Funktionsanalyse von beta-catenin in hypertrophen Chondrocyten durch gewebespezifische Gendeletion

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1 Funktionsanalyse von beta-catenin in hypertrophen Chondrocyten durch gewebespezifische Gendeletion Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Svitlana Golovchenko aus Schichany, Russland

2 Als Dissertation genehmigt von der Naturswissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 4. Oktober 2016 Vorsitzender des Promotionorgans: Prof. Dr. Jörn Wilms Erste Gutachter: Prof. Dr. Klaus von der Mark Zweite Gutachterin: Dr. PD Alexandra Schambony

3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis... I Abbildungsverzeichnis... IV Abkürzungsverzeichnis... VII 1 Zusammenfassung Einleitung Entwicklung des Vertebratenskeletts Chondrogenese Mesenchymale Kondensation Chondrocytendifferenzierung und Wachstumszone Regulation der Chondrogenese und enchondralen Ossifikation Osteogenese Knochenumbau Wnt-Faktoren und -Signalwege in der Skelettogenese Der kanonische Wnt-Signalweg Nicht-kanonische Wnt-Signalwege Regulation der Wnt-Signalwege Die Rolle von Wnt/ β-catenin in der Skelettogenese Die Rolle von Wnt/ βcatenin Signaltransduktion während der Chondrogenese Rolle des β-catenins in der Osteoblastogenese Regulation der Osteoklastogenese durch das Wnt/ β-catenin Signaling Mausmodelle Die BACCol10 spezifische Cre Deleter Maus, BACCol10a1-Cre BACCol10Cre; ROSA26-LacZ und -YFP Reporter-Mausmodelle (M. Gebhardt) Deletion der β-catenin Gens ctnnb1 in hypertrophen Chondrocyten durch Generierung einer BACCol10Cre; ctnnb1 fl/fl Maus Auswirkungen der β-catenin-deletion in hypertrophen Chondrocyten Aufgabenstellung Ergebnisse Deletion des β-catenin Gens ctnnb1 in hypertrophen Chondrocyten verursacht Trabekelschwund in der Spongiosa von Röhrenknochen Deletion des β-catenin Gens ctnnb1 in hypertrophen Chondrocyten Gewebespezifität der Cre Expression unter dem BACCol10a1 Promoter Bestätigung der spezifischen Deletion der ctnnb1 Expression im hypertrophen Knorpel Starker Trabekelschwund in der Spongiosa von Cat-ko Mäusen Reduziertes Trabekelwerk in der Spongiosa von Cat-KO Knochen: reduzierte Osteoblastendifferenzierung oder verstärkter Abbau von Knochentrabekeln? Einfluss der βcatenin Deletion in hypertrophen Chondrocyten auf die osteogene Differenzierung I

4 Inhaltsverzeichnis Die Auswirkungen der β-catenin-deletion auf die terminale Differenzierung von hypertrophen Chondrocyten Der Trabekelschwund in Cat-KO Knochen korreliert mit einer erhöhten Osteoklastenaktivierung Die erhöhte Osteoklastenaktivität in Cat-KO Mäusen wird wahrscheinlich durch eine verstärkte RANKL Expression verursacht Ist β-catenin für die Transdifferenzierung von hypertrophen Chondrocyten verantwortlich? Diskussion Material und Methoden Material Allgemeine Chemikalien Kits Enzyme Reagenzien für die Genotypisierung Reagenzien für die in situ Hybridisierung Reagenzien für die Sondenherstellung Eindeckmittel Antikörper Reagenzien für die Immunhistochemie und Immunfluoreszenz Medien und Lösungen für Zellkulturen Färbelösungen Verbrauchsmaterialien Bakterien Bakterielle Kulturmedien und Zusätze Geräte Software Methoden Mauszucht Verpaarung der Mäuse Genotypisierung der Mäuse Präparative Methoden Präparation von Mäusen Alcianblau/Alizarinrot Skelettfärbung MikroCT-Analyse Histologische Methoden Herstellung von Paraffinschnitten Herstellung von Kryoschnitten Rehydrierung von Paraffinschnitten Färbungen von Gewebeschnitten Immunhistochemie und Immunfluoreszenz auf Gewebeschnitten RNA-in situ Hybridisierung Herstellung von RNA-Sonden für die RNA-in situ Hybridisierung Ablauf der in situ Hybridisierung Bakterien- und Zellkulturmethoden Allgemeine Bedingungen für bakterielle Kulturen Kompetente DH5α Bakterien Isolation von hypertrophen Chondrocyten II

5 Inhaltsverzeichnis C6 und 4H4 Zelllinien Realtime PCR RNA-Isolierung Photometrische Bestimmung der RNA-Konzentration cdna-synthese mit SuperScript II RT (Invitrogen RT-PCR Kit) cdna-amplifizierung und Analyse der Genexpression Anhang Oligonucleotidsequenzen Sonden für in situ Hybridisierung Literaturverzeichnis III

6 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abbildung 1. Knochenbildung durch die enchondrale Ossifikation Abbildung 2. Längsschnitt durch einen Radius einer neugeborenen Maus Abbildung 3. Schematische Darstellung der Regulation der Chondro- und Osteogenese und die Rolle von -Catenin Abbildung 4. Primäre Spongiosa mit Osteoid produzierenden Osteoblasten, markiert mit anti-kollgen I Antikörpern; Farbsubstrat: alkalische Phosphatase Abbildung 5. Osteoklastendifferenzierung (adaptiert nach Thirunavukkarasu, 2000 ).. 10 Abbildung 6. Diversität der Wnt-Faktoren und Signalwege Abbildung 7. Kanonischer Wnt-Signalweg (adaptiert nach Liu et al., 2008 [32]) Abbildung 8. Die Rolle des kanonischen (βcatenin-abhängigen) Wnt-Signalwegs in der chondrogenen und osteogenen Differenzierung (adaptiert nach Hartmann, 2006 [3]).. 13 Abbildung 9. Herstellung der BAC-Col10a1-Cre-Neo-DNA für transgene Expression von Cre-Rekombinase in hypertrophen Chondrocyten, adaptiert nach [62,63] Abbildung 10. Schematische Darstellung des BACCol10a1-Cre-Plasmids mit der Cre- Neo-Kassette Abbildung 11. Gefloxtes und floxdel-ctnnb1-allele Abbildung 12. Genotypisierung Abbildung 13. Die Expression der Cre-Recombinase in Cat-KO Mäusen und des Collagen X Gens Col10a1 ((in situ Hybridisierung) Abbildung 14. Die in situ Hybridisierung mit der βcatenin-rna-sonde zeigt das Fehlen eines βcatenin-signals in hypertrophen Chondrocyten (*) Abbildung 15. Der relative ctnnb1 -mrna-spiegel in hypertrophen Chondrocyten, ganzen Epiphysen und ganzen Röhrenknochen Abbildung 16. Alcian Blau-Färbung zeigt das Fehlen von Knochentrabekeln in großen Bereichen der Spongiosa inklusive des knorpeligen Kerns in Cat-KO Knochen Abbildung 17. IHC mit anti-collagen I-Antikörper Antikörper zeigt die Abwesenheit von Knochentrabekeln in weiten Bereichen der Spongiosa Abbildung 18. Die in situ Hybridisierung mit einer Col1A1-Sonde zeigt eine deutliche Reduktion von Col1a1 exprimierenden Osteoblasten an der Knorpel-Knochengrenze. 26 IV

7 Abbildungsverzeichnis Abbildung 19. Das Fehlen von calcifizierten Knochentrabekel wurde mit der Alizarin Rot-Färbung nachgewiesen. Humerus, P2, 10x Vergößerung Abbildung 20. Safranin O-Färbung zeigt, dass nicht nur der Knochenanteil der Trabekel, sondern auch die Knorpelkerne im Knochenmarksraum fehlen Abbildung 21. Masson-Goldner-Trichromfärbung zeigt einen deutlichen Knochentrabekelschwund in der Methaphyse Abbildung 22. Quantitative Auswertung von Trabekelschwund mittels Osteomeasure- Software an nach Goldner-Masson gefärbten Schnitten Abbildung 23. MicroCT-Analyse von drei Wochen alten Tieren Abbildung Größenunterschiede zwischen vier Wochen alten Wildtyp und Knockout Mäusen (Founderlinie 1465). 2. Verkürzte Röhrenknochen der Extremitäten von Wildtyp- und Knockout-Mäusen (vier Wo.) Abbildung 25. Die freien Osx-positiven Zellen sind deutlich nach Immunhistochemie mit anti-osx-antikörper und Peroxidase (AEC als Farbsubstrat) Abbildung 26. Die histomorphometrische Analyse von Osterix-positiven Zellen in Paraffinschnitten von P Abbildung 27. Die in situ Hybridisierung mit der Mmp13-mRNA-Sonde Abbildung 28. Die Mmp13-Expression bei Knockout-Tieren ist deutlich reduziert Abbildung 29. Die Opn-Expression in späthypertrophen Chondrocyten und in Osteoblasten Abbildung 30. Die in situ Hybridisierung mit der Vegf-Sonde zeigte keine deutliche Veränderungen in der Vegf-Expression in Cat-KO-Tieren Abbildung 31. Unveränderte Invasion von Endothelzellen wurde durch die Imunofluoreszenz mit anti-cd31- (PECAM) Antikörpern festgestellt Abbildung 32. Der relative Vegf-Spiegel zeigte keine signifikante Veränderung in hypertrophen Chondrocyten (HC) Abbildung 33. Die in situ Hybridisierung mit Runx2-RNA-Sonde zeigte deutliche Abnahme der Runx2-Expression im Knorpel und Knochenmark Abbildung 34. Die deutliche Senkung des Runx2-Spiegels sowohl in hypertrophen Chondrocyten als auch in ganzen Epiphysen und Knochen der Knockout-Mäuse Abbildung 35. Die relative Osx-Expression in hypertrophen Chondrocyten und in Knochen von Knockout-Mäusen ist signifikant herunterreguliert V

8 Abbildungsverzeichnis Abbildung 36. Die relativen Expressionsspiegel von Bmp-Faktoren in hypertrophen Chondrocyten Abbildung 37. Die relative Expression von zwei Bmp-Inhibitoren, Chordin und Noggin, in hypertrphen Chondrocyten Abbildung 38. Die in situ Hybridisierung mit Ihh-RNA-Sonde zeigte keine Unterschiede in der Expression von Ihh in Knochen von WT- und Cat-KO-Mäusen Abbildung 39. Die relative Ihh-Expression n hypertrophen Chondrocyten, ermittelt mittels qrt-pcr, war nicht signifikant reduziert Abbildung 40. Die TRAP-Färbung von Knochenschnitten der 3 Tage alten Mäusen g. 43 Abbildung 41. Die TRAP-Färbung von Knochenschnitten der 17 Tage alten Mäusen. 44 Abbildung 42. Auswertung der morphometrischen Analyse von dem Osteoklastenvolumen im Verhältnis zum Gesamtvolumen (ocl.v./t.a..) Abbildung 43. Die in situ Hybridisierung mit der Mmp9-RNA-Sonde Abbildung 44. Die Expression von Mmp9 in Knochen von 7 Tage alten Knockout- Mäusen Abbildung 45. Immunistochemische Analyse mit anti-rankl-antikörpern Abbildung 46. Der relative Opg-mRNA-Spiegel war in hypertrophen Chondrocyten von Knockout-Tieren nicht signifikant reduziert Abbildung 47. Der relative Rankl-mRNA-Spiegel. Die hypertrophen Chondrocyten und Epiphysen von Knockout-Mäusen wiesen Überexpression von Rankl auf Abbildung 48. Die relativen Expressionsspiegel in der 4C6-Zelllinie nach der Inaktivierung des β-catenins mit ctnnb1-sirna Abbildung 49. Immunfluoreszenz auf Tibia Schnitten von P2 BACCol10Cre; R26YFP;ctnnb1 fl/fl (KO) und BACCol10Cre;R26YFP;ctnnb1 fl/+ (WT) Mäusen mit anti- Osterix- und anti-yfp-antikörpern (A; C); B, D: Immunofluoreszenz mit anti- Collagen I- und anti-yfp-antikörpern VI

9 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abb Abbildung APC Adenomatous Polyposis Coli BAC Bacterial Artificial Chromosome BMP Bone morphogenetic protein BSA Rinderserumalbumin (Bovine serum albumin) BSP Bone sialoprotein βtrcp β-transducin-repeat-containing Protein C Grad Celsius CBP/p300 Cyclo-AMP response element-binding Protein cdna complementäre DNA CD-RAP Cartilage-drived retinoic acid-sensitiv protein CK1α Casein Kinase 1α Col Kollagen COMP Cartilage oligomeric matrix protein Dkk1 Dickkopf 1 DMEM Dulbecco s modified Eagle s medium DNA Desoxyribonukleinsäure (Desoxyribonucleic acid) Dsh Dishevelled E Embryonaltag (zur Klassifizierung von Mausentwicklungsstadien) EDTA Ethylendiamintetraacetat, Dinatriumsalz EZM extrazelluläre Matrix FCS Fötales Kälberserum (Fetal calf serum) FGF Fibroblast growth factor FGFR Fibroblast growth factor receptor fl floxed Fz Frizzled g Gramm GSK3β Glykogen Synthase Kinase 3β h Stunde HDAC Histondeacetylase HTC hypertrophe Chondrocyten I-CAT Inhibitor of β-catenin and T-cell factor Ihh Indian hedgehog kb Kilobase KO Knockout LB Luria Broth LEF1 Lymphoid Enhancer-binding Faktor 1 LRP low density Lipoprotein receptor related protein M Molar MAPK Mitogen-activated protein Kinase M-CSF Macrophage colony-stimulating factor min Minute ml Milliliter MMP Matrixmetalloproteinase N-CAM Neural cell adhesion molecule NFATC1 Nuclear Factor Of Activated T-Cells VII

10 Abkürzungsverzeichnis NFκB nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B- cells NLK Nemo-Like Kinase nt Nukleotid Ocn Ostecalcin Opg Osteoprotegerin Opn Osteopontin Osx Osterix P Postnataltag (zur Klassifizierung von Mausentwicklungsstadien) PBS Phosphate-buffered Saline PCP Planar Cell Polarity PCR Polymerase Kettenreaktion/Polymerase chain reaction PFA Paraformaldehyd PKC Proteinkinase C Prx Paired-related homeobox Gen PTH Parathyroid hormone PTHrP Parathyroid hormone related peptide RANK Receptor activator nuclear factor κb RANKL Receptor activator nuclear factor -κb ligand RNA Ribonukleinsäure (Ribonucleic acid) RT Raumtemperatur Runx2 Runt-related transcription factor 2 s Sekunde Sfrp Secreted frizzled-related protein Shh Sonic hedgehog SLRP Small leucin rich protein Sox SRY (sex determining region Y)-box Gen SRY sex determining region Y TBS Tris-buffered Saline TCF T-Cell-specific Factor TGFβ Transforming growth factor β TRAP Tartrat-resistente alkalische Phosphatase Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Tween-20 Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat ÜN übernacht Upm Umdrehungen pro Minute UTR untranslatierter Bereich VEGF Vascular Endothelial Growth Factor Wif1 Wnt inhibitory factor Wnt Wingless / Int-1 WT Wildtyp X-Gal bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside YFP yellow fluorescent protein VIII

11 Zusammenfassung 1 Zusammenfassung Die Elemente des Vertebratenskeletts werden zum größten Teil als Knorpelmodell angelegt, die bis auf den Gelenkknorpel im Laufe der embryonalen und frühen postnatalen Entwicklung durch den Prozess der enchondralen Ossifizierung verknöchern. Die Umwandlung der Knorpelelemente in Knochenelemente beginnt mit der Differenzierung von Chondrocyten im Zentrum der Knorpelanlagen zu hypertrophen Chondrocyten, die neben verschiedenen Knochen-spezifischen Genen auch VEGF (Vaskular Endothelial Growthfactor) produzieren und damit die Einsprossung von Knochenmarkgefäßen induzieren. Der hypertrophe Knorpel wird von Osteochondroklasten abgebaut und durch Knochenmark und Knochen ersetzt. Für die Regulation dieser komplexen Prozesse sind mehrere Gene und Faktoren verantwortlich, die zum größten Teil von drei Zelltypen produziert werden: Osteoblasten, Chondrocyten und Osteochondroklasten. Wnt- Faktoren und Signalwege spielen in diesem Prozess eine zentrale Rolle, und β-catenin reguliert als wichtiger Transkriptionsfaktor die Knochen- und Knorpelentwicklung über den kanonischen Wnt/ β-catenin-signalweg. Um die Funktion des -Catenins in der enchondralen Ossifikation und somit in der Skelettogenese genauer zu analysieren, wurde in dieser Arbeit das β-catenin Gen ctnnb1 spezifisch unter dem Col10a1- Promotor in hypertrophen Chondrocyten in einem Mausmodell deletiert. Dies wurde durch die Kreuzung einer β-catenin fl/fl Maus mit einer BACCol10Cre-Deleter-Maus erreicht. Fötale und neugeborene BACCol10Cre+; βcatenin fl/fl Mäuse (Cat-KO) zeigten einen starken Trabekelschwund in der Spongiosa der Röhrenknochen unterhalb der hypertrophen Knorpelzone, obwohl die Expression der Cre-Rekombinase auf hypertrophe Chondrocyten begrenzt war. Die Morphologie der hypertrophen Zone wurde zwar nicht beeinträchtigt, aber die Expressionsraten bzw. die mrna-spiegel von einigen Markern der Späthypertrophie, wie Runx2, Mmp13, Vegf und Osx, waren reduziert, was mit der Hilfe der in situ Hybridisierung und qrt-pcr bestätigt wurde. Als mögliche Ursache für die fehlenden subchondralen Trabekel in Röhrenknochen der Cat-KO-Mäuse wurde zum ersten eine Beeinträchtigung der Osteoblastendifferenzierung erwogen, möglicherweise aufgrund fehlender bzw. veränderter Sekretion parakriner Faktoren. Als mögliche Faktoren wurden Mitglieder der BMP-Familie (BMP2, -4, -6 und -7), ihre Inhibitoren Noggin und Chordin, sowie der Skelettentwicklungsfaktor Indian Hedgehog (IHH) untersucht. Es wurde eine reduzierte Expression von Bmp2 und Bmp7 mit Hilfe der qrt-pcr nachgewiesen, aber auf welche Weise sich die Deletion von ctnnb1 auf die Bmp-Expression auswirkt, ist noch unklar. Gegen eine Beeinträchtigung der Osteoblastendifferenzierung aufgrund der ctnnb1 Deletion sprach zunächst der Befund, dass keine signifikanten Unterschiede in der Dichte von Osterix-positiven Osteoblastenvorläuferzellen zwischen Cat-KO und Wildtyp- Mäusen gemessen werden konnte. Zum zweiten wurde eine verstärkte Resorption von Knochentrabekeln durch die Osteoklasten als Erklärung für den Phänotyp in Betracht gezogen. Mit Hilfe der TRAP- Färbung wurde gezeigt, dass in Cat-KO-Mäusen die Anzahl der Osteoklasten an der 1

12 Zusammenfassung Knorpel-Knochenmarkgrenze stark erhöht war. Außerdem war die Expression der Matrix-Metalloproteinase Mmp9 überreguliert, die vor allem für die Resoption des hypertrophen Knorpels durch Osteoklasten verantwortlich ist. Weitere Untersuchungen der Expression von Rankl und Opg als wichtigsten Faktoren des Gleichgewichts zwischen Knochenauf- und Abbau wiesen mit Hilfe der qrt-pcr eine verstärkte Rankl- Expression im Gewebe der Cat-KO-Tieren auf, eine Bestätigung einer erhöhten Osteoklastenaktivität. Als dritte Möglichkeit für die Aufklärung des Mechanismus des Trabekelschwunds wurde eine Inhibition der Transdifferenzierung von hypertrophen Chondrocyten zu Osteoblasten untersucht. Diese Hypothese wurde erst vor kurzem plausibel durch den parallele Befunde aus unserer und weiteren Arbeitsgruppen, die zeigten, dass hypertrophe Chondrocyten an der Knorpel-Knochenmarksgrenze nicht notwendigerweise, wie bisher angenommen, durch Apoptose eliminiert werden, sondern zu trabekulären Osteoblasten transdifferenzieren können. Ursprünglich hatte ich nur das Fehlen von an Trabekel gebundenen Osteoblastenvorläuferzellen (Osx-positiv und Col I-negativ) in Cat KO Mäusen gezeigt. Nach Etablierung eines BACCol10Cre; Rosa26YFP; β-catenin fl/fl Reporter Mausmodells, in dem alle Zellen, die von hypertrophen Chondrocyten abstammen, YFP exprimieren, konnte ich eine signifikante Reduktion der Anzahl von YFP-positiven, also Chondrocyten-abgeleiteten Osteoblasten in der Spongiosa von Cat-KO-Mäusen nachweisen. Das bedeutet, dass der beschriebene Phänotyp der Cat-KO Mäuse nach Deletion von ctnnb1 in hypertrophen Chondrocyten möglicherweise durch ein Zusammenwirken dreier verschiedener, durch -Catenin regulierter Mechanismen zustande kommt: Eine erhöhte Osteoklastenaktivität aufgrund erhöhter Rankl Expression in hypertrophen Chondrocyten, auf eine reduzierte Osteoblastendifferenzierung aufgrund reduzierter Bmp-Expression, und auf eine Inhibition der Transdifferenzierung von hypertrophen Chondrocyten zu Osteoblasten. 2

13 Einleitung 2 Einleitung 2.1 Entwicklung des Vertebratenskeletts Die Entwicklung des Vertebratenskeletts fängt in früheren Embryonalstadien an und dauert bis zum Epiphysenschluss beim Übergang zum Erwachsenenalter. Das Vertebratenskelett erfüllt neben seiner primären Aufgabe als stützende und schützende Konstruktion auch Aufgaben als endokrines und hämatopoetisches Organ [1]. Für seine richtige und fehlerfreie Entwicklung und für den Erhalt spielt eine ausbalancierte Homöostase von verschiedenen Gewebe- und Zellarten und anderen Faktoren eine wichtige Rolle. Das Skelett besteht aus mehr als 200 Knochen als Bauelemente, aus Gelenkknorpel, Bändern und Sehnen als Verbindungsstücken und sorgt mit Hilfe der an ihm befestigten Muskeln für die Mobilität des Körpers. Die wichtigsten Zellen des Knochens sind Osteoblasten und Osteoklasten. Gelenkknorpel besteht aus Chondrocyten in verschiedenen Differenzierungsstadien. Für die biomechanischen Eigenschaften des Knorpels und des Knochens ist die gewebespezifische extrazelluläre Matrix (EZM) essentiell. Sie spielt auch eine unentbehrliche Rolle für Zellproliferation, -interaktion und -differenzierung und somit für die Entwicklung und den Erhalt des ganzen Skeletts. Je nach Knochenart verläuft die Skelettogenese durch endesmale oder enchondrale Ossifikation und fängt in beiden Fällen mit der Kondensation von mesenchymalen Zellen an. Durch die endesmale Ossifikation, bei der Mesenchymzellen direkt zu Osteoblasten differenzieren, entstehen Knochen des Schädeldachs und des Gesichts (Kiefer), und das Schlüsselbein [1, 2]. Die meisten Knochen des Endoskeletts wie Röhrenknochen, Wirbel und Rippen werden durch enchondrale Ossifikation gebildet. Dabei kondensieren mesenchymale Vorläuferzellen zu Knorpelblastemen, die zu Knorpelanlagen der einzelnen Knochenelemente differenzieren. Die Knorpelanlagen werden im Laufe der Entwicklung in einem komplexen Prozess der Chondrocytenreifung und Kalzifizierung, des Abbaus des hypertrophen Knorpels und Ersatzes durch Knochen und Knochenmark durch einsprossende Endothelzellen, Osteoblastenvorläuferzellen und Knochenmarkstammzellen ersetzt [1]. 3

