranin Färbung: zunächst mit Astrablau färben, mit Wasser spülen, dann mit Safranin färben und mit HCl-Ethanol auswaschen Name des Farbstoffes Methylgrün- Essigsäure Was und wie wird gefärbt Farbfixierschnellmethode, Zellkerne grün Färbung: ca. 10 min färben Name des Farbstoffes Toluidinblau Was und wie wird gefärbt Sehr schöne Übersichtsfärbung: Verholzte und verkorkte Zellwände und der Zellkern: grünblau, Zellulose: purpurrot bis violettrot Färbung: nach Fixierung in Alkohol-Formalin-Eisessig- Gemisch (1 min) kommen die Schnitte auf den Objektträger und werden 1-5 min mit 1-2 Tropfen Lösung gefärbt. Ohne Auswaschen kann ein Deckglas aufgelegt und untersucht werden. Name des Was und wie wird gefärbt 30 von 72

31 Farbstoffes Phloroglucin Ligninnachweis (verholzte Zellwände), leuchtend rot Färbung: einige Sekunden bis Minuten, kurz in konzentrierte HCl überführen und anschließend in H 2 O beobachten (Achtung, nicht mit der Säure an die Objektive geraten!) Name des Farbstoffes Eosinfärbung Anilinblau Doppelfärbung Aniliblau/Eosin Was und wie wird gefärbt Plasmafarbstoff, sehr guter Vitalfarbstoff, rosa Färbung: 5-15 min Kallosenachweis (Polysaccharid), charakteristisch auf den Siebplatten des Phloems Färbung: 5-10 min färben, mit destill. Wasser auswaschen Kallosebeläge blau, übrige Tellwandbereiche rot Färbung: 5 ml Anilinlsg.+1 ml Eosinlsg. mischen, Schnitte 10 min färben, danach kurz mit destilliertem Wasser waschen Name des Farbstoffes Lugolsche Lösung (Jod-Kaliumjodid- Lsg.) Was und wie wird gefärbt Nachweismittel, speziell für Stärke (Kartoffel, Mais, Getreide): blauviolett bis schwarz-violett, Eiweiß: gelbbraun Färbung: 1-2 Tropfen Lösung auf das frische Präparat (wenige Sekunden bis 1 Minute), mit Deckgläschen direkt betrachten Nach der Färbeprozedur ist immer mit VE-Wasser zu spülen, um überschüssigen Farbstoff restlos zu entfernen. Tabelle 9: Farbstoffe für Postvitalfärbung pflanzlicher Präparate 31 von 72

32 Name desfarbstoffes Eosin (G) Anilinblau Was und wie wird gefärbt Plasmafarbstoff, rosa Färbung: 5-10 Minuten färben, schnell entwässern Kallosen und Siebröhren kräftig blau, Zellwände rot Färbung: Schnitte für wenige Minuten in die Farblsg. legen, anschließend in reines Glycerol übertragen Doppelfärbung Anilinblau/Eosin Färbung: 10 min färben, mit Wasser spülen, schnell entwässern, da Äthanol die Farbstoffe ausspült, Kallose blau, Plasma rot Gentianaviolett Kernfärbung, blau Färbung: einige Minuten färben und mit Äthanol oder HCl- Äthanol differenzieren Das Eindeckeln der pflanzlichen Präparate entspricht prinzipiell dem tierischer Proben Material und Methoden für Block Material Das benötigte Pflanzenmaterial ist in den einzelnen Methodenbeschreibungen aufgeführt. Gefärbt wird mit den in den Tabellen 8 und 9 zusammengestellten Lösungen. Für den Oxalatnachweis wird Schwefelsäure benötigt. 2. Methoden 2.1. Kalziumoxalatnachweis: Material: - - z.b. Rhabarberstengel, Sauerampfer - - konzentrierte und verdünnte, ca. 10%ige Schwefelsäure Präparation: Quer-oder Längsschnitte werden mit konzentrierter oder verdünnter Schwefelsäure beträufelt (1-2 Tropfen). In konzentrierter Schwefelsäure wandeln sich Kalziumoxalatkristalle sehr schnell an Ort und Stelle in Anhäufungen feiner nadelförmiger Gipskristalle um. In verdünnter Schwefelsäure lösen sich die Kristalle erst auf und fallen dann irgendwo im Präparat als Gipsnadeln aus. Diese Reaktion kann direkt mikroskopisch beobachtet werden. 32 von 72

33 2.2 Mikroskopieren verschiedener Gefäßtypen Material: - Sproß vom Kürbis o.ä. - Salzsäure (konz. HCl mit Wasser auf das doppelte Volumen verdünnen) Präparation: Von einem halbierten Stengel werden dünne Längsschnitte im Bereich eines Leitbündels angefertigt. Zunächst erfolgt eine einfache Betrachtung in Wasser mit Deckgläschen unter dem Mikroskop. Zum Nachweis des Lignins in den Gefäßwänden legt man die Schnitte in 3%ige alkoholische Phloroglucinlsg.. Nach etwa 1 min. werden die Schnitte in einem Tropfen verdünnte HCl übertragen. Es wird ein Deckglas aufgelegt und beobachtet. Achtung! HCl darf nicht an die Objektive gelangen! Ergebnis: Von innen nach außen fortschreitend sind im Längsschnitt Ring-, Schrauben-, Treppen- bzw. Netz- und Tüpfelgefäße zu finden. Lignifizierte Sekundärwände färben sich kräftig rot Mikroskopieren von Siebröhren und Geleitzellen Material: - Sproß vom Kürbis o.ä., außerdem Anilin- und Eosinlösung Präparation: Es werden Längs- und Querschnitte angefertigt. Die möglichst dünnen Schnitte werden in einer Mischung von Anilinlösung (5 ml) und Eosinlösung (1 ml) etwa 10 min. in einem abgedeckten Blockschälchen gefärbt. Danach spült man kurz mit VE-Wasser. Ergebnis: Die Zellwände werden durch das Eosin rot, die Kallosebeläge durch das Anilin leuchtend blau gefärbt. Im Querschnitt erkennt man das Phloem an dem charakteristischen Muster größerer Siebröhren und kleinerer Geleitzellen. Ab und zu liegt eine Siebplatte in der Schnittebene. Im Längsschnitt erkennt man das Phloem an den Siebplatten, von denen Plasmafahnen abgehen. Auch hier fallen die kleineren, plasmareichen Geleitzellen auf, deren längliche Zellkerne mitunter gut erkennbar sind. Parallel verlaufende Siebröhren sind durch Siebfelder verbunden Mikroskopieren verschiedener Leitbündel Material und Geräte: - - kriechender Hahnenfuß (Ranunculus repens): Ausläufer und Wurzeln - - Mais (Zea mays): Stengel junger Pflanzen - - Maiglöckchen (Convallaria majalis): Rhizom 33 von 72

