Einführung in die Mikrobielle Ökologie

Transkript

1 Einführung in die Mikrobielle Ökologie 2 Von Fröschen, Maikäfern, Schnecken und linearem Denken Vom spezifischen Nachweis einer Art Vom Nachweis mikrobieller Aktivitäten Weshalb ist der Frosch grün? 1

2 Maikäfer, flieg'! Ein Maikäfer, dem man die Flügel abschneidet, kann nicht mehr hören. Schöne Grüße vom Maikäfer Menschen können sowohl durch die Nase als auch durch den Mund atmen. Normalerweise lernen sie, durch die Nase zu atmen und den Mund geschlossen zu halten. Klemmt man ihnen jedoch mit einer Klammer die Nase zu, dann vergessen sie die guten Sitten... 2

3 Grünalge Diatomeen Cyanobakterien Dinoflagellaten Augenflagellat Nanoflagellaten Global Players Bakterien Ciliaten Bakteriophagen Mit wem haben wir es eigentlich zu tun? Taxonomie Ziel: System mit Übereinstimmung zur natürlichen Verwandtschaft, der Phylogenie vgl. Stamm bei Tieren 3

4 Was ist eine Art? Bei sexueller Fortpflanzung: Fortpflanzungemeinschaft, die fruchtbare Nachkommen erzeugt Bei Prokaryoten: Art anhand von diversen Merkmalen operationell definiert, heute zunehmend auf der Basis der 16 S rrna Taxonomie Taxonomie ist ein wichtiger Bestandteil der 'Autökologie' der Organismen Übereinstimmung innerhalb einer Art 95 % 70 % 98 % 4

5 Physiologische Eigenschaften von Bakterien aus dem Stechlin-See Heribert (Henrik Cypionka Sass) 16 S rrna (Carl Woese) 5

6 Eignung der ribosomalen RNA für phylogenetische Analysen Ribosomen in jeder Zelle vorhanden (bis zu ), Einsatz von RNA-Sonden (Fluoreszenz-in situ-hybridisierung, FISH) Gen für rrna (rdna) 1x (manchmal mehrfach) vorhanden Elementare komplizierte Funktion erlaubt kaum grundlegende Mutationen. Andererseits wird durch einen Basenaustausch nicht eine Aminosäure eine Proteins verändert RNA lang genug für ausreichend Variationsmöglichkeiten, streng konservierte, variable und hypervariable Bereiche, erlaubt Analyse und Sondeneinsatz für weitläufig und näher verwandte Arten (diverse andere 'Fingerprint'-Techniken für sehr eng Verwandte) Langsame Evolution 'Molekulares Chronometer', je weniger Sequenzübereinstimmung, desto früher getrennte Entwicklung 6

7 PCR-Maschine (Thermocycler) Prinzip der Polymerase Chain Reaction DNA-Doppelstrang 94 C Denaturierung - Schmelzen der DNA C Annealing - Primeranlagerung 72 C Kary B. Mullis, 1983 Elongation - Kettenverlängerung siehe Methodenpraktikum, unter Teaching n 7

8 Der phylogenetische Stammbaum aller Lebewesen nach Sequenzvergleichen der ribosomalen 16 (bzw. 18) S-RNA. Die Strichlängen sind dem phylogenetischen Abstand proportional Ein phylogenetischer Stammbaum 8

9 Arten insgesamt Prokaryoten Eukaryoten Beschrieben: ~ Mio Geschätzt: 1 Milliarde Mio Anzahl der Arten in 30 g Waldboden (Reassoziationskinetik von DNA) Torsvik V, Goksoyr J, Daae FL (1990) High diversity in DNA of soil bacteria. Appl. Env. Microbiol. 56: Dykhuizen DE (1998) Santa Rosalia revisited: Why are there so many species of bacteria? Antonie van Leeuwenhoek 73:25-33 Statt zu Klonieren kann man oft auch mit PCR amplifizieren 9