14 Einleitung Abbildung 1. Knochenbildung durch die enchondrale Ossifikation: Zuerst fangen mesenchymale Zellen zu kondensieren an, so wird eine knorpelige Anlage der zukünftigen Extremitäten vorgeformt. Umgebende mesenchymale Zellen werden flacher und bilden Perichondrium. Im Bereich der hypertrophen Chondrocyten (HTC) differenzieren Zellen des Perichondriums zu ersten Osteoblastenvorläuferzellen unter dem Einfluss von Signalen von prä- und hypertrophen Chondrocyten. Es entsteht das Periosteum. Osteoblasten produzieren zuerst nicht-mineralisierte, Kollagen reiche extrazelluläre Matrix, das Osteoid, das sich zu mineralisierten kortikalen Knochen (Substantia compacta) entwickelt. Die im Osteoid eingemauerten Osteoblasten differenzieren zu Osteocyten. Osteoklasten resorbieren Knochenmatrix und formen so Knochentrabekel und hohle Räume für Knochenmark und Gefäße. Ihre Aktivität ist auch für die Freisetzung von Kalzium und Phosphat wichtig [3]. 2.2 Chondrogenese Mesenchymale Kondensation Die Knochen des Vertebratenskeletts werden als mesenchymale Kondensationen (Blasteme) in Gliedmaßenknospen angelegt [4]. Die mesenchymalen Vorläuferzellen differenzieren sich zu Chondrocyten und bilden die knorpeligen Anlagen der verschiedenen Skelettelemente als Zwischenstufe der enchondralen Ossifikation [1, 5]. Eine zentrale Rolle in der Initiation der Chondrogenese spielt Sox9, ein Transkriptionsfaktor der SRY Genfamilie und einer der ersten Marker während der Kondensation. Sox9 wird in Chondroprogenitorzellen und Chondroblasten hoch exprimiert und mit dem Beginn der Hypertrophie ausgeschaltet [4, 6]. Dieser Prozess der Blastembildung hängt stark von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen und löslichen Wachstumsfaktoren der BMP/TGF -Familie und der Wnt-Familie ab. Die EZM der Blasteme, die von mesenchymalen Zellen produziert wird, ist reich an Typ I Kollagen, Fibronektin und Hyaluronsäure, das zunächst eine enge Zell-Zell-Interaktion inhibiert [5]. Während der Differenzierung zu Chondrocytenvorläufern steigen die Aktivität der Hyaluronidase und die 4

15 Einleitung Produktion von Zelladhäsionmolekülen N-Cadherin und N-CAM, sodass direkte Zellkontakte zwischen Chondrocyten möglich werden. Der Differenzierungsprozess wird weiterhin durch Interaktion von EZM-Molekülen wie Thrombospondin, Tenascin und COMP mit Zelladhäsionsfaktoren reguliert [4]. Im Laufe der Differenzierung zu Chondrocyten ändert sich die Zusammensetzung der EZM von Typ I Kollagen/Fibronektin zu Typ II Kollagen und Aggrecan. In der Peripherie der Knorpelblasteme differenzieren die mesenchymalen Zellen zu Osteochondroprogenitorzellen. Sie bilden zunächst das Perichondrium und später periostalen Knochen [1] Chondrocytendifferenzierung und Wachstumszone Eine räumlich und zeitlich exakt kontrollierte Differenzierung von Chondrocyten ist ein wichtiger Schritt in der Skelettogenese. Die drei Extremitätenachsen sind durch das Expressionsmuster verschiedener Hox Gene festgelegt und werden durch das Zusammenspiel mit verschiedenen Faktoren der Wnt-, BMP/TGFβ- und Hedgehog-Familie realisiert. Das charakteristische Merkmal für die Transition von Chondroprogenitoren zu Chondrocyten ist die Produktion der knorpelspezifischen EZM, die statt Typ I Kollagen Typ II, IX und XI Kollagen und verschiedene Proteoglykane enthält, vor allem Aggrecan, das Kollagenfibrillen schützt [1, 7]. In den Knorpelanlagen der Röhrenknochen vermehren sich Chondroblasten zunächst langsam (Ruhezone), mit Beginn des Längenwachstums aber stark und ordnen sich säulenförmig in einer Zone zwischen Epiphyse und Diaphyse an (Proliferationszone). Proliferierende und hypertrophe Chondrocyten bilden mehrschichtige knorpelige Struktur an beiden Enden des wachsenden Knochens zwischen Epiphyse und Metaphyse, die als Wachstumszone (Wachstums- oder Epiphysenfuge) bezeichnet wird (s. Abb.1) und an deren Enden sich die Reservezone mit ruhenden Knorpelzellen befindet. Diese Ruhezone ist durch niedrige Proliferationsraten und Produktion von Typ IIB Kollagen und Proteoglykan reichen Matrix charakterisiert [7]. Am Ende der Proliferationszone nehmen Chondroblasten an Größe zu, reduzieren der Proliferationsrate und differenzieren zunächst zu prähypertrophen, dann zu hypertrophen Chondrocyten [1, 7]. Dieser Differenzierungsprozess ist mit einem dramatischen Anwachsen des Zellvolumens der hypertrophen Chondrocyten bis auf das Zehnfache, mit der Knorpelmineralisierung sowie mit einer Änderung der Genexpression von Col2a1, dem Gen des Typ II Kollagens, zu Col10a1 (TypX Kollagen-Gen) sowie der Expression von knochentypischen Genen wie alkalische Phosphatase, Osteopontin und Bone Sialoprotein (BSP) verbunden. Der Übergang von der Prähypertrophie zur Hypertrophie wird durch Sox5, Sox6 und Sox9 stimuliert [1, 7, 8]. Zur gleichen Zeit fangen die Zellen des Perichondriums an Runx2, ein Mastergen der Osteogenese, zu exprimieren und Knochenproteine zu synthetisieren, aus denen die kortikale Knochenmanchette gebildet wird [1]. Zusätzlich beeinflusst Runx2 Chondroblastenproliferation und Säulenbildung und induziert zusammen mit Runx3 auch die hypertrophe Differenzierung 5

16 Einleitung der Chondrocyten. Nach Takeda et al. (2001), aktiviert Runx2 die Transkription von Markern der Chondrocytenreifung wie Col10a1, Osteopontin, und Osterix [9]. Die späthypertrophen Chondrocyten unterlaufen am unteren Ende der Knorpelzone eine terminale Differenzierung, gekennzeichnet durch die Expression des Endothelzellwachstumsfaktors Vegf, der Matrix-Metallproteinease Mmp13 und Osteopontin (Opn). An der Grenze zur primären Spongiosa sterben die meisten Chondrocyten durch Apoptose. Das von den hypertrophen Chondrocyten sezernierte VEGF induziert die vaskuläre Invasion des mineralisierten hypertrophen Knorpels durch die Knochenmanschette [1, 7]. Blutgefäße transportieren Endothelzellen, Osteoblastenvorläufer, Osteoklasten und hämatopoetische Zellen in den hypertrophen Knorpel, der durch Osteoklasten abgebaut und durch Knochen ersetzt wird. Beim Abbau des hypertrophen Knorpels werden vertikale Stege der kalzifizierten Typ X Kollagen-reichen Kalkknorpels hinterlassen, an den einwandernde Osteoblasten Osteoid (Typ I Kollagen) ablagern. Daraus entwickeln sich die Knochentrabekel der Spongiosa in der primären Ossifikationszone[1, 5, 7, 10]. In der Mitte der Epiphyse wird eine sekundäre Ossifikationszone durch den gleichen Vorgang gebildet [7]. Nach dem Abschluss des Knochenwachstums im Erwachsenenalter schließt sich die Wachstumsfuge (außer bei Nagern) und es bleibt nur hyaliner Gelenkknorpel an Enden der Knochen erhalten (s. Abb.1). Abbildung 2. Längsschnitt durch einen Radius einer neugeborenen Maus. Die verschiedenen Zonen (rechts) sind durch die Morphologie der Chondrocyten und die Expression verschiedener Matrix Makromoleküle (Kollagene, Proteoglykane) definiert (links).die Proliferation und Differenzierung der Chondrocyten wird durch eine komplexe Interaktion verschiedener Wachstums und Transkriptionfaktoren reguliert (links). 6

17 Einleitung Regulation der Chondrogenese und enchondralen Ossifikation Die Differenzierungsvorgänge während der Chondrogenese werden von verschiedenen Wachstumsfaktoren, Hormonen und anderen Signalmolekülen und ihren Rezeptoren reguliert, die verschiedene intrazelluläre Signalwege zu verschiedenen Transkriptionsfaktoren auslösen. Für ein kontrolliertes Längenwachstum ist eine exakte zeitliche und räumliche Kontrolle und Koordination der Proliferations- und der Differenzierungs der Chondrocyten anderseits notwendig. Insulin-like Growth Faktoren (Somatomedine und Somatotropin), und verschiedene Wachstumsfaktoren der FGF-Familie und TGFβ- Familie kontrollieren abhängig von der Expression ihrer Rezeptoren die Chondrocytenproliferation in der Wachstumszone [4]. Der FGF-Rezeptor Fgfr3 wird in nichthypertrophen Chondrocyten exprimiert und inhibiert die Proliferation über Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors Stat1, was zu Überexpression des Zellzyklusinhibitors p21 führt [11]. Die Liganden von FGFR3 sind FGF 18 und FGF9, die in Zellen des Perichondriums und Periosteums exprimiert werden. Die Expression von Fgf18 wird durch Runx2 reguliert und hemmt Proliferation und Reifung von Chondrocyten. Außerdem inhibiert FGF18 die Expression von Indian Hedgehog (Ihh) [12]. Fgf9 wird nur in proximalen Extremitätenknochen exprimiert [1]. Beide Liganden interagieren außerdem mit FGFR1, der in prähypertrophen und hypertrophen Chondrocyten exprimiert wird, und induzieren die Expression von Vegf und Vegfr1 und somit die vaskuläre Invasion [13]. Ein wichtiger Kontrollmechanismus der hypertrophen Differenzierung von Chondrocyten ist die negative feed-back Schleife von Ihh und PTHrP. PTHrP stimuliert die Proliferation von Chondrocyten in der unteren Proliferationszone und in der prähypertrophen Zone, aber inhibiert die Reifung zu hypertrophen Chondrocyten (s. Abb.2): Ihh wird von prähypertrophen Chondrocyten sezerniert und induziert die PTHrP Expression im Perichondrium. PTHrP wiederum inhibiert die Expression von Ihh und die zu frühe Differenzierung von Säulenchondrocyten zu prähypertrophen Chondrocyten [14, 15]. Von der Balance zwischen Proliferation und dem Zeitpunkt der hypertrophen Differenzierung hängt das Längenwachstum der Knorpelwachstumszone ab. Die Anpassung der Rate der Chondrocytendifferenzierung an der Rate der Proliferation erfolgt ferner mit Hilfe des Gleichgewichts zwischen BMP und FGF Signalwegen. FGF18 inhibiert Ihh Expression, und durch den BMP Signalweg wird die Ihh Expression in Zellen auch unabhängig vom PTHrP Einfluss hochreguliert [12, 16]. Die Hypertrophie der Chondrocyten ist der vorbereitende Schritt zur enchondralen Ossifikation. Hypertrophe Chondrocyten exprimieren als einzige Zellen der Körpers Typ X Kollagen, sowie alkalische Phosphatase, Ihh, PTHrP Rezeptor, Runx2, Bmp6, Mmp13, Opn, Vegf, HIF1α und viele andere Gene [4]. Runx2 wird in prähypertrophen Chondrocyten exprimiert und stimuliert die hypertrophen Differenzierung und Expression von Kollagen X Expression [17] und weiteren Genen die auch für die Osteogenese wichtig sind wie Osterix [18, 19]. In Zellen des Perichondriums aber inhibiert Runx2 Chondrocytenhypertrophie über die Hochregulation von Fgf18 und somit vorzeitige Knochenbildung. Durch die Bindung von HDAC4 wird diese Funktion von Runx2 in Chond- 7

18 Einleitung rocyten inhibiert [9]. Ein Zielgen von Runx2 ist die Matrix-Metalloproteinase MMP13, die in terminaldifferenzierten hypertrophen Chondrocyten exprimiert wird und zusammen mit MMP9 nicht-mineralisierte Matrix degradiert [20]. Andere EZM-Moleküle, wie Osteopontin und Osteocalcin spielen ihre Rolle in Zell-Matrix-Interaktion während der enchondralen Ossifikation. Weitere Faktoren beeinflussen die Chondrogenese entweder über direkte Genregulation wie Sox9 und Hif1α oder über die Regulation von Runx2 [4]. Eine wichtige Rolle spielt auch der Wnt/β-Catenin-Signalweg, auf den später eingegangen wird. Abbildung 3. Schematische Darstellung der Regulation der Chondro- und Osteogenese und die Rolle von -Catenin. 2.3 Osteogenese Das Knochengewebe besteht aus einer organischen Komponente, vorwiegend Kollagen I und V, verschiedenen Phospo-und Glykoproteinen wie BSP (Bone Sialoprotein), Osteocalcin, Osteopontin, Matrix Gla Protein, dem anorganischen Bestandteil Hydroxyapatit, sowie verschiedenen Zelltypen: Für die Synthese der Knochenmatrix sind Osteoblasten verantwortlich, Zellen mesenchymaler Herkunft. Osteocyten sind terminaldifferenzierte Osteoblasten, die in Knochenmatrix eingemauert sind und eine Aufgabe der Mechanosensoren erfüllen. Osteoklasten, die für die Knochenresorption zuständig sind, sind Zellen myelo-monocytärer Herkunft. Während der enchondralen Ossifikation differenzieren die Zellen des Periosteums, die Runx2 exprimieren, unter dem Einfluss von angrenzenden differenzierenden Chondrocyten zu Osteoblasten. So entsteht der kortikale Knochen, oder die Knochenmanschette [22]. Der trabekuläre Knochen (primäre Spongiosa) wird von Osteoblasten gebildet, die nach der Entstehung des Knochenmarks an den Resten des von Osteoklasten resorbierten kalzifizierten Knorpels anheften und zunächst die organische Komponente der Knochenmatrix, den so genannten Osteoid, deponieren. Osteoid besteht zu 90% aus Typ I Kollagen, außerdem aus weiteren Kollagenen (Typ V und VI) und Matrixproteinen, wie Osteopontin, Bone Sialoprotein 8

19 Einleitung und alkalische Phosphatase, die die Matrix stabilisieren, sowie Osteocalcin, das die Mineralisation reguliert als auch als Hormon sezerniert wird und den Insulinstoffwechsel reguliert [23]. Anti Col 1 Osteoid anti Kollagen I Abbildung 4. Primäre Spongiosa mit Osteoid produzierenden Osteoblasten, markiert mit anti- Kollgen I Antikörpern; Farbsubstrat: alkalische Phosphatase Knochenumbau Knochenwachstum, Heilungsprozesse nach Knochenfrakturen und die Anpassung an mechanische Belastungen erfordern ständigen Knochenumbau und Regeneration. Dieser Prozess hängt stark von dem Gleichgewicht zwischen Knochenaufbau durch Osteoblasten und Knochenresorption durch Osteoklasten ab. Osteocyten spielen ihre Rolle als Mechanosensoren in der Regulation der Aktivität der Osteoklasten [2]. Osteoblasten induzieren die Aktivierung und anschließende Differenzierung von Osteoklasten mit Hilfe der von ihnen sezernierten Faktoren M-CSF und RANKL: M-CSF reguliert Proliferation und Überleben von Osteoklasten über seinen Rezeptor c-fms und über Akt- / MAPK-Signalwege; RANKL bindet an seinen Rezeptor RANK und TRAF6 auf Osteoklasten und induziert verschiedene Signalwege (NFκB-, MAPK- etc.). Außerdem aktiviert RANKL über Kalziumspiegel den Transkriptionsfaktor NFATC1, der für die Differenzierung von Osteoklasten wichtig ist [24]. Osteoprotegerin, das auch von Osteoblasten produziert wird, inhibiert Osteoklasten durch die Bindung an den RANK- Rezeptor. So wird die Bindung von RANKL verhindert [25]. Verschiedene Faktoren, wie Steroid-Hormone (Glukocortikoide, Östrogen) und Peptidhormone (PTH) regulieren die Expression von Rankl und Opg [26]. Runx2 induziert die Expression von Opg in Osteoblasten und über BMP2 die Rankl-Expression in hypertrophen Chondrocyten und in Osteoblasten [27, 28]. 9

20 Einleitung Abbildung 5. Osteoklastendifferenzierung (adaptiert nach Thirunavukkarasu, 2000 [27]), Cbfa1=Runx Wnt-Faktoren und -Signalwege in der Skelettogenese Wnts sind Cystein-reiche sezernierte Glycoproteine, die von neunzehn Genen der Wnt- Familie kodiert sind und verschiedene Signalwege in der Embryogenese induzieren (Abb. 6). In der Skelettogenese spielen Wnt-Faktoren eine wichtige Rolle in der Regulation der Knochen- und Knorpeldifferenzierung. Nachdem Wnt an einen Membranrezeptorkomplex bindet, der aus ein bis zehn G-Protein gekoppelten Frizzled (Fz) Rezeptoren und LRP5 oder LRP6 (low-density Lipoprotein (LDL) Rezeptor-related Protein) besteht, wird das Signal über verschiedene intrazelluläre Signalwege weitergeleitet. Diese evolutionär hoch konservierten Signalwege werden je nach Mediatoren entweder als kanonische (β-catenin-abhängige) oder nicht-kanonische Wnt-Signalwege bezeichnet [29, 30]. 10

21 Einleitung Inhibieren Chondrogenese induzieren Chondrocytendedifferenzierung Wnt 3a ß-cat Signalweg (kanon.) Nicht kanonischer (JNK,PKC) Wnt 1 7a Inhibiert Typ II Kollagenexpression und Hypertrophie Stimuliert Chondrocytenhypertrophie Wnt 5a Wnt 4 Wnt 8c Frzld LR5P JNK Canonical pathway b-cat TCF/Lef Genexpression Induziert Gelenkbildung und Chondrocytendedifferenzierung Stimuliert Expression von Typ II Kollagen Wnt 9a Wnt 11 Wnt 7b PKC, Ca2+ Stimuliert Osteogenese Abbildung 6. Diversität der Wnt-Faktoren und Signalwege Der kanonische Wnt-Signalweg Der kanonische Wnt-Signalweg (s. Abb.7) ist durch die Akkumulierung und Translokation von β-catenin, einem intrazellulären Adhäsionsmolekül, in den Zellnukleus gekennzeichnet [30, 31]. In der Abwesenheit von Wnt wird β-catenin im Cytoplasma mit Hilfe von Scaffoldproteinen APC (Adenomatous Polyposis Coli) und Axin durch Casein Kinase 1α (CK1α) und Glykogen Synthase Kinase 3β (GSK3β) phosphoryliert. Das führt zur Interaktion mit dem β-transducin-repeat-containing Protein (β-trcp) und anschließender Ubiquitinierung und proteosomaler Degradation [31, 32]. Die Bindung von Wnt an Frizzled und LRP5/6 führt zur Bindung von Dishevelled (Dsh) und Axin an den Membranrezeptorkomplex und Zerfall des Ubiquitinierungskomplexes, wodurch die Degradation von β-catenin verhindert wird. Das akkumulierte β-catenin wird in den Zellkern transloziert, bindet an TCF (T-Cell-specific)/LEF1 (Lymphoid Enhancerbinding Faktor 1) Transkriptionsfaktoren und induziert als Co-Aktivator die Expression von Zielgenen [29]. TCF wirkt zusammen mit Groucho und HDAC (Histondeacetylase) als Repressor der Transkription [33, 34, 35]. β-catenin löst Groucho ab und rekrutiert die Histonacetylase CBP/p300 (Cyclo-AMP response element-binding Protein), um die Gentranskription zu aktivieren [36]. Zielgene des Wnt/ β-catenin Signalweges sind z. B.: Sox9 in Mesenchym [37, 38], Runx2 [39] und Ihh [40] in Chondrocyten, RANKL [41] und Osteocalcin [42] in Osteoblasten. 11

22 Einleitung Abbildung 7. Kanonischer Wnt-Signalweg (adaptiert nach Liu et al., 2008 [32]) Nicht-kanonische Wnt-Signalwege Die β-catenin-unabhängige Wnt-Signaltransduktion geschieht über verschiedene Mediatoren und zwei Hauptverzweigungen, die Planar Cell Polarity- (PCP) und Wnt/Ca2+- Signalwege. Die Aktivierung von kanonischen oder nicht-kanonischen Wnt-Signalwegen hängt vom Zelltyp und Zielgenen der Signaltransduktion ab [32] Regulation der Wnt-Signalwege Die Modulation von Wnt-Signalen geschieht sowohl über extrazelluläre als auch über nukleäre Antagonisten [32]. Der Wnt inhibitory Factor 1 (Wif1) und Mitglieder der Sfrp (Soluble frizzled like receptor protein)-familie inhibieren die Interaktion von Wnt- Faktoren mit Frizzled. Dkk1 bewirkt Internalisierung und Sclerostin inhibiert Rezeptoraktivität von LRP [32]. Die nukleäre Signaltransduktion wird über die Inhibierung von β-catenin reguliert. β- Catenin-bindende Antagonisten sind Chibby, das an C-Terminus von β-catenin bindet, und ICAT, das die Bindung von β-catenin an TCF inhibiert [43, 44]. Die Phosphorylierung von TCF/LEF1 durch Aktivierung der MAPK-related Proteinkinase NLK/Nemo führt zur Dissoziation des β-catenin/tcf/lef1-dna-komplexes und Beeinträchtigung der Wnt-Zielgentranskription [45]. 12

23 Einleitung 2.5 Die Rolle von Wnt/ β-catenin in der Skelettogenese Die Aufklärung von der Rolle von Wnt/β-Catenin in der Embryogenese erfolgte anhand verschiedener transgener Mausmodelle sowie von diversen in vitro loss- und gain-offunction Studien. Generell stimuliert die Wnt-Signaltransduktion die Knochendifferenzierung und inhibiert die Knorpelentwicklung, aber die Wirkung verschiedener Wnt Faktoren ist stark vom Entwicklungsstadium abhängig. Wnt Faktoren können inhibitorisch und aktivierend auf einzelne Prozesse und sowohl in β-catenin-abhängiger oder unabhängiger Weise wirken. Unabhängig von seinem Einfluss auf die Genexpression reguliert β-catenin Zell-Zell-Interaktionen und Epithel-Mesechym-Transformation (EMT) bei entwicklungsbiologischen Prozessen und in der Carcinogenese Die Rolle von Wnt/ βcatenin Signaltransduktion während der Chondrogenese β-catenin greift in die verschiedenen Schritte der Knorpelzelldifferenzierung je nach Wnt Faktoren und anderen Ko-Faktoren positiv oder negativ ein. RANKL Abbildung 8. Die Rolle des kanonischen (βcatenin-abhängigen) Wnt-Signalwegs in der chondrogenen und osteogenen Differenzierung (adaptiert nach Hartmann, 2006 [3]). a) β-catenin blockiert die chondrogene Differenzierung von bipotenten (Sox9 und Runx2 exprimierenden) mesenchymalen Zellen, wird aber für die Chondrocytenreifung benötigt. Das kanonische Wnt-Signaling bewirkt die Differenzierung von Osteoblastenvorläuferzellen zu Osterix-positiven (und dann zu Osteocalcin-produzierenden) Osteoblasten. b) β-catenin induziert OPG Expression und inhibiert Osteoklastogenese. 13

24 Einleitung Der erste Schritt der Chondrogenese, die Bildung von mesenchymalen Kondensationen, wurde anhand von ex vivo Studien in Mikromassenkulturen untersucht. Die Studien ergaben, dass einige Wnt-Faktoren, wie Wnt1, Wnt3a, Wnt4, Wnt7a, Wnt9a und Wnt11, die Chondrogenese inhibieren [22, 46]. β-catenin in stabilisierter Form inhibiert Chondrogenese über Sox9-Repression, und die Inaktivierung des β-catenins in mesenchymalen Zellen führt zur Inhibierung der Chondrocyten- und Osteoblastendifferenzierung (s. Abb.8) [22, 37, 47]. Wnt5a und 5b beeinträchtigen die Chondrogenese in Mikromassenkulturen nicht [22]. Die Überexpression von Wnt5a und 5b in vivo hemmt die Reifung von proliferierenden zu hypertrophen Chondrocyten, aber auch die Inaktivierung von Wnt5a führt zur Hemmung der Hypertrophie [46, 48]. Sowohl die Überexpression von Wnt4 und Wnt8 als auch die Stabilisierung von β-catenin forcieren die Chondrocytenhypertrophie [48, 49]. Die Studie von Akiyama et al. demonstrierte die Destabilisierung von Sox9, einem Inhibitor der Hypertrophie, durch hohe Konzentrationen von β-catenin [47]. Ein anderer Regulator der Hypertrophie der Chondrocyten ist Wnt9a, das über den kanonischen Wnt/ β-catenin-signalweg die Expression von Indian Hedgehog (Ihh) durch die Bindung von β-catenin / LEF1 an regulatorische Sequenz des Ihh Gens induziert [40]. Die Überexpression von Wnt9a führt zu einer verstärkten Chondrocytenhypertrophie und stimuliert die Osteoblastendiffenzierung im Periosteum [50]. Die Wnt9a- Signaltransduktion bewirkt ein Anstieg der β-catenin-konzentration, das entweder über den Ihh Signalweg oder über die Inaktivierung von Sox9 die Reifung von hypertrophen Chondrocyten begünstigt [40, 50]. Zusätzlich demonstrierten Mak et al. die Funktion von β-catenin als Inhibitor der Apoptose in proliferierenden Chondrocyten [51]. In vivo Studien mit transgenen Mäusen zeigten, dass die Inaktivierung von β-catenin zur Verzögerung der Chondrogenese führt. Ein konditioneller β-catenin-knockout mit Hilfe von Col2a1-Cre-Mäusen führte zur Inaktivierung von β-catenin in proliferierenden Chondrocyten und Beeinträchtigung der Proliferation und Hypertrophie [47]. Die Inaktivierung von β-catenin in mesenchymalen Vorläuferzellen (Chondro- Osteoprogenitoren) mittels Dermo1-Cre- Deleter Mäusen zeigte ektopische Knorpelbildung in Calvarien und Röhrenknochen [38] und eine signifikante Verzögerung der Chondrocytendifferenzierung [52]. Den gleichen Phänotyp wiesen Prx-1-Cre;β-Catenin fl/fl - Mäuse auf [37] Rolle des β-catenins in der Osteoblastogenese Für die Osteoblastendifferenzierung und Funktion spielt Wnt/ β-catenin Signalweg eine essentielle Rolle [22]. Die Inaktivierung von β-catenin in verschiedenen Cre-Linien (Dermo1-Cre [38, 52], Prx1-Cre [37], Col2a1-Cre [38]) vor oder nach der mesenchymalen Kondensaton führte zur Inhibierung der Osteoblastendifferenzierung und Reifung und reduzierter Expression von Osteoblastenmarkern wie Typ I Kollagen, Osterix und Osteocalcin [38, 52]. Nur bei Prx1-Cre-Transgenen blieben die früheren Stadien der Osteoblastogenese und Runx2-Expression intakt [37]. Die Expression von Typ I Kollagen, 14