34 - - Kürbis (Cucurbita pepo): Sproß - - Wurmfarn (Dryopteris filis-mas oder andere Art): Wurzelstock - - alkoholische Phloroglucinlsg. und verdünnte Salzsäure Präparation: Von den verschiedenen Pflanzenteilen werden Quer- und Längsschnitte angefertigt. Zum Nachweis des Lignins in den Gefäßwänden legt man die Schnitte in 3%ige alkoholische Phloroglucinlsg.. Nach etwa 1 min werden die Schnitte in einem Tropfen verdünnte HCl übertragen. Es wird ein Deckglas aufgelegt und beobachtet. Achtung! HCl darf nicht an die Objektive gelangen! Beobachtung: Die hier gewählten Pflanzen weisen sehr unterschiedlichen Leitbündeltypen auf. Im Wurzelstock des Wurmfarns sind die großen, ellyptischen Leitbündel konzentrisch aufgebaut, beim Kriechenden Hahnenfuß sind sie im Querschnitt ringförmig angeordnet. 34 von 72

35 3.4 Literatur Böhlmann, D Botanisches Grundpraktikum zur Phylologie und Anatomie Quelle & Meyer, Wiesbaden Braune, W., Leman, A. & Taubert, H Pflanzenanatomisches Praktikum 1, 2 VEB Gustav Fischer Verlag, Jena Brian, E.S., Gunning, M., Steer, W Bildatlas zur Biologie der Pflanzenzelle, Struktur und Funktion Aufl., Fischer Stuttgart Gerlach, D Botanische Mikrotechnik Aufl., Thieme, Stuttgart Kuhn, K., Probst, W Biologisches Grundpraktikum, Band I. Fischer, Stuttgart Kutschera, U Grundpraktikum zur Pflanzenphysiologie. Quelle & Meyer Verl. Wiesbaden Neumann, K.H Pflanzliche Zell- und Gewebekulturen. UTB für Wissenschaft, Ulmer, Stuttgart Nultsch, W Mikroskopisch- Botanisches Praktikum Georg Thieme Verlag, Stuttgart Rothmaler, W Exkursionsflora, 2, Grundband Fischer, Jena Sauer, F Tiere und Pflanzen im Wassertropfen Fauna-Verlag Dr. F. Sauer, Eichenweg 8, Karlsfeld, 2. Auflage Schlüter, W Mikroskopie. Verlag Volk und Wissen, Berlin Sitte, P., Ziegler, H., Ehrendorfer, F., Bresinsky, A. Strassburger Lehrbuch der Botanik Fischer Stuttgart, 33 Auflage Stahl-Biskup, E., Reichling, J Anatomie und Histologie der Samensplanzen. Mikroskopisches Praktikum für Pharmazeuten 35 von 72

36 Deutscher Apotheker Verlag Stuttgart 36 von 72

37 4 Quantitative Mikroskopie Block 6 (mikroskopisches Zählen und Messen), und 7 (Zählen und Messen mit dem Zellcounter und mit CMA und Vergleich mit klassischer Methode) des Praktikums 4.1 Mikroskopisches Messen Partikelzählen mit der Zählkammer Die klassische Art, die Partikelkonzentration z.b. von Blutzellen oder Hefezellen zu bestimmen, ist das Zählen unter Verwendung einer Zählkammer. Hierbei werden unterschiedliche Quadrate, die sich aus einem Gitternetz auf der Zählkammer ergeben nach einem bestimmten Schema ausgezählt. Im Praktikum kommen die Thoma-, Bürker- und Neubauer- Zählkammer zur Anwendung, die prinzipiell in ihrem Aufbau ähnlich sind (Beschreibung siehe Anhang unter Punkt 6.3. Tab. 17) Abb. 8: Struktur einer Zählkammer Grundquadrat Gruppenquadrat Arbeit mit dem Objekt- und Okularmikrometer (Eichung) Für die Längenmessungen an mikroskopischen Objekten sind Okularmikrometer und Objektmikrometer notwendig. Für jedes Okular ist die Ermittlung eines Mikrometerwertes notwendig (Eichung) über den eine absolute Länge des Objektes ermittelt werden kann. (Vorschrift unter Punkt 4.5 ) Geschwindigkeitsmessung Mittels Stoppuhr können die Geschwindigkeiten sich bewegender Organismen unter dem Mikroskop ermittelt. Dazu ist die eine Zählkammer zu verwenden, da über die ermittelte Zeit und die zurückgelegte Strecke die Geschwindigkeit berechnet werden kann. 37 von 72