10 FISH Fluoreszenzin situ- Hybridisierung Nevskia ramosa Anaerobes methanoxidierendes Konsortium aus methanogenen Archaeen (rot) und sulfatreduzierenden Bakterien (grün) Boetius, A. et al.( 2000) A marine microbial consortium apparently mediating anaerobic oxidation of methane. Nature 407: FISH Fluoreszenzin situ- Hybridisierung Näheres zu Mikroskopie und Elektrodenmessungen s. Homepage, VL zum Methodenpraktikum Examples of fluorescence in situ hybridization techniques. (a) In situ hybridization combined with microsensor measurements. In situ hybridization of a vertical biofilm slice with a carboxytetramethylrhodamine-labeled probe (NIT3) specific for the genus Nitrobacter (red stain cluster) correlated to oxygen and nitrate gradients measured by microelectrodes. Magnification, 400. Adapted from Schramm et al. [63]. (b) Confocal microscopic image of a bacterial aggregate thin section after simultaneous hybridization with a Cy3-labeled probe specific for nitrite-oxidizing Nitrospira sp. (red) and a Cy5-labeled probe specific for ammonia-oxidizing Nitrosospira sp. (blue). Scale bar indicates 20 mm (A Schramm, M Wagner, unpublished data). 10

11 Vergleich von amplifizierten 16 S rrna-banden von Reinkulturen und Sediment (0-10 mm) aus Schiermonnikoog durch Denaturierende Gradienten-Gel- Elze Wieringa Elektrophorese (DGGE) Im obersten Zentimeter eines Sediment lassen sich verschiedene Bakterienarten in verschiedenen Schichten nachweisen. Näheres zur DGGE s. Homepage, VL zum Methodenpraktikum Wie weist man mikrobielle Aktivitäten nach? Substratverwertung Tracer Analyse von Zellbestandteilen Wachstum Wärmefreisetzung Hemmung Produktbildung 11

12 Substratumsatz Probleme: - Fließgleichgewicht (steady state, Bildungsrate Verbrauchsrate) - Natürliche Konzentrationen meist nur nm - Div. Kontrollen, Substratzusatz, Ausschluss von Größenklassen oder Licht etc. verändern die Situation schnell grundlegend Messung des Nettoumsatzes nur an sehr aktiven Standorten z.b. CO 2 -Freisetzung, O 2 -Aufnahme Substratverwertung Produktbildung Tracer Einsatz von Tracern z.b. 14 C, 35 S, fluoreszierende Modellsubstrate wie MUF (Methylumbelliferyl-Rest fluoresziert nach Abspaltung durch (Exo)-Enzym) Bestimmung des "Heterotrophen Potenzials", Zusatz von Substratüberschuss, (Einbau von zugesetzten markierten Substraten,? Glucose,? Konzentration im Vergleich zur natürlichen Konzentration) Abschätzung von v max Tracer sollen - natürliche Konzentration möglichst wenig erhöhen - nur kurz umgesetzt werden, damit sie nicht in einen Kreislauf geraten Beispiel photosynthetische Primärproduktion Substratverwertung CO 2 + H 2* O fi < CH 2 O> + * O 2 Produktbildung Messung der 14 CO 2 -Fixierung im Licht (z.b. Flasche im See) Tracer Erhöhung der CO 2 -Konzentration meist kein Problem Dunkelkontrolle zum Abzug der CO 2 -Fixierung im Dunkeln? Netto- oder Brutto-Fixierung: Anfangs nur Aufnahme O 2 -Freisetzung (minus Dunkelkontrolle) nur bei sehr hohen Raten sinnvoll Tracer sollen - die natürliche Konzentration möglichst wenig erhöhen - nur kurz umgesetzt werden, damit sie nicht in einen Kreislauf geraten 12

13 Hemmung Wärmefreisetzung Jede lebende Zelle auch thermophile produziert Wärme. Mikrokalorimeter 13

14 Wärmefreisetzung Wieviel Wärme setzt ein Mensch frei? 2500 kcal pro Tag = kj/tag = /(24 * 60 * 60) kj/s = 120 J/s = 120 W 14