25 Einleitung Osterix und Runx2 blieb in Osx-positiven Zellen mit inaktiviertem β-catenin erhalten, aber die Transition zu terminal differenzierten Ocn-positiven Osteoblasten wurde inhibiert [53]. Die Osteoblastogenese wird auch durch die stabilisierte (konstitutiv aktive) Form des β- Catenins beeinträchtigt, bei der ein Exon, das Phosphorylierungsstellen enthält, fehlt. Nicht-phosphoryliertes β-catenin wird nicht degradiert und akkumuliert in der Zelle. In Prx1-Cre-Mäusen fehlten Schädelknochen und einige andere Extremitätenknochen [50]. Die ständige Expression von β-catenin in Osx-positiven Osteoblastenvorläufern führt zur schnellen Reifung zu Matrix produzierenden Osteoblasten und zum Anstieg der Proliferation, aber auch zur Inhibierung der terminalen Differenzierung [53]. In vitro Studien untersuchten Auswirkungen von stabilisiertem β-catenin auf die Osteoblastendifferenzierung in pluripotenten mesenchymalen Zelllinien. Den Studien zufolge induzierte β-catenin alkalische Phosphatase in C3H10T1/2 [54] und verstärkte Osteoblastogenese in C3H10T1/2 und ST2 Zellen [55]. Synergistisch mit BMP2 stimuliert die Stabilisierung von β-catenin Osteoblastogenese dramatisch [56]. Die Deletion von β-catenin in Calvarienosteoblasten verzögerte Osteocalcin-Expression und reduzierte Mineralisierung [57]. In der Osteoblastogenese reguliert Wnt/ β-catenin Signalweg die Differenzierung zu reifen Osteoblasten Regulation der Osteoklastogenese durch das Wnt/ β-catenin Signaling Um die Rolle von β-catenin in der Osteoklastenaktivierung zu untersuchen und seine Zielgene während der Osteoklastenaktivierung und Reifung zu identifizieren, wurden diverse molekulargenetische Studien an Mäusen mit inaktivierten oder konstitutiv aktivem β-catenin in Osteoblasten durchgeführt [32]. Durch die Inaktivierung des β- Catenin-Gens ctnnb1 unter dem Col1a1-Promotor in Osteoblasten wurde eine Abnahme der Knochenmasse bei gestiegener Osteoklastenzahl ohne Veränderungen der Osteoblastenzahl und -Funktion beobachtet. Die Studie zeigte dass die -Catenin zusammen mit TCF-1 die Expression von Osteoprotegerin stimuliert, daher bewirkte die Deletion des -Catenin-Gens in Osteoblasten eine Suppression der Osteoprotegerin (Opg)- Expression und damit eine verstärkte Knochenresorption [58]. Die Osteoblastenspezifische Inaktivierung von β-catenin in Ocn-Cre-transgenen Mäusen ergab die gleichen Veränderungen in der Regulation der Osteoklastogenese von Opg und Rankl. Die Inaktivierung von APC in Osteoblasten (ständige Aktivierung des kanonischen Wnt Signalweges) führte dagegen zur Osteopetrose aufgrund einer Defizienz von Osteoklasten [57]. Gleichzeitig zeigten Spencer et al. (2005), dass -Catenin die Rankl- Genexpression in Osteoblasten durch die Bindung an den Rankl-Promotor zusammen mit TCF1 direkt inhibiert. [41]. Außerdem wurde eine signifikante Verminderung der Knochenmasse und erhöhte Anzahl von Osteoklasten in Tcf -/- -Mäusen aufgrund der herunteregulierten Opg-Expression beobachtet. Die doppel-heterozygoten Tcf +/- ; β- 15

26 Einleitung Cat +/- -Mäusen wiesen eine kleinere Knochenmasse als einfach-heterozygote Tiere, eine höhere Osteoklastenzahl und reduzierte Opg-Expression auf [58]. Die Aktivierung von β-catenin in Osteoblasten wirkte negativ auf Osteoklastendifferenzierung wegen der erhöhten Opg-Expression. [58]. Hypertrophe Chondrocyten exprimieren auch Opg [59] und Rankl [60]. Die Studie von Xiong et al. an verschiedenen konditionalen RANKL defizienten Mäusen belegte, dass hypertrophe Chondrocyten und die in Knochenmatrix eingebetteten Osteocyten wichtige RANKL-Quellen während der Knorpel-Knochenumbauprozesse sind [61]. Die Inaktivierung von β-catenin in hypertrophen Chondrocyten unter Col10a1-Promotor wird die Rolle des β-catenin in der Osteoklastogenese in dieser Arbeit weiter aufklären. 2.6 Mausmodelle Die BACCol10 spezifische Cre Deleter Maus, BACCol10a1-Cre + Um die Rolle der hypertrophen Chondrocyten in der enchondralen Ossifizierung und Funktionen von diversen Genen, die von diesen Zellen exprimiert werden, zu untersuchen, wurde ein zelltypspezifische BACCol10Cre-Deleter-Maus in der Gruppe von Prof. Klaus von der Mark etabliert [62]. Collagen X ist ein extrazelluläres Matrixprotein und spezifischer Marker von hypertrophen Chondrocyten. Da bei den Mäusen die Wachstumsfuge nicht schließt, wird Collagen X durchgehend exprimiert. Für die Generierung eines Col10-Cre-Neo Vektors wurde die LacZ-Kassette im plach-col10a1-lacz-frt-neo-frt Vektor [63] durch Cre Rekombinase ersetzt. Der Col10-Cre-Neo Vektor wurde im BAC RP23-192A7 Vektor durch homologe Rekombination in E.coli in Exon 2 des Col10a1 Gens inseriert [62]. Da dieser BAC-Klon das gesamte Col10a1 Gen mit 200 kb flankierender Sequenz enthält, steht die Cre Rekombinase unter der Kontrolle des Promoters und anderer cisregulatorischen Elemente der Col10a1 und wird daher spezifisch in hypertrophen Chondrocyten exprimiert. Die aufgereinigte und linearisierte BACCol10Cre DNA wurde in die männlichen Pronuclei von C57Bl6 Hybridmäusen injiziert, und nach Implantation in FVB/ CB57Bl6 Wirtsmäuse wurden 16 transgene Cre-Founder Mauslinien mit 1 bis 5 Cre-Kopienzahlen erhalten [62]. Der Nachweis von BACCol10Cre DNA in Nachkommen erfolgte mittels PCR mit Primern 1 (Col10A1Int.rec5 ) und P5 (Cre reverse) (S. Ergebnisse Cre PCR, Abb. 12). 16

27 Einleitung Abbildung 9. Herstellung der BAC-Col10a1-Cre-Neo-DNA für transgene Expression von Cre- Rekombinase in hypertrophen Chondrocyten, adaptiert nach [62,63]. A) Genomische Struktur des murinen Col10a1-Gens mit Exons (graue Kasten) und Introns. Die Sequenzen, die zur Herstellung der 5 und 3 homologen Regionen in Exon 2 und Intron 1 genutzt wurden sind schwarz dargestellt; B) Der Targeting Vector Col10a1-Cre-frt-neo-frt enthält 5 und 3 homologe Regionen des Col10a1, die die Cre-frtneo-frt-Kassette flankieren, für die homologe Rekombination in E. coli. Die kodierende Sequenz für Cre Rekombinase wurde mit dem ATG des Col10a1-Leserahmens fusioniert. C) Ausschnitt aus dem BAC- Klon Col10a1-Cre-frt-Neo-frt nach homologer Rekombination mit dem Targeting Vector. En starker Enhancer ca. 4,6 kb upstream des Transkriptionstartes; P-n Primer für die Genotypisierung; Pfeile entsprechen der Primerorientierung. Abbildung 10. Schematische Darstellung des BACCol10a1-Cre-Plasmids mit der Cre-Neo-Kassette. Durch homologe Rekombination wurde das Col10a1-Cre-frt-Neo-frt-Fragment in das BAC RPC A/-Plasmid eingebracht. 17

28 Einleitung BACCol10Cre; ROSA26-LacZ und -YFP Reporter-Mausmodelle (M. Gebhardt) Der routinemäßige Nachweis der Insertion und zelltypspezifische Expression des Cre Transgens erfolgte durch die Kreuzung von BACCol10Cre Mäusen mit ROSA26LacZ Reporter Mauslinie [62]. Die Expression des lacz Gens, das Enzym βgalaktosidase kodiert, wird in ROSA26LacZ Mäusen durch eine Stopsequenz, die durch zwei loxp Seiten flankiert ist, inhibiert [64]. Durch die Kreuzung mit BACCol10Cre Mäusen wird diese Stopsequenz herausgeschnitten und lacz wird in hypertrophen Chondrocyten exprimiert [62]. Nach erfolgter Rekombination des loxp-flankierten ROSA26 Locus durch die Cre Rekombinase wird das Reporter-Gen unter dem ROSA26 Promoter nicht nur in hypertrophen Chondrocyten, sondern in der gesamten Nachkommenschaft der hypertrophen Chondrocyten exprimiert, auch wenn das Col10a1 Gen nicht mehr aktiv ist und kein neues Cre mehr exprimiert wird. Da die zellspezifische Expression von Cre und Aktivierung von Reportergen in diesen Zellen die Verfolgung vom bestimmten Zelltyp bis zum Endpunkt in der Zellentwicklung (mögliche Transdifferenzierung oder Apoptose) ermöglicht, wurde ein Mausmodell BACCol10Cre; ROSA26YFP etabliert, um Nachkommen von hypertrophen Chondrocyten in Spongiosa zu verflogen und osteogene Charakteristika von diesen Zellen zu analysieren [65]. BACCol10Cre Mäusen (Founderlinien 1465 und 1421/27, s. [62]) wurden mit ROSA26YFP Reporter Mauslinie (B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)- Cos/J) verpaart. Mit Hilfe der PCR wurden transgene Tiere identifiziert Deletion der β-catenin Gens ctnnb1 in hypertrophen Chondrocyten durch Generierung einer BACCol10Cre; ctnnb1 fl/fl Maus Für die Untersuchung der Rolle des β-catenins in hypertrophen Chondrocyten und der Osteogenese während der Knorpel-Knochen-Umwandlung wurde in der Gruppe von Prof. K. von der Mark ein Mausmodell etabliert, in dem das gefloxte -Catenin Gen ctnnb1 fl/fl durch Kreuzung mit der BACCol10Cre-Maus spezifisch in hypertrophen Chondrocyten inaktiviert wurde. Die ctnnb1 fl/fl Maus wurde von Brault et al., 2001 etabliert (Abb. 11) [66]. Cre-negative ctnnb1 fl/fl Weibchen (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. R. Kemler, MPI Freiburg) wurden mit BACCol10a1Crepositiven Männchen gekreuzt. Die F1-Generation hatte mit 50%-Wahrscheinlichkeit BACCol10Cre-DNA und enthielt ein Wildtyp- und ein gefloxtes ctnnb1-allel (BAC- Col10a1-Cre + ; βcatenin fl/wt oder BACCol10a1-Cre - ; βcatenin fl/wt ). Die Genotypisierung erfolgte mit Hilfe der PCR mit den Primern RM 41 und 42 ([66], s. Abb. 11)) für gefloxte Allele und RM 68 und 69 für floxdel Allele (s. Ergebnisse Catenin PCR, Abb. 12 ). Die F2 Nachkommen aus der Kreuzung zweier BACCol10a1-Cre + ; βcatenin fl/wt - Mäusen waren mit 25%-Wahrscheinlichkeit BACCol10a1-Cre + ; βcatenin fl/fl. 18

29 Einleitung Abbildung 11. Gefloxtes und floxdel-ctnnb1-allele. Exone (2-9) sind als blaue Kasten dargestellt, loxp- Sequenzen als lila Dreiecke. Primer für die Genotypisierung: RM41 und RM42 für gefloxte Allele. Vereinfacht nach Brault, V. et al, 2001 [66]. 2.7 Auswirkungen der β-catenin-deletion in hypertrophen Chondrocyten Im Rahmen meiner Diplomarbeit Inhibition der enchondralen Knochentrabekelbildung nach Inaktivierung des beta-catenin Gens in hypertrophen Chondrocyten [67] wurden die Auswirkungen der spezifischen β-catenin-deletion auf den Phänotyp der Cat-KO- Mäuse analysiert. In hypertrophen Chondrocyten konnten keine Veränderungen in der Morphologie festgestellt werden, es wurde aber der hohe Verlust an subchondralen Knochentrabekel sowohl mit Hilfe der histologischen Färbung (Alcian Blau und Alizarin Rot) als auch mit Hilfe der Immunhistochemie mit anti-collagen I Antikörpern nachgewiesen. Es gab Anhaltspunkte, dass die fast vollständige Resorption der Trabekel möglicherweise durch eine Überaktivität der Osteoklasten verursacht wurde. Im Ergebnisteil werden diese morphologischen Veränderungen im Detail mit Hilfe von verschiedenen histologischen und histochemischen Methoden analysiert. Es wurde eine höhere Dichte von Osteoklasten, die auch größer waren, an der Knorpel-Knochenmark-Grenze von Cat-KO-Tieren mit Hilfe der TRAP-Färbung festgestellt. Die erstellte primäre Hypothese, dass die Defizienz der Knochentrabekel auf die Überaktivierung der Osteoklasten durch die Überexpression von RANKL bzw. Unterregulation von Opg oder auf mangelhafte Osteoblastendifferenzierung zurückzuführen wäre, konnte nicht eindeutig geklärt werden. Die Analyse der Rankl und Opg Expression mit Hilfe der qrt-pcr ergab nur unsichere Ergebnisse. DieAnalyse der Expression von weiteren chondro- und osteogenen Faktoren erfolgte mit Hilfe der in situ Hybridisierung und wies Veränderungen in der Mmp13 und Runx2 Expression auf. 19

30 Aufgabenstellung 3 Aufgabenstellung Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Funktion von β-catenin in hypertrophen Chondrocyten in Bezug auf die enchondralen Ossifikation durch histologische und molekularbiologische Analyse der Skelettentwicklung der BACCol10Cre; ctnnb1 fl/fl Maus aufgeklärt werden. Insbesondere sollte die Frage geklärt werden, ob die beobachtete Reduktion bzw. der Abwesenheit der Knochentrabekel auf eine Inhibition der Osteoblastendifferenzierung in der Spongiosa, oder auf einen verstärkten Trabekelabbau durch Osteoklasten zurückzuführen ist. Möglicherweise sind beide Mechanismen für den Trabekelschwund in der Spongiosa verantwortlich. Die Auswirkungen der β-catenin-deletion in hypertrophen Chondrocyten auf die Skelettentwicklung sollten mit Hilfe von immunhistologischen Methoden auf Paraffin- und Gefrierschnitten untersucht werden. Der Einfluss auf die Expression von Skelettogenese regulierenden Genen sollte mit Hilfe der in situ Hybridisierung mit RNA-Sonden und qrt-pcr durchgeführt werden. Die Untersuchung der Osteoklastenaktivität sollte anhand des histologischen Nachweises der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP) und der für die Regulation der Osteoklastendifferenzierung verantwortlichen Molekülen RANKL und Osteoprotegerin erfolgen. Als alternative Erklärung des Trabekeldefizits in der Spongiosa sollte die Möglichkeit einer Inhibition der Osteoblastendifferenzierung aufgrund der Deletion des -catenin Gens ctnnb1 untersucht werden. Da ctnnb1 aber nur in hypertrophen Chondrocyten deletiert wurde, würde das die Hypothese einer Transdifferenzierung von terminalen Chondrocyten zu Osteoblasten bestätigen, die in einer paralell laufenden Diplomabeit in der Arbeitsgruppe entwickelt wurde. Diese Untersuchungen sollte durch Analyse der Expression von Osterix, einem knochenspezifischen Transkriptionsfaktor in Spongiosazellen von BACCol10Cre;YFP;ctnnb1 fl/fl Reporter Mäusen erfolgen, in denen die von Chondrocyten abstammende trabekuläre Osteoblasten anhand der Expression des Reporter Gens YFP identifiziert und quantifiziert werden können. 20

31 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Deletion des β-catenin Gens ctnnb1 in hypertrophen Chondrocyten verursacht Trabekelschwund in der Spongiosa von Röhrenknochen Deletion des β-catenin Gens ctnnb1 in hypertrophen Chondrocyten Um die Rolle von β-catenin in hypertrophen Chondrocyten aufzuklären, wurde das ctnnb1 Gen spezifisch in hypertrophen Chondrocyten inaktiviert. Dazu wurde die konditionale β-catenin Knockout Maus (ctnnb1 fl/fl ) von Brault et al. (2000) mit BAC- Col10Cre Mauslinien (1466, 1481, 1465, 1420) verpaart [62]. Alle BACCol10Cre Linien ergaben den gleichen Phänotyp. Der Genotyp der Nachkommen wurde durch PCR Analyse von Cre, ctnnb1 wt und ctnnb1 fl aus der DNA von Schwanzbiopsien bestimmt. Für die Analyse des Phänotyps wurden Würfe von Embryonen (E14.5-E18.5), neugeborenen, juvenilen und aduten Mäusen morphologisch, histologisch, immunologisch und durch in situ Hybridisierung untersucht. Für die Analyse des ctnnb1 Null Phänotyps ( Cat-KO ) wurden ctnnb1 fl/fl / Cre + Mäuse verwendet, als Wildtyp (WT) Kontrollen ctnnb1 fl/fl / Cre- Tiere.) A B Abbildung 12. Genotypisierung. A) Genotypisierung von Wildtyp-, ctnnb1 +/fl und ctnnb1 fl/fl -Mäusen. Die β-catenin-pcr mit den Primern RM41 und RM42 [66] lieferte bei homozygoten Wildtyptieren eine 221 bp-bande (Spur 1), bei Mäusen mit zwei gefloxten Allelen eine 324 bp-bande (Spur 3) und bei Heterozygoten zwei Banden (Spur 2); B) Genotypisierung durch Col10Cre-PCR mit den Primern P1 und P5 (Cre-rev): Cre-positive Tiere zeigen eine Bande bei 305 bp (Cre + ) (Spur 1 und 2; Spur 3 war Cre-negativ) [67] Gewebespezifität der Cre Expression unter dem BACCol10a1 Promoter Die spezifische Expression von Cre-Rekombinase in hypertrophen Chondrocyten unter dem BACCol10a1 Promoter wurde mittels in situ Hybridisierung bestätigt (Abb.13, A- C). Auch die Analyse weiterer Gewebe zeigte, das Cre außer im hypertrophen Knorpel in keinen anderen Zellen, exprimiert wird, auch nicht in Knochenzellen. Das Cre- 21

32 Ergebnisse Expressionsmuster korreliert mit dem Signal der Col10a1-RNA-Sonde. Die Expressionsstärke von Col10a1 wurde nicht beeinträchtigt (Abb.13, D-G). Abbildung 13. Die Expression der Cre-Recombinase (A, B, C) in Cat-KO Mäusen und des Collagen X Gens Col10a1 (D, E: Cat-WT; F, G: Cat-KO) (in situ Hybridisierung) ist auf hypertrophen Chondrocyten begrenzt. Cat-KO: BACCol10Cre+;ctnnb1 fl/fl Maus (Cat-KO Maus); Cat-WT: BAC- Col10Cre-; ctnnb1 wt/wt Maus, P2. 10x Vergrößerung Bestätigung der spezifischen Deletion der ctnnb1 Expression im hypertrophen Knorpel Die in situ Hybridisierung mit der ctnnb1-rna-sonde zeigte, wie erwartet, das Fehlen von ctnnb1-rna in der hypertrophen Zone von BACCol10Cre;ctnnb1 fl/fl (Cat-KO) Mäusen, während die β-catenin-signale in der proliferativen Zone und im Knochenmark gleich stark wie in Wildtyp-Mäusen waren (Abb.14). Der lokal heterogene Phänotyp von Cat-KO Mäusen zeigt sich im unterschiedlich starken Fehlen in Knochentrabekeln und Osteoblasten in verschiedenen Würfen als auch in unterschiedlichen Signalstärken und Expressionsmustern von β-catenin (Abb.14E-H). 22

33 Ergebnisse WT * * KO * * E WT F KO G WT H KO * * * * Abbildung 14. Die in situ Hybridisierung mit der βcatenin-rna-sonde zeigt das Fehlen eines βcatenin-signals in hypertrophen Chondrocyten (*). A, C: Femur; B, D, E, F: Tibia; G,H: Fibula. Alter: A-D: P2; E-H: P0 [90]. 10x Vergrößerung. Die Expression von ctnnb1 in Knorpel und Knochen wurde auch quantitativ mittels qrt-pcr untersucht. Dazu wurde ctnnb1 RNA aus hypertrophen Chondrocyten, ganzen Epiphysen bzw. ganzen Knochen in cdna überschrieben und amplifiziert. In allen drei Gewebenarten war die Expression von ctnnb1 fast halb so niedrig wie in den WT Kontrollen (Abb.15). Die noch vorhandene ctnbb1 RNA in hypertrophen Chondrocyten von Knockout-Mäusen wurde entweder während der Differenzierung von Chondrocyten zu hypertrophen Zellen nicht degradiert oder stammt möglicherweise aus anhaftenden Knochentrabekeln und anderem Gewebe während der Präparation der hypertrophen Zone. 23

34 Ergebnisse 1,40 1,60 1,40 1,20 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 WT KO βcatenin HC 0,00 WT KO βcatenin Epiphyse 0,00 WT KO βcatenin ganze Knochen Abbildung 15. Der relative ctnnb1 -mrna-spiegel in hypertrophen Chondrocyten, ganzen Epiphysen und ganzen Röhrenknochen (inkl. Epiphysen) von 5 Tage alten ctnnb1-ko und WT Mäusen wurde mit Hilfe der Realime-PCR (qrt-pcr) bestimmt. Die Expression von ctnnb1 in Knockout- Mäusen ist deutlich reduziert. HC: hypertrophe Chondrocyten Starker Trabekelschwund in der Spongiosa von Cat-ko Mäusen Die phänotypischen Auswirkungen der ctnnb1 Deletion wurden mittels verschiedenen histologischen Färbungen untersucht: Alcian Blau, Masson-Goldner und Safranin O Färbungen wurden eingesetzt, um die Knorpel und Knochenentwicklungsstörungen sichtbar zu machen. Die Alcian Blau Färbung von Cat-KO- und Wildtyp-Röhrenknochen von 17 Tage alten Mäusen zeigt einen dramatischen Verlust von trabekulärem Knochen in der Spongiosa von ctnnb1 defizienten Tieren (Abb.16). Alcian Blau und Safranin O färben Proteoglykane an; damit wird deutlich, dass auch der knorpelige Kern der Knochentrabekel abgebaut ist (Abb. 16, 20). Bei älteren Cat-KO-Mäusen (hier P17) fehlen auch Trabekel in der sekundären Ossifikationszone. Deswegen erscheint der Epiphysenknorpel zusammengedrückt. Diese dramatischen Veränderungen im Knochenbau wirken sich auch auf die Größe der transgenen Tiere aus, wie deutlich bei 4 Wochen alten Mäusen erkennbar ist (Abb. 24). 24

35 Ergebnisse H T H SO KM Abbildung 16. Alcian Blau-Färbung zeigt das Fehlen von Knochentrabekeln in großen Bereichen der Spongiosa inklusive des knorpeligen Kerns in Cat-KO Knochen. Humerus, P17; A, B, D, E: Methaphyse; C, F: sekundäre Ossifikationszone. WT: Wildtyp; KO: Knockout. A, C, D, F: 10x Vergrößerung, B, E: 20x Vergrößerung. T = Trabekel, H =hypertropher Knorpel, SO = Sekundäres Ossifikationszentrum, KM = Knochenmark). Um die Auswirkungen der ctnnb1 Deletion auf den Trabekelschwund genauer zu untersuchen, wurde zuerst eine immunhistochemische Analyse von Collagen I, einem der wichtigen Bestandteile der Knochenmatrix, durchgeführt. Die immunhistochemische Analyse mit dem anti-collagen I Antikörper (Abb. 17) bestätigte das Fehlen von Knochentrabekeln in der Spongiosa von Cat-KO Tieren; sie korrelierte mit dem Fehlen von Collagen I produzierenden Zellen (vorwiegend Osteoblasten) im Knochenmark, die durch in situ Hybridisierung mit einer Col1A1-Sonde (Abb. 18) festgestellt wurde. Die Alizarin-Rot-Färbung (Abb. 19) bestätigte auch eine Reduktion von kalzifizierten Trabekeln in der Metaphyse und eine Verminderung der Kalzifizierung in der späthypertrophen Knorpelzone in Cat-KO-Tieren. Auch in der sekundären Ossifikationszone fehlten sowohl die Trabekel als auch Collagen I produzierenden Zellen (nicht gezeigt). In den kortikalen Knochen dagegen blieb die Collagen I positive Matrix erhalten (Abb. 17). Die Col1a1-RNA wurde im Skelett von Cat-KO-Mäusen nur in kortikalen Knochen und in restlichen Trabekeln mit Hilfe der in situ Hybridisierung (Abb. 18) nachgewiesen. Im Knochenmark konnten keine Col1A1-positiven Zellennachgewiesen werden. 25

36 Ergebnisse K K K Abbildung 17. IHC mit anti-collagen I-Antikörper Antikörper zeigt die Abwesenheit von Knochentrabekeln in weiten Bereichen der Spongiosa. Humerus, P17, A, D: 5x Vergrößerung; B, E: 10x Vergrößerung. K = kortikaler Knochen. C: Ausschnitt aus B, 30x Vergrößerung. Blaue Pfeile: Osteoid. Abbildung 18. Die in situ Hybridisierung mit einer Col1A1-Sonde zeigt eine deutliche Reduktion von Col1a1 exprimierenden Osteoblasten an der Knorpel-Knochengrenze. P2, A, C: Humerus; B, D: Ulna/Radius. 10x Vergrößerung. 26

37 Ergebnisse Abbildung 19. Das Fehlen von calcifizierten Knochentrabekel wurde mit der Alizarin Rot-Färbung nachgewiesen. Humerus, P2, 10x Vergößerung. Der Trabekelschwund nimmt mit fortschreitende Alter zu und ist bei Cat-KO-Mäusen ab dem Lebenstag am stärksten ausgeprägt, wie hier anhand eine Safranin O Färbung (Abb.20) gezeigt wird. Safranin O färbt die Proteoglykane im Knorpel und in den Knorpelkernen der Knochentrabekel an (z.b. Abb 20, P17, Pfeile). WT KO Abbildung 20. Safranin O-Färbung zeigt, dass nicht nur der Knochenanteil der Trabekel, sondern auch die Knorpelkerne im Knochenmarksraum fehlen, ein Anzeichen für eine erhöhte Osteoklastenaktivität. Am stärksten war der Phänotyp bei P17-Cat-KO-Mäusen ausgeprägt. Als Gegenfärbung wurde Methylgrün zur Kernfärbung verwendet. Femur, 10x Vergrößerung. 27

38 Ergebnisse Auch die Masson-Goldner-Trichromfärbung wurde zur Differenzierung von Geweben angewendet. Dabei wurden Knochen von unterschiedlich alten Mäusen untersucht. Die Differenzierungsbilder variieren sich je nach Knochen und Alterstadien der Mäuse. Am deutlichsten wurden die phänotypischen Auswirkungen der β-catenin in 17 Tage alten Mäusen sichtbar. Diese Färbung zeigt die allmähliche Abnahme sowohl von Knochentrabekeln als auch von Kollagen produzierenden Zellen (Osteoblasten) im Knochenmark mit zunehmendem Entwicklungsstadium (Abb. 21, grün gefärbt). Abbildung 21. Masson-Goldner-Trichromfärbung zeigt einen deutlichen Knochentrabekelschwund in der Methaphyse. Unterschiede in der Ausprägung des Phänotyps wurden in verschiedenen Altersstadien beobachtet. Die Gewebeschnitte, die nach Masson-Goldner gefärbt wurden, wurden mit Hilfe des Osteomeasure-Programms ausgewertet (Abb. 22). Es wurde das Verhältnis Trabekelvolumen zu Knochenvolumen in verschiedenen Knochen gemessen. Hier spiegelte sich 28

39 Ergebnisse der heterogene Phänotyp wieder: Die Trabekel waren am stärksten im Femur und Tibia abgebaut, dagegen in Humerus eher schwächer. 30,00 25,00 20,00 BV/TV 15,00 10,00 5,00 0,00 Femur WT Femur KO Tibia WT Tibia KO Humerus WT Humerus KO Abbildung 22. Quantitative Auswertung von Trabekelschwund mittels Osteomeasure-Software an nach Goldner-Masson gefärbten Schnitten. Das Trabekelvolumen wurde bei Knockout-Tieren vermindert. Ein dramatisches Bild des Knochendefizits in Cat-KO Mäusen zeigte sich in der MicroCT-Analyse von 3 Wochen alten Cat-KO Mäusen (Abb. 23). Auffällig waren das Fehlen von calcifiziertem Gewebe in Trabekelgerüst, im Knochenmark, und in der sekundären Ossifikationszone. A WT B KO E WT F KO G H C D Abbildung 23. MicroCT-Analyse von drei Wochen alten Tieren ergab massiven Verlust von Knochentrabekeln sowohl in der Methaphyse als auch in der sekundären Ossifikationszone. A, B, E, F, G, H: Kniegelenk; C, D: Tibia, sagitale Schnitt (Aufnahmen von Prof. A. Hess) [90]. 29

40 Ergebnisse Die Größenunterschiede zwischen Wildtyp- und Knockout-Tieren waren besonders bei adulten Mäusen deutlich. Die Färbung der Extremitäten mit Alizarin Rot Färbung zeigte stark verkürzte Knochen bei adulten Cat-KO-Tieren. 1 2 Abbildung Größenunterschiede zwischen vier Wochen alten Wildtyp und Knockout Mäusen (Founderlinie 1465). Die Knockout-Maus ist ungefähr 20% kleiner als Wildtyp [67]. 2. Verkürzte Röhrenknochen der Extremitäten von Wildtyp- und Knockout-Mäusen (vier Wo.). Alizarinrot Färbung des kalzifizierten Knochens. A) Vordere Extremitäten; B) Hintere Extremitäten. Die Knockout-Maus hatte um ca % verkürztröhrenknochen und ein verkleinertes Schulterblatt (Pfeile). (Anfärbung: Britta Schlund) [90]. 30

41 Ergebnisse 4.2 Reduziertes Trabekelwerk in der Spongiosa von Cat-KO Knochen: reduzierte Osteoblastendifferenzierung oder verstärkter Abbau von Knochentrabekeln? Die Ausprägung des Phänotyps, d.h. die Reduktion der Knochentrabekel in der Spongiosa von Cat-KO-Tieren schwankt in den Nachkommen verschiedener Founderlinien zwischen mäßig und stark, d.h. fast vollständigem oder nur teilweisem Fehlen von Knochentrabekeln. Eine mögliche Ursache könnten minimale Unterschiede in der Regulation der Knochenhomöostase sein, d.h. im fein ausbalancierten Prozess zwischen Knochenauf- und -abbau. Bei diesem Prozess spielt das Gleichgewicht zwischen Aktivität und Differenzierung von Osteoblasten und Osteoklasten, die den Knochenabbau verursachen, eine wichtige Rolle. Deswegen können für den Trabekelschwund in Cat-KO- Mäusen zwei mögliche Mechanismen verantwortlich sein: Eine reduzierte Osteoblastendifferenzierung und somit eingeschränkter Aufbau des Trabekelgerüsts, oder ein verstärkter Trabekelabbau, möglicherweise durch Überaktivierung von Osteoklasten verursacht, oder auch eine Kombination von beiden Möglichkeiten Einfluss der βcatenin Deletion in hypertrophen Chondrocyten auf die osteogene Differenzierung Für die Untersuchung einer möglichen Hemmung der Osteoblastendifferenzierung in Cat-KO Mäusen wurden zunächst eine immunhistochemische Untersuchungen mit anti- Osterix-Antikörpern durchgeführt. Osterix wurde ursprünglich als Osteoblastenspezifischer Transkriptionsfaktor nachgewiesen [68], später allerdings auch in frühhypertrophen Chondrocyten gefunden. Die immunhistochemische Analyse zeigte Osterix im Kern von Trabekel-assoziierten Osteoblasten und in früh-hypertrophen Chondrocyten von Cat-KO und WT Mäusen (Abb. 25). Dabei wurden Osterix-positive Zellen im Knochenmark von Cat-KO-Mäusen, auch dort wo Knochentrabekel fehlen, nachgewiesen (Abb.25C). In Übereinstimmung mit der Literatur [19, 68, 69] wurde Osterix auch in Kernen von Chondrocyten der prähypertrophen Zone sowohl in Wildtyp- als auch in Cat-KO-Gewebe nachgewiesen. (Abb. 25). 31

42 Ergebnisse Abbildung 25. Die freien Osx-positiven Zellen sind deutlich nach Immunhistochemie mit anti-osx- Antikörper und Peroxidase (AEC als Farbsubstrat). A, C: Humerus; B, D: Ulna und Radius, P2. Rote Pfeile in B: an Trabekeln anhaftende Osteoblasten; blaue Pfeile in C: freie Osteoblastenvorläuferzellen. Zur Analyse der Osterix-positiven Zellen im Knochenmark wurde zwischen freien Zellen (vorwiegend Osteoblastenvorläuferzellen) (blaue Pfeile in Abb.25C) und an Trabekeln haftenden Zellen (Osteoblasten und Osteocyten) (rote Pfeile in Abb.25B) unterschieden. Nach der histomorphometrischen Auswertung zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen Trabekel - gebundenen Osteoblasten und freien Osteoblasten in Wildtyp- und Knockout-Tieren (Abb.26). Obwohl bei den Cat-KO-Mäusen die meisten Knochentrabekel fehlten, wurden zahlreiche Osx-positive Zellen frei im Knochenmark gefunden. Bei den Wildtyp-Tieren waren dagegen die meisten Osx-positiven Zellen an Trabekel gebunden. Das deutete darauf hin, dass die Osteoblastendifferenzierung zwar nicht beeinträchtigt wurde, aber es fehlten die knorpeligen Stege für die Einnistung von Osteoblasten und ihre Differenzierung zu Collagen-Matrix produzierenden Osteocyten. Das wiederum deutet auf einen verstärkten Abbau der Knochentrabekel inclusive deren Knorpelkerne an der Knorpel-Knochengrenze durch Osteoklasten bzw. Chondroklasten (die aller Wahrscheinlichkeit nach mit Osteoklasten identisch sind). 32

43 Freie Osx+ Zellen/ Trabekel gebundene Alle Osx+ Zellen / m 2 Ergebnisse A B wt ko wt ko humer. tibia wt ko Abbildung 26. Die histomorphometrische Analyse von Osterix-positiven Zellen in Paraffinschnitten von P5. Cat-KO Tibia und Femurepiphysen zeigte eine signifikante Zunahme von freien im Verhältnis zu Trabekel- gebundenen Osx+ Zellen in Knochenmark von Cat-KO Tieren hin (A) B: Die Gesamtdichte von Osx-positiven Zellen pro µm 2 ist bei Cat-KO und WT Tieren ungefähr gleich [90] Die Auswirkungen der β-catenin-deletion auf die terminale Differenzierung von hypertrophen Chondrocyten Um Anhaltspunkte für die molekularen Ursachen für das Fehlen von Knochentrabekeln in der Spongiosa zu klären, wurden zuerst die Auswirkungen der β-catenin-deletion auf die terminale Differenzierung von hypertrophen Chondrocyten analysiert, da diese Differenzierung eine wichtige Voraussetzung für die enchondrale Ossifizierung ist. Dazu wurden Änderungen der Expression von typischen Markergenen von späthypertrophen Chondrocyten qualitativ mit Hilfe der in situ Hybridisierung und quantitativ durch die Realtime-PCR (qrt-pcr) untersucht. Für die in situ Hybridisierung wurden histologische Schnitte von Wildtyp- und Cat-KO-Extremitäten von E18,5 bis P7 mit Sonden für MMP13, VEGFA und Osteopontin, sowie für die osteogenen Transkriptionsfaktoren Runx2 und Osterix hybridisiert. Matrix-Metalloprotease 13 (Mmp13) MMP13 ist für die enchondrale Ossifizierung essentiell, da sie für den Verdau der Knorpelmatrix an der Knorpel-Knochengrenze verantwortlich ist und somit die Einsprossung von Kapillargefäßen aus dem Knochenmark ermöglicht [70, 71]. In der in situ Hybridisierung wurden keine signifikanten Unterschiede in der Mmp13 Expression in der hypertrophen Zone festgestellt. Mmp13 wurde wie erwartet sowohl in Cat-KOals auch in WT Epiphysen in späthypertrophen Chondrocyten und Osteoblasten und zum Teil in Osteoklasten nachgewiesen [72]. Bei Cat-KO Tieren fehlte erwartungsgemäß das Mmp13-Signal in den Bereichen der Spongiosa, in denen die Knochentrabekel fehlten, oder war vermindert in Bereichen in denen weniger Trabekel erhalten waren (Abb.27, Pfeile). In höherer Vergrößerung war eine deutliche MMP13 Expression in 33

44 Ergebnisse hypertrophen Chondrocyten von WT, aber nicht in Cat-KO Epiphysen zu erkennen (Abb. 27H, Kreis), während die Mmp13 Expression in den Osteoklasten unterhalb der Knorpel-Knochenmarkgrenze (Abb. 27, orange Pfeile) ungefähr gleich war. G WT H Cat-KO Abbildung 27. Die in situ Hybridisierung mit der Mmp13-mRNA-Sonde zeigte Fehlen des Hybridisierungssignals in Bereichen ohne Knochentrabekel in Knochen von Knockout-Mäusen. A,D: Humerus; B, E: Ulna, Radius; C, F: Femur, P2. Pfeile: Bereiche ohne Trabekel bzw. mit weniger Trabekeln.G, H: höhere Vergrößerung. Kreis:Fehlen der Trabekel im subchondralen Bereich des Cat-KO- Gewebes. Orange Pfeile: MMP13 expression in Osteoklasten unterhalb der Knorpel-Knochen-Grenze) [90]. Für die qrt-pcr wurde RNA aus der hypertrophen Zone, aus ganzen Epiphysen sowie aus ganzen Knochen P5- P6 Tage Mäusen extrahiert und in cdna umgeschrieben. Die quantitative Auswertung der Mmp13-Expression durch qrt-pcr bestätigte eine signifikante Minderung in der Expression in hypertrophen Chondrocyten, sowie in der RNA aus der gesamten Epiphyse und aus ganzen Knochen (Abb. 28). 34

45 Ergebnisse 1,40 2,00 2,40 1,20 1,60 2,00 1,00 0,80 1,20 1,60 1,20 0,60 0,40 0,20 0,80 0,40 0,80 0,40 0,00 WT KO Mmp13 HC 0,00 WT KO Mmp13 Epiphysen 0,00 WT KO Mmp13 ganze Knochen Abbildung 28. Die Mmp13-Expression bei Knockout-Tieren ist deutlich reduziert. HC: hypertrophe Chondrocyten Osteopontin (Opn) Die Analyse der Opn Expression durch in situ Hybridisierung zeigte keine prinzipiellen Unterschiede im Expressionsmuster im Knorpelbereich der Epiphysen von WT und Cat-KO Tieren, allerdings fehlten Opn-Signale erwartungsgemäß in der Spongiosa von Cat-KO Knochen in Bereichen mit fehlenden Knochentrabekeln (Abb.29). Dies bestätigte (zusammen mit den Ergebnissen der Col1A1-ISH, s. Abb. 18) das Fehlen von ausdifferenzierten Osteoblasten in der Spongiosa. Die Expression von Opn in kortikalen Knochen, und in Zellen der erhaltenen Knochentrabekel blieb hingegen gleich in Knockout- und Wildtyp-Tieren. Abbildung 29. Die Opn-Expression in späthypertrophen Chondrocyten und in Osteoblasten der erhaltenen Trabekel in Knochen der Knockout-Tieren blieb unverändert, in Bereichen ohne Knochentrabekel fehlten Opn exprimierende Osteoblasten. A,D: Humerus; B, E: Ulna, Radius; C, F Femur, P2. 35

46 Ergebnisse VEGF Die Analyse der Vegf-Expression durch in situ Hybridisierung zeigte ebenfalls vergleichbare Expressionsmuster in Cat-KO und WT Epiphysen (Abb.30). Die qrt-pcr- Analyse hingegen ergab eine deutlich reduzierte Expression von Vegf in der RNA aus Gesamtepiphysen, aber eine fast unveränderte Expression in hypertrophen Chondrocyten.(Abb.32) Die Reduktion der Vegf Expression in der Epiphyse wies auf eine mögliche Inhibition der Immigration von Endothelzellen und damit auf ein Defizit im Aufbau deskapillarnetzes hin. In der Immunofluoreszenzanalyse von Endothelzellen mit Antikörpern gegen PECAM (CD31) und Collagen I konnte allerdingskeine wesentliche Beeinträchtigung der Invasion von Endothelzellen im Knochenmark von Cat-KO-Mäusen festgestellt werden: Die Endothelzellen erreichten auch in den Cat-KO Epiphysen die Knorpel-Knochengrenze (Pfeil) wenn die Antikörperreaktion auch schwächer ausfiel als in WT Epiphysen (Abb. 31). Abbildung 30. Die in situ Hybridisierung mit der Vegf-Sonde zeigte keine deutliche Veränderungen in der Vegf-Expression in Cat-KO-Tieren. A,C: Humerus; B, D: Ulna, Radius, P2. 36

47 Ergebnisse A W T B KO CD 31 Collagen C D Abbildung 31. Unveränderte Invasion von Endothelzellen wurde durch die Imunofluoreszenz mit anti-cd31- (PECAM) Antikörpern festgestellt. (Prof. von der Mark) [90]. 1,40 2,80 1,20 2,40 1,00 2,00 0,80 1,60 0,60 1,20 0,40 0,80 0,20 0,40 0,00 WT KO Vegf HC 0,00 WT KO Vegf Epiphysen Abbildung 32. Der relative Vegf-Spiegel zeigte keine signifikante Veränderung in hypertrophen Chondrocyten (HC), in Epiphysen war die Vegf-Expression nur geringfügig reduziert. 37

48 Ergebnisse Runx2 Besondere Aufmerksamkeit wurde dem Einfluss der β-catenin Deletion auf Änderungen der Expression von Runx2 in Knorpel- und Knochenzellen der Wachstumszone gewidmet. Wie bereits in der Einleitung beschrieben, ist Runx2 (auch cbfa1) der wichtigste Transkriptionsfaktor für fast alle Knochenspezifischen Gene und damit essentiell für die osteogene Differenzierung [73, 74]. Runx2 wird außer in Osteoblasten nur noch in frühen hypertrophen Chondrocyten exprimiert und ist für die Expression von MMP13, Opn, Col1a1 verantwortlich, wird selbst aber durch -Catenin hochreguliert [75]. In Übereinstimmung mit diesen Befunden zeigte die in situ Hybridisierung Analyse eine deutlich reduzierte Runx2-Expression in hypertrophen Chondrocyten der Wachstumszone als auch in Osteoblasten der Spongiosa von Cat-KO Knochen (Abb.33). Abbildung 33. Die in situ Hybridisierung mit Runx2-RNA-Sonde zeigte deutliche Abnahme der Runx2-Expression im Knorpel und Knochenmark. A, C: Femur; B, D: Tibia, P2. Die quantitative Analyse mittels der qrt-pcr bestätigte eine signifikante Reduktion der Runx2 mrna Spiegel (Abb. 34), was in Übereinstimmung mit Berichten über die Regulation der Runx2 Expression durch den Wnt/β-Catenin-Signalweg steht [42, 75]. 38

49 Ergebnisse 2,80 2,40 2,00 1,60 1,20 0,80 0,40 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 WT KO Runx2 HC 0 WT KO Runx2 Epiphysen 0,00 WT KO Runx2 ganze Knochen Abbildung 34. Die deutliche Senkung des Runx2-Spiegels sowohl in hypertrophen Chondrocyten als auch in ganzen Epiphysen und Knochen der Knockout-Mäuse. Osterix (Osx) Ein weiterer wichtiger osteogener Transkriptionsfaktor ist Osterix, ein Osteoblastenmarker, der von Runx2 reguliert wird [18, 19, 68]. Die qrt-pcr-analyse ergab eine deutliche Minderung der Osx-Expression in hypertrophen Chondrocyten und ganzen Knochen (Abb. 35). Die folgenden Untersuchungen mit Hilfe der Immunofluoreszenz von YFP-transgenen Cat-KO-Mäusen veranschaulichte die verminderte Anzahl von Osx-positiven Osteoblasten (s. unten). 3,20 1,20 2,80 2,40 2,00 1,00 0,80 1,60 0,60 1,20 0,80 0,40 0,40 0,20 0,00 WT KO Osx HC 0,00 WT KO Osx ganze Knochen Abbildung 35. Die relative Osx-Expression in hypertrophen Chondrocyten und in Knochen von Knockout-Mäusen ist signifikant herunterreguliert. 39

50 Ergebnisse Mitglieder der BMP-Familie und ihre Inhibitore Diese Befunde über die Supression der Expression von osteogenen Transkriptionsfaktoren legten nahe, auch den Einfluss der -Catenin Deletion auf die Expression von Wachstumsfaktoren der BMP Familie zu untersuchen, die eine zentrale Rolle in der chondrogenen und osteogenen Differenzierung spielen und vom Wnt/β-Catenin- Signalweg reguliert werden. Die qrt-pcr Analyse zeigte eine deutliche Reduktion des Bmp2-mRNA-Spiegels in hypertrophen Chondrocyten, und eine schwächere Expression von Bmp4 und Bmp7 (Abb.36). Bmp6 war nicht signifikant reduziert. Die Expression von Inhibitoren des BMP-Signalwegs, Chordin und Noggin, war hingegen unverändert (Abb.37). 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 WT KO Bmp7 Abbildung 36. Die relativen Expressionsspiegel von Bmp-Faktoren in hypertrophen Chondrocyten von Cat-KO-Tieren zeigten eine geringe Abnahme in der Expression von Bmp4 und 7. Die Bmp2- Expression war gegenüber WT Tieren deutlich reduziert, dagegen waren die BMP6 mrna Spiegel nicht signifikant verändert. 2,40 1,40 2,00 1,20 1,60 1,20 0,80 1,00 0,80 0,60 0,40 0,40 0,20 0,00 WT KO Chordin 0,00 WT KO Noggin Abbildung 37. Die relative Expression von zwei Bmp-Inhibitoren, Chordin und Noggin, in hypertrphen Chondrocyten von Cat-KO-Mäusen wies keine signifikante Veränderung auf. 40

51 Ergebnisse Indian Hedgehog Die Untersuchung der Expression von Ihh, einem Marker von hypertrophen Chondrocyten, dessen Expression von BMP-Signalweg reguliert wird, ergab keine signifikante Veränderung des Ihh Signals in der in situ Hybridisierung (Abb.38), und nur eine leichte, statistisch nicht signifikante Minderung nach der qrt-pcr Analyse (Abb.39). Abbildung 38. Die in situ Hybridisierung mit Ihh-RNA-Sonde zeigte keine Unterschiede in der Expression von Ihh in Knochen von WT- und Cat-KO-Mäusen. A,C: Femur; B, D: Tibia, P2. 41

52 Ergebnisse 2,80 2,40 2,00 1,60 1,20 0,80 0,40 0,00 WT KO Ihh HC Abbildung 39. Die relative Ihh-Expression n hypertrophen Chondrocyten, ermittelt mittels qrt- PCR, war nicht signifikant reduziert. 42