15 Wärmefreisetzung Beispiel: Mikrobieller Abbau von Tetraethyl- Blei im Boden Teeling H, Cypionka H, Appl Microbiol Biotechnol (1997) 48: Probenahme im Watt 15

16 Mikrokalorimetrie Heat production in mudflat and sandflat sediment Anu Kisand Mikrokalorimetrie Stimulierung der mikrobiellen Aktivität im Wattsediment (Neuharlinger Siel) durch Glucosezusatz (nach 60 h: 100 µmol/15 g) 10 cm 50 cm 300 cm 530 cm 10 cm 50 cm 300 cm 530 cm Wärmefreisetzung (µw) Integrierte Wärmemenge (J) 16

17 (Bakterien)wachstum Wachstum 3 H-Thymidin-Aufnahme (1/4 der DNA) Tracer Einbau von markierten Aminosäuren (Leucin) Tracer 35 SO 42 -Assimilation ( 1 % der Trockenmasse) Zunahme von DNA (konst. pro Zelle) Zunahme der Zellzahl (Grazer abfiltriert < 2µm) FDC (frequency of dividing cells) Tracer Zellbestandteile Hemmung Ohne Inkubation oder Zusatz von Stoffen! Was heißt eigentlich identisch? Nur wer sich ändert bleibt sich treu... Identifizierung und Zählung aktiver Zellen Umsatz von künstlichen Elektronenakzeptoren, Tetrazoliumsalze INT oder TTC Tracer Prinzip: 'Verpackter' Akzeptor wird aufgenommen und reduziert, wobei ein unlösliches, gefärbtes oder fluoreszierendes Produkt entsteht 17

18 Identifizierung und Zählung aktiver Zellen Mikroautoradiographie: Einbau von radioaktiven Substraten z.b. 14 C-Glutamat in Proteine oder 3H-Thymidin in die DNA Tracer Zählung teilungsfähiger Zellen mit Nalidixinsäure: Hemmt DNA-Replikation, es entstehen fädige Zellen, die sich nicht teilen Wachstum Bestimmung der Ribosomenzahl mit fluoreszierenden Sonden: Je aktiver eine Zelle, desto mehr Ribosomen hat sie Analyse von Zellbestandteilen Nalidixinsäure hemmt Teilung aber nicht Wachstum Es sind viel mehr Bakterien aktiv als sich kultivieren lassen. 18

19 Analyse von Zellbestandteilen Analyse von Zellbestandteilen aktiver Zellen DNA (Epifluoreszenz-Nachweis mit DAPI oder Acridinorange) als indikator intakter Zellen (s.o.) Phosplipide als nur kurzfristig überdauernde Bestandteile Ribosomen: pro Bakterium je nach Aktivität, Anfärbung mit RNA-Sonden Messenger-RNA (mrna) als Indikatoren für gerade gebildete Proteine molekularbiologische Methoden... Hemmung Wirkung von Hemmstoffen Möglichst spezifische Blockade von essentiellen Prozessen Anhäufung von Intermediaten oder alternativen Endprodukten Langfristig Veränderung des Systems... (kurzfristig einsetzen!) 19

20 Hemmung Wirkung von Hemmstoffen Plötzliche Dunkelheit hemmt die Photosynthese (s.o.) Filtrieren entfernt Grazer Acetylen (C 3 H 3 ) hemmt die Denitrifikation (Umsetzung von N 2 O zu N 2 ). Es entsteht N 2 O als Endprodukt und ist leicht im Gaschromatographen nachweisbar Bromethansulfonat (BES) hemmt die Methanogenese. BES ist ein Analoges des Coenzym M Molybdat hemmt die Sulfatreduktion. Molybdat ist ein Analoges des Sulfat Nitrapyrin hemmt die Nitrifikation (Umsetzung von Ammonium zu NItrat). Käuflich als 'N-Serve' etc. 20