53 Ergebnisse Der Trabekelschwund in Cat-KO Knochen korreliert mit einer erhöhten Osteoklastenaktivierung Die histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen von Cat-KO-Mäusen mit Alcian Blau- und Safranin O-Färbungen sowie immunhistochemische Analysen mit anti-collagen I Antikörpern zeigten nicht nur das Fehlen des Osteoidmantels der Tabekel in derspongiosa der Röhrenknochen, sondern auch Fehlen desknorpeligen Kerns der Knochentrabekel. Das deutete auf möglicherweise verstärkte Knochenresorption durch Osteoklasten hin. Um diese Möglichkeit zu prüfen, wurden Osteoklasten mit Hilfe der TRAP (Tartrate Resistant Acid Phosphatase)-Färbung auf Paraffinschnitten verschiedener Cat-KO- und WT-Knochen angefärbt. Die TRAP-Färbung zeigte mehrere mehrkernige, d.h. aktivierte, und zum Teil einkernige Osteoklasten an der Knorpel-Knochenmark-Grenze und an den erhaltenen Knochentrabekeln in der Spongiosa. Die Zahl der Osteoklasten entlang der Knorpel-Knochen-Grenze von Cat- KO-Knochen war deutlich höher als in WT-Knochen, in denen die Osteoklasten vorwiegend an Knochetrabekeln gefunden wurden (Abb. 40, 41). Die Dichte der Osteoklasten an der Knorpel-Knochen-Grenze sowie ihre Größe wurde mit der Osteomeasure Software ausgemessen. Die Anzahl der aktivierten Osteoklasten stieg mit dem Alter der Mäusen (Abb. 42). Abbildung 40. Die TRAP-Färbung von Knochenschnitten der 3 Tage alten Mäusen zeigte aktivierte mehrkernige Osteoklasten an der Knorpel-Knochenmark-Grenze und Fehlen von Knochentrabekeln bei Knockout-Tieren, Femur. A, C: 10xVergrößerung; B, D: 20x Vergrößerung. 43

54 Ergebnisse Abbildung 41. Die TRAP-Färbung von Knochenschnitten der 17 Tage alten Mäusen zeigte an der Knorpel-Knochenmark-Grenze stark vergrößerte, mehrkernige, ausdifferenzierte Osteoklasten und fast vollständiges Fehlen von Knochentrabekeln bei Knockout-Tieren, Femur. A, C: 10xVergrößerung; B, D: 20x Vergrößerung [90]. Das Auszählen von Osteoklasten und Ausmessen des Osteoklastenvolumens relativ zur Gesamtvolumen mit Hilfe des Osteomeasure Programms (Med III) ergab einen wesentlichen Anstieg in der Osteoklastenzahl in Cat-KO-Mäusen, besonders bei den älteren Tieren. Das relative Volumen war ebenso größer bei Knockout-Mäusen. Die Analyse umfasste nur Bereiche an der Knochenmark-Knorpel (hypertrophe Zone)- Grenze auf jeweils vier histologischen Schnitten von Humerus (P17) und Tibia (P7), die mit TRAP Färbung gefärbt waren, weil die sonstigen Osteoklasten an Knochentrabekeln, wenn die noch intakt waren, nicht von hypertrophen Chondrocyten mit dem deletierten ctnnb1 beeinflusst werden konnten. 44

55 Ergebnisse A ocl.v / t.a. B ocl nr./ t.a. 1,2 40 1,0 0,8 30 0,6 20 0,4 0,2 10 C wt ko D wt ko 0,7 25 0,6 0,5 20 0,4 15 0,3 0,2 0, wt ko wt Abbildung 42. Auswertung der morphometrischen Analyse von dem Osteoklastenvolumen im Verhältnis zum Gesamtvolumen (ocl.v./t.a..) (A, C) und der Anzahl of Osteoklasten (ocl.nr./t.a.) an der Knorpel-Knochenmarkgrenze (B, D). Es wurden jeweils vier Schnitte mit TRAP-gefärbten Humerus, P17 (A, B) oder Tibia, P7 (C, D) analysiert [90]. Auf die verstärkte Osteoklastendifferenzierung deutete auch die erhöhte Expression von Mmp9 hin, die mit Hilfe der in situ Hybridisierung untersucht wurde (Abb. 43). MMP 9 wird von reifen mehrkernigen Osteoklasten produziert und ist vor allem verantwortlich für den Abbau der Knochenkollagene I und V an den Resoptionslakunen. In Knochen von Cat-KO-Mäusen wies ein starkes Signal von der Mmp9-mRNA-Sonde an der Knochenmark-Knorpel-Grenze auf eine Akkumulation von aktivierten Osteoklasten in diesem Bereich hin. Wie auch bei der TRAP-Färbung war das Signal bei älteren Mäusen (hier P7 im Vergleich zu P3) stärker. Die Wildtyp-Tiere zeigten eine verstärkte Mmp9-Expression auch entlang der Trabekeln auf. ko 45

56 Ergebnisse Abbildung 43. Die in situ Hybridisierung mit der Mmp9-RNA-Sonde zeigte eine verstärkte Expression von Mmp9 in der Zellen an der Knochenmark-Knorpel-Grenze und weniger Mmp9-positive Zellen im Knochenmark von 3 Tage alten Knockout-Mäusen. A, C: Femur; B, D: Tibia. 10x Vergrößerung [90]. Abbildung 44. Die Expression von Mmp9 in Knochen von 7 Tage alten Knockout-Mäusen war auch überreguliert an der Grenze zwischen Knochenmark und Wachstumszone. A, C: Femur; B, D:Tibia. 10x Vergrößerung. 46

57 Ergebnisse Die erhöhte Osteoklastenaktivität in Cat-KO Mäusen wird wahrscheinlich durch eine verstärkte RANKL Expression verursacht Die wichtigsten Faktoren, die für das Gleichgewicht zwischen der Inhibierung und der Aktivierung der Osteoklasten und somit für den Erhalt der Knochenhomöostase sorgen, sind RANKL und Osteoprotegerin. In früheren Untersuchungen wurde bereits gezeigt, dass eine Aktivierung des Wnt-Signalwegs in Osteoblasten die Rankl-Expression und somit die Aktivierung von Osteoklasten herunterreguliert [58]. Um festzustellen, ob durch die Deletion von ctnnb1 in hypertrophen Chondrocyten das Gleichgewicht zwischen Rankl und Opg Expression beeinträchtigt ist, wurden zunächst immunhistochenmische Analysen durchgeführt. Untersuchungen mit anti-rankl- Antikörpern zeigten zwar deutliche RANKL-Signale in hypertrophen Chondrocyten (Abb. 45), aber es konnten keine deutlichen Unterschiede zwischen Cat-KO- und WT- Tieren erkannt werden, die eine semiquantitative Aussage ermöglichten. A WT B KO 100 m C WT D KO 50 m Abbildung 45. Immunistochemische Analyse mit anti-rankl-antikörpern wies Rankl-Expression sowie in Osteoblasten als auch in hypertrophen Chondrocyten nach. A, B: Humerus; C, D: Tibia; P1 [90]. 47

58 Ergebnisse Um quantitative Aussagen zu erhalten, wurde die Expression von Rankl und Opg in der hypertrophen Zone, Epiphysen und in ganzen Knochen mit Hilfe der qrt-pcr gemessen. Die Reduktion der Expression von Opg in hypertrophen Chondrocyten war nicht sigifikant (Abb.42). In Epiphysen und im ganzen Knochen war die Reduktion der Opg Expression deutlicher, was wahrscheinlich auf den hohen Anteil von Osteoblasten zurückzuführen ist. Da die Osteoblastenzahl, wie oben gezeigt, in der Spongiosa von Cat-KO-Mäusen deutlich niedriger ist, ergab die qrt-pcr Analyse hier eine deutliche Reduktion im Vergleich zu Wildtyp Epiphysen bzw. Knochen. 2,40 2,00 2,40 2,00 2,40 2,00 1,60 1,20 0,80 1,60 1,20 0,80 1,60 1,20 0,80 0,40 0,00 0,40 WT KO Opg HC 0,00 WT KO Opg Epiphyse 0,40 0,00 WT KO Opg ganze Knochen Abbildung 46. Der relative Opg-mRNA-Spiegel war in hypertrophen Chondrocyten von Knockout- Tieren nicht signifikant reduziert. Die deutliche Reduzierung wurde erst in Epiphysen und ganzen Knochen nachgewiesen, was eher auf den Anteil von Opg, das von Osteoblasten exprimiert wird, zurückzuführen ist. Dagegen zeigten die Untersuchung einen Anstieg der Rankl mrna-spiegel um 20% in Cat-KO-Chondrocyten (Abb.47). Dies könnte die verstärkte Osteoklastenaktivität in Cat-KO-Mäusen und damit die verringerte Trabekelmenge erklären. 3,60 3,20 2,80 2,40 2,00 1,60 1,20 0,80 0,40 0,00 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 WT KO 0,00 Rankl HC Rankl WT Epiphyse KO 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 WT KO Rankl ganze Knochen Abbildung 47. Der relative Rankl-mRNA-Spiegel. Die hypertrophen Chondrocyten und Epiphysen von Knockout-Mäusen wiesen Überexpression von Rankl auf. In den ganzen Knochen blieb die Expression scheinbar unverändert aufgrund des höheren Anteils an Osteoblasten im Vergleich zu Chondrocyten. 48

59 Relative mrna level Ergebnisse Um zu bestätigen, dass β-catenin in hypertrophen Chondrocyten die Rankl Expression stimuliert, wurde der ctnnb1- RNA-Spiegel mit Hilfe der ctnnb1-sirna in der zu hypertrophen Chondrocyten differenzierten Mauszelllinie 4C6 herunterreguliert. Die Bestimmung der ctnnb1- mrna mit Hilfe der qrt-pcr bestätigte einen um mehr als 50% reduzierte ctnnb1- mrna nach der Inhibition durch sirna (Abb. 48). Während Opgund Vegf-Spiegel nicht beeinträchtigt war, stieg die Rankl-Expression signifikant an, was in Übereinstimmung mit dem erhöhten Rankl-mRNA Spiegel in -Catenindefizienten hypertrophen Chondrocyten steht. 3,0 2,5 K-siRNA ctnnb1-sirna 2,0 1,5 1,0 0,5 Ctnnb1 Rankl Opg Vegfa Col10a1 Abbildung 48. Die relativen Expressionsspiegel in der 4C6-Zelllinie nach der Inaktivierung des β- Catenins mit ctnnb1-sirna [90] Ist β-catenin für die Transdifferenzierung von hypertrophen Chondrocyten verantwortlich? Während die oben gezeigten Befunde über die erhöhte Osteoklastenaktivität in Cat-KO Mäusen dafür sprechen, dass das Fehlen der Knochentrabekel in der Spongiosa auf eine verstärkte Resorption der primären Spongiosa zurückzuführen ist, deuteten die Ergebnisse über eine reduzierte Expression der osteogenen Faktoren Osx und RUNX2 sowie der BMP Wachstumsfaktoren in ctnnb1-defizienten hypertrophen Chondrocyten eher darauf hin, dass die Deletion der ctnnb1 Expression in hypertrophen Chondrocyten eine mögliche Transdifferenzierung zu Osteoblasten verhindert. In unabhängigen Studien in der Arbeitsgruppe wurde mit Hilfe von Reportergen Studien gezeigt, dass ein substantieller Teil der hypertrophen Chondrocyten der Wachstumszone nicht, wie bisher angenommen, durch Apoptose elimiert wird, sondern einen Transdifferenzierungsprozess zu Osteoblasten durchläuft und so zu ca. 30 bis 40 % der Osteoblasten der Spongiosa, des Endosteums und des cortikalen Knochens beiträgt [88]. Die Arbeiten basierten auf der Entwicklung einer Col10Cre-deleter Maus [62], mit deren Hilfe 49

60 Ergebnisse es möglich wurde, durch Kreuzung mit ROSA26LacZ oder ROSA26-YFP die betreffenden Reportergene spezifisch in hypertrophen Chondrocyten zu exprimieren. Auf diese Weise wurde festgestellt, dass LacZ- oder YFP-positive Zellen auch unterhalb der Knorpel-Knochengrenze auftauchten, obwohl dort keine Cre Aktivität gemessen werden konnte. Diese Zellen wurden immunhistologisch und durch in situ Hybdridisierung als Osteoblasten bzw. deren Vorläuferzellen identifiziert [88]. Dieses Lineage-tracing System wurde eingesetzt, um die Frage zu klären, ob die Deletion von ctnnb1 in hypertrophen Chondrocyten kausal am Transdifferenzierungsvorgang zu Osteoblasten oder Osteoblastenvorläuferzellen verhindert. Eine solche Rolle für - Catenin wird vor allem dadurch wahrscheinlich, als die zentrale Steuerungsfunktion von -Catenin in der Osteoblastendifferenzierung unumstritten ist [3, 89]. Zur Klärung dieser Frage wurde ein BACCol10Cre; Rosa26YFP; β-catenin fl/fl Mausmodell etabliert, in dem die Cre Recombinase gleichzeitig mit der Deletion des ctnnb1 Gens in hypertropehn Chondrocyten auch das Reportergen YFP aktiviert. Um die Wahrscheinlichkeit für YFP-positiven Cat-KO Mäusen zu erhöhen, wurden die β- Catenin fl/fl ; YFP +/- -Männchen mit BACcol10Cre +/- ; βcatenin fl/wt -Weibchen gekreuzt. In dieser Reportermauslinie wurde versucht nachzuweisen, ob es einen Unterschied in der Anzahl von YFP-positiven Osteoblasten, die von hypertrophen Chondrocyten abstammen müssen, in der Spongiosa von Cat-KO und Cat-WT-Tieren gibt. Dazu wurden Schnitte von BACCol10Cre; R26YFP; ctnnb1 fl/fl Mäusen sowie von BACCol10Cre; R26YFP; ctnnb1 fl/+ Kontrollmäusen durch Immunfluoreszenz mit anti-osterix-, anti- YFP (GFP)-Antikörpern zur Identifizierung der doppelpositiven Zellen (Osteoblasten) eingesetzt. Danach wurden die einfach- und doppelpositiven Zellen gezählt und diese Daten wurden ausgewertet. Wie es in der Tabelle 1 dargestellt ist, war die Anzahl der Osx- und YFP-positiven Osteoblasten, das heißt, Osteoblasten, die von hypertrophen Chondrocyten abstammen, im Vergleich zu nur YFP-positiven Zellen (alle Abkömmlinge der hypertrophen Chondrocyten) in Cat-KO-Tieren deutlich (mehr als um die Hälfte) reduziert. Das Verhältnis von YFP-positiven zu YFP-negativen Osteoblasten (alle Zellen waren Osx-positiv) war nur mäßig verringert. Dafür war die Anzahl von allen Osx-positiven Zellen in Spongiosa um dreifache reduziert, was den Ergebnissen aus der qrt-pcr (Abb. 35) entspricht. Die Anzahl von allen YFP-positiven Zellen war bei den Cat-KO-Mäusen fast um die Hälfte niedriger als bei den WT-Tieren. ayfp aosx merge merge/ayfp merge/aosx Cat-WT ,30 0,41 Cat-KO ,13 0,32 Tabelle 1. Auswertung der Immunofluoreszenz mit anti-yfp- und anti-osx-antikörpern. Anzahl der Schnitte: WT: 22; KO:

61 Ergebnisse Abbildung 49. Immunfluoreszenz auf Tibia Schnitten von P2 BACCol10Cre;R26YFP;ctnnb1 fl/fl (KO) und BACCol10Cre;R26YFP;ctnnb1 fl/+ (WT) Mäusen mit anti-osterix- und anti-yfp- Antikörpern (A; C) zeigte verringerte Anzahl von doppelpositiven Zellen bei Knockout. B, D: Immunofluoreszenz mit anti-collagen I- und anti-yfp-antikörpern: Collagen I deutet die Knochentrabekel an, YFP-positive Zellen sind bei Wildtyp vor allem an Trabekeln lokalisiert. 51

62 Diskussion 5 Diskussion β-catenin, das im Zentrum der kanonischen Wnt-Signalwege steht, spielt eine bedeutende und vielseitige Rolle während der gesamten Embryogenese. Die Wirkung des kanonischen Wnt-Signalings und β-catenins auf die Skelettogenese wurde in verschiedenen Studien untersucht. Besondere und komplexe Funktionen hat β-catenin als Regulator der Osteogenese in der Chondrogene und der Reifung der Chondrocyten zu hypertrophen Zellen. Da die Hypertrophie ein entscheidender Prozess während der enchondralen Ossifikation ist, sollte die Analyse der Auswirkungen der β-catenin-deletion in hypertrophen Chondrocyten auf die Knochenentwicklung wichtige Erkenntnisse zur Funktion des Gens in der hypertrophen Chondrocyten während der Skelettogenese bringen. Die spezifische Deletion des ctnnb1 in hypertrophen Chondrocyten unter dem Col10a1- Promoter führte zu zunehmendem Trabekelschwund in der Knochenspongiosa von Cat-KO- Mäusen. Der Phänotyp wurde zuerst am Tag E18 der Embryonalentwicklung, mit zunehmender Verstärkung in den postnatalen Entwicklungsstadien, beobachtet, bis hin zu 3-4 Wochen alten Mäusen, die ca. 20% Knochentrabekel- und Wachstumsreduktion zeigten. Die kortikale Knochendichte blieb unverändert. Dieser Trabekelschwund korrelierte mit einer Zunahme von Osteoklasten sowie dem Fehlen von Knochenmatrix produzierenden Osteoblasten, dabei war die Gesamtzahl der Osterix-positivenZellen in der Spongiosa von Cat-KO Mäusen weitgehen unverändert gegenüber WT Mäusen. Die Ausprägung des Phänotyps variierte innerhalb unterschiedlicher BACCol10a1Cre-Gründerlinien je nach der Entwicklungsstadium und Knochenart, obwohl alle hypertrophen Chondrocyten Cre exprimierten. Diese Schwankungen im Grad des Trabekelschwunds könnten auf die unterschiedliche Anzahl von BAC-Col10a1-Cre Kopien im Genom oder auf mosaikartige Deletionsmuster der hypertrophen Chondrocyten mit nur einem oder beiden deletierten ctnnb1-allelen zurückgeführt werden. Die histologische und morphologische Untersuchung der Wachstumszone von Röhrenknochen der Cat-KO Maus zeigte keine signifikanten morphologischen Veränderungen der Chondrocyten im Vergleich zur Wildtyp Maus. Dagegen ergab sich aus in situ Hybridisierungsanalysen und quantitativen qrt-pcr Bestimmungen von Markern der Späthypertrophie (Runx2, Mmp13, Vegf und Osx) durch ein klarer Hinweis darauf, dass durch die Deletion des ctnnb1 Gens die terminale Differenzierung von hypertrophen Chondrocyten beeinträchtigt wurde. Es wurde in früheren Studien gezeigt, dass die Mmp13-Expression durch β-catenin positiv reguliert wird [76]: Die qrt-pcr bestätigte diese Ergebnisse und zeigte eine deutliche Reduktion der Mmp13-Expression in hypertrophen Chondrocyten von Cat-KO-Mäusen. Die verringerte MMP13-Aktivität deutet darauf hin, dass die Knorpelresorption und das Eindringen von Gefäßen in die späthypertrophe Zone möglicherweise beeinträchtigt sind. Auch die Vegf-Expression war in der hypertrophen Zone eher leicht vermindert, jedoch hatte dies keine starke Auswirkung auf die Gefäßeneinsprossung in das Knochenmark, die auch in Cat- KO Mäusen die Knorpel-Knochengrenze erreichte. Jedoch zeigte die Immunfluoreszenzanalyse mit anti-cd31-antikörpern eine etwas schwächere Ausprägung der Kapillargefäße in der 52

63 Diskussion Spongiosa von Cat-KO Tieren im Vergleich zu Wildtyp Tieren. Die Einwanderung von Knochenmarkzellen samt Osteoklasten- und Osteoblastenvorläufer war somit wahrscheinlich nicht beeinträchtigt. Auch die Expression der osteogenen Transkriptionsfaktoren Runx2 und Osx war in hypertrophen Chondrocyten von Cat-KO Mäusen stark reduziert. Dieser Befund stimmt mit der Aussage von Gaur et al. überein, dass die Runx2-Expression vom kanonischen Wnt-Signalweg direkt reguliert wird [75]. Die Reduktion der Osx-Expression in hypertrophen Chondrocyten (basierend auf qrt-pcr Ergebnissen) ist wohl eine Folge der Runx2-Herunterregulation, da die Osx-Expression von Runx2 reguliert wird [19]. Außerdem reguliert Runx2 die Expression von Vegf und Matrixmetalloproteasen [21]. All dies hatte aber offensichtlich keinen bedeutenden Einfluss auf die Größe oder Morphologie der gesamten hypertrophen Zone. Mehrere hypothetische Ursachen für die ganz oder teilweise fehlende Trabekel in der Spongiosa von Cat-KO Tieren kommen in Frage: Zum ersten wurde eine Beeinträchtigung der Osteoblastendifferenzierung und somit der Knochenbildung aufgrund einer veränderten Sekretion von parakrinen Faktoren von ctnnb1-defizienten Chondrocyten in Betracht gezogen, zum zweiten eine verstärkte Resorption der Knochentrabekel durch Osteoklasten. Aufgrund neuerer Daten wurde eine dritte Möglichkeit untersucht, nämlich eine Inhibition der Transdifferenzierung von hypertrophen Chondrocyten zu Osteoblasten. Das Zusammenspiel aller drei Ursachen ist ebenfalls möglich. Die erste Annahme basiert auf der Reduktion oder dem Fehlen von Typ I Kollagen bzw. dessen mrna-expression, bestätigt durch immunhistochemischen Nachweis mit Anti-Kollagen I-Antikörpern und ISH mit der Col1a1-Sonde. Da Typ I Kollagen in der Spongiosa vor allem durch Osteoblasten produziert wird, deutet das Fehlen von Typ I Kollagen zunächst auf mangelhafte oder fehlende Osteoblastendifferenzierung bzw. auf das Fehlen von Osteoblastenvorläuferzellen hin. Da aber ctnnb1 nur in hypertrophen, Col10a1 exprimierende Chondrocytenlinaktiviert wurde, stellt sich die Frage, auf welcher Weise in diesem Fall hypertrophe Chondrocyten die Osteoblastendifferenzierung beeinflussen könnten. Eine Möglichkeit dafür wäre ein parakriner Faktor, der von hypertrophen Chondrocyten produziert wird und die Osteoblastendifferenzierung stimuliert, analog zu den Chondrocyten des Perichondriums, die die Differenzierung der Osteoblasten und die Bildung der Knochenmanschette beeinflussen [22]. Mögliche Faktoren wären z. B. BMP2, 6, 7, die in hypertrophen Chondrocyten exprimiert werden [77] und eine Rolle in der Osteogenese durch Induktion von Runx2 und Osx spielen [21]. Der kanonische Wnt-Signalweg und Bmp-Signalwege agieren synergetisch während der Skelettogenese, indem sie Runx2-Expression induzieren. Die Untersuchung der Expression der Bmp- Faktoren mit Hilfe der qrt-pcr ergab in der Tat eine signifikante Reduktion von Bmp2- Expression und die Verminderung der Bmp7-Expression. Ob sich der kanonische Wnt- Signalweg auf Bmp-Expression auswirkt, ist noch unklar. Die Expression von Ihh, einem Downstream Faktor des Bmp-Signalwegs, und der Bmp-Inhibitoren Noggin und Chordin blieb unverändert. Das deutet darauf hin, dass die Deletion von ctnnb1 durch Inhibiton der BMP Sekretion von hypertrophen Chondrocyten die Differenzierung von Osteoblastenvorläufern zun reifen Osteoblasten beeinträchtigen könnte. 53

64 Diskussion Die Hauptursache für das Fehlen der Knochentrabekel in der Spongiosa von Cat-KO ist wahrscheinlich die erhöhte Osteoklasten-Aktivität. Wäre nur die Osteoblastendifferenzierung in der Spongiosa inhibiert, könnten die Reste des Kalkknorpels stehen bleiben, die im Wildtyp nach der Resorption des hypertrophen Knorpels als Substrate dienen, an denen sich Osteoprogenitorzellen anheften und zu Osteoblasten differenzieren. Es besteht allerdings auch die Möglichkeit, dass bei verringerter Trabekelmenge aufgrund fehlender Osteoblasten und ohne genügende Einkapselung der Knorpelkerne durch Osteoid (vor allem Typ I Kollagen) die Stege aus Kalkknorpel dem ungeschützen Angriff einer Überzahl von Osteoklasten gegenüberstehen und daher vollständig abgebaut werden. Zunächst wurde jedoch als Hauptursache für den Phänotyp der Cat-KO-Mäuse die verstärkte Osteoklastenaktivität angenommen und genauer untersucht. Die TRAP-Färbung zeigte, dass bei Cat-KO-Mäusen die Anzahl der Osteoklasten an der Knorpel-Knochenmark-Grenze drastisch erhöht war und die Osteoklasten deutlich größer als bei Wildtyp-Mäusen waren. Die Expression der Mmp9, einer Protease, die stark in Osteoklasten exprimiert wird, war ebenso hochreguliert. Außerdem wurde mittels qrt-pcr eine verstärkte Expression von Rankl in hypertrophen Chondrocyten beobachtet, dem wichtigsten Osteoklasten-aktivierenden Faktor. Frühere Studien haben bereits gezeigt, dass RANKL und OPG auch in hypertrophen Chondrocyten exprimiert werden [59, 60]. Aufgrund der erhöhten RANKL Aktivität in hypertrophen Chondrocyten und des Fehlens der trabekulären Osteoblasten und der daraus resultierenden Verminderung der OPG Sekretion werden Osteoklasten überaktiviert und resorbieren knorpelige Überreste der Trabekel. Das verhindert die Einnistung und Differenzierung der Osteoblastenvorläuferzellen. Diese Befunde stehen in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten, die gezeigt haben, dass β-catenin eine bedeutende Rolle in der Regulation der Osteoklastenaktivität spielt. In Osteoblasten stimuliert β-catenin die Expression von Osteoprotegerin (OPG), ein Gegenspieler von RANKL [58, 78], durch die Bindung an βcat/tcf4 Bindungsstellen des Opg Promoters und inhibiert damit die Osteoklastenaktivierung. Außerdem wird Rankl direkt von β-catenin durch die Bindung an den Rankl Promoter inhibiert [41]. Die Inaktivierung von β-catenin in Osteoblasten führte daher zu einer unkontrollierten Osteoklastenaktivität und starken Resorption von Knochentrabekeln. Die Expression von Rankl, das Osteoklastenvorläuferzellen durch die Bindung an RANK aktiviert, blieb unverändert [58]. Die Expression von Opg wurde dagegen herunterreguliert, was zu einer verstärkten Osteoklastogenese führte [58]. In hypertrophen Chondrocyten der Cat-KO-Mäuse wurde keine signifikante Reduktion der Opg Expression, hingegen eine verstärkte Rankl Expression mittels qrt-pcr nachgewiesen, was zum gleichen Endresultat wie die Deletion von ctnnb1 in Osteoblasten führt [57], nämlich eine Inhibition der Trabekelbildung. Die Expression von Opg war bei Cat-KO Tieren nur in hypertrophen Chondrocyten nicht signifikant reduziert, dagegen deutlicher in Epihysen, was darauf hindeuten könnte, dass Opg von mehreren Zelltypen exprimiert wird. Desweiteren spielen andere Faktore je nach Zelltyp eine wesentliche Rolle in der Regulation der Rankl und Opg Expression. Sato et al. zeigten, dass die Opg Expression über Wnt/ β- Catenin-Signalweg von BMP-2 hochreguliert wird [78]. Außerdem erhöht BMP-2 die Expression von Rankl über Smad1 [28]. In hypertrophen Chondrocyten der Cat-KO-Mäuse wur- 54

65 Diskussion de jedoch reduzierte Bmp2-Expression nachgewiesen, dass zur Verminderung der Opg Expression führen konnte. Da aber die Rankl-Expression erhöht war, kontrollieren wahrscheinlich ein oder mehrere regulierende Faktoren das Gleichgewicht zwischen RANKL und OPG in Knochenhomöostase. Dieses Gleichgewicht ist in frühen Stadien der Skelettogenese sehr wichtig, sodass auch nicht signifikante Veränderungen dramatische Folgen in der Knochenentwicklung und Wachstum haben. Die dritte Möglichkeitgewann durch neue Befunde an Gewicht, die zeigten, dass Chondrocyten nach dem Hypertrophie-Stadium nicht vollständig durch Apoptose oder Autophagie eliminiert werden [79], sondern zu einem erheblichen Anteil zu Osteoblasten transdifferenzieren [80-84]. Obwohl trabekuläre Osteoblasten zum großten Teil von Osteoblastenvorläufer Zellen, die durch die einsprossenden Gefäßen in Knochenmark gelangen, abstammen [85], wurde im letzten Jahr von verschiedenen Gruppen durch lineage tracing Studien unabhängig gezeigt, dass ein substanzieller Anteil der trabekulären Osteblasten von hypertrophen Chondrocyten abstammt. Die Untersuchung der freien und Trabekel gebundenen Osx-positiven aber Col I-negativen Osteoblastenvorläuferzellen im Knochenmark von Cat-KO-Mäusen zeigt e- zunächst, dass die Anzahl von Osteoprogenítorzellen beinahe unverändert war und dass nur die an Trabekel gebundenen Zellen fehlten. Das BACCol10Cre; Rosa26YFP; β-catenin fl/fl Mausmodel lieferte aber genauere Ergebnisse über den Anteil der von hypertrophen Chondrocyten abstammenden Osteoblasten (YFP- und Osx-positive Zellen) in der Spongiosa. Hierbei war das Verhältnis von Chondrocyten abgeleiteten, YFP-positiven Osteoblasten zu allen YFP-positiven Zellen bei Cat-KO Mäusen gegenüber WT Mäusen signifikant reduziert. Fazit Die Inaktivierung des β-catenins in hypertrophen Chondrocyten beeinträchtigt die Entwicklung und den Aufbau der Knochentrabekel in der Spongiosa der Röhrenknochen. Für das Fehlen der Knochentrabekel inklusive der Kalkknorpelkerne in der Spongiosa sind wahrscheinlich zwei Mechanismen verantwortlich: Zum Einen eine erhöhte Osteoklastenaktivität aufgrund einer Erhöhung der RANKL Expression in ctnnb1 defizienten hypertrophen Chondrocyten, und zum Anderen auf einer Inhibition der Differenzierung von Osteoblasten. Da die Anzahl der nicht an Trabekel gebundenen Osteoblastenvorläuferzellen zwischen Cat-KO und Wildtyp-Tieren nicht signifikant variiert, beruht die phänotypische Veränderung der Spongiosa wahrscheinlich auf einer Beeinträchtung der Differenzierung der Osteoblastenvorläufer zu reifen, Osteoid produzierenden Osteoblasten aufgrund einer geringeren BMP2 Sekretion sowie der fehlenden kalzifizierten knorpeligen Stege, der Überreste des Kalkknorpels der Wachstumszone. Die geringere Osteoblastenzahl in der Spongiosa von Cat-KO kann jedoch auch bedeuten, dass die Deletion von ctnnb1 in hypertrophen Chondrocyten nicht nur deren terminale Differenzierung, sondern auch ihre Transdifferenzierung zu Osteteoblasten inhibiert. 55

66 Material und Methoden 6 Material und Methoden 6.1 Material Allgemeine Chemikalien Alle verwendeten Chemikalien (Salze, Säuren, Alkohole, fertige Lösungen etc.) mit dem Reinheitsgrad pro analysi wurden von folgenden Firmen bezogen: AppliChem Darmstadt Merk KGaA Darmstadt Carl Roth GmbH Co. Karlsruhe Sigma-Aldrich Chemie GmbH München Kits Name ABC Elite Kit Vectastain AEC Subtrate Kit for Peroxidase BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit DIG RNA Labeling Mix Link-Label IHC Detection System QIAGEN Plasmid Midi Kit QIAquick PCR Purification Kit RNeasy Mini Kit Superscript II RNase H - Reverse Transcription Set Vector Blue AP Substrate Kit III Hersteller Vector Lab., Burlingame, CA, USA Vector Lab., Burlingame, CA, USA Applied Biosystems, Carlsbad, CA Roche, Mannheim BioGenex, Hamburg Qiagen, Hilden Qiagen, Hilden Qiagen, Hilden Invitrogen, Karlsruhe Vector Lab., Burlingame, CA, USA Enzyme Name Collagenase P (Clostridium histolyticum) DNA-Restriktionsendonukleasen Hot Start Polymerase HOT FIREPol EvaGreen qpcr Mix Plus Hyaluronidase Proteinase K RNA-Polymerase SP6 RNA-Polymerase T3 RNA-Polymerase T7 Hersteller Roche, Mannheim NEB, Frankfurt a.m. Solis BioDyne über Medibena, Wien Carl Roth, Karlsruhe Roche, Mannheim Roche, Mannheim/Fermentas St. Leon-Rot Roche, Mannheim/Fermentas St. Leon-Rot Roche, Mannheim/Fermentas St. Leon-Rot 56

67 Material und Methoden RNAse A SuperScript II RNase H- Reverse- Transkriptase Set Tom Taq (thermostable Taq DNA polymerase expressed recombinantly in E. coli and purified) Trypsin Roche, Mannheim Invitrogen GmbH, Karlsruhe Dr. Thomas Samson (Erlangen) Invitrogen GmbH, Karlsruhe Reagenzien für die Genotypisierung Name Hersteller/ Zusammensetzung Lysepuffer für Schwanzbiopsien 50 mm Tris ph mm KCl 2,5 mm EDTA 0,45% NP-40 0,45% Tween 20 Ad 500 ml H 2 O dntp Mix MP Biomedicals, LLC, Illkirch 10x Tom Taq Puffer 200 mm Tris ph 8,5 500 mm KCl 50 mm MgCl 2 Ad 10 ml H 2 O Ethidiumbromid Carl Roth, Karlsruhe Agarose Bio&Sell, Feucht 1%/2% Agarosegel 4,5g / 9g in 375 ml 1x TAE Puffer 50x TAE Puffer Tris (40 mm) 242,3 g NaAcetat (3 mm) 20,54 g EDTA/Titriplex 3 (0,04 mm) 0,76 g 96%-Essigsäure (ad ph7,9) ca. 80 ml H 2 0 ad 1 l Orange G Sigma-Aldrich, München 6x DNA Ladepuffer 0,5% Orange G 50% Glycerin in 1x E-Puffer 1kb DNA Leiter Gibco, Karlsruhe Reagenzien für die in situ Hybridisierung Name Hersteller/ Zusammensetzung 10x PBS (ph 7,4) NaCl 80 g KCl 2 g KH2PO4 2 g Na2HPO4 x 2H2O 14,4 g H20 ad 1 10x TBS Tris/HCl 60,6 g NaCl 87,6 g H20 ad 1 57

68 Material und Methoden ad ph 7,4 mit HCl 1x TBS-1%Tween 10x TBS 100 ml Tween 20 1 ml H20 ad 1 20x SSC NaCl 175,3 g Trinatriumcitrat-dihydrat 88,2 g H20 ad 1 ad ph 7 mit HCl Proteinase K Puffer 20 mm Tris/HCl ph 7,2 20 ml 1 mm EDTA ph 8,0 2 ml H20 ad 1 Proteinase K 150 µl in 150 ml Puffer Tris/Glycin Puffer Tris Base 24,2 g Glycine 15 g H2O ad 2 l 10x PE PIPES ph 6,8 100 mm EDTA ph 8,0 10 mm NTE 0,5 M NaCl 100 ml 10 mm Tris/HCl ph 7 10 ml 5 mm EDTA ph 8 10 ml H20 ad 1 NTM 100 M NaCl 20 ml 100 mm Tris/HCl ph 9,5 100 ml 50 mm MgCl2 50 ml H20 ad 1 10x MAB Maleinsäure 116 g NaCl 88 g H20 ad 1 ad ph 7,5 mit NaOH Plätzchen 1xMAB-Tween 10x MAB 100 ml H2O ad 1 l Tween-20 1 ml Hybridisierungspuffer Formamid 25 ml NaCl (5 M) 7,5 ml 10x PE 5 ml 10% BSA 0,5 ml 20% SDS 2,5 ml 5% Heparin 0,5 ml trna 50 mg/ml 0,1 ml 10% Blockierungslösung Blockierungsreagenz (# Roche, Mannheim) in MABT Färbelösung BM-Purple 20 ml Levamisole (bei -20 C) 200 µl Tween-20 (0,1%) 20 µl BM-Purple Substratlösung Roche, Mannheim BSA Carl Roth, Karlsruhe Heparin-Natrium Roth, Karlsruhe / Sigma-Aldrich, München Levamisole Sigma-Aldrich, München RNase-Inhibitor Ribolock 2500U Fermentas, St. Leon-Rot t-rna (50mg/ml) AppliChem, Darmstadt 58

69 Material und Methoden Reagenzien für die Sondenherstellung Name 10xPuffer für Restriktionsverdau 10xTranskriptionspuffer DIG-gelabelte NTPs RNasin T7/T3/Sp6 RNA-Polymerase t-rna (1mg/ml) Hersteller/Zusammensetzung Fermentas, St. Leon-Rot Fermentas, St. Leon-Rot Roche, Mannheim Promega, Mannheim Fermentas, St. Leon-Rot AppliChem, Darmstadt Eindeckmittel Name Aquatex Elvanol Kaisers Glycerolgelatine Roti-Histo-Kit Hersteller Merck, Darmstadt Carl Roth, Karlsruhe Merck, Darmstadt Roth, Karlsruhe Antikörper Name Anti-digoxygenin-AP Fab fragments Chick-anti-YFP (ab6556) Concentrated Rabbit Link (Biotinylated goat anti-rabbit Immunoglobulins) Goat anti-chick FITC Goat anti-rabbit Cy3 Goat anti-rabbit Cy5 Goat anti-rankl Goat anti-rat Cy3 Horse anti-goat Rabbit anti-collagen I (ab21286) Rabbit anti-βcatenin (H-102): sc-7199 Rabbit-anti-osterix (ab22552) Rat-anti-Collagen I Rat-anti-PECAM SS Goat Link (Biotinylated Rabbit Anti-goat Immunoglobulins) Hersteller Roche, Penzberg Abcam, Cambridge, UK BioGenex, Hamburg Abcam, Cambridge, UK Abcam, Cambridge, UK Abcam, Cambridge, UK R&D Systems, Minneapolis Abcam, Cambridge, UK Vector Laboratories, Burlingame Abcam, Cambridge, UK Santa Cruz Biotechnologiy, Inc. Abcam, Cambridge, UK Chondrex, Redmond, WA BD Pharmingen, San Jose, CA BioGenex, Hamburg 59

70 Material und Methoden Reagenzien für die Immunhistochemie und Immunfluoreszenz Name Hersteller 10x PBS (ph 7,4) NaCl 80 g KCl 2 g KH2PO4 2 g Na2HPO4 x 2H2O 14,4 g H20 ad 1 Ethanol Carl Roth, Karlsruhe Methanol Carl Roth, Karlsruhe Xylol Carl Roth, Karlsruhe 1mg/ml Hoechst BSA Carl Roth, Karlsruhe Normal goat serum Jackson Immuno Research, West Grove, PA Concentrated AP Label (Alkaline Phosphatase-Conjugated BioGenex, Hamburg Streptavidin Link Diluent BioGenex, Hamburg Common Antibody Diluent BioGenex, Hamburg SigmaFast Red Sigma-Aldrich, München 10mM Citratpuffer Na3Citrat 10mM, ph 6,0 ABC Elite Reagent Vector Laboratories, Burlingame Medien und Lösungen für Zellkulturen Zellen: primäre hypertrophe Chondrocyten; 4H4 und 4C6-Zelllinien [86]. Name Collagenase-Lösung DMEM High Glucose DMEM/Ham s/f12 Medium 1:1 Fetales Kälberserum (FCS) Fungizone 100X MEM Alpha modification Natrium-Ascorbat-Phosphat Oligofectamin OptiMEM Penicillin-Streptomycin-Lösung Trypsin-EDTA Trypsin-Lösung βglycerophosphat Hersteller/ Zusammensetzung Collagenase 1mg/ml (Roche, Mannheim) in sterilem DMEM/Ham s/f12-medium mit 5% oder 10% FCS PAA Laboratories, Cölbe Gibco, Karlsruhe Biochrom AG Seromed, Berlin Invitrogen, Karlsruhe PAA Laboratories, Cölbe 50 µg/ml Ambion, Life Technologies Ambion, Life Technologies PAA Laboratories, Cölbe 2,5ml / 500ml Medium 1g/l Trypsin, 0.66mM EDTA Trypsin 1mg/ml (Gibco, Karlsruhe) in sterilem PBS 10mM 60

71 Material und Methoden Färbelösungen Name Zusammensetzung 0,1M Natriumacetatpuffer, ph 4,2 1,36 g Natriumacetat-Trihydrat 100ml dh 2 O 10X Safranin O 1g Safranin O (Carl Roth, Karslruhe) in Ethanol abs., + 50ml dh 2 O 2% Alizarin Red für Paraffinschnitte 2% (w/v) Alizarin Red in dh 2 O ph ad 4.2 mit NH 4 OH Alcian Blau Lösung für Paraffinschnitte Alcain Blue 8GX (Sigma A-3157) 3%ige Essigsäure ph 2,5 Alcian Blau Lösung für Skelettfärbung 150 mg/l Alcian blue 8GX, Sigma A-3157 (Sigma-Aldrich, München) 20% Eisessig 80% Ethanol (98%) Alizarin Rot Lösung für Skelettfärbung 50 mg/l Alizarin red sodium sulphate, Sigma A-3757 (Sigma-Aldrich, München) 1% KOH Aufbewahrungslösung für 50% Glycerin geklärte Skelette 50% Ethanol (95%) Azophloxin 0,5 g Azophloxin (Fluka) 100ml dh 2 O 0,2 ml Eisessig Hämatoxylin A+B nach Weigert Chroma Klärlösung für Skelettfärbung 2% KOH in H 2 O Lichtgrün 0,1-0,2 g Lichtgrün SF (Chroma) 100ml dh 2 O 0,2 ml Eisessig Mayers Hämalaun Roth, Karlsruhe Methylgrün 0,5 g Methylgrün (Sigma-Aldrich) 100ml 0,1M Natriumacetatpuffer, ph 4,2 Phosphorwolfram-Orange G 3-5 g Phosphorwolframsäure (Merck) 2 g Orange G (Roth) 100ml dh 2 O Verbrauchsmaterialien Name Hersteller 1,5/2 ml Reaktionsgefäße Eppendorf AG, Hamburg 5/10/25ml Zellkulturpipetten Greiner Bio-One, Frickenhausen 6-/12-well plates TPP, Trasadingen Cryomold Einbettförmchen Sakura Finetek, Torrance, CA Discardit II Spritzen Beckton-Dickinson, Heidelberg Falcon-Reaktionsröhrchen Greiner Bio-One, Frickenhausen Feather disposable scalpel Feather, Osaka 61

72 Material und Methoden Feather microtome blades N35 Hybridisierungs-Glaskammern Microlance 3 #20 Kanülen PCR-Streifen (1x8 Gefäße), Domed Cap Strips Pipettenspitzen RNase-freie, gestopfte Pipettenspitzen Rotilab Einbettkassetten Superfrost Plus Objektträger Superfrost Plus Objektträger von Menzel Gläser Tissue-Tek O.C.T Einbettmedium Zellkulturschalen Zellschaber Feather, Osaka Clontech, Saint-Germain-en-Laye Beckton-Dickinson, Heidelberg Greiner Bio-One, Frickenhausen Sarstedt, Nümbrecht Sorenson, Salt Lake City, UT Carl Roth GmbH&Co, Karlsruhe Menzel Gläser über Carl Roth GmbH&Co, Karlsruhe Carl Roth GmbH&Co, Karlsruhe Sakura Finetek, Torrance, CA Josef Peske, Aindling-Arnhofen TPP, Trasadingen Bakterien Zur Sondenherstellung: Escherichia coli DH5_: F- enda1 hsdr17 (rk-,mk+) supe44 thi-1 _- reca1 gyra96 rela1 deor.(laczya-argf)-u169 '80dlacZ.M Bakterielle Kulturmedien und Zusätze Name Agar LB-Broth Ampicillin Hersteller Carl Roth, Karlsruhe Carl Roth, Karlsruhe Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Geräte Name Agarose-Gelelektrophoreseapparaturen AxioCam ICcI camera Axioplan2 Microscop Bakterienbrutschrank Function LINE ChemiDoc MP System CO 2 -Begasungsbrutschrank BBD 6220 Cryomicrotome CM 3050s Digitale Mikroskopkamera Axiocam icc 1 E.A.S.Y. 429K gel documentation station EcoTemp TW20 Wasserbad FLUOstar Omega microplate reader Hersteller Peqlab, Erlangen Carl Zeiss GmbH, Jena Carl Zeiss GmbH, Jena Heraeus, Hanau Bio-Rad Laboratories, Inc., München Heraeus, Hanau Leica Microsystems, Wetzlar Carl Zeiss GmbH, Jena Herolab, Wiesloch Julabo, Seelbach BMG Labtech, Ortenberg 62

73 Material und Methoden Geldokumentationsanlage Hamamatsu digital camera C Hybrisierungsofen icycler CFX für Realtime PCR Invertmikroskop Axiovert 25 LSM789 confocal laser scanning microscope LVis plates Megafuge 1.0R Zentrifuge Paraffin-Mikrotom PCR-Thermocycler Master Cycler gradient Schüttler für Bakterinkulturen Shandon Citadel 2000 Tissue Processor Stereomikroskop Stemi SV 11 Thermomixer comfort Tischzentrifugen Zentrifugen Biofuge fresco und Labofuge 400R Herolab, Wiesloch Hamamatsu Memmert, Schwabach VWR, Darmstadt Bio-Rad Laboratories, Inc., München Carl Zeiss GmbH, Jena Carl Zeiss GmbH, Jena BMG Labtech, Ortenberg Heraeus, Hanau Leica Microsystems, Wetzlar Eppendorf AG, Hamburg Infors HT, Bottmingen GMI, Ramsey Carl Zeiss GmbH, Jena Eppendorf AG, Hamburg Eppendorf AG, Hamburg Heraeus Holding GmbH, Hanau Software Name Hersteller E.A.S.Y. win32 Herolab GmbH Laborgeräte, Wiesloch BioPhotometer Eppendorf AG, Hamburg ImageLab Bio-Rad Laboratories, Inc., München Osteomeasure Osteimetrics, Inc., Decatur, GA, USA CFX Manager TM 2.0 Software Bio-Rad Laboratories, Inc., München OpenLab5.5.2 imaging Software PerkinElmer, Waltham, MA Axio Vision Version Carl Zeiss GmbH, Jena Omega-MARS data analysis software 2.10 R3 BMG Labtech, Ortenberg 63

74 Material und Methoden 6.2 Methoden Mauszucht Verpaarung der Mäuse Es wurden BACCol10a1-Cre-transgene und βcatenin fl/fl -Mäuse Mäuse vom Stamm FVB verwendet (Herstellung der BACCol10a1-Cre; βcatenin fl/fl -Mäuse siehe Einleitung Abschnitt 2.7). Die nächste Generation war entweder Cre-positiv oder Cre-negativ, enthielt aber beide gefloxtes und Wildtypallele (BACCol10a1-Cre + ; βcatenin fl/wt oder BACCol10a1-Cre - ; βcatenin fl/wt ). Die andere Strategie für die Zucht von Knockout-Mäusen war: Die beiden Elternteile sollten zwei gefloxte βcatenin-allele tragen, also Cre-positive mit βcatenin fl/fl und Cre-negative mit βcatenin fl/fl Mäuse. Damit wurde die Wahrscheinlichkeit für Knockout-Tier in einem Wurf höher. BACCol10a1-Cre-transgene Mäuse aus Founderlinien 1465 und 1421/7 wurden mit RO- SA26YFP Reporter Stamm (B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J, Prof Michael Wegner (Erlangen) und Prof. Hans-Martin Jäck (Erlangen)) verpaart. Transgene Nachkommen (BAC- Col10a1-Cre+; R26YFP+/-) wurden mit PCR identifiziert Genotypisierung der Mäuse Isolierung genomischer DNA für die Genotypisierung Bei der Präparation bzw. während der laufenden Zucht wurden den Mäusen Gewebsbiopsien zur Genotypisierung entnommen. Bei Mäusen ab dem E17,5-Stadium wurde ein Stück des Schwanzes (0,5-1cm) genommen. Zur Aufbereitung der DNA für die folgende Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde dieses Protokoll benutzt: Die Biopsien wurden ÜN bei 55 C in je 500 µl Schwanz-Lyse-Puffer mit 5 l (1:100 Verdünnung) Proteinkinase K (10 mg/ml) inkubiert. Die lysierte Probe wurde gevortext, abgekühlt und für 13 min bei RT, rpm zentrifugiert um die Haare zu pelletieren. Der Überstand (ca. 400 µl) wurde in ein frisches Reaktionsgefäß mit 500 µl 100% Isopropanol durch Kippen überführt. Die Probe wurde gemischt, ein DNA-Präzipitat wurde sichtbar. Es wurde 8 min bei RT, rpm zentrifugiert, der Überstand wurde abgenommen und verworfen. 300 µl 70% Isopropanol wurden zugegeben, anschließend wurde zentrifugiert für 8 min bei RT, rpm. Der Überstand wurde abgenommen und verworfen, das Pellet ca. 10 min bei 37 C getrocknet. Das Pellet wurde in 200 µl dh 2 O aufgenommen. 1-2 µl der Probe wurden für die PCR eingesetzt. Genotypisierungs-PCR 64

75 Material und Methoden Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde genutzt, um die in den Biopsien enthaltene DNA zu amplifizieren. Durch PCR werden DNA-Abschnitte exponentiell vermehrt. Dabei werden die gewünschten DNA-Abschnitte durch Oligonukleotidprimer (s. Material) festgelegt und die DNA mit Hilfe der Taq-Polymerase amplifiziert. Folgende PCR-Programme wurden benutzt: SGTAQ (etabliert von Dr. Sonja Gebhard, Experimentelle Medizin I, Erlangen) für Cre- und β- Catenin-PCR 94 C 4min 94 C 30sec 55 C 30sec 35x 72 C 30sec 72 C 7min 4 C R26YFP für ROSA26YFP-PCR 94 C 3min 94 C 30sec 58 C 1min 30x 72 C 50sec 72 C 2min 4 C Die Reaktionsansätze wurden nach folgendem Schema hergestellt (Einfach-Ansatz): Für Cre-, β-catenin-pcrs: aufgereinigte DNA variabel 10x PCR Puffer 2,5µl dntp-mix (je 10mM) 1,25µl Forward Primer 0,125µl Reverse Primer 0,125µl Tom-Taq-Polymerase 0,42µl H 2 O ad 25µl Cre-PCR Forward Primer: Primer 1 (=hcol10a1intrec5 ) Reverse Primer: Primer 5 (=Cre-rev =hcol10a1exon2rec3) - dient dem Nachweis der Cre-Rekombinase unter dem Col10a1-Promotor. Auf einem 1%-igen Agarose-Gel liefert sie ein 305bp großes Fragment. 65

76 Material und Methoden β-catenin-pcr Forward Primer: RM41 Reverse Primer: RM42 - dient dem Nachweis der gefloxeten βcatenin-allelen. Auf einem 2%-igen Agarose-Gel liefert sie ein 221bp großes Fragment bei zwei Wildtyp-Allelen, 324bp großes Fragment bei zwei gefloxten Allelen und zwei Fragmente bei heterozygoten Tieren. ROSA26YFP-PCR: aufgereinigte DNA variabel 10x PCR Puffer 2,0µl dntp-mix (je 10mM) 1,0 µl DMSO 1,0 µl R26 wt ,2 µl R26 wt ,2 µl R26 YFP ,2 µl Tom-Taq-Polymerase 0,4 µl H 2 O ad 20 µl - dient dem Nachweis der R26YFP-Allelen. Auf einem 1,5%-igen Agarose-Gel liefert sie ein 600bp großes Fragment bei zwei Wildtyp-Allelen, 320bp großes Fragment bei zwei mutanten Allelen und zwei Fragmente bei heterozygoten Tieren. Auftrennung von DNA im Agarose-Gel Um 1-/1,5-/2-%ige Gele herzustellen wurde die entsprechende Menge Agarosepulver in 1x E- Puffer durch kurzes Aufkochen in der Mikrowelle gelöst. Nach Abkühlung auf ca. 55 C wurde die Lösung mit Ethidiumbromid (Carl Roth, Karlsruhe) zu einer Endkonzentration von 0,6µg/ml (entsprechend 6µl einer 10mg/ml Ethidiumbromid-Lösung auf 100ml Agarose-Gel) versetzt. Die DNA-Proben wurden mit 20% v/v Probenpuffer gemischt und mit dem 1 kb DNA-Standard (Invitrogen) auf das Gel aufgetragen. Der Gellauf erfolgte in 1x E-Puffer bei 110 V und wurde mit der Agarosegel-Dokumentation E.A.S.Y. 429K (Herolab), später mit ChemiDoc MP Imaging System (BioRad) und den dazugehörigen Softwares E.A.S.Y. win32 bzw. ImageLab ausgewertet Präparative Methoden Präparation von Mäusen Im Zeitraum dieser Arbeit wurden Mäusen in den postnatalen Altersstadien P1, P2, P5 und P16 sowie im embryonalen Stadium E18,5 präpariert. 66

77 Material und Methoden Für die Präparation wurden adulte Mäuse durch CO2, neugeborene Mäuse durch Chloroform getötet. Die Haut wurde entfernt. Für Skelettfärbungen wurden die Knochenelemente so weit wie möglich freipräpariert, zur Paraffinbettung wurde Muskelgewebe an dem Skelettelement belassen. Embryonen wurden aus dem Uterus und aus den embryonalen Hüllen präpariert und in PBS gewaschen. Embryonen in E18,5 Stadium wurde einzelne Skelettelemente präpariert. In Vorbereitung auf histologische Verfahren wurden präparierte Elemente in 4% Paraformaldehyd in PBS übernacht fixiert Alcianblau/Alizarinrot Skelettfärbung Zur Färbung der präparierten Mausskelette bzw. Skelettelemente wurde eine Alcian Blau/Alizarin Rot Färbung durchgeführt, wobei Alcian Blau Proteoglykane des Knorpel blau und Alizarin Rot kalzifizierte Bereiche und damit den Knochen rot färbt. Durch die Färbung lassen sich zum einen Knochen und Knorpel darstellen, zum anderen wird das um das Skelett übrige Gewebe weiter entfernt und geklärt. Dadurch ist ein sehr feine Präparation und Darstellung des Skeletts möglich. Die Skelettelemente wurden weitmöglichst freipräpariert und zunächst ÜN in Ethanol (95%) bei RT auf der Wippe fixiert. Der Ethanol wurde abgesaugt, die Skelettelemente ebenso ÜN in Alcian Blau-Lösung gefärbt. Im Anschluss daran wurden es nach einer mindestens dreistündigen Ethanolwaschung (95%) für einen weiteren Tag in 2% KOH auf der Wippe geklärt. Größere Skelettelemente wurden je nach Bedarf länger geklärt, bis das Gewebe ausreichend durchsichtig erschien. Bei Bedarf wurde überschüssiges Gewebe vorsichtig entfernt und ÜN bei RT auf der Wippe mit Alizarin Rot gefärbt, bei Bedarf bei großen Skelettelementen auch länger. Es folgte ein Klärung der Skelettelemente in 1% KOH/20%Glycerol für mindestens zwei Tage, bei Bedarf vorher eine zusätzliche Klärung in 2% KOH. Die gefärbten Skelettelemente wurde in einer 1:1-Mischung aus Glycerol/95% Ethanol bei RT gelagert MikroCT-Analyse Die MikroCT-Bilder von Maustibien wurden mit Hilfe der Cone-Beam MicroCT Scanner in Institut für Medizinphysik, FAU Erlangen gemacht [87] Histologische Methoden Herstellung von Paraffinschnitten Skelettelemente wurden nach der Präparation in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS über Nacht bei 4 C auf der Wippe fixiert. Mäuse ab dem P3-Stadium wurden nach der Fixierung mit 0,5 M 67

78 Material und Methoden EDTA entkalkt (junge Mäuse entsprechend ihres Alters ähnlich lang, 16 Tage alte Mäuse ca. 4 Wochen). Am nächsten Tag wurden sie 3 x 15min in PBS bei 4 C auf der Wippe gewaschen. Anschließend wurden sie in einer aufsteigenden Ethanolreihe (1 h 50% Ethanol, 1 h 80% Ethanol, 1 h 80% Ethanol, 24 h 100% Ethanol) bei 4 C auf der Wippe dehydriert. Des Weiteren wurden sie bei RT 1 h mit einem 1:1 Ethanol/Xylol-Gemisch und 1 h mit 100% Xylol behandelt. Es folgte eine Inkubation über Nacht in Paraffin bei 60 C bevor die Gewebe in Paraffin eingebettet wurden. Alternativ wurde aufsteigende Ethanolreihe und Infiltrierung mit Paraffin mit dem automatischen Einbettungsgerät Citadelle (GMI) mit folgendem Programm durchgeführt: Lösung Temperatur Dauer 80% EtOH RT 1 h 96% EtOH RT 1 h 96% EtOH RT 1 h 100% Isopropanol RT 1 h 100% Isopropanol RT 2 h 100% Xylol RT 1 h 100% Xylol RT 2,2 h 100% Paraffin 60 C 3 h 100% Paraffin 60 C 2 h Das in Paraffin eingebettete Gewebe wurde bis zur Verwendung bei 4 C gelagert. Mit dem Paraffin-Mikrotom wurden 6 μm dicke Schnitte angefertigt, auf Superfrost Plus Objektträger (Roth) aufgebracht und bis zur weiteren Verwendung bei 4 C gelagert. Da die in situ Hybridisierung in manchen Fällen schwache Signale lieferte, was an mangelnder Fixierung der RNA oder Abbau dieser durch RNAsen liegen könnte, wurden speziell RNAse-frei hergestellte Lösungen verwendet Herstellung von Kryoschnitten Gewebeproben wurden in Cryomold Formen mit Tissue-Tek O.C.T Medium (Sakura) eingebettet und auf Trockeneis gelegt. Die Blöcke wurden bei -80 C gelagert und mit dem Kryotom 6-7 µm dick geschnitten Rehydrierung von Paraffinschnitten Für die histologischen Färbmethoden, Immunhistochemie und in situ Hybridisierung wurden die Paraffinschnitte nach folgendem Protokoll rehydriert: Lösung Xylol 100%EtOH Dauer 2x 10 min 2x 5 min 68

79 Material und Methoden EtOH-Reihe (95 %, 90 %, 80 %, 70 %, 50 %, 30 %) dh 2 O oder PBS je 2 min 5 min Färbungen von Gewebeschnitten Alcianblau Färbung Mit Alcian Blau lassen sich saure Glykosaminoglykane anfärben, die Färbung dient somit zum Nachweis von Knorpelmatrix. Die Paraffinschnitte wurden durch eine absteigende Alkoholreihe deparaffiniert und rehydriert (s.o.). Die Färbung in Alcian Blau-Lösung erfolgte für 30 min, danach wurde unter laufendem Leitungswasser für 2 min gewaschen. Die Gegenfärbung der Zellkerne erfolgte mit Eosin 1-2s mit anschließendem Waschen mit Leitungswasser für 30s. Es wurde eine aufsteigende Alkoholreihe angeschlossen (1 x 2 min 30% Ethanol, 1 x 2 min 50% Ethanol, 1 x 5 min 80% Ethanol, 1 x 5 min 90% Ethanol, 1 x 5 min 100% Ethanol, 2 x 10 min Histol) und mit Roti-Histo-Kit eingedeckelt. Für die Alcian Blau-Färbung von Kryoschnitten wurde Protokoll von Cohen, M et al., 2012 optimiert. Zuerst wurden die Schnitte bei -20 C in Methanol für 20 min fixiert.nach dem Waschen in PBS für 10 min bei RT folgten ein Spülgang in dh 2 O und anschließende Inkubaion in 1% Essigsäure für 5 min. Danach wurden die Schnitte in Alcian Blau Lösung für 30 min gefärbt und unter laufendem Leitungswasser für 10 min gewaschen. Die Dehydrierung und Eindeckeln erfolgte wie bei den Paraffinschnitten. Alizarinrot-Färbung Mit Alizarinrot Färbung werden die kalzifizierten Bereiche der Knochen sichtbar (rot). Nach der Rehydrierung wurden die Schnitte in Alizarin rot/h 2 O-Lösung (2% ph 4,1 4,3 von Nicole Eitzinger) 1x kurz eingetaucht, danach wurden unter laufendem Leitungswasser für 2 min gewaschen. Es wurde eine aufsteigende Alkoholreihe angeschlossen (1 x 2 min 30% Ethanol, 1 x 2 min 50% Ethanol, 1 x 5 min 80% Ethanol, 1 x 5 min 90% Ethanol, 1 x 5 min 100% Ethanol, 2 x 10 min Histol) und mit Roti-Histo-Kit eingedeckelt. Oder nach dem Protokoll von Nicole Eitzinger erfolgte die Entfärbung in Aceton für 2 min, danach in Aceton/Xylol (1:1): 20x Dippen und anschließend in Xylol (oder Histol) für 10 min und Eindeckelung mit Roti-Histo-Kit. TRAP-Färbung Die TRAP-Färbung dient dem Nachweis des Osteoklasten-spezifischen Enzyms Tartratresistente saure Phosphatase. Es wurde das Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP)-Kit von Sigma-Aldrich verwendet. Die Schnitte wurden zuerst rehydriert. Währenddessen wurden 45 ml dh 2 O im Wasserbad auf 37 C in der Küvette vorgewärmt, eine Mischung aus 0,5 ml Naphtol AS-BI-Phosporsäure, 2ml Acetat-Lösung und 1 ml 0,335 mol ph 5,0 Tartratlösung wurden di- 69

80 Material und Methoden rekt hinzugegeben. Die Inkubation erfolgte 1 h im Wasserbad bei 37 C im Dunkeln. Eine Mischung aus 0,5 ml 0,2 M Natrium-Acetatlösung, ph 5,0, 0,5 ml Natriumnitritlösung und 1,1 mg/ml Fast Red TR Salz wurde 2 min vor Gebrauch angesetzt, direkt zu den Schnitten in die Küvette gegeben und für 5-10 min bei 37 C inkubiert. Die Schnitte wurde mit dh 2 O gewaschen und die Zellkerne mit Mayers Hämalaun (1:5 verdünnt in H 2 O) für sec gegengefärbt. Es wurde unter laufendem Leitungswasser 10 min gewaschen und mit Aquatex eingedeckelt Safranin O-Färbung mit Methylgrün-Gegenfärbung Zur Anfärbung der Proteoglycane in der extrazellulären Knorpelmatrix wurden die Paraffinschnitte rehydriert und anschließend für 15 s in 1% Essigsäure gewaschen. Die Färbung in 0,1% SafraninO Lösung erfolgte direkt im Anschluss für 5 min. Danach wurde die Schnitte mit dh 2 O gewaschen. Es folgte die Gegenfärung mit Methylgrün für 5 min. Eine Abfolge von 2x 95% Ethanol, 2x 100% Ethanol und 2x 100% Xylol für je 2 min diente der Entfärbung und Dehydrierung. Die Schnitte wurden mit Roti Histokitt eingedeckelt. Masson-Goldner-Trichrom-Färbung Diese Färbmethode erzeugt grüne Bindegewebe und Knochen (Proteinfasern), blassrote Muskeln, leuchtend rote Erythrocyten, oranges Zytoplasma und blau-schwarze Zelkerne. Nach der Rehydrierung wurden die Schnitte zuerst mit Weigerts Hämatoxylin für 2 min gefärbt und anschließend mit fließendem Leitungswasser gewaschen. Die nächste Lösung war Azophloxin für 15 min und danach wurde in 1% Essigsäure gespült. Danach wurden die Schnitte für 3-5 min in Phosphorwolfram-Orange G-Lösung eingestellt. Hier war die mikroskopische Kontrolle nötig, damit die Färbung nicht zu stark wurde. Nach dem nächsten Spülen in 1% Essigsäure folgte der nächste Färbeschritt mit Lichtgrün für 3 min. Danach wurde wieder mit 1% Essigsäure gespült und anschließend dehydriert und mit Roti-HistoKit eingedeckelt Immunhistochemie und Immunfluoreszenz auf Gewebeschnitten Um β-catenin, Collagen I, RANKL, Osterix, YFP und PECAM auf Proteinebene nachzuweisen, wurde Immunhistochemie bzw. Immunofluoreszenz für einfache oder Doppelmarkierung durchgeführt. Die Paraffinschnitte wurden durch eine absteigende Alkoholreihe (Xylol Ethanol) deparaffiniert und rehydriert und die Kryoschnitte wurden mit Methanol (20 min bei -20 C) fixiert. Die Antigen-Demaskierung wurde abhängig von der Art des nachzuweisenden Antigens und der Detektionsmethode nach folgendem Schema durchgeführt: Antigen Lösung 1 Dauer, T Waschen Lösung 2 Dauer, T Kollagen I 0,25M EDTA, 30 min/ RT IHC ph 8 10mM Citratpuffer, ph 6 20min/ 70 C im Wasserbad, abkühlen 20 min/rt PBS, 5 min/ RT 70

81 Material und Methoden Kollagen I IFL β-catenin IHC PECAM IFL 0,25M EDTA, ph 8 10mM Citratpuffer, ph 6 0,25M EDTA, ph 8 YFP IFL 0,25M EDTA, ph 8 RANKL IHC 10mM Citratpuffer, ph 6 Osterix IFL 0,25M EDTA, ph 8 30 min/ RT PBS, 5 min/ RT 20min/ 70 C im Wasserbad, abkühlen 20 min/rt PBS, 5 min/ RT 30 min/ RT PBS, 5 min/ RT 30 min/ RT PBS, 5 min/ RT 20min/ 70 C im Wasserbad, abkühlen 20 min/rt PBS, 5 min/ RT 30 min/ RT PBS, 5 min/ RT 1 mg/ml Hyaluronidase 1 mg/ml Hyaluronidase 1 mg/ml Hyaluronidase 0,3% H 2 O 2 in PBS 1 mg/ml Hyaluronidase 20 min/ RT 20 min/ RT 20 min/ RT 30 min/ RT 20 min/ RT Überschüssiges PBS wurde vorsichtig entfernt, die Objekte mit Pap-Pen umrandet. Die Blockierung der unspezifischen Bindestellen erfolgte mit 1% BSA/PBS (evtl. mit Levamisol 1:100, wenn mit AP-Substrat gefärbt) für 30 min./rt. Die Inkubation mit den anti-βcatenin (1:500)-, anti-collagen I (1:1000)-, anti-rankl (10µg/ml)- und anti-osterix (1:200)-Antikörpern erfolgte bei der Immunhistochemie mit der einfachen Markierung oder bei der Immunfluoreszenz übernacht bei 4 C. Bei der immunhistochemischen Doppelmarkierung wurden die Schnitte mit primärem Antikörper für 1-2 h bei 37 C inkubiert. Anschließend wurde 5 x 3min in PBS gewaschen. Die Inkubation mit den entsprechenden sekundären Antiköpern erfolgte je nach Methode 30 min 1 h bei RT, anschließend wurde 3 x 5 min mit PBS gewaschen. Dieser sekundäre Antikörper erkennt den Primärantikörper. Danach erfolgte bei der immunhistochemischen Färbung die Inkubation entweder mit Alkalische Phosphatase- Streptavidin-Konjugat in Common Antibody Diluent (BioGenex, Hamburg) oder Elite ABC Reagent (Vector Lab.) (hier Peroxidase: Vorbehandlung mit 3% H 2 O 2 in PBS für 5 min notwendig) für 30 min bei RT, anschließend wurde 3 x 5 min mit PBS gewaschen. Dieses Antikörperfragment und kann durch eine enzymatische Reaktion des entsprechenden Enzyms sichtbar gemacht werden. Die Inkubation mit dem Substrat der Alkalische Phosphatase (Fast Red Tabletten, Sigma-Aldrich oder Vector Blue, Vector Lab.) erfolgte ca.10 min bei RT, mit dem Substrat für Peroxidase (AEC, Vector Lab.) ca. 20 min, RT, anschließend wurde bei der Detektion mit AP 10 min mit dh 2 O gewaschen und mit Kaiser s Glyceringelatine/Merck eingedeckelt und bei der Detektion mit Peroxidase mit PBS und mit Leitungswasser gewaschen und mit Aquatex eingedeckelt. Bei der Immunfluoreszenz folgte nach dem entsprechenden fluorochrommarkierten sekundären Antikörper die Inkubation mit Hoechst (1-2mg/ml) für die Zelkernfärbung (10 min). Danach wurde 3 x 5 min mit PBS gewaschen und mit Elvanol eingedeckelt. Bei der immunhistochemischen Doppelmarkierung wurde am ersten 71

82 Material und Methoden Tag ein Antigen markiert und gefärbt und am zweiten Tag folgte die Detektion von dem anderen Antigen. Übernacht wurden die Schnitte bei 4 C in PBS gelagert RNA-in situ Hybridisierung Mit der RNA-in situ Hybridisierung (ISH) lässt sich mrna spezifisch im Gewebe nachweisen und damit das Genexpressionsmuster analysieren. Das Prinzip ist, dass eine bei Expression in den Zellen vorhandenen mrna mit einer komplementären RNA-Sonde hybridisiert. Diese RNA-Sonde enthält markierte Nukleotide, die mittels eines Antikörpers detektiert werden können. Der Antikörper ist mit Alkalischer Phosphatase gekoppelt und kann ein zugegebenes Substrat umsetzten. Dadurch kommt es zu einer Farbreaktion, die die Lokalisation des mrna Sonden-Hybrides anzeigt. Von entscheidender Bedeutung sind damit die Fixierung der RNA, die Sonde und Bedingungen, die eine spezifische Hybridisierung gewährleisten Herstellung von RNA-Sonden für die RNA-in situ Hybridisierung Für die in situ Hybridisierungen wurden bereits in der Arbeitsgruppe vorhandene Sonden (bereitgestellt von Cordula Surmann-Schmitt, Michael Stock und Britta Schlund) sowie selbst hergestellte Sonden verwendet. Die dazu genutzten Vektoren wurden ebenfalls freundlicherweise von Mitgliedern der Arbeitsgruppe bzw. von Kooperationspartnern zur Verfügung gestellt. Aus ihnen wurden durch in vitro-transkription die spezifischen Sonden generiert. Eine Übersicht über die verwendeten Sonden und ihre jeweilige Herstellung bzw. Herkunft befindet sich im Anhang. Transformation der Bakterien (Hitzeschock-Methode) Für jede Ligationsreaktion wurde je ein Gefäß mit DH5α kompetenten Zellen auf Eis aufgetaut und je 1 l Klonierungsreaktion zu jedem Gefäß mit kompetenten Bakterien zugegeben und gemischt. Danach folgte die Inkubation auf Eis für 20 min. Währenddessen wurde entsprechendes Volumen von LB-Medium auf 42 C vorgewärmt. Die Bakterien wurden mittels Hitzeschocks bei 42 C für 45 sec transformiert und danach für 2 min auf Eis inkubiert. 250 l vorgewärmtes LB-Medium wurde zu Bakterien zugegeben. Die Bakterien wurden für 1 Stunde bei 37 C inkubiert (Schüttler). Je 20 l des Ansatzes wurden auf je eine LB-Platte (amp) ausplattiert, der Rest auf andere Platte und übernacht bei 37 C im Brutschrank inkubiert. Am nächsten Tag wurden Mini-Kulturen angeimpft: 3 ml LB-Medium + eine Kolonie, Inkubation ün bei 37 C (Schüttler). Anschließend erfolgte Minipräp-Aufreinigung mit Qiagen Kit für Plasmidisolierung. Die Minipräp s wurden mit EcoRI-HF (zur Kontrolle) verdaut (bei 37 C für 1 Stunde) und mit Gelelektrophorese kontrolliert (1% Agarosegel, 105 V, 30 min) 72

83 Material und Methoden Verdauansatz V 10 µl MP-DNA 1 µl Enzym 0,5 µl 10xPuffer 1 µl H 2 O 7,5 µl Sequenzierung Um festzustellen, ob es ein richteges PCR-Produkt kloniert wurde, erfolgte eine Sequezierung von Minipräp-DNA-Ansätzen Sequezieransatz in l V 10 MP-DNA 2 Big Dye 2 Primer 1:20 verdünnt (T7) 1 H 2 O 5 Das Programm lief ün: - 96 C 3 min - 30 Zyklen: o 96 C 20 sec o 50 C 30 sec o 60 C 4 min - 8 C Am nächsten Tag erfolgte die Fällung der Sequezieransätze: Zu jedem 10 l-ansatz wurde 90 l reines Wasser zugegeben und der Ansatz wurde in steriles Eppendorfcap überführt, danach wurden 10 l 3M Na-Acetat ph 4,8, 250 l eiskalter 100% E- toh zugegeben und der Ansatz wurde bei rpm, 4 C für 30 min zentrifugiert. Überstand wurde abpipettiert und das Pellet mit eiskaltem 70% EtOH gewaschen und bei rpm, 4 C für 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde bei 37 C ca. 2 min getrocknet und in 15 l HiDi Puffer resuspendiert. Die Sequenzieransätze wurden in den beschrifteten Caps bei Birgit Saffer (NFZ, 2. Stock) abgegeben. Wenn die Sequenzierung erfolgreich war, wurden Midi-Kulturen angeimpft: 50 ml LBAmp- Medium (50 Ampicillin) in 250 ml-kolben, mit 100 l Mini-Kultur, und ün bei 37 C inkubiert (Schüttler, 220 rpm). Am nächsten Tag erfolgte die Aufreinigung mit Qiagen Kit (Midi- Präp) Plasmid-Isolierung Zur Vermehrung von Vektoren zur Sondenherstellung für die ISH wurden die Plasmide durch Retransformationen in Bakterien (DH5α kompetente) vermehrt und aufgereinigt. Zur schnellen 73

84 Material und Methoden Isolierung kleiner Mengen Plasmid-DNA wurde das Minipräp-Plasmidisolierungskit von Qiagen verwendet. Die Plasmid-Isolierung beruht auf der alkalischen Lyse von Bakterien und der nachfolgende Denaturierung aller Nukleinsäuren. Schließlich erfahren nur kleine Nukleinsäuren (Plasmide) eine komplette Renaturierung. E.coli-Übernachtkultur wurde durch Zentrifugation pelletiert und in Puffer P1 (50 mm Tris, 10 mm Na-EDTA, 100 µg/ml RNaseA, ph 8,0) resuspendiert. Durch Zugabe von Lysepuffer P2 (200 mm NaOH, 1 % SDS) wurden die Bakterien aufgeschlossen und die Nukleinsäuren denaturiert. Die Renaturierung kleiner Nukleinsäuren erfolgte durch Zugabe von Neutralisierungspuffer P3 (3 M K-Acetat, ph 5,5). Eine anschließende Zentrifugation führte zur Trennung der Plasmid- DNA von unlöslichen Zellbestandteilen. Der plasmidhaltige Überstand wurde auf eine Säule aufgetragen an deren Silikatmembran die DNA selektiv bindet. Die gebundene DNA wurde mit Waschpuffer-PE gewaschen und anschließend mit H 2 O eluiert. Die Mini-DNA konnte gleich weiterverwendet werden oder wurde bis zur Verwendung bei -20 C gelagert. Für größere Ansätze wurde entsprechende eine Midi-Präparation durchgeführt. DNA-Gehalt und Reinheit wurden photometrisch bei 260 bzw.280 nm gemessen (Photometer BioPhotometer Eppendorf). Reine DNA sollte einen od260/od280-quotienten von etwa 2,0 besitzen. Dazu wurde die DNA verdünnt (1/50-1/100) und in eine Küvette gefüllt. Als Nullwert wurde das Diluent verwendet. Linearisierung Es wurden jeweils Antisense-Sonden (sollten mit der mrna hybridisieren, Signal in ISH) und zur Kontrolle Sense-Sonden (sollten nicht mit der mrna hybridisieren, kein Signal in ISH) hergestellt. Das Plasmid wurde zunächst mit dem jeweiligen Restriktionsenzym über Nacht linearisiert. Dazu wurden jeweils 10 µg DNA mit 4 µl Restriktionsenzym, 10 µl des entsprechenden 10xPuffers und je nach Enzym 1% BSA, aufgefüllt mit Wasser auf 100 µl und ÜN bei 37 C im Bakterienbrutschrank inkubiert. Die erfolgreiche Linearisierung wurde auf einem 1%igen Agarose-Gel mit jeweils 5 µl des Restriktionsansatzes kontrolliert. Zur Entfernung von Proteinverunreinigungen wurde die DNA mit Hilfe des QIAquick PCR Purification-Kits nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt. Dabei wurde der Ansatz auf Aufreinigungssäulchen gegeben, gewaschen und mit 30 µl dh 2 O eluiert. In vitro Transkription Im Anschluss daran wurde die RNA mit der entsprechenden RNA-Polymerase in vitro transkribiert. Dazu wurden 1 μg linearisierte, aufgereinigte DNA, 2 μl 10xTranskriptionspuffer, 2 μl RNA-Polymerase, 1 μl RNasin (RNAse-Inhibitor) und 2 μl Digoxigenin-markierte dntps (Roche, Mannheim) mit RNase-freiem Wasser auf 20 μl aufgefüllt und 2 h bei 37 C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz mit 1 μl trna (1mg/ml; Roche, Mannheim), 7μl 7,5M Ammoniumacetat und 75μl 100% EtOH versetzt und über Nacht bei -20 C gefällt. Am nächsten Tag wurde nach 20-minütiger Zentrifugation (RT, 13000rpm) das Pellet in 70% EtOH gewaschen, 2 min 74

85 Material und Methoden bei 37 C getrocknet und in 100 μl RNase-freiem H 2 O aufgenommen. Die Sonden wurden bei - 20 C gelagert. Auftrennung von RNA im Agarose/Formaldehyd-Gel Zur Kontrolle hergestellter RNA-Sonden für die in situ Hybridisierung wurde RNA- Gelelektrophorese durchgeführt. Um Verunreinigungen mit RNasen zu verhindern, wurde die Gelkammer min mit 2 M NaOH vorbehandelt. Für ein großes Gel wurde 1 g Agarose in 90 ml RNase-freiem Wasser aufgekocht. Nach Abkühlung wurde evt. verdampftes Wasser nachgefüllt, 5 ml 20xMOPS, 5 ml Formaldehyd und 10 µl Ethidiumbromid zugegeben und sofort gegossen. Die RNA-Proben wurden mit der dreifachen Menge an RNA-Probenpuffer (5 ml Formamid, 1,67 ml Formaldehyd, 0,5 ml 20 MOPS, 2,8 ml Wasser und Bromphenolblau) vermischt, bei 65 C für 15 min denaturiert, abzentrifugiert und aufgetragen. Der Lauf erfolgte in 1xMOPS, zusätzlich wurden in die untere Laufkammer 24 µl Ethidiumbromid gegeben. Das Gel lief ca. 3 h bei 40 V und wurde in der Agarosegel-Dokumentation E.A.S.Y. 429K und die Software E.A.S.Y. win32 von Herolab ausgewertet Ablauf der in situ Hybridisierung Die Paraffinschnitte wurden zunächst wie unten angegeben bei Raumtemperatur vorbehandelt. Dabei war mit größtmöglicher Vorsicht darauf zu achten, dass RNAse-frei gearbeitet wird. Die jeweiligen Lösungen wurden unter speziellen RNAse-freien Bedingungen mit nur dafür genutzten Reagenzien hergestellt. Lösung Dauer Xylol 2 x 10min 100% EtOH 2 x 5min Ethanol -Reihe(95%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30%) je 2min 1 x PBS 2 x 5min 4% PFA in PBS 30min Proteinase K in Proteinase K-Puffer 10min (10μg/ml in 20mM Tris/HCl, 1mM EDTA ph 7,2) 1 x PBS 5min 4% PFA in PBS 30min 1 x PBS 2 x 5min 2 x SSC 2 x 5min Tris/Glycin Puffer 15min Anschließend wurden die Schnitte in Atlas Hybridisierungs-Glaskammern (Clontech) mit 1,8ml Hybridisierungspuffer (s. Material) für 3 h bei 55 C prähybridisiert. Für die nachfolgende Hybridisierung wurden 150 μl Hybridisierungspuffer mit 5 μl RNA-Sonde gemischt und bei 80 C für 5 min denaturiert. Danach wurde die Sonden-Lösung in die Atlas Hybridisierungskammer pipet- 75

86 Material und Methoden tiert und mehrmals invertiert. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 55 C. Sonden die in der ISH ein schwaches Signal zeigten wurden alternativ bei 50 C hybridisiert und in höherer Konzentration eingesetzt (10 µl). Am nächsten Tag wurde die Hybridisierungsmischung entfernt und die Gewebeschnitte für die Detektion mit dem Antikörper vorbereitet. Folgende Waschschritte wurden durchgeführt: Lösung Dauer Temperatur 2xSSC 2 x 20min RT 2xSSC 20min 50 C 1xSSC 20min 55 C 1xSSC 20min 60 C 1xSSC 10min RT 1 x NTE 15min 37 C 10μg/ml RNase A in 1x NTE 30min 37 C 1 x NTE 15min 37 C 2xSSC waschen RT 2xSSC 60min 50 C 1xSSC kurz waschen 55 C 1xSSC 60min 55 C 1xSSC 60min 60 C 1xSSC 30min RT 10% Blocklösung in MABT 60min RT Zum Nachweis der Digoxigenin-markierten RNA-Sonden wurden die Schnitte mit anti-dig-fab fragments, d.h. Antikörperfragmenten gegen die Digoxigenin-markierten, hybridisierten Sonden, inkubiert. Dazu wurden an den Enden der Objektträger kleine Knetgummikugeln angebracht, die als Abstandshalter für die Deckgläser dienten. Zwischen die beiden Gläser wurde anti-dig-fab fragments -Lösung (1:5000 in 1% Blocklösung verdünnt) aufgetragen und ÜN bei 4 C inkubiert. Am darauf folgenden Tag wurden die Deckgläser entfernt und die Schnitte 4 x 10 min und 1 x 20 min in TBST und 3 x 10 min in NTM gewaschen. Die Schnitte wurden wieder mit Deckgläsern versehen und mit einer Farbelösung aus BM-Purple (Farbsubstrat für die Alkalische Phosphatase, Levamisole (Hemmung der endogenen Alkalischen Phosphatase des Knorpels), Tween-20 (Detergenz) gefärbt. Die Schnitte wurden je nach Sonde und Expressionsstärke des Gens bis zu 7 Tage im Dunkeln inkubiert, wobei verdunstete Färbelösung aufgefüllt wurde. Zum Abstoppen wurden die Deckgläser entfernt, die Schnitte 3 x 10 min in PBS gewaschen und mit Kaisers Glyceringelatine eingedeckelt. Um das jeweilige Expressionsmuster auf Wildtypund transgenem Schnitt vergleichen zu können wurden die jeweiligen Paare nach gleicher Entwicklungszeit abgestoppt. Das Ergebnis wurde unter dem Mikroskop betrachtet und fotografiert. 76

87 Material und Methoden Bakterien- und Zellkulturmethoden Allgemeine Bedingungen für bakterielle Kulturen Bakterien wurden in LB Medium als Suspension oder auf LB-Agar Platten (100µg/ml Ampicillin) bei 37 C kultiviert. LB Medium: 25 g LB-Broth (Carl Roth) in 1l dh 2 O lösen und autoklavieren LB-Agar Platte: 1,5% Agar in LB Medium autoklavieren, bis ca. 60 C kühlern, 100µg/ml Ampicillin zugeben und in Petri-Schalen gießen, bei 4 C lagern Kompetente DH5α Bakterien Escherichia coli DH5α: F- enda1 hsdr17 (rk-,mk+) supe44 thi-1 λ-reca1 gyra96 rela1 deor.(laczya-argf)-u169 φ80dlacz.m15 Um kompetente Bakterien herzustellen, wurd zuerst SOB-Medium in Fehrenbachkolben und FCB angesetzt. SOB-Medium: 2% Trypton 4 g 0,5% Hefe 1 g 10mM NaCl 2 ml 1M NaCl-Lösung Mit Milli Q H 2 O ad 200ml, autoklavieren 2,5mM KCl 0,5 ml 1M KCl-Lösung 10mM MgCl2 2 ml 1M MgCl2-Lösung 10mM MgSO4 2 ml 1M MgSO4-Lösung FCB: 0,5 ml 1m K-Acetat 5 ml 1m KCl 2,25 ml 1M MnCl2 0,5 ml 1M CaCl2 1,5 ml 0,1M Hexamine CoCl3 (Sigma) 5 ml 100% Glycerol Mit Mit Milli Q H 2 O ad 50ml, sterilfiltrieren Kultur wurde in 200ml + 12 ml 5 M NaCl angeimpft und übernacht bei RT schwenken gelasse (bis OD600 ca. 0,6). Bakterien wurden in sterilen Falcons abgefüllt und für 10 min auf Eis gestellt. Danach wurde 10 min bei 4 C und 3300rpm zentrifugiert. Überstand wurde abgekippt und das pellet in 20 ml eiskaltem FCB resuspendiert. Zellen wurden dann für 15 min auf Eis gelegt. Danach wurde 700 µl DMSO unter Schütteln langsam zugegeben und dann 10 min auf Eis inku- 77

88 Material und Methoden biert. 700 µl DMSO wurde nochmal unter Schütteln langsam zugegeben und 5 min auf Eis inkubiert. Bakterien wurden á 500µl im Trockeneis/EtOH-Bad aliquotiert und bei -70 C gelagert Isolation von hypertrophen Chondrocyten Vollständige vordere und hintere Extremitäten von P5 Mäusen wurden frei präparieren (Muskel und Haut soweit wie möglich entfernen). Bei Wildtyp und Knockout Mäusen, gemischte Würfe mit wt littermates wurden Knorpel und Chondrocyten getrennt für jede Maus präpariert. Epiphysenknorpel von Humerus, Radius und Ulna sowie von Femur, Tibia und Fibula sauber freilegen (in Petrischalen auf sterilem Whatman-Papier). Epiphysen wurden mit feinem Messer and der Grenze zum hypertrophen Knorpel abgeschnitten; danach wurde der hypertrophe Knorpel zusammen mit der Knochenmanschette durchgeschnitten. Der hypertrophen Knorpel wurde aus der Knochenmanschette herausgenommen und in 6 Well plates mit DMEM transferiert. Der Knorpel wurde unter dem Stereomikroskop auf Reinheit geprüft, mit kurzer Pasteurpipette in 5 ml Falcontube transferiert. DMEM wurde mit Pasteurpipette abgezogen, Trypsin (1mg/ml in sterilem PBS, 5 ml/10 Embryonen) dazugegeben, ca. 20 min bei 37 C im Schüttler im Brutschrank inkubiert. Nach der Inkubation wurde Trypsin mit Pipette vorsichtig abgezogen, mit 5 ml Kollagenase- Lösung (Clostridium Coll.) 1mg/ml in DMEM/Ham s/f12 mit 5% FCS) für ca. 90 min bei 37 C langsam geschüttelt. Dissoziation der noch nicht aufgelösten Knorpelstücke durch mehrmaliges Aufziehen mit einer 10ml Pipette. Knochenreste sammelten sich am Boden, Chondrocyten wurden im Überstand mit Pasteurpipette abgezogen und in neues 15 ml Falcontube transferiert. Zellzahl wurde im Überstand in der Neubauer Zählkammer gezählt. Danach erfolgte die Zentrifugation der Chondrocyten (1.200 rpm, 5 min). Der Überstand wurde abgesaugt und verworfen, Zellpellet entsprechend der Zellzahl (in DMEM/Ham s/f12 mit 10% FCS und Penicillin/Streptomycin supendiert: 105-5x105 in 6-well Plate. Für RNA Isolierung: Die Zellen wurden 24h im Zellkulturbrutschrank bei 37 C kultiviert, die Reinheit der Primärkulturen unter dem Mikroskop kontrolliert, fotographiert. Wenn alle Chondrocyten angewachsen sind (Knochemarkszellen haften nicht an!) Medium absaugen, die Zellen 2x mit frischem RNAse-freiem PBS waschen, 350µl RLT-Puffer /well dazugeben, mittels Zellschaber sorgfältig von der Unterlage lösen, in RNAse freie Eppendorf- Reaktionsgefäße überführen und bis zur RNA-Isolierung bei -70 C lagern C6 und 4H4 Zelllinien 4C6 und 4H4 Zellen sind Subklone der chondrogenen murinen Zelllinie MC615. Diese Subklone weisen die Anzeichen der Chondrocytendifferenzierung sowie Col2a1- und Col10a1-Expression als auch die Bildung von Kondensationen [86]. Deswegen wurden sie für die Inaktivierung des β-cateningens (ctnnb1) in vitro mit Hilfe der sirna-methode ausgewählt. 78

89 Material und Methoden Kultivierung und Differenzierung 4C6 und 4H4 Zellkulturen wurden im normalen Medium (1:1 DMEM/F12, 10% FCS, 0.5% Pen/Strep) bis zur Konfluenz kultiviert. Danach folgte die Inkubation mit dem Differenzierungsmedium (normales Medium mit 10mM β-glycerophosphat und 50 µg/ml Natrium- Ascorbatphosphat) für 2 Wochen. Zwei 10cm-Schalen mit 4C6 und 4H4 Zellen wurde 1:4 mit Trypsin-EDTA und 1 mg/ml Collagenase gesplittert und übernacht mit dem Differenzierungsmedium inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellkulturen auf 6-well-Schalen gesplittert (4C6: 8.2x104 Zellen/well; 4H4: 7.5x104 Zellen/well) und mit dem normalen Medium ohne Pen/Strep bis 80% Konfluenz kultiviert. sirna-versuch Ctnnb1- und Kontrolle-siRNA (Ambion, Life Technologies): Silencer Select pre-designed sirna; Sequenz (5 3 ): sense: CACUUGCAAUAAUUACAAAtt; antisense: UUUGUAAUU- AUUGCAAGUGag. Die Transfektion von Zellen mit ctnnb1-sirna erfolgte nach dem Herstellerprotokoll. Die Transfektionslösungen wurden nach dem folgenden rezept zubereitet: Lösung A: 15 µl OptiMEM + 5 µl Oligofectamin pro well Lösung B: 180 µl OptiMEM ohne sirna pro well; 175 µl OptiMEM + 5 µl von 20µM ctnnb1-sirna Stocklösung pro well; 175 µl OptiMEM + 3 µl Kontrolle-siRNA pro well Zu der Transfektionslösung B wurde jeweils 80 µl Lösung A zugegeben. Die Zellen wurden in 2 ml OptiMEM gewaschen. Danach wurde 800µl OptiMEM pro well und 200µl Transfektions-Mix nach dem folgenden Schema zugegeben. Well 1A ohne sirna Well 2A Kontrolle sirna Well 3A ctnnb1-sirna Well 1B ohne sirna Well 2B Kontrolle sirna Well 3B ctnnb1-sirna Die Zellen wurden für 5 h bei 37 C inkubiert. Danach wurde 1 ml DMEM/F % FCS + 1% Pen/Strep pro well zugegeben. Nach der 24h-Inkubation wurden die Zellen mit RLT/ β-me Puffer lysiert und RNA wurde mit Hilfe des RNeasy Plus Kit isoliert (s.u.) Realtime PCR RNA-Isolierung Für die RNA-Isolierung aus den primären Chondrocytenkulturen oder 4C6/4H4-Zelllinien wurde das RNeasy-Kit von Qiagen nach Angaben des Herstellers verwendet. Um Verunreinigungen 79

90 Material und Methoden durch genomische DNA auszuschließen wurde ein DNase Verdau mit dem RNas-freien DNase Set von Qiagen durchgeführt. Die Zellen wurden zunächst in RLT-Buffer lysiert. Die Lysate wurden zur Homogenisierung in QIAshredder Säulen überführt und kurz abzentrifugiert (2 min., 10000rpm, RT). Der Durchlauf wurde mit einem Volumen 100%-igen Ethanol versetzt, danach auf RNeasy Mini-Säulen überführt und zentrifugiert (15 s, rpm, RT). Die gebundene RNA wurde mit Waschpuffer RW1-Puffer gewaschen. Um eine möglichst DNA-freie RNA-Lösung zu bekommen, wurde direkt auf die Säule DNase I-Lösung (10 μl DNase I in 70 μl RDD-Puffer) pipettiert und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die RNA erneut mit RW1-Puffer gewaschen und schließlich mit RNase-freiem H 2 O eluiert. Die aufgereinigte RNA wurde bei -70 C aufbewahrt Photometrische Bestimmung der RNA-Konzentration RNA-Gehalt und Reinheit wurden photometrisch bei 260 bzw.280 nm gemessen (Photometer BioPhotometer Eppendorf). Reine RNA sollte einen OD260/OD280-Quotienten von etwa 1,8 besitzen. Dazu wurde die RNA verdünnt (1/100) und in eine Küvette gefüllt. Als Nullwert wurde das Diluent verwendet. Alternativ wurden die Proben auf LVis Platte (BMG Labtech) aufgetragen, mit FLUOstar Omega Mikroplattenleser (BMG Labtech) gemessen und mit MARS Analysesoftware 2.10 R3 (BMG Labtech) ausgewertet cdna-synthese mit SuperScript II RT (Invitrogen RT-PCR Kit) Ansatz in l V 20 µl 1-5 µg RNA x dntp Mix (je 10mM) 1 Random Primer 1:20 verdünnt Je 1 H 2 O Ad 12 µl 5 min bei 65 C, danach auf Eis, kurz zentrifugieren 5x First-Strand Buffer 4 0,1 M DTT 2 RNasin 1 Die Ansätze wurden vorsichtig gemischt und 2 min bei RT inkubiert. Danach wurde 1 ml Super- Script II RT und steriles Wasser ad 20 µl zugegeben und bei RT 2 10 min inkubiert. Danach erfolgte die Inkubation bei 42 C für 50 min und Inaktivierung bei 70 C für 15 min cdna-amplifizierung und Analyse der Genexpression In einer 96-well PCR-Platte wurden für jedes Produkt Dreifachbestimmungen mit den zugehörigen Primerpaaren (s. o.) durchgeführt. Dazu wurden 25 µl Ansätze wie folgend gemischt: 80

91 Material und Methoden Ansatz, V 25 µl 10 µl Primeransatz 1 µl 10µM F-Primer 1 µl 10µM R-Primer 8 µl RNase-freies dh 2 O + 15 µl cdna-mix 0,1 µl cdna 5 µl HOT FIREPol 9,9 µl RNase-freies dh 2 O cdna wurde für Realtime-PCR mittels icycler von BioRad Laboratories amplifiziert und die Genexpression wurde mit CFX ManagerTM 2.0 Software (BioRad) analysiert 81

92 Anhang 7 Anhang 7.1 Oligonucleotidsequenzen Random Hexamer Primers: Roche, Mannheim Oligos: Life Technologies / Invitrogen, Karlsruhe Name Sequenz 5-3 Methode Pr. 1: Col10A1Int.rec5 TTTTAGAGCATTATTTCAAGGCAGTTTCCA Genotypsiserung Pr. 5: Cre-rev AGGCAAATTTTGGTGTACGG Genotypsiserung RM41 AAGGTAGAGTGATGAAAGTTGTT Genotypsiserung RM42 CACCATGTCCTCTGTCTATTC Genotypsiserung R26 wt 0883 AAAGTCGTCCTGAGTTGTTAT Genotypsiserung R26 wt 0316 GGAGCGGGAGAAATGGATATG Genotypsiserung R26 YFP 4982 AAGACCGCGAAGAGTTTGTC Genotypsiserung T7 GTAATACGACTCACTATAGG Sequenzierung M13-rev GGAAACAGCTATGACCATG Sequenzierung Cre-left AAAATTTGCCTGCATTACCG RT-PCR Cre-right ATTCTCCCACCGTCAGTACG RT-PCR MMP13 F CATTCGTCATCCTGGCCACCTCC RT-PCR MMP13 R CATCCACATGGTTGGGAAGTTCTG RT-PCR cbfa1-3 UTR-F1 GTG TTC TGT GGT CTC TGA G Realtime qpcr cbfa1-3 UTR-R1 GGC AAA AGC TTG CAG AAC TC Realtime qpcr Cyclophilin-for CCACCGTGTTCTTCGACAT Realtime qpcr Cyclophilin-rev CAGTGCTCAGAGCTCGAAAG Realtime qpcr 5AmMMP13 AAAGATTATCCCCGCCTCAT Realtime qpcr 3AmMMP13 TGGGCCCATTGAAAAAGTAG Realtime qpcr 5 mrunx2ic ATACCCCCTCGCTCTCTGTT Realtime qpcr 3 mrunx2ic AGGTTGGAGGCACACATAGG Realtime qpcr 5AMRANKL TTGCACACCTCACCATCAAT Realtime qpcr 3AMRANKL TCCGTTGCTTAACGTCATGT Realtime qpcr mopg left ACC TCA CCA CAG AGC AGC TT Realtime qpcr mopg right GCT CGA TTT GCA GGT CTT TC Realtime qpcr mvegfa-real-5 CCTGGTAATGGCCCCTCCTC Realtime qpcr mvegfa-real-3 CCCCATTGCTCTGTCCTTG Realtime qpcr Osx-left ATGGCGTCCTCTCTGCTTG Realtime qpcr Osx-right CTTTCCCCAGGGTTGTTGAG Realtime qpcr mihh 1 CCCCAACTCACCTCCCGACATC Realtime qpcr mihh 2 CGCCAGCAGTCCATACTTATTTCG Realtime qpcr 5`mBMP2 GCAACAGAAGCCCAGTTGCT Realtime qpcr 3 mbmp2 CCCGGCCACCATGGT Realtime qpcr 5 mbmp4 CGCAGCTTCTCTGAGCCTTT Realtime qpcr 3 mbmp4 GCAGGACTTGGCATAATAAAACG Realtime qpcr 5 mbmp6 AGCTTGCAAGAAGACTGAGC Realtime qpcr 3 mbmp6 CTCGGGATTCATAAGGTGGA Realtime qpcr 82

93 Anhang 5 mbmp7 ATTGCACCTGAAGGCTATGC Realtime qpcr 3 mbmp7 AGAGGACAGAGATGGCGTTG Realtime qpcr 5 mchordin TCAAGTTTACGCTTCTCTGTCTCCTA Realtime qpcr 3 mchordin AGGATGTTGCCTGTGGGATCT Realtime qpcr 5 mnoggin GCCGAGCGAGATCAAAGG Realtime qpcr 3 mnoggin TCTTGCTCAGGCGCTGTTT Realtime qpcr 5mbCate4 GGGACTCTGCACAACCTTTC Realtime qpcr 3mbCate5 TCCTGATGGAGCAGGAGATT Realtime qpcr 7.2 Sonden für in situ Hybridisierung ISH-Sonde β-catenin Vektor von: In-vitro-Transkription Mitglieder der Experimentellen Medizin I, Erlangen Orientierung Restriktionsenzym RNA-Polymerase antisense SpeI T7 ISH-Sonde Cre In-vitro-Transkription Orientierung Restriktionsenzym RNA-Polymerase antisense HindIII T7 sense SmaI T3 ISH-Sonde Col10a1 Vektor von: Mitglieder der Experimentellen Medizin I, Erlangen